CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMATICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CATALASE
E TIROSINASE POR ELETROFORESE CAPILAR COM
DETECÇÃO UV/VIS E ESPECTROMETRIA DE MASSAS
RODRIGO DE COSTA
Florianópolis
Novembro/2020
Rodrigo de Costa
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA CATALASE E TIROSINASE POR ELETROFORESE CAPILAR COM DETECÇÃO UV/VIS E
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Relatório apresentado ao Departamento de Química
da Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial da disciplina de
Estágio II (QMC 5512)
__________________
Dr. Gustavo Amadeu Micke
Orientador
___________________
Bruno Cavagnoli
Coorientador
Florianópolis Novembro/2020Agradecimentos
Primeiramente agradeço a minha família e amigos pelo apoio e incentivo em todos esses anos.
A Universidade Federal de Santa Catarina aos seus professores e funcionários por tornar possível concluir essa importante etapa da minha vida.
Ao Laboratório de Eletroforese Capilar (LabEC) que proporcionou além do espaço físico oportunidade de desenvolver na prática esse trabalho.
Ao orientador Dr. Gustavo Amadeu Micke e ao coorientador Bruno Cavagnoli que conduziram o meu caminho do aprendizado e pelos ensinamentos.
Aos colegas do LabEC pela ajuda e por compartilharem seu precioso tempo e esforço, o que foi fundamental para a conclusão deste trabalho.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 11 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 13 2.1. Hiperpigmentação ... 13 2.1.1. Melanina ... 14 2.1.2. Tirosinase ... 15 2.2. Envelhecimento Capilar ... 16 2.2.1. Catalase ... 16 2.3. Eletroforese Capilar ... 17 2.3.1. Instrumento ... 18 2.3.2. Detectores ... 19
2.3.3. Eletroforese para análise de reação enzimáticas ... 20
2.3.4. Injeção Múltipla ... 20 2.3.5. Peróxido de Hidrogênio ... 21 3. OBJETIVOS ... 22 3.1. Objetivo Geral ... 22 3.2. Objetivos específicos ... 22 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 23 4.1. Instrumentação ... 23 4.2. Reagentes ... 23 4.3. Amostras e extratos ... 23
4.4. Preparo das soluções ... 24
4.5. Método utilizando injeção simples ... 25
4.6. Método utilizando estratégias de injeção múltipla ... 25
4.7. Segurança no Laboratório e Resíduos ... 25
5.1. Método da análise da atividade da enzima tirosinase pelo detector
(DAD)...26
5.1.1. Análise da tirosina utilizando Injeção simples ... 26
5.1.2. Injeção múltipla e teste do tempo de injeção do espaçador... 27
5.1.3. Curva de calibração da tirosina pelo método de injeção múltipla (DAD)... ... 28
5.1.4. Análise da amostra Cogumelo ... 31
5.2. Método da análise da atividade da enzima tirosinase pelo detector (CE-MS)... ... 35
5.2.1. Injeção simples para análise da tirosina e amostra de cogumelo .. 35
5.2.2. Curva de calibração da tirosina pelo método de Injeção múltipla .. 39
5.3. Método da análise da atividade da enzima catalase pelo detector (DAD).... ... 43
5.3.1. Injeção simples para análise do peroxido de hidrogênio ... 43
5.3.2. Teste da melhor concentração de eletrólito para o método ... 44
5.3.3. Análise da amostra de Batata ... 47
6. CONCLUSÃO ... 51
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema simplificado do caminho da melanogênese ... 14 Figura 2 - Mecanismo da atividade da monofenolase e da difenolase da tirosinase 15 Figura 3 - Instrumentação da Eletroforese capilar onde — R1 e R2 reservatórios com
eletrólito, e1 e e2 os eletrodos, F a fonte de alta tensão, D o detector, C o computador, EOF o fluxo eletrosmótico gerado no capilar... 18
Figura 4 - Fluxo Eletrosmótico ... 19 Figura 5 - Esquema de Injeção múltipla MISER. Onde: A – Analito 1; B - Analito 2; E
– Espaçador; D – Detector e EOF representa o fluxo eletrosmótico ... 21
Figura 6 - Preparação do extrato da mostra de cogumelo ... 24 Figura 7 - Preparação do extrato da amostra de batata ... 24 Figura 8 - Eletroferograma e espectro da tirosina 47,5 mg L-1. Onde pico1 – tirosina 47,5 mg L-1 ... 26
Figura 9 - Comparação dos eletroferogramas da Tirosina 47,5 mg L-1: método de injeção múltipla, variando o tempo de injeção do espaçador em A 5 s; B 10 s; C -15 s; D - 12 s. Onde pico 1 – padrão interno de tirosina 47,5 mg L-1 e pico 2 – analito tirosina 47,5 mg L-1 ... 27
Figura 10 - Eletroferogramas obtidos para a curva de calibração da tirosina. Onde
