Baseia-se na transferência de espécies carregadas entre um íon reagente e a molécula alvo, produzindo um íon que pode ser analisado.Espécies formadas no modo positivo são normalmente adutos entre a molécula alvo e íons pequenos como H+, H3O+ e NH4+ e, no modo negativo, resulta da perda de prótons, captura de elétrons, dentre outros.
• espectros normalmente simples, com pouca ou nenhuma fragmentação;
• técnica bem sensível, pois a corrente de íons é concentrada em poucas espécies.
• realizada a altas pressões - relativa a utilizada no analisador de massas - e é extremamente eficiente em se produzir íons.
Gás Afinidade por Próton, kcal/mol
Helio 42
Metano 127
Vapor de água 167
Isobutano 195
Amônia 207
• se molécula for ionizada com pouco acréscimo de energia, fragmentação será reduzida e o íon molecular será mais abundante.
• impacto de elétrons de baixa energia aumenta o íon molecular mas há perda de sensibilidade. • IQ - basicamente a molécula está rodeada pelos íons reagentes e a carga passa para a
molécula por uma interação química sem muita transferência de energia.
• prótons ou mesmo entidades grandes carregadas podem ser adicionadas a molécula sem muita transferência de energia.
• gás reagente introduzido na fonte iônica (~0,5 - 1,0 Torr) a uma concentração de 104 :1 para a amostra e é ionizada pelo bombardeamento de elétrons (~500V).
• maioria dos íons, o gás reagente é ionizado por IE.
• o íon R+. inicialmente formado pode reagir com outra molécula de R para formar espécies iônicas reativas que depois ataca a molécula M da amostra.
R+. + R → RH+ + (R-H). ou RH. + (R-H)+ RH+ + M → R + MH+ (protonação)
(R-H)++ M → (R-2H) + MH+ (protonação) (R-H)++ M → R + (M-H)+ (abstração de hidreto) R+. + M → R + M+. (troca de carga)
• mais comum: protonação que é favorecida para moléculas com afinidade por próton maior do que o reagente.
• abstração de hidreto: comum para moléculas com baixos valores da afinidade por próton (alcanos).
• troca de carga: favorecido para reagentes de alta energia de ionização como hélio.
• energia interna da molécula ionizada resultante depende do reagente escolhido, temperatura da fonte e pressão.
• Exemplo: acetado de lavanduila (PA = ~8.7 eV); CH4 (PA= 5.7eV); (i-C4H8 = 8.5eV); (NH3 = 9.0eV)
• com metano: posterior fragmentação é quase completa para a espécie CH5+ altamente exotérmica.
• com amônia: pouca reação (fragmentação unimolecular)
• metano pelo bombardeamento por elétrons gera: CH4+, CH3+ , CH2+, CH+, C+ , H2+ , H+ , algumas mais abundantes do que outras.
• íons mais proeminentes, 95% do total: CH5+ , C2H5 + , C3H5 + . • CH4+
+ CH4 → C2H5+ + CH3
• C2H5+ + CH4 → C3H5+ + H2
• São extremamente reativos, podem atacar a molécula, passando a carga para elas.
• pode-se gerar (M + 1)+ , (M + 29)+, (M + 41)+, normalmente apresentam maior estabilidade do que o íon molecular por IE.
• Metano: baixo valor de afinidade por próton e é mais provável de se observar o íon molecular de um composto desconhecido do que utilizando-se isobutano ou amônia. É a primeira escolha para uma ionização química de aspecto geral, especialmente para amostras desconhecidas.
• desvantagem : alto grau de fragmentações.
• Amônia: alto valor de afinidade por próton. Previne fragmentações. Gás de difícil manipulação, pois é corrosivo.
• Isobutano: também tem aplicação geral. Tem maior afinidade por próton do que metano, menor grau de fragmentação (se ocorrer a ionização).
• Ionização Seletiva: técnica poderosa para compostos desconhecidos. Com a escolha adequada do gás reagente é possível ionizar seletivamente um composto em uma mistura complexa. Leva a um aumento significativo no limite de detecção.
• pode contornar problemas associados com a detecção e identificação de estereoisômeros. Diferença em isômeros é responsável por pouca diferença de energia.
• IQ: sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas para muitos compostos. Massa molecular pode ser identificado. Menor fragmentação, gerando espectros mais simples e mais fáceis de serem entendidos. Isômeros químicos e estereoisômeros podem ser distinguidos. Compostos podem ser seletivamente ionizados em misturas complexas. Informação obtida é complementar a IE.
• em adição aos gases, vapores como metanol podem promover a IQ.
• CL/EM: a fase líquida entra na fonte de íons, é vaporizada e se torna o reagente da IQ. • Alcanos: abundante [M - H]+
• Alcenos: duas séries de íons
• [CnH2n+1]+ , consistindo do íon [M+ H]+ e dos íons derivados deles;
• [CnH2n]+ , consistindo do íon [M -H ]+ e fragmentos de menor massa derivados dele. • observa-se também o M+. .
Figura: Espectros de massas do acetato de lavanduila por ionização química utilizando metano isobutano e amônia, respectivamente, como gás reagente.
Figura: Espectro de massas da Reserpina por impacto de elétrons e ionização química utilizando metano como gás reagente.
ELECTROSPRAY
nova e poderosa técnica de ionização, produzindo gotas altamente carregadas a partir de soluções.
método de se gerar gotas altamente carregadas das quais íons são ejetados pelo processo de evaporação.
Evaporação do íon: é um processo no qual íons são emitidos de gotas carregadas diretamente para a fase gasosa.
pulveriza-se um líquido contendo íons pré-formados na forma de gotas carregadas e emissão subsequente dos íons das gotas para a fase gasosa.
Electrospray e Ionspray: um campo elétrico é gerado na extremidade do pulverizador aplicando-se uma alta voltagem diretamente no pulverizador (4kV), com o contra-eletrodo
atraídos para as gotas pelo campo elétrico enquanto são separadas do líquido. A separação é incompleta e cada gota contém íons de ambos os sinais. Somente o excesso de íons de um sinal se encontra disponível para evaporação e somente uma fração deles é que realmente evaporam.
gera somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico. operado a pressão atmosférica e temperatura ambiente.
limitada a baixo fluxo: 1-10 ml /min.
gera íons altamente carregados de compostos que possuam vários sítios de carga (peptídeos, oligonucleotídeos). Situação vantajosa para a observação de espécies de alto peso molecular onde cargas múltiplas produzem íons com valores de razão m/z na faixa de massas de um instrumento tipo quadrupolo, permitindo a determinação rotineira de pesos moleculares de compostos na faixa de kilodalton.
uma proteína de peso molecular de 15.000 adicionada de 15 prótons, por exemplo, tem uma razão massa/carga de 1000, sendo facilmente detectada por um quadrupolo.
Eleva a capacidade de se detectar e medir acuradamente o peso molecular de compostos que se encontram bem além da faixa de massa normal de um quadrupolo.
um espectro de massas por ESI de uma proteína é caracterizado por uma série de picos de íons carregando números diferentes de cargas (diferentes valores de massa/carga).
“Software” é disponível para converter a multiplicidade dos picos dos íons oriundo de cada espécie em um único pico correspondendo ao peso molecular da molécula neutra.
solventes típicos são Água/Metanol 50/50 ou Água/ Acetonitrila contendo 1-5% de ácido acético ou fórmico ;
concentração de proteína de 1-10pmol/ml.
ESI tem demonstrado futuro promissor na verificação de estruturas simples à caracterização de substâncias desconhecidas. Pode-se obter informações em detalhes estruturais de ordens maiores, isto é, mudanças na conformação induzida por solventes, na desnaturação refletida no grau de protonação, mudança hidrogênio/deutério e estabilidade CID.
Processo de emissão: mecanismo pelo qual íons podem ser emitidos de um líquido para a fase gasosa.
proposto inicialmente por Irebane e colaboradores em 1976. Quando uma gota carregada evapora no ar, um ponto crítico pode ser atingido no qual é cineticamente e energeticamente possível para os íons na superfície do líquido evapora para o ar.
Geração da gota: gotas podem ser formadas de vários modos, todos envolvendo o rompimento da superfície do volume de líquido com uma fonte de energia suficiente para sobrepor a energia da superfície. Em um nebulizador pneumático, uma velocidade alta do jato de ar forma gotas a partir do fluxo de líquido. Aplicação de um campo elétrico na extremidade do nebulizador auxilia na dispersão das gotas e gera uma carga líquida em cada gota.
ESI, um alto campo elétrico na superfície do líquido cria um stress elétrico, que gera gotas sem a necessidade de qualquer jato de gás.
Figura: Esquema de uma interface fonte iônica à pressão atmosférica-analisador de massas, utilizando uma cortina de gás, para minimizar a formação de adutos.
Figura: Espectros de massas utilizando Eletronspray como fonte iônica, da apomioglobina de cavalo (superior; com o espectro de massas deconvolucionado) e do dímero da albumina bovina (inferior).
IONSPRAY
Fonte de íons electronspray pneumaticamente assistido. Características
alta sensibilidade para compostos biológicos; íons moleculares sem degradação térmica; baixo consumo de amostra;
determinação de peso molecular na faixa de massa do kilodalton. Descrição
nova técnica idealmente útil para a introdução de compostos polares e termolábeis em um espectrômetro de massas;
é uma fonte de íons a pressão atmosférica, na qual íons pré-formados em solução são emitidos para a fase gasosa sem a aplicação de qualquer aquecimento.
íons quase-moleculares podem ser gerados de compostos lábeis e de alto peso moleculares sem degradação térmica;
o líquido contido na amostra é bombeado através de um pulverizador, o qual é mantido a uma alta voltagem de modo que uma neblina de gotas altamente carregadas são formadas;
com a evaporação das gotas, íons são ejetados para a fase gasosa por um processo de baixa energia, o qual não induz fragmentação;
compostos com um ou mais sítios de carga são observados com íons mono ou multicarregados como existiam na solução original
pode ser conectado a sistemas de CL, gerando um sistema CL/EM e permite que microvolumes de amostras sejam introduzidas a baixas velocidades de fluxo.
a baixa velocidade de fluxo e alta sensibilidade o torna útil para novos métodos de separação eletroforética como CZE, o qual vem se tornando altamente importante como técnica rotineira de separação bioquímica. Análises completas podem ser realizadas com picomole, ou menores quantidades de material, o que é útil quando somente se dispõe de pequena quantidade de amostra.
Geração de íons (mais comum): bombardeamento de moléculas gasosas com um feixe de elétrons.
Impacto de elétrons (70 eV) mistura de íons positivos e negativos e espécies neutras.
Íons positivos são direcionados para o analisador pela aplicação de voltagem positiva no
repeller. Focalização pela voltagem aplicada nas lentes.
Íons negativos e elétrons atraídos para um catodo positivo.
+ -
+
- + - + - +
+ - + - + -+
+ - +
+ - +
+ - + - +
+ -+ -+
+ - + - +
+ - +
+ -
+ -
+-+
+
+
+
+
+
O processo de emissão
O processo de emissão
Gota original contém íons de ambas as polaridades sendo uma predominante Com a evaporação do solvente, o campo elétrico aumenta e os íons se movem para a superfície A um campo elétricocrítico, íons são emitidos da gota Resíduo involátil permanece como uma partícula seca
Figura: Esquema do processo de emissão que ocorre em uma fonte de íons tipo eletronspray.
Figura: Esquema representatio de uma interface CLAE/EM a pressão atmosférica do tipo Ionzpray (Eletronspray).
TERMOSPRAY
outro processo que cria gotas carregadas.
Operado a baixa pressão e temperatura elevada, a qual é necessária para o processo de pulverização e geração de carga, entretanto, leva a decomposição térmica de algumas espécies sensíveis.
O líquido é introduzido na fonte através de um tudo capilar, cuja extremidade é aquecida. Controlando a temperatura consegue-se ejetar pequenas gotas da extremidade do nebulizador.
Figura: Esquema de uma espectrômetro de massas com fonte iônica do tipo Termospray.
Termospray - Electrospray – Ionspray: como fontes de um espectrômetro de massas capaz de gerar íons pseudo-moleculares de compostos iônicos e polares, as três técnicas diferem em suas características. As diferenças se encontram principalmente em como as gotas são criadas e carregadas e como os íons são amostrados, do que como os íons são realmente gerados.
Electrospray e Ionspray: operados a pressão atmosférica e temperatura ambiente. Geram somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo elétrico. Podem gerar íons altamente carregados de compostos que possuem vários sítios de carga.
MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
• baseada na dessorção por laser de íons orgânicos, uma técnica inicialmente concebida no início dos anos 70.
• moléculas são dessorvidas e ionizadas com um pulso curto de fótons. Íons são gerados em um ponto, em termos de espaço e tempo, o que torna MALDI altamente compatível com um espectrômetro de massa com tempo de vôo.
• precedendo a análise, a amostra é misturada em um excesso molar de aproximadamente 1000 vezes com uma matriz apropriada de baixo peso molecular. Pequena quantidade é secada na sonda.
• é importante que o comprimento de onda do laser coincida com o máximo de absorção do composto da matriz. Este comprimento de onda não é absorvido pela molécula de interesse. • matriz serve para absorver a energia do laser e prevenir a decomposição das espécies de
interesse; isolar as biomoléculas uma das outras para evitar agregação que deve interferir na análise; aumentar a produção de íons.
• Matrizes: ácido nicotínico, ácido sinapínico (ácido trans-3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinâmico), ácido ferrúlico (ácido trans-3-metoxi-4-hidroxicinâmico), ácido cinâmico, ácido dihidroxibenzóico, dentre outros que possuem absorção intensa a 320-350nm.
• Laser: Nd-YAG (neódio-ítrio-alumínio-granada); nitrogênio; IR.
• a absorção da luz do laser leva a dessorção dos íons relacionados a matriz e a molécula intacta.
• íons produzidos são predominantemente de cargas z =+1 e z =+2
• Aplicações: a espectrometria de massas com ionização/dessorção a laser assistida por uma matriz tem emergido como um método de determinação do peso molecular de peptídeos e proteínas.
• oligonucleotídeos, oligossacarídeos, glicoconjugados, ligninas e polímeros sintéticos. • característica fascinante: faixa de massa prática extensa.
• útil na análise de proteínas simples como as conjugadas. Proteínas consistindo de subunidades ligadas não covalentemente podem ser desorvidas como se fossem uma só unidade:
• Exemplo: glicose isomerase: 4 subunidades idênticas.
• o espectro de massas utilizando ácido nicotínico como matriz é dominado pelo pico do tetrâmero. Utilizando ácido sinapínico, somente o íon molecular da subunidade monomérica é observado, possivelmente porque a solução dessa matriz denatura a proteína. Isto indica que a dessorção por laser pode refletir a conformação da molécula antes da dessorção.
• proteínas com pesos moleculares superior a 200.000Da tem sido analisadas, assim como um grande número de glicoproteínas.
• Gramicidina S sintetase: 512KDa
• Anticorpo: contém pouco ou nenhum pico que possa ser atribuído a fragmentos formados durante ou antes da dessorção.
• tolera impurezas das amostras comumente encontradas em amostras de origem biológicas, tais como sais e tampões.
• não é fácil de ser hifenado.
• o uso de MALDI-TOF-MS na caracterização de produtos naturais foi demonstrado pelo estudo de taxanos.
• a observação dos íons [M + H]+ , [M + Na]+ e [M + K]+ confirmam o peso molecular. Fragmentos correspondendo a perda de substituintes também é observado, gerando informações estruturais.
• melhores matrizes em termos de abundância e reprodutibilidade dos espectros foram 4- nitroanilina e 4-nitrofenol.
• menos de 5 min foram gastos na aquisição e calibração de um espectro de massas • foram examinados para dessorção a 337 nm.
• espectrômetro de massas com tempo de vôo linear. • fonte de laser a 337 nm, laser de nitrogênio .
• íons acelerados a 10KV e detectados utilizando um detector padrão de dual microchannel
plate. L a s e r M a tr iz c o n te n d o a a m o s tr a Í o n s D e te c to r
M a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
M a tr iz é o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
Figura: Espectro de massas da albumina sérica bovina obtida por analisador de massas do tipo tempo de vôo e laser para desorver e ionizar a molécula. Massa molecular de 66650 Daltons.
PDMS - Plasma Dessorption Mass Spectrometry
• dessorção por plasma foi desenvolvida por Macfarlane colaboradores em 1974;
• são empregados fragmentos decorrentes da fissão do elemento Califórnio (252 Cf → 142Ba18+ + 106Tc 22+ ) para ionizar compostos termolábeis.
• envolve exposição de uma amostra não volátil ao impacto com fragmentos de alta energia. • ionização obtida pelo impacto de íons primários com energia da ordem de 100MeV
• análise de massas é efetuada com tempo de vôo. 105 - 107 espectros são acumulados para se obter íons estatisticamente suficientes.
• não é possível utilizar EM-EM utilizando-se tubos de vôo retos. • acoplamento com técnicas de separação não é possível.
• Vantagens: tolerância a impurezas, sensibilidade e simplicidade. Estas estão relacionadas ao uso do suporte de nitrocelulose.
• tem sido útil na obtenção de pesos moleculares.