Espectrometria de Massas
Profa. Dra. Débora de Almeida Azevedo
MSc e DSc em Química Orgânica – DQO/IQ/UFRJ Pós-doutorado em Química Ambiental – CSIC/Barcelona-Espanha
Professora Adjunta do DQO/IQ/UFRJ desde Fev/1996
LABEM – Laboratório de Espectrometria de Massas Departamento de Química Orgânica
Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro
INTERESSES
Técnica analítica poderosa utilizada para identificar compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades químicas e estruturais de moléculas; pode ser realizada com quantidades bem pequenas (ao nível do picograma) e a concentrações bem baixas em misturas quimicamente complexas (ppt); gera informações valiosas a um grande número de profissionais físicos, engenheiros de controle de processos, químicos, astronautas, biólogos etc.
USOS
• identificar estruturas de biomoléculas (carboidratos, ácidos nucleicos, esteróides); • seqüenciar biopolímeros como proteínas e oligossacarídeos;
• determinar como as drogas são utilizadas pelo organismo;
• realizar análises como a confirmação e quantificação de abuso de drogas; • análise de poluentes ambientais;
• determinar a idade e origens de espécies em geoquímica e arqueologia; • identificar e quantificar componentes de misturas orgânicas complexas.
INSTRUMENTAÇÃO
Grande variedade, diferentes princípios físicos, separação de íons pela razão massa/carga:
I. dispersão em um setor magnético ou em um campo elétrico radial; II. movimento em um campo elétrico com radiofrequência;
III. tempo de vôo, após aceleração através de um potencial fixo; IV. freqüência ciclotron em um campo magnético.
Os Componentes
de um
Espectrômetro de Massas
Fonte
Analisador
Detector
Manipulação
dos
dados
Introdução
da
Amostra
Espectro
de
Massas
Separação dos íons
Amostra - sólida, líquida ou vapor Íons - fase gasosa
Condições de alto vácuo
Detector - íons geram um sinal elétrico que é proporcional ao número de íons.
FONTE IÔNICA
Geração de íons (mais comum): bombardeamento de moléculas gasosas com um feixe de elétrons.
Impacto de elétrons (70 eV): mistura de íons positivos e negativos e espécies neutras.
Íons positivos: direcionados para o analisador pela aplicação de voltagem positiva no
repeller. Focalização pela voltagem aplicada nas lentes.
Íons negativos e elétrons: atraídos para um catodo positivo.
Moléculas e fragmentos neutros não ionizados: bombeados para fora do sistema.
No processo de ionização por impacto de elétrons (IE), a energia dos elétrons é geralmente muito maior do que a energia das ligações químicas das moléculas;
Quando elétrons de alta energia interagem com moléculas, ocorre a ionização; ligações são rompidas e fragmentos formados. Esta a razão porque não só íons da molécula intacta aparecem nos espectros de massas;
Embora íons positivos e negativos sejam gerados na fonte ao mesmo tempo, uma polaridade é escolhida, e o espectro de massas consiste de íons positivos ou íons negativos. Partículas neutras não são detectadas;
Espectro de massas de íons positivos são normalmente os mais utilizados.
-+
+
+
Figura 2: Esquema de uma fonte de íons com ionização por impacto de electrons.
PRODUÇÃO DE ÍONS
É de fundamental importância a geração de um feixe intenso, contando íons característicos das moléculas não dissociadas e dos processos de fragmentação relacionado à estrutura:
Impacto de elétrons (IE) Ionização química (IQ)
Ionização por dessorção química (DCI)
Ionização por campo/dessorção por campo (FI/FD) Espectrometria de massas de íons secundários (SIMS) Bombardeamento por átomos rápidos (FAB)
Dessorção por plasma (PD) Dessorção por laser (LD) Termospray (TSI)
Electronspray (ESI)
Ionização à pressão atmosférica (API)
SETOR MAGNÉTICO
• elemento de foco direcional pois íons monoenergéticos, que deixam a fonte em um feixe divergente, são atraídos ao foco do coletor,
• um íon acelerado em um campo magnético de força B segue trajetória circular de raio r ; • mv/z = rB
• razão massa/carga: m/z = B2r2 /2v ;
• os parâmetros B e v são variáveis para modificar a massa do íon que segue uma determinada trajetória;
• dispersa os íons de acordo com a razão momento/carga;
• íons de massas diferentes mas com a mesma energia cinética emanados do mesmo ponto, seguem trajetórias diferentes através do raio central do setor magnético
Fonte Iônica Para o vácuo Magneto Feixe de ions separados Coletor de ions Tubo do
analizador Saída dos ions
SETOR ELÉTRICO setor elétrico cilíndrico;
dispersa os íons com a razão energia cinética/carga; elemento de foco direcional;
íon positivo em um campo elétrico está sujeito a uma força na direção do campo e o percurso do íon no campo é curvo;
o raio da curvatura (rc), da trajetória do íon depende da energia do íon e da força do campo elétrico;
analisador de energias - serve para limitar a faixa de energias do feixe iônico;
faixa de energias - fator de limitação da resolução dos analisadores de deflexão magnética. Somente íons de energia Ve segue a trajetória de raio r; íons com energias maiores ou menores seguem trajetórias de raios maiores ou menores. r = 2V/E
INSTRUMENTOS DE SETORES
• combinação dos setores eletrostáticos e magnéticos; • configuração usual é a geometria Nier-Johnson;
• íons de massas grandes apresentam trajetórias de raios maiores do que íons de massas pequenas;
• íons de diferentes razões massa/carga são focalizados para o detector variando a força do campo magnético;
• a combinação da focalização por energia e por momento, acoplando dos analisadores eletrostáticos e magnéticos (focalização dupla) gera alta resolução, obtendo-se massa precisa;
• pode-se obter uma resolução tão alta que a massa de uma partícula é medida com três ou quatro casas decimais;
• resolve-se íons de mesma massa nominal mas com fórmulas químicas diferentes como N2 e CO a m/z 28.
Figura 4: Esquema de um espectrômetro de massas de duplo foco, com analisador de íons por campo elétrico e magnético.
QUADRUPOLO
• analisador de massas;
• usa quatro polos elétricos (um “quadrupolo”) e nenhum campo magnético.
• íons são introduzidos no analisador com velocidades constante em uma direção paralela aos polos (direção z) e então, passam a oscilar nas direções x e y.
• isto é obtido pela aplicação simultânea de uma voltagem de corrente contínua e de uma voltagem de radiofreqüência aos polos;
• ocorre uma variação estável que permite ao íon passar de um extremo ao outro do quadrupolo sem chocar-se com os polos;
• esta oscilação depende da razão massa/carga do íon;
• apenas íons com uma determinada razão m/z conseguirão atravessar o analisador; • demais íons terão oscilações instáveis e chocar-se-ão com os polos.
• varredura de massas é feita variando-se a radiofreqüência e a voltagem da corrente contínua, mantendo-se sua razão constante.
• instrumentos com setores operam tipicamente com voltagens de aceleração na faixa de KeV, enquanto quadrupolos operam com energias cinéticas na faixa de 0-10 eV; • filtro de massas tipo quadrupolo é o que utiliza um analisador de massas verdadeiro,
enquanto o setor magnético mede momento e o elétrico a energia;
• gera baixa resolução (unitária), mas é mais facilmente interfaceada aos vários sistemas de introdução de amostra.
Figura 6: Esquema representativo da interface analisador tipo quadrupolo e eletromultiplicador utilizando blindagem para raios-X.
“ION TRAP” – TRAPA IÔNICA
Paul, 1956: aparelho que mantém íons gasosos em um volume pequeno utilizando somente campos elétricos;
são três eletrodos: dois eletrodos de tampas terminais (“end-cap eletrodes”) e um eletrodo central em anel, cada um com uma seção de corte hiperbólica, forma uma câmara dentro da qual íons podem ser confinados;
aplicação de uma voltagem de radiofreqüência (rf) ao eletrodo em anel estabelece um campo elétrico quadrupolar;
íons de razão massa/carga apropriada tem trajetórias estáveis dentro da câmara e são confinados por vários segundos.
1984: primeiro “ion trap quadrupolar” comercial.
pode ser classificado na mesma categoria de filtro de massas como o quadrupolo; é um quadrupolo tri-dimensional, e equação semelhante do íon é aplicada.
método novo de ejetar seletivamente da câmara íons de razão m/z cada vez maiores;
para se obter o espectro de massas, a amplitude da voltagem rf é aumentada, fazendo com que íons de razão m/z cada vez maiores se tornem instáveis;
ionização. A amplitude rf é aumentada, e íons de massas cada vez maiores são seqüencialmente ejetados da câmara e detectados por um multiplicador de elétrons.
parâmetro importante na operação do ion trap é a pressão do gás de fundo. Hélio é adicionado como um banho de gás - colisões dos íons com o gás inibe a trajetória dos íons em direção ao centro do ion trap (controle da trajetória), gerando melhor resolução e sensibilidade.
CARACTERÍSTICAS ÚNICAS DO ÍON TRAP alta sensibilidade;
faixa de massa grande, excede a 70KDa; resolução ultra alta (106);
limite de detecção atomol : 10-18 mol;
espectrometria de massas de estágios múltiplos, (EM)n n < 13; podendo utilizar métodos diferentes de decomposição de íons (colisão com gás, irradiação com fóton, interação com superfície);
determinação inequívoca do caminho de fragmentação real;
geração de íons na câmara por ionização por impacto de elétrons, ionização química, injeção efetiva dos íons gerados de outras fontes por APCI, ESI, MALDI;
manipulação fácil;
efetivo para reações íon-molécula; avaliação da polaridade de íons gasosos.
Corte esquemático do ITMS
Corte esquemático do ITMS
“end-cap” Detector Voltagem rf suplementar “end-cap” Filamento Voltagem rf fundamental Anel eletrodo TEMPO DE VÔO
• tipo mais simples de análise de partículas carregadas; • único campo envolvido é a aceleração;
• utiliza uma voltagem de aceleração constante; todos os íons de massas diferentes apresentam uma velocidade diferente;
• cada íon atravessa uma distância fixa em diferentes tempos; • tempo de vôo de um íon por uma distância L é dado por: • t = L/v ; mv2/2 = zv ; t = Lm1/2 /(2zv)1/2
• ideal para análise de íons gerados por dessorção por plasma ou laser (pulsada), pois o processo de ionização é espacialmente e temporalmente confinado;
• método capaz de gerar uma análise de massas completa para cada evento de ionização discreto (alta velocidade de varredura).
• baseado na medida de uma diferença de tempo entre um sinal de partida e outro de chegada;
• os íons dessorvidos são acelerados por uma diferença de potencial aplicada entre o suporte e a grade extrativa. Os íons acelerados percorrem um espaço livre até o detector. Sendo a energia de aceleração a mesma, os íons de massas diferentes se separam no espaço livre e chegam em tempos diferentes ao detector.
• a fonte de 252Cf é colocada pouco atrás do suporte. O processo de fissão nuclear libera simultaneamente dois fragmentos a 180o um do outro, enquanto um produz a ionização da amostra, o outro é detectado e gera uma marcação de tempo eletrônico. • os produtos de fissão atravessa o substrato e provoca a dessorção do depósito sobre o
suporte.
• um modo de melhorar a resolução dos instrumentos com tempo de vôo é o espelho eletrostático ou “reflectron” (“Reflecting electrical field”- campo elétrico refletor). • todo espalhamento de velocidade, e conseqüentemente alargamento do tempo de vôo,
no feixe de íons é compensado refletindo o feixe em um campo eletrostático pois os íons mais rápidos penetram mais e então tem um caminho de vôo total maior.
Fonte
Separador
Detector
Grade
Sinal
Final
Sinal
Partida
Junção
Fenômeno de desorção
Instrumento com Tempo de Vôo
Instrumento com Tempo de Vôo
Figura 7: Esquema de um espectrômetro de massas utilizando analisador de íons do tipo tempo de vôo.
DETECTORES
corrente de íons é extremamente pequena, mas pode variar rapidamente em uma faixa bem grande;
a este baixos níveis, tipicamente na faixa de 10-14 a 10-11 A, ruído de fontes estranhas é um fator muito significativo;
o sinal tem que ser ampliado significativamente antes que o processamento usual dos sinais e a manipulação das informações possam ser aplicados;
amplificação é usualmente realizada com um elétron-multiplicador. Multiplicadores geram um ganho de sinal na faixa de 104 a 106. A corrente que sai de um multiplicador é ainda bem pequena e é usualmente novamente ampliada;
uma performance bem alta de sinal/ruído é alcançada com um certo número de multiplicadores: “box-and-grid”, “venetian blind” , multiplicadores de diodo contínuo
“box-and-grid” : feixe de íons é acelerado na direção de uma rede fina (“grid”) que é mantido a um potencial negativo bem alto. A maioria dos íons atravessa a rede para colidir com uma superfície de Cu-Be, a qual é bem emissiva e irá projetar 3 a 4 elétrons para cada íon que colide. A colisão dos elétrons em uma segunda superfície de Cu/Be leva a mais emissões de elétrons, e o processo é repetido 12 a 16 vezes.
Multiplicadores com diodo contínuo: uma alta voltagem negativa, tipicamente 1800v é aplicada através de uma trombeta de vidro cujo interior é coberto com óxido de titânio. A cobertura serve como uma superfície de emissão.
• um gradiente de potencial é desenvolvido dentro do envelope. Um íon colide com a superfície levando a emissão de vários elétrons ;
• estes irão descer a superfície levando a mais emissões de elétrons; • um ganho de 105 a 106 é atingido com 1800 a 2000v;
• para prevenir a perda de elétrons pela entrada da trombeta e parra definir o potencial de entrada, uma rede fina é fixada no topo do multiplicador;
• extremamente suscetível a contaminação da superfície. Não é sensível a contaminação por ar, vapor d’água e a maioria dos gases reagentes da ionização química;
• íons positivos são atraídos fortemente para o multiplicador devido a alta voltagem negativa em sua entrada. Os íons devem ser atraídos para uma área definida sem se chocarem com as placas protetoras.
• para íons pesados, o gradiente mínimo de potencial necessário para contornar esta inércia dos íons e atraí-los é maior do que para os íons de massa baixa. Isto fixa o limite mínimo dependente da massa para a voltagem do multiplicador.
• tipicamente, o multiplicador deve ser operado acima de 1700v para um instrumento de 800u. • a amplificação do sinal do íon torna possível a detecção de um simples íon que chega ao
coletor. Embora a eficiência de ionização e transmissão no espectrômetro de massas atinge somente um íon no coletor para aproximadamente 105 moléculas da amostra introduzidas, espectros de massas úteis podem ser obtidos ao nível do subnanograma.
• Raios-X: quando íons colidem com os polos de um sistema quadrupolo, raios-x brandos podem ser gerados. Raios-x colidindo com multiplicadores pode levar a emissão de elétrons da superfície pela ação fotoelétrica. A corrente devido ao raios-x pode mascarar completamente o sinal de fluxo de íons, levando a um aumento no sinal e ruído
• a colisão íon-polo gera também um número significativo de moléculas neutras excitadas. Também leva a um aumento no sinal de saída
DETECTORES “Post acceleration” “Microchannel plate” “Photo diode array” “Eletron multiplier” com plano focal
• “Microchannel plate”: placa fina constituída de milhões de microcanais. Uma cobertura metálica de Ni-Cr depositada nas duas faces da placa assegura contato e emissão. Os íons incidentes colidem com as paredes internas do canal devido a sua inclinação e provocam a emissão de elétrons secundários. Estes são acelerados por um campo elétrico entre as duas faces das placas. Por choque contra a parede, os elétrons provocam uma avalanche de elétrons, sendo recolhidos por um anodo.
• sistema de detecção com plano focal: coletam todos os íons por uma faixa de massa ao mesmo tempo. Foi aplicado por vários anos utilizando foto-placas. Detectores com plano focal têm se tornado disponível comercialmente. Aumenta a sensibilidade por um fator de 100. 1 K v Í o n s e- e -P C M 2 P C M 1
“ M i c r o c h a n n e l P l a t e ”
“ M i c r o c h a n n e l P l a t e ”
Figura 10: Figuras de bombas de vácuo: difusora e mecânica.
INTERPRETAÇÃO DE ESPECTROS DE MASSAS
um espectro de massas apresenta a massa da molécula e as massas de pedaços da molécula; na forma barra-gráfico, a abscissa indica a massa (m/z, razão massa para número de cargas nos íons) e a ordenada indica a intensidade relativa;
apresentam picos adicionais devido ao ruído de fundo do instrumento. São devidos a compostos que são dessorvidos das paredes do instrumento. Devem ser subtraídos dos espectros de massas dos compostos;
interpretação é baseada na química de íons gasosos;
a massa e a abundância relativa do íon molecular indica o tamanho e a estabilidade da molécula;
o número de íons abundantes e sua distribuição na escala de massas são indicativos do tipo de molécula e dos grupos funcionais presentes;
uma molécula composta de subestruturas estáveis conectadas por ligações fracas gera um espectro com poucos fragmentos proeminentes, como o espectro de massas da nicotina.
O Íon Molecular
M+. - informação mais valiosa de um espectro de massa; sua massa e composição elementar mostram os limites nos quais os fragmentos se situam.
para determinados tipos de moléculas, o íon molecular não é suficientemente estável para ser encontrado em quantidades apreciáveis no espectro por impacto de elétrons;
deve ser o íon de maior massa no espectro;
dever ser um íon com número ímpar de elétrons (OE+. : “odd-electron ion”);
deve ser capaz de gerar íons importantes na região de massa alta do espectro pela perda lógica de espécies neutras
no espectro por IE, a amostra se ioniza pela perda de um elétron, deixando um elétron desemparelhado, e o íon molecular se torna uma espécie radicalar. Tal íon, molecular ou fragmento, com um elétron desemparelhado é denominado OE e é representado pelo símbolo +.
EE (‘even-electron’): íons nos quais os elétrons da camada externa se encontram compartilhados. O símbolo + é utilizado (EE+);
facilidade de ionização destes elétrons se encontra na ordem n > π > σ ;
íons contendo somente elétrons emparelhados (EE+) são geralmente mais estáveis e conseqüentemente são fragmentos mais abundantes nos espectros de IE;
Abundância do íon molecular X estrutura: [M+.] - depende da sua estabilidade ; [M+.] - é um indício da estrutura molecular;
[M+.] - usualmente aumenta com o aumento de insaturações e número de anéis; [M+.] - usualmente diminui com o aumento do tamanho da cadeia de uma estrutura; [M+.] - diminui com as ramificações
Em geral, a estabilidade da molécula se assemelha a estabilidade do íon M+., e é refletido na abundância do M+. .
Figura 11: Espectros de Massas de alcanos lineares e isoprenóide, salientando suas principais posições de clivagem.
Ionização
abrangem duas classes : enérgica e branda;
ionização enérgica, com elétrons de 70eV, produz uma grande proporção de moléculas ionizadas com energias internas tão altas que elas se fragmentam antes de saírem da fonte iônica;
as massas desses fragmentos são as informações básicas das subestruturas utilizadas na interpretação;
ionização branda minimiza tais fragmentações.
ionização por elétrons: o feixe de elétrons de alta energia são gerados de um filamento incandescente e atravessam a câmara de ionização em direção ao anodo do outro lado. O fluxo
de moléculas da amostra vaporizada a uma pressão de ~10-3 Pa (10-5 Torr) entra na fonte e interage com o feixe de elétrons formando uma grande variedade de produtos, incluindo íons positivos;
são empurrados para fora da fonte por um pequeno potencial (‘repeller’) e são acelerados para o analisador de massas;
maior parte das moléculas são removidas por bombas de vácuo na fonte iônica.
a energia de 70 eV se encontra ~10eV acima da energia necessária para ionizar as moléculas. A pressão da amostra na câmara de ionização é mantida bem baixa garantindo que colisões secundárias dos íons com moléculas ou elétrons sejam negligenciáveis;
o resultado inicial da interação do elétron com a molécula é a formação do íon molecular pela ejeção de outro elétron (OE+. );
parte ou todos os íons moleculares decompõe-se posteriormente, levando aos fragmentos. somente reações unimoleculares são importantes na fragmentação por IE; a pressão da amostra é baixa o suficiente para evitar reações entre íons e moléculas.
ionização branda: aumentando a pressão da câmara de ionização para ~100 Pa (0,75 Torr), se garante que a molécula da amostra sofrerá centenas de colisões antes de sair.
bombardeamento por elétrons no metano ou outros gases a tais pressões em uma fonte iônica fechada (saída para o vácuo pequena) produz os íons ‘reagentes’ em abundância como o CH5+ .
eles reagirão com a amostra através de reações íon-molécula; algumas serão bandas gerando íons produtos estáveis representando moléculas não dissociadas.
ionização branda leva ao íon molecular MH+ , mais estável, menor grau de fragmentação; para os métodos tradicionais de ionização (IE e IQ) a amostra deve ser vaporizada;
introdução direta na fonte de íons é preferida para compostos de baixa volatilidade. A amostra é introduzida via sonda na fonte de íons, onde é vaporizada por aquecimento.
INFORMAÇÕES SOBRE A ESTRUTURA MOLECULAR São obtidas eficientemente na seguinte ordem:
• possíveis moléculas, comparando-se cada estrutura contra todas as informações disponíveis
• Importância relativa dos picos • maior intensidade
• maior massa no espectro • maior massa no grupo de picos Características da estrutura mais plausível
• listar todas as estruturas possíveis;
• predizer seus espectros a partir do mecanismo de dissociação apropriado e compare-o com o obtido
• espectros de referência são importantes; deve-se obtê-los nas mesmas condições instrumentais utilizadas para o composto em estudo. Valores de abundância pode variar entre os instrumentos
PROPONDO A ESTRUTURA MOLECULAR
Regra do Nitrogênio: “se um composto contém átomos de nitrogênio (ou um número par), seu íon molecular será um número ímpar”;
H2O : m/z 18 ; NH3 : m/z 17;
Perdas neutras lógicas: há somente um certo número de fragmentos neutros de pequena massa que são comumente perdidos na decomposição dos íons moleculares;
a presença de um íon “importante” separado do íon de maior massa por uma massa anômala é indicativo que o último não é o íon molecular;
perda de fragmentos neutros a partir do íon molecular são aqueles comumente conectados por ligações simples;
íons importantes de massas (M - 1)+ , (M - 15)+ , (M - 18)+ e (M - 20)+ normalmente representam a perda de H, Me, H2O e HF respectivamente a partir do íon molecular;
tais picos de perdas de neutros pequenos são de grande significância na dedução da estrutura molecular.
íons característicos
tais íons característicos são úteis na sugestão de fragmentos possíveis da molécula.
m/z 30 - aminas; m/z 77 - fenil;
m/z 105 - metilbenzil ou benzoil;
m/z 149 - ftalato, embora muitos outros compostos possam também gerá-los; m/z 191 - terpanos
m/z 217 - esteranos m/z 74 - ésteres metílicos m/z 58 - metil cetonas lineares
ESPECTROS DE MASSAS DE CLASSES DE COMPOSTOS COMUNS
Marcação isotópica e outras técnicas especiais têm sido utilizadas para se elucidar os mecanismos de fragmentação.
Hidrocarbonetos
• sofrem rearranjos randômicos, o qual é reduzido com ramificações e insaturações.
Hidrocarbonetos alifáticos saturados
• apresentam íon molecular pequeno; • séries típicas de (CnH2n+1)+ ;
• ramificações levam a decréscimo na intensidade do M+. e a um aumento na abundância de (CnH2n+1)+ e (CnH2n )+ . devido a quebra e retenção de carga no carbono ramificado;
Hidrocarbonetos alifáticos insaturados
• aumenta [M+.] somente para compostos de baixo peso molecular; • clivagem alílica;
• método para localização de ligações duplas: introdução de grupos funcionais nas ligações duplas induzindo fragmentações com clivagens específicas de ligações, ex. ozonólize.
Hidrocarbonetos cíclicos saturados
• íons moleculares mais abundantes;
• decomposições do esqueleto do anel deve envolver clivagem de no mínimo duas ligações;
• correlação espectral cuidadosa pode dar informações estruturais valiosas; • Exemplo: 5-α-pregnano
• (M - CH3)+ advém da perda do grupo metila angular, principalmente C19 ;
• íon m/z 149 é composto principalmente dos anéis A e B via mecanismo complexo;
• estereoquímica dos anéis A/B tem efeito característico neste processo: isômero 5-β-(cis) a razão [m/z 149]/[m/z 151] é menor do que no isômero 5-α.
Hidrocarbonetos cíclicos insaturados
• íon significante m/z 54 vem de reação tipo Retro Diels-Alder, reação gera um fragmento dieno e monoeno e pode ser bem específica da ligação dupla, mesmo em moléculas como os terpenos e alcalóides.
Hidrocarbonetos aromáticos
• pico do íon molecular é normalmente bem intenso;
• processos de clivagem do anel aromático necessita de alta energia;
• posição no anel de substituintes alquilas tem pouca influência no espectro;
• séries de íons homólogos dos fenilalcanos ocorrem a massas correspondendo a C6H5(CH2)n+ (m/z 77, 91, 105, 119,...) ;
• íon mais característico desta série corresponde a ruptura da ligação benzílica com perda do maior grupo alquila;
• íon benzílico é estabilizado por ressonância.
• dehidrogenação e dehidratação catalítica ou térmica podem gerar íons como (M - 2)+.
; (M - 18)+. e (M - 20)+. , embora também possam advir da fragmentação por impacto de elétrons.
Álcoois alifáticos cíclicos
• clivagem a é favorável na ligação do anel mais substituída;
• reações posteriores pela eliminação de CnH2n leva aos íons característicos OE+.
a m/z 44, 58, 72, 86,...
• perda de água é um caminho principal de decomposição do M+.
.
Fenóis
• o pico (M - CO)+.
, usualmente acompanhado pelo (M - CHO)+ , é especialmente útil no reconhecimento dessa funcionalidade;
• íons (M - 18 )+.
- “efeito orto” • pico (M - 1)+
- advém da perda de hidrogênio benzílico
Cetonas e aldeídos alifáticos
• íon molecular das cetonas é usualmente observado; de aldeídos alifáticos de cadeia longa é normalmente pequeno, mas pode ser identificado pelos fragmentos característicos (M - H2O)+. e (M - C2H4)+..
• pico CHO+
(m/z 29) é proeminente para aldeídos pequenos; • clivagem a gerando (M - H)+
é apreciável somente quando RCO+ for bem estabilizado; • clivagem α é mais proeminente em cetonas alifáticas;
• íon acílio mais abundante é usualmente formado pela perda do maior grupo alquila, enquanto o íon alquila mais abundante é o mais estável
• apresentam as séries características a m/z 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, devido a CnH2n+1CO+ e CnH2n+1 .
Ésteres
• íon molecular é observado; • sofrem clivagem α;
• sofrem clivagem β com rearranjo de H;
• ramificações leva a mudanças características na série do íon CH3OCO(CH2)n+ , m/z 59, (73), 87, 101, ... com maior abundância nos carbonos terciários.
MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO
Na espectrometria de massas convencional as reações são unimoleculares.
Fatores que influenciam a abundância de um íon:
• estabilidade do íon produto (estabilização do íon por compartilhamento de elétrons; por ressonância);
• íons radicais distônicos: isômeros com sítios de carga e radical separados :
• CH3NH2+. e . CH2N+H3 podem ser mais estáveis que seus correspondentes clássicos.
Regra de Stevenson
• ruptura de uma ligação simples em um íon OE+.
pode levar a dois grupos de produtos: íon e radical . Íon fragmento é usualmente o mais estável, o mais abundante;
• perda do maior grupo alquila
• estabilidade do produto neutro: H2 , CH4, H2O, C2H4, CO, NO, CH3OH, H2S, HCl, CH2=C=O, CO2 ;
• efeitos estéricos/entropia.
Alcanos lineares
• espectro resultante tem vários picos com abundância variando regularmente • aumento regular na abundância com o decréscimo de tamanho dos íons alquila • estruturas de tamanhos menores, como C3H7+
e C4H9+ , são estruturas de íons carbênio ramificados mais estáveis
• alcanos substituídos com grupos eletronegativos que não diminuem significantemente a energia de ionização (ex. Cl, Br, NO2, CN) apresentam efeitos semelhantes nas abundâncias
dos íons CnH2n+1+ .
• séries de íons de massa baixa
• vários grupos de picos separados por 14 u (série separadas por grupos CH2); outros tem
separações menores, 12 ou 13u (série de íons separadas por CH e C);
• geram informações sobre as subestruturas (heteroátomos, anéis, ligações duplas); • indicador da presença de uma cadeia alquila.
INICIALIZAÇÃO DE REAÇÃO EM SÍTIOS RADICALARES OU DE CARGA
predizer o caminho de decomposição preferida assume-se que as reações são iniciadas em sítios favoráveis para os elétrons desemparelhados e para a carga positiva no íon em decomposição.
a dissociação resultante da inicialização por sítios radicalares e de carga são, respectivamente, clivagens homolíticas e heterolíticas.
facilidade de ionização: n >π > σ .
o símbolo +. no final da molécula significa um íon com número ímpar de elétrons sem definir o sítio do radical. Uso de . ou + na molécula , CH3+.CH3 , implica na localização do radical ou carga.
MEDIDA DE MASSA EXATA (ALTA RESOLUÇÃO)
medida da massa de um íon com acurácia suficiente gera uma identificação inequívoca de sua composição elementar (e isotópica).
técnica conhecida como espectrometria de massas de alta resolução; instrumentos de duplo foco ou FT/ICR são usualmente utilizados;
elementos podem ser identificados desse modo pois os pesos atômicos monoisotópicos não são números inteiros exatos;
sendo 12C = 12,00000000, então 1H = 1,007825035, 14N= 14,00307400, 16O= 15,99491463. cada isótopo tem um único e característico “defeito de massa”, e a massa do íon, o qual mostra o defeito de massa total, identifica sua composição isotópica e elementar.
exemplo: íon com massa 43,0184 pode ser C2H3O+ e não pode ser C3H7+ (m = 43,0547) ou C2H5N+ (m = 43,0421).
Figura: Espectro de massas do 4-fenilcicloexeno e mecanismo de fragmentação do tipo retro-Diels-Alder gerando seus principais fragmentos.
Figura: Espectro de massas do cicloexeno e do 3-metil-3-hexanol e mecanismos de fragmentação de seus principais fragmentos.
Figura: Espectro de massas da 2-dodecanona e mecanismos de fragmentação, via Mecanismo de McLafferty, de seus principais fragmentos.
Figura: Espectro de massas da 5-fenil-2-pentanona e mecanismos de fragmentação, via Mecanismo de McLafferty, de seus principais fragmentos.
Figura: Espectro de massas do 3-metil-3-heptanol e mecanismos de fragmentação de seus principais fragmentos.
Figura: Mecanismos de fragmentação tipo Mecanismo de McLafferty e mecanismo de perda de molécula de água de álcoois lineares.
IONIZAÇÕES BRANDAS IONIZAÇÃO QUÍMICA
Baseia-se na transferência de espécies carregadas entre um íon reagente e a molécula alvo, produzindo um íon que pode ser analisado.Espécies formadas no modo positivo são normalmente adutos entre a molécula alvo e íons pequenos como H+, H3O+ e NH4+ e, no modo negativo, resulta da perda de prótons, captura de elétrons, dentre outros.
• espectros normalmente simples, com pouca ou nenhuma fragmentação;
• técnica bem sensível, pois a corrente de íons é concentrada em poucas espécies.
• realizada a altas pressões - relativa a utilizada no analisador de massas - e é extremamente eficiente em se produzir íons.
Gás Afinidade por Próton, kcal/mol
Helio 42
Metano 127
Vapor de água 167
Isobutano 195
Amônia 207
• se molécula for ionizada com pouco acréscimo de energia, fragmentação será reduzida e o íon molecular será mais abundante.
• impacto de elétrons de baixa energia aumenta o íon molecular mas há perda de sensibilidade. • IQ - basicamente a molécula está rodeada pelos íons reagentes e a carga passa para a
molécula por uma interação química sem muita transferência de energia.
• prótons ou mesmo entidades grandes carregadas podem ser adicionadas a molécula sem muita transferência de energia.
• gás reagente introduzido na fonte iônica (~0,5 - 1,0 Torr) a uma concentração de 104 :1 para a amostra e é ionizada pelo bombardeamento de elétrons (~500V).
• maioria dos íons, o gás reagente é ionizado por IE.
• o íon R+. inicialmente formado pode reagir com outra molécula de R para formar espécies iônicas reativas que depois ataca a molécula M da amostra.
R+. + R → RH+ + (R-H). ou RH. + (R-H)+ RH+ + M → R + MH+ (protonação)
(R-H)++ M → (R-2H) + MH+ (protonação) (R-H)++ M → R + (M-H)+ (abstração de hidreto) R+. + M → R + M+. (troca de carga)
• mais comum: protonação que é favorecida para moléculas com afinidade por próton maior do que o reagente.
• abstração de hidreto: comum para moléculas com baixos valores da afinidade por próton (alcanos).
• troca de carga: favorecido para reagentes de alta energia de ionização como hélio.
• energia interna da molécula ionizada resultante depende do reagente escolhido, temperatura da fonte e pressão.
• Exemplo: acetado de lavanduila (PA = ~8.7 eV); CH4 (PA= 5.7eV); (i-C4H8 = 8.5eV); (NH3 = 9.0eV)
• com metano: posterior fragmentação é quase completa para a espécie CH5+ altamente exotérmica.
• com amônia: pouca reação (fragmentação unimolecular)
• metano pelo bombardeamento por elétrons gera: CH4+, CH3+ , CH2+, CH+, C+ , H2+ , H+ , algumas mais abundantes do que outras.
• íons mais proeminentes, 95% do total: CH5+ , C2H5 + , C3H5 + . • CH4+
+ CH4 → C2H5+ + CH3
• C2H5+ + CH4 → C3H5+ + H2
• São extremamente reativos, podem atacar a molécula, passando a carga para elas.
• pode-se gerar (M + 1)+ , (M + 29)+, (M + 41)+, normalmente apresentam maior estabilidade do que o íon molecular por IE.
• Metano: baixo valor de afinidade por próton e é mais provável de se observar o íon molecular de um composto desconhecido do que utilizando-se isobutano ou amônia. É a primeira escolha para uma ionização química de aspecto geral, especialmente para amostras desconhecidas.
• desvantagem : alto grau de fragmentações.
• Amônia: alto valor de afinidade por próton. Previne fragmentações. Gás de difícil manipulação, pois é corrosivo.
• Isobutano: também tem aplicação geral. Tem maior afinidade por próton do que metano, menor grau de fragmentação (se ocorrer a ionização).
• Ionização Seletiva: técnica poderosa para compostos desconhecidos. Com a escolha adequada do gás reagente é possível ionizar seletivamente um composto em uma mistura complexa. Leva a um aumento significativo no limite de detecção.
• pode contornar problemas associados com a detecção e identificação de estereoisômeros. Diferença em isômeros é responsável por pouca diferença de energia.
• IQ: sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas para muitos compostos. Massa molecular pode ser identificado. Menor fragmentação, gerando espectros mais simples e mais fáceis de serem entendidos. Isômeros químicos e estereoisômeros podem ser distinguidos. Compostos podem ser seletivamente ionizados em misturas complexas. Informação obtida é complementar a IE.
• em adição aos gases, vapores como metanol podem promover a IQ.
• CL/EM: a fase líquida entra na fonte de íons, é vaporizada e se torna o reagente da IQ. • Alcanos: abundante [M - H]+
• Alcenos: duas séries de íons
• [CnH2n+1]+ , consistindo do íon [M+ H]+ e dos íons derivados deles;
• [CnH2n]+ , consistindo do íon [M -H ]+ e fragmentos de menor massa derivados dele. • observa-se também o M+. .
Figura: Espectros de massas do acetato de lavanduila por ionização química utilizando metano isobutano e amônia, respectivamente, como gás reagente.
Figura: Espectro de massas da Reserpina por impacto de elétrons e ionização química utilizando metano como gás reagente.
ELECTROSPRAY
nova e poderosa técnica de ionização, produzindo gotas altamente carregadas a partir de soluções.
método de se gerar gotas altamente carregadas das quais íons são ejetados pelo processo de evaporação.
Evaporação do íon: é um processo no qual íons são emitidos de gotas carregadas diretamente para a fase gasosa.
pulveriza-se um líquido contendo íons pré-formados na forma de gotas carregadas e emissão subsequente dos íons das gotas para a fase gasosa.
Electrospray e Ionspray: um campo elétrico é gerado na extremidade do pulverizador aplicando-se uma alta voltagem diretamente no pulverizador (4kV), com o contra-eletrodo
atraídos para as gotas pelo campo elétrico enquanto são separadas do líquido. A separação é incompleta e cada gota contém íons de ambos os sinais. Somente o excesso de íons de um sinal se encontra disponível para evaporação e somente uma fração deles é que realmente evaporam.
gera somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico. operado a pressão atmosférica e temperatura ambiente.
limitada a baixo fluxo: 1-10 ml /min.
gera íons altamente carregados de compostos que possuam vários sítios de carga (peptídeos, oligonucleotídeos). Situação vantajosa para a observação de espécies de alto peso molecular onde cargas múltiplas produzem íons com valores de razão m/z na faixa de massas de um instrumento tipo quadrupolo, permitindo a determinação rotineira de pesos moleculares de compostos na faixa de kilodalton.
uma proteína de peso molecular de 15.000 adicionada de 15 prótons, por exemplo, tem uma razão massa/carga de 1000, sendo facilmente detectada por um quadrupolo.
Eleva a capacidade de se detectar e medir acuradamente o peso molecular de compostos que se encontram bem além da faixa de massa normal de um quadrupolo.
um espectro de massas por ESI de uma proteína é caracterizado por uma série de picos de íons carregando números diferentes de cargas (diferentes valores de massa/carga).
“Software” é disponível para converter a multiplicidade dos picos dos íons oriundo de cada espécie em um único pico correspondendo ao peso molecular da molécula neutra.
solventes típicos são Água/Metanol 50/50 ou Água/ Acetonitrila contendo 1-5% de ácido acético ou fórmico ;
concentração de proteína de 1-10pmol/ml.
ESI tem demonstrado futuro promissor na verificação de estruturas simples à caracterização de substâncias desconhecidas. Pode-se obter informações em detalhes estruturais de ordens maiores, isto é, mudanças na conformação induzida por solventes, na desnaturação refletida no grau de protonação, mudança hidrogênio/deutério e estabilidade CID.
Processo de emissão: mecanismo pelo qual íons podem ser emitidos de um líquido para a fase gasosa.
proposto inicialmente por Irebane e colaboradores em 1976. Quando uma gota carregada evapora no ar, um ponto crítico pode ser atingido no qual é cineticamente e energeticamente possível para os íons na superfície do líquido evapora para o ar.
Geração da gota: gotas podem ser formadas de vários modos, todos envolvendo o rompimento da superfície do volume de líquido com uma fonte de energia suficiente para sobrepor a energia da superfície. Em um nebulizador pneumático, uma velocidade alta do jato de ar forma gotas a partir do fluxo de líquido. Aplicação de um campo elétrico na extremidade do nebulizador auxilia na dispersão das gotas e gera uma carga líquida em cada gota.
ESI, um alto campo elétrico na superfície do líquido cria um stress elétrico, que gera gotas sem a necessidade de qualquer jato de gás.
Figura: Esquema de uma interface fonte iônica à pressão atmosférica-analisador de massas, utilizando uma cortina de gás, para minimizar a formação de adutos.
Figura: Espectros de massas utilizando Eletronspray como fonte iônica, da apomioglobina de cavalo (superior; com o espectro de massas deconvolucionado) e do dímero da albumina bovina (inferior).
IONSPRAY
Fonte de íons electronspray pneumaticamente assistido. Características
alta sensibilidade para compostos biológicos; íons moleculares sem degradação térmica; baixo consumo de amostra;
determinação de peso molecular na faixa de massa do kilodalton. Descrição
nova técnica idealmente útil para a introdução de compostos polares e termolábeis em um espectrômetro de massas;
é uma fonte de íons a pressão atmosférica, na qual íons pré-formados em solução são emitidos para a fase gasosa sem a aplicação de qualquer aquecimento.
íons quase-moleculares podem ser gerados de compostos lábeis e de alto peso moleculares sem degradação térmica;
o líquido contido na amostra é bombeado através de um pulverizador, o qual é mantido a uma alta voltagem de modo que uma neblina de gotas altamente carregadas são formadas;
com a evaporação das gotas, íons são ejetados para a fase gasosa por um processo de baixa energia, o qual não induz fragmentação;
compostos com um ou mais sítios de carga são observados com íons mono ou multicarregados como existiam na solução original
pode ser conectado a sistemas de CL, gerando um sistema CL/EM e permite que microvolumes de amostras sejam introduzidas a baixas velocidades de fluxo.
a baixa velocidade de fluxo e alta sensibilidade o torna útil para novos métodos de separação eletroforética como CZE, o qual vem se tornando altamente importante como técnica rotineira de separação bioquímica. Análises completas podem ser realizadas com picomole, ou menores quantidades de material, o que é útil quando somente se dispõe de pequena quantidade de amostra.
Geração de íons (mais comum): bombardeamento de moléculas gasosas com um feixe de elétrons.
Impacto de elétrons (70 eV) mistura de íons positivos e negativos e espécies neutras.
Íons positivos são direcionados para o analisador pela aplicação de voltagem positiva no
repeller. Focalização pela voltagem aplicada nas lentes.
Íons negativos e elétrons atraídos para um catodo positivo.
+
+
- + - + - +
+ - + - + -+
+ - +
+ - +
+ - + - +
+ -+ -+
+ - + - +
+ - +
+
+
-+-+
+
+
+
+
+
O processo de emissão
O processo de emissão
Gota original contém íons de ambas as polaridades sendo uma predominante Com a evaporação do solvente, o campo elétrico aumenta e os íons se movem para a superfície A um campo elétricocrítico, íons são emitidos da gota Resíduo involátil permanece como uma partícula seca
Figura: Esquema do processo de emissão que ocorre em uma fonte de íons tipo eletronspray.
Figura: Esquema representatio de uma interface CLAE/EM a pressão atmosférica do tipo Ionzpray (Eletronspray).
TERMOSPRAY
outro processo que cria gotas carregadas.
Operado a baixa pressão e temperatura elevada, a qual é necessária para o processo de pulverização e geração de carga, entretanto, leva a decomposição térmica de algumas espécies sensíveis.
O líquido é introduzido na fonte através de um tudo capilar, cuja extremidade é aquecida. Controlando a temperatura consegue-se ejetar pequenas gotas da extremidade do nebulizador.
Figura: Esquema de uma espectrômetro de massas com fonte iônica do tipo Termospray.
Termospray - Electrospray – Ionspray: como fontes de um espectrômetro de massas capaz de gerar íons pseudo-moleculares de compostos iônicos e polares, as três técnicas diferem em suas características. As diferenças se encontram principalmente em como as gotas são criadas e carregadas e como os íons são amostrados, do que como os íons são realmente gerados.
Electrospray e Ionspray: operados a pressão atmosférica e temperatura ambiente. Geram somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico. Podem gerar íons altamente carregados de compostos que possuem vários sítios de carga.
MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
• baseada na dessorção por laser de íons orgânicos, uma técnica inicialmente concebida no início dos anos 70.
• moléculas são dessorvidas e ionizadas com um pulso curto de fótons. Íons são gerados em um ponto, em termos de espaço e tempo, o que torna MALDI altamente compatível com um espectrômetro de massa com tempo de vôo.
• precedendo a análise, a amostra é misturada em um excesso molar de aproximadamente 1000 vezes com uma matriz apropriada de baixo peso molecular. Pequena quantidade é secada na sonda.
• é importante que o comprimento de onda do laser coincida com o máximo de absorção do composto da matriz. Este comprimento de onda não é absorvido pela molécula de interesse. • matriz serve para absorver a energia do laser e prevenir a decomposição das espécies de
interesse; isolar as biomoléculas uma das outras para evitar agregação que deve interferir na análise; aumentar a produção de íons.
• Matrizes: ácido nicotínico, ácido sinapínico (ácido trans-3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinâmico), ácido ferrúlico (ácido trans-3-metoxi-4-hidroxicinâmico), ácido cinâmico, ácido dihidroxibenzóico, dentre outros que possuem absorção intensa a 320-350nm.
• Laser: Nd-YAG (neódio-ítrio-alumínio-granada); nitrogênio; IR.
• a absorção da luz do laser leva a dessorção dos íons relacionados a matriz e a molécula intacta.
• íons produzidos são predominantemente de cargas z =+1 e z =+2
• Aplicações: a espectrometria de massas com ionização/dessorção a laser assistida por uma matriz tem emergido como um método de determinação do peso molecular de peptídeos e proteínas.
• oligonucleotídeos, oligossacarídeos, glicoconjugados, ligninas e polímeros sintéticos. • característica fascinante: faixa de massa prática extensa.
• útil na análise de proteínas simples como as conjugadas. Proteínas consistindo de subunidades ligadas não covalentemente podem ser desorvidas como se fossem uma só unidade:
• Exemplo: glicose isomerase: 4 subunidades idênticas.
• o espectro de massas utilizando ácido nicotínico como matriz é dominado pelo pico do tetrâmero. Utilizando ácido sinapínico, somente o íon molecular da subunidade monomérica é observado, possivelmente porque a solução dessa matriz denatura a proteína. Isto indica que a dessorção por laser pode refletir a conformação da molécula antes da dessorção.
• proteínas com pesos moleculares superior a 200.000Da tem sido analisadas, assim como um grande número de glicoproteínas.
• Gramicidina S sintetase: 512KDa
• Anticorpo: contém pouco ou nenhum pico que possa ser atribuído a fragmentos formados durante ou antes da dessorção.
• tolera impurezas das amostras comumente encontradas em amostras de origem biológicas, tais como sais e tampões.
• não é fácil de ser hifenado.
• o uso de MALDI-TOF-MS na caracterização de produtos naturais foi demonstrado pelo estudo de taxanos.
• a observação dos íons [M + H]+ , [M + Na]+ e [M + K]+ confirmam o peso molecular. Fragmentos correspondendo a perda de substituintes também é observado, gerando informações estruturais.
• melhores matrizes em termos de abundância e reprodutibilidade dos espectros foram 4-nitroanilina e 4-nitrofenol.
• menos de 5 min foram gastos na aquisição e calibração de um espectro de massas • foram examinados para dessorção a 337 nm.
• espectrômetro de massas com tempo de vôo linear. • fonte de laser a 337 nm, laser de nitrogênio .
• íons acelerados a 10KV e detectados utilizando um detector padrão de dual microchannel
plate. L a s e r M a tr iz c o n te n d o a a m o s tr a Í o n s D e te c to r
M a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
M a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
Figura: Espectro de massas da albumina sérica bovina obtida por analisador de massas do tipo tempo de vôo e laser para desorver e ionizar a molécula. Massa molecular de 66650 Daltons.
PDMS - Plasma Dessorption Mass Spectrometry
• dessorção por plasma foi desenvolvida por Macfarlane colaboradores em 1974;
• são empregados fragmentos decorrentes da fissão do elemento Califórnio (252 Cf → 142Ba18+ + 106Tc 22+ ) para ionizar compostos termolábeis.
• envolve exposição de uma amostra não volátil ao impacto com fragmentos de alta energia. • ionização obtida pelo impacto de íons primários com energia da ordem de 100MeV
• análise de massas é efetuada com tempo de vôo. 105 - 107 espectros são acumulados para se obter íons estatisticamente suficientes.
• não é possível utilizar EM-EM utilizando-se tubos de vôo retos. • acoplamento com técnicas de separação não é possível.
• Vantagens: tolerância a impurezas, sensibilidade e simplicidade. Estas estão relacionadas ao uso do suporte de nitrocelulose.
• tem sido útil na obtenção de pesos moleculares.
LIQUID SIMS
• espectrometria de massas de íons secundários.
• a ionização por “Liquid SIMS” (LSIMS) é obtida quando íons primários de Césio, acelerados a 30-35 kV colidem com uma amostra posicionada sobre uma superfície e são produzidos íons (íons secundários).
• ions secundários são produzidos como resultado do bombardeio de uma superfície (SIMS) ou de um filme de líquido (LSIMS) por um feixe de íons acelerados.
• tem sido utilizado para a análise da superfície de materiais inorgânicos (como SIMS) e, mais recentemente, para substâncias orgânicas pouco voláteis (como LSIMS)
• os resultados obtidos por FAB e LSIMS são comparáveis.
• sugere-se que LSIMS seja mais sensível devido à possibilidade de focalização para o feixe de íons de Césio.
V a c = 8 k V
+
+
+
V a c + 3 5 k V
C s
+C s
+C s
+Técnicas Hifenadas
• acoplamento em linha (“on-line”) de métodos é de grande potencial na química analítica. • seletividade da amostra pode ser ajustada , levando a uma maior velocidade de análise ou
uma melhora nos limites de detecção.
• técnicas hifenadas ⇒ acoplamento de um método de separação como a cromatografia com fase gasosa (CG), cromatografia com fluido supercrítico (SFC), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou métodos por eletromigração (eletroforese em zona capilar - CZE) com a espectrometria de massas.
• consiste em diferentes blocos ⇒ preparação da amostra, separação, interface, detecção e aquisição/manipulação dos dados.
• técnica de separação, interface e a técnica de ionização estão se tornando indistinguíveis como unidades separadas nos novos sistemas
CL/EM
• CLAE tem se tornado uma das técnicas mais utilizadas na análise de compostos orgânicos.
• tem vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois os compostos não precisam ser vaporizados para a análise, necessita-se menos pré-tratamento da amostra e tem maior grau de seletividade .
• limitação da CL é a ausência de um detector universal como o detector por ionização com chama na CG.
• EM gera especificidade, seletividade e sensibilidade e informação estrutural na análise de compostos orgânicos.
• a faixa de técnicas de ionização e a faixa de massa analisável, permite a análise de um grande número de compostos orgânicos.
• CL/EM é atualmente utilizada routineiramente. Permite análise quali e quantitativa.
Interfaceamento CL/EM
TSP - acoplamento com nebulizador aquecido
ESI - acoplamento e ionização por nebulização em um campo elétrico.
• interface de primeira geração como a de correia móvel se procura contornar a aparente incompatibilidade entre a introdução de um líquido em um alto vácuo pela remoção do líquido.
• interface de segunda geração, métodos de ionização brandas foram acoplados com a introdução dos líquidos, por exemplo: CF-FAB.
• sistema CL/EM de terceira geração, o interfaceamento e a ionização emergem como uma técnica combinada. O método de interfaceamento é simultaneamente uma técnica de ionização, como no caso do termospray e electrospray.
E s tr a té g ia d e In te r fa c e a m e n to C L /E M
E flu e n te d a C o lu n a N e b u liz a ç ã o D e sso lu ç ão d a g o ta Io n iz a ç ão n a fase g a so sa E v a p o ra ç ã o d o Ío n T S P , E S I, H N I Io n iz a ç ã o D ire ta C F -F A B R e m o ç ã o d o S o lv e n te S o lu to V a p o riza d o Io n iz a ç ã o M B I, P B IInterrelações entre a polaridade do soluto,
Interrelações entre a polaridade do soluto,
a interface e a
a interface e a
velocidade de fluxo permitida
velocidade de fluxo permitida
Apolar
Polar
Iônico
MBI PBI TSP , HNI CF-FAB ESI ESI
Faixa veloc. fluxo
ml/min µl/min Fase Reversa Fase Reversa (Fase Móvel (Fase Móvel Água/Metanol Água/Metanol (8:2) (8:2) Ion-exchange Ion-exchange Ion-par Ion-par Fase Normal Fase Normal (Fase Móvel (Fase Móvel ex. Hex./solv. ex. Hex./solv. Polar 9:1) Polar 9:1)
Interface CL/EM via Nebulizador Aquecido (interface ao API)
Características
aceita fluxo total de uma coluna de grande diâmetro sem a nessecidade de divisão fase móvel aquosa até 100% de água
velocidade de fluxo maior 1,0 ml/min
possibilidade de uso de tampões voláteis e não-voláteis
vaporização por pulverização de involáteis e compostos lábeis com o mínimo de degradação térmica
espectro simples ideal para EM/EM
pode ser utilizado para introdução rápida de amostra sem a CL.
sensibilidade
especificidade não voláteis e compostos
Cromatografia líquida está rapidamente se tornando o método de escolha na separação de compostos que não podem ser analisados por cromatografia gasosa devido a sua baixa volatilidade.
o eluente de uma coluna cromatográfica de grande diâmetro é introduzido diretamente na fonte API onde o líquido é pulverizado em um vaporizador aquecido brandamente.
rápida retirada do solvente e vaporização das gotas minimiza a decomposição térmica e preserva a identidade molecular para a ionização por transferência de próton na fonte APCI. introdução de toda a amostra da coluna resulta no limite de deteção na faixa do picograma. tampões são tolerados pela fonte a pressão atmosférica sem problemas de contaminação significante e a rápida vaporização do eluente pulverizado permite o uso de 100% de água.
Descrição da Interface
consiste em um pulverizador acoplado a uma câmara aquecida de dessolução/vaporização. o eluente flui através de um tubo de aço inoxidável de grande diâmetro diretamente a um nebulizador onde é convertido em uma neblina fina por um jato de ar ou nitrogênio a alta velocidade.
gotas são carreadas por uma capa de gás.
o gás aquecido (120oC) e a mistura da amostra fluem do tubo para a região de reação da fonte de API onde a amostra é quimicamente ionizada pela transferência de carga ou de próton pelos íons reagentes.
a fase móvel vaporizada atua como gás reagente, produzindo íons [M+H]+ no modo positivo e [M-H]+ no modo negativo.
a cortina de gás previne que qualquer solvente, amostra ou tampão entre a região do analisador e mantém o sistema de vácuo, lentes e os polos do quadrupolo sem contaminação.
moléculas agrupadas (“clustered”) são retiradas dos íons ao passarem pela cortina de gás e pelo orifício de amostragem atmosfera-vácuo.
a grande quantidade de solvente, amostra e tampão que são constantemente pulverizados para a fonte são carreados pelo fluxo de gás para fora da região de reação de 760 Torr. Uma bomba de ar é utilizada para bombear o gás para fora da fonte.
Vaporização da amostra
a incompatibilidade entre CL e EM tem sido a dificuldade de se converter moléculas relativamente não voláteis solvatadas em um líquido em uma molécula gasosa sem induzir decomposição excessiva.
processo nesta interface é um de se dispersar o fluxo de líquido na forma de pequenas gotas suspensas em um gás carreador.
a uma temperatura suficientemente alta, as gotas são vaporizadas a uma velocidade que permite que moléculas orgânicas intactas sejam dessorvidas das gotas ou partículas com o mínimo de decomposição térmica.
o processo de evaporação por pulverização rápida atua para preservar a identidade molecular de compostos involáteis e relativamente lábeis, para formar um vapor molecular no gás carreador útil para uma ionização química branda.
Ionização da amostra
as moléculas da amostra vaporizada são carreadas no fluxo de gás direto para uma região de reação íon-molécula a pressão atmosférica
a ionização primária cria íons reagentes do vapor do solvente o qual flui através da região. a probabilidade de fragmentações durante a ionização é pequena e resulta em íons moleculares e moleculares .Gera informações sobre o peso molecular e o domínio dos íons quase-moleculares é ideal para experimentos EM/EM onde se obtém informações estruturais.
(A) m/z 195
(B)
Figura: CLAE/EM utilizando ionização química a pressão atmosférica no modo negativo. Fragmentograma do íon m/z 195 e espectro de massas do 2,4,6-triclorofenol de uma amostra de água de rio. 100 150 200 250 m/z 0 100 % 21.00 21.75 22.50 23.25 24.00 24.75 25.50 tR 0 100 % 195 197 199
CG/EM
vem se tornando rotineiro desde a década de sessenta.
o acoplamento de um método de separação como a cromatografia com fase gasosa com a espectrometria de massas aumenta grandemente a especificidade da análise e a CG/EM é atualmente uma ferramenta rotineira na análise de misturas orgânicas complexas.
Aplicações: estudos estruturais, para compostos desconhecidos, análise de misturas (obter informações de muitos componentes ou identificar e quantificar alguns componentes).
Principais limitações: vaporização térmica da amostra seguida pela ionização na fase gasosa; somente moléculas apolares ou de média polaridade, termoestáveis e volatilizáveis são analisadas. Moléculas polares somente são analisadas via derivatizações.
Exemplo: açúcares, álcoois, ácidos, moléculas polifuncionalizadas.
maioria dos compostos de interesse biológico não se vaporizam ao serem aquecidos. Derivatizações se faziam necessárias.
problemas com as colunas empacotadas: baixas eficiências das colunas e grande tempos de retenção.
Colunas capilares permitem a separação de misturas com alta resolução. Desta forma, é possível analisar misturas cada vez mais complexas em espaços de tempo cada vez menores. As quantidades de amostra que podem ser injetadas nas colunas capilares são muito pequenas, acarretando a necessidade de injetores especiais e detectores mais rápidos e sensíveis.
o espectrômetro de massas pode ser acoplado diretamente ao cromatógrafo a gás, de modo que os componentes que eluem vão diretamente para a fonte de íons, que operam sob vácuo. Desta forma, uma parte da coluna trabalha em pressões baixas. Portanto, o controle do gás de arraste é mais crítico, havendo sempre alguma perda da eficiência da coluna.
Gases: hélio (melhor e mais caro) e Hidrogênio (explosivo e mais barato). Com estes gases as colunas capilares trabalham com maior eficiência de separação.
“SCAN”: velocidade de varredura dos espectros.
os tempos de varredura são suficientemente rápidos para permitir a obtenção de vários espectros de massas completos durante a eluição de um único pico (vários espectros de massas por segundo) na unidade de cromatografia com fase gasosa.
ideal é que sejam obtidos de 8 a 15 medidas de cada pico. Caso sejam efetuadas um número menor de medidas, pode-se perder informações do cromatograma, comprometendo a sua resolução.
Já um número excessivo de medidas pode provocar o acúmulo desnecessário de informações, saturando a capacidade do disco e tornando demoradas as operações de tratamento dos dados adquiridos.
Cromatogramas de massas ou fragmentogramas: são o registro da variação da intensidade correspondente aos íons de uma determinada relação m/z.
“SIM” : Monitoramento Seletivo de Íons - MSI.
descreve a operação na qual as intensidades de vários íons específicos são registrados ao invez do espectro de massas inteiro.
alta especificidade e sensibilidade de detecção podem ser obtidos para compostos escolhidos previamente.
Figura: Fração de hidrocarbonetos aromáticos do material particulado da atmosfera de Campos dos Goytacazes, amostrado em 21/11/97 no sítio Corpo de Bombeiros, centro da cidade.
(A) Cromatograma de íons totais (CIT);
Figura: Análise do extrato orgânico total de uma amostra de sedimento de um afloramento de Jundiaí, Bacia do Parnaíba (Maranhão):
(C) Cromatograma de íons totais (CIT);
(D) Fragmentograma m/z 219, pico base do reteno.
16.00 20.00 24.00 28.00 32.00
16.00 20.00 24.00 28.00 32.00
(A)
SUMÁRIO CG/EM
SUMÁRIO CG/EM
VARREDURA LINEAR
☺
PERFIL TOTAL DA AMOSTRA
☺
ESPECTRO DE MASSAS
DETECÇÃO DE COMPONENTES
TRAÇOS
MONITORAMENTO SELETIVO DE
ÍONS (MSI)
☺
DETECÇÃO SELETIVA
☺
DETECÇÃO DE COMPONENTES
TRAÇOS
☺
PERFIS DE DISTRIBUIÇÃO DE
FAMÍLIAS CONHECIDAS
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
GASOSA-ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DE MISTURAS COMPLEXAS
ANÁLISE DE MISTURAS COMPLEXAS
ENVOLVENDO
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA DE
MISTURAS COMPLEXAS
IONIZAÇÃO DE COMPOSTOS
SEPARADOS
SEPARAÇÃO DOS ÍONS
DETECÇÃO DOS ÍONS
Figura: Análise de uma mesma amostra contendo fenantreno e antraceno (mesma concentração, mesmo volume de injeção). Não se atenha a diferença no tempo de retenção. (A) fragmentograma m/z 178; (B) Monitoramento seletivo do íon m/z 178.
(A)
Figura: CG/EM-MSI, fragmentos m/z 191 e m/z 218, íons característicos de série de hopanos e αββ esteranos de fração de hidrocarbonetos alifáticos de amostra de petróleo de bacia brasileira.
CZE/MS
• Eletroforese de zona capilar (“CZE”) e a espectrometria de massas (“MS”) foram interfaceadas em 1987
• tem emergido como uma aquisição importante no campo da química analítica, combinando velocidade e alta eficiência de separação e baixo consumo de amostra gerado pela CZE, com a sensibilidade e universalidade da espectrometria de massas.
• CZE é uma técnica de separação de compostos iônicos em um tubo aberto pela aplicação de um gradiente de voltagem. Compostos migram diferentemente pelo tubo como resultado de sua mobilidade eletroforética. O fluxo eletroosmótico da CZE líquida é uma técnica instrumentalmente simples, utilizando normalmente um capilar de sílica fundida (50-100 cm)
20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 m/z 191 T21 T23 Ts H30 G H31 H33 H35 H29 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 m/z 218 C29αββ C28αββ C27αββ R S