pico 1 - padrão interno (PI) tirosina 47,5 mg L-1, pico 2 - analito (AT) tirosina de concentração variada. ... 28
Figura 11 - Eletroferograma da tirosina 76 mg L-1 com integração dos picos. Onde pico 1 - padrão interno (PI) tirosina 47,5 mg L-1, pico 2 - Analito (AT) tirosina 76 mg L- 1 ... 29
Figura 12 - Comparação entre as curvas de calibração da tirosina. ... 30 Figura 13 - Eletroferograma e espectro da primeira análise do vial (1) com o extrato
de cogumelo. Onde os picos 1 e 2 são referentes ao sinal da amostra de cogumelo ... 31
Figura 14 - Eletroferograma e espectro da segunda análise do vial (1) com extrato de
cogumelo e 50 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a amostra de cogumelo ... 32
Figura 15 - Eletroferograma e espectro da terceira análise do vial (1) com extrato de
cogumelo e 100 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a amostra de cogumelo ... 32
Figura 16 - Eletroferograma e espectro da quarta análise do vial (1) com extrato de
cogumelo e 150 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a amostra de cogumelo ... 33
Figura 17 - Comparação entre os eletroferogramas das Figuras 13, 14, 15 e 16. Onde
os picos 1 e 2 são referentes a amostra de cogumelo ... 33
Figura 18 - Eletroferograma e espectros dos picos da análise do vial (1) com extrato
de cogumelo e 150 µL solução de tirosina, utilizando injeção múltipla. Onde picos 1 e 2 – referentes a amostra de cogumelo; pico 3 – padrão interno tirosina 47,5 mg L-1 34
Figura 19 - Eletroferograma da tirosina 47,5 mg L-1 ... 35
Figura 20 - Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo. ... 36 Figura 21 - Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da
solução de tirosina 47,5 mg L-1 ... 37
Figura 22 - Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da
solução de tirosina 47,5 mg L-1 após 1h ... 37
Figura 23 - Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da
solução de tirosina 47,5 mg L-1 após 2 h. ... 38
Figura 24 - Comparação do eletroferogramas das figuras 23 e 22 ... 38 Figura 25 - Eletroferograma da injeção múltipla da tirosina 47,5 mg L-1. Onde pico 1 – padrão interno; pico 2 – analito. ... 39
Figura 26 - Eletroferogramas obtidos para a curva de calibração. Onde pico 1 –
Padrão interno tirosina 47,5 mg L-1; pico 2 – Tirosina de concentração variada. ... 40
Figura 27 - Curva de calibração para a tirosina usando a área corrigida. ... 41 Figura 28 - Eletroferograma da análise do extrato de cogumelo pelo método da curva
de calibração. Onde pico 1 – Padrão interno tirosina 47,5 mg L-1; pico 2 – Analito extrato de cogumelo. ... 42
Figura 29 - Eletroferograma da água destilada ... 43 Figura 30 - Eletroferograma do peroxido de hidrogênio 150 mg L-1. Onde pico 1 – peróxido de hidrogênio. ... 44
Figura 31 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 5 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio ... 45
Figura 32 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 10 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio ... 45
Figura 33 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 20 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio ... 46
Figura 34 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 30 mmol L-1. Onde pico 1 - complexo de peróxido de hidrogênio ... 46
Figura 35 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 40 mmol L-1. Onde pico 1 - complexo de peróxido de hidrogênio ... 47
Figura 36 - Eletroferograma do vial (1) com extrato batata. Onde pico1 e 2 são
referentes ao sinal da amostra de batata ... 48
Figura 37 - Eletroferograma do vial (2) com extrato de batata + 50 µL de peróxido de
hidrogênio 450mgL-1. Onde pico 1 - referente ao complexo de peroxido de hidrogênio formado; pico 2 - referente ao sinal da amostra de batata. ... 48
Figura 38 - Eletroferograma do vial (3) com extrato de batata + 150 µL de peróxido de
hidrogênio 450mgL-1. Onde pico 1 - referente ao complexo de peroxido de hidrogênio formado; pico 2 - referente ao sinal da amostra de batata. ... 49
Figura 39 - Comparação dos eletroferogramas do vial (3) em diferentes tempos: A –
inicial; B – após 30 min; C – após 1 h. Onde pico 1 – Referente ao complexo e peroxido de hidrogênio ... 50
LISTA DE ABREVIATURAS
LabEC – Laboratório de Eletroforese capilar
CE – Eletroforese capilar (do inglês capillary electrophoresis) EOF – Fluxo eletrosmótico (do inglês Electroosmotic Flow) DAD – Detector de arranjo de diodos
UV-vis – Ultravioleta-Visível
CE-MS – Eletroforese capilar acoplada a detector de espectrômetro de massa TBS – Tetraborato de Sódio
EMMA – Microanálises mediadas por eletroforese capilar (do inglês electrophoretically mediated microanalysis)
EPIs – Equipamento de proteção individual PI – Padrão Interno
AT – Analito
LOD – Limite de detecção LOQ – Limite de quantificação
MISER – Injeção Múltipla em única corrida experimental (do inglês multiple-injection in a single experimental run)
O estudo sobre a atividade das enzimas catalase e tirosinase e a sua a utilização na área da cosmetologia, se desenvolve à medida que aumenta a busca para atingir os padrões de beleza estabelecidos pela sociedade, pois a atividade das enzimas estão relacionadas a problemas estéticos como a hiperpigmentação da pele e a despigmentação capilar. No presente trabalho foram desenvolvidos métodos para análise da atividade das enzimas tirosinase e catalase utilizando eletroforese capilar acoplada a diferentes detectores. Para a atividade da tirosinase, o método teve como base o consumo da tirosina para a formação de L-dopa. Utilizaram-se dois diferentes detectores, o detector de arranjo de diodos UV-vis (DAD) e o espectrômetro de massas (CE-MS) para realizar as análises, com ambos foi possível detectar o sinal da tirosina. Fez-se uso de estratégias de injeção múltipla com o intuído de minimizar o erro de injeção da técnica. Foi utilizado a relação sinal-ruído para o cálculo do Limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ). O método utilizando o detector DAD apresentou um LOD de 1,52 mg L-1 e LOQ de 4,56 mg L-1, enquanto o método utilizando o detector CE-MS apresentou um LOD de 0,043 mg L-1 e LOQ de 0,13 mg L-1. Realizou-se a análise de uma amostra de cogumelo, que não apresentou atividade da enzima tirosinase. Para a atividade da catalase, o método teve como base a determinação do consumo do peróxido de hidrogênio pela atividade da enzima para a formação de água e oxigênio. Utilizou-se o tetraborato de sódio para a formação de um complexo de peroxido de hidrogênio para a detecção direta utilizando o detector de arranjo de diodos UV-vis. Este mostrou a capacidade de detectar o sinal do peróxido de hidrogênio. O método foi aplicado para a análise de uma amostra de batata, que não apresentou atividade da enzima catalase.
1. INTRODUÇÃO
O setor brasileiro de Higiene pessoal, Perfumaria e Cosméticos apresentou amplo crescimento nas últimas duas décadas, com índice de crescimento deflacionado superior a 10% ao ano, segundo a Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos (ABIHPEC). Entre 2009 e 2016, o segmento de HPPC (Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos) recebeu cerca de 645 mil novos MEI e mais 26 mil Microempresas (ME). Dados da ABIHPEC mostram que a venda direta garantiu trabalho para 3,99 milhões de pessoas em 2017.
Tendo em vista o crescente uso de produtos químicos nestes ramos da economia, destaca-se a importância da Química Analítica para as indústrias das áreas de cosméticos e HPPC, considerando a necessidade de atestar a qualidade, a eficácia e a segurança destes produtos além de atender às exigências das agências de regulação. A preocupação em cuidar da aparência, principalmente da pele e do cabelo, tem levado a um aumento na venda de produtos de beleza. Nesse contexto, tem ocorrido também um aumento do interesse do uso das enzimas catalase e tirosinase na formulação de novos produtos.
Uma categoria de cosméticos muito utilizada são os clareadores de pele para o tratamento de problemas relacionados ao excesso de produção da melanina como: melanoma, melasma, sardas e manchas escuras de idade. Que estão relacionados a atividade enzimática da tirosinase, pois possui uma grande importância no processo da melanogênese para a síntese da melanina. Produtos para o clareamento cutâneo para o tratamento das manchas escuras na pele são normalmente baseados na inibição da atividade da tirosinase para reduzir o nível de pigmentação da pele. Outra preocupação relacionada a estética são os cabelos brancos, sendo um dos fatores a diminuição da atividade da enzima catalase com a idade, assim o corpo tem um aumento de peróxido de hidrogênio, sendo esse um dos principais fatores na descoloração do cabelo.
Tendo em vista a importante relação das enzimas com a área da cosmetologia, torna-se interessante o desenvolvimento de produtos que apresentem estas atividades enzimáticas. Uma importante técnica em constante desenvolvimento que pode ser utilizada para este fim é a eletroforese capilar (CE, do inglês capillary electrophoresis). A CE apresenta vantagens como baixo tempo de análise, pequenas quantidades de amostra, reagentes e solventes, além da possibilidade de completa
automação. Com o interesse comercial no estudo das enzimas as vantagens da técnica são atrativas.
O trabalho consiste primeiramente no desenvolvimento de métodos analíticos utilizando eletroforese capilar para a determinação da atividade da tirosinase, para dois tipos de detectores, arranjo de diodos UV-vis e Espectrômetro de massas, utilizando injeções simples e múltiplas. Foi desenvolvido também um método com detector de arranjo de diodos UV-vis para a atividade da enzima catalase.
2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Hiperpigmentação
Hiperpigmentação é um termo utilizado para descrever o escurecimento irregular da pele ocasionado pelo excesso de produção de melanina, que é a causa de condições de pele como a ceratose seborreia e melasma, que são manchas escuras que aparecem nas áreas de maior exposição ao sol.1 Outro exemplo é a hiperpigmentação pós-inflamatória, em que manchas escuras irregulares aparecem nas áreas da pele que sofreram alguma inflamação ou lesão como acne, dermatite, queimaduras e cortes. Existe ainda a hiperpigmentação induzida por drogas, que é causada por medicamentos, geralmente temporária, ou seja, as manchas somem após o uso do medicamente ser suspenso. Esta pode ser difusa, cobrindo várias áreas do corpo, ou focal, afetando somente uma área específica. A hiperpigmentação também pode ser um sintoma de doenças autoimunes, gastrointestinais, câncer de pele e diversas outras. Tais condições são muito comuns afetando a maioria da população independentemente do tipo de pele.1,2
Condições relacionadas a hiperpigmentação são em sua maioria benigna e não prejudiciais à saúde. 3 Entretanto, existe maior preocupação em relação à estética, tendo uma alta demanda para o tratamento. Existe uma dificuldade para o tratamento devido às diversas causas e formas que a hiperpigmentação pode ter. Os tratamentos normalmente são de baixa eficiência, não conseguindo remover as manchas completamente ou removendo-as apenas temporariamente. 1,2,3
Existe um interesse pela pesquisa e desenvolvimento de novas tecnologias para a elaboração de produtos mais eficazes e o oferecimento de uma maior variedade de métodos, com o intuito de expandir o mercado de tratamento da hiperpigmentação. 3 O tratamento pode ser realizado através de medicamentos, produtos cosméticos ou procedimentos dermatológicos. Uma das principais formas de tratamento se dá através da inibição da atividade dos melanócitos, para a diminuição da síntese de melanina. Logo, entender a atividade da enzima tirosinase tem grande importância devido ao seu papel fundamental na melanogênese. 1,3
2.1.1. Melanina
Na camada basal da epiderme da pele dos seres humanos, encontram-se as células chamadas de melanócitos, que contêm melanossomos, nos quais a síntese e armazenamento da melanina acontece. Estes são responsáveis pelo transporte de melanina para as células encontradas na epiderme da pele.4 A melanina produzida tem como principal função a pigmentação da pele, cabelo, e olhos, e serve para a proteção contra raios UV provindos da radiação solar. Existem duas principais classes de melanina produzidas por seres humanos, sendo elas a eumelanina, de coloração marrom escuro ou preto, e a feomelanina, de coloração vermelho amarelado. Ambas são sintetizadas a partir da dopaquinona. 4,5,6
A melanogênese é o processo no qual os melanócitos vão produzir a melanina (Figura 1). 7, 13
Figura 1 – Esquema simplificado do caminho da melanogênese
Fonte: CICHOREK et al. (2013)13
A tirosina serve como material de partida para a biossíntese da melanina. A enzima tirosinase irá realizar a oxidação da tirosina para L-dopa, que é convertido novamente pela tirosinase para dopaquinona, que pode ser espontaneamente convertido para dopachrome. A partir do dopachrome serão formados numerosos intermediários que irão formar a melanina. A tirosinase é responsável pela etapa
2.1.2. Tirosinase
A tirosinase também é encontrada em outros mamíferos, além de plantas, frutas e fungos, como a batata, maçã e cogumelos. Em cada espécie a enzima apresenta diferentes propriedades estruturais, entretanto todas possuem um sítio ativo composto de dois átomos de cobre, com cada um coordenado a três resíduos de histidina, que é capaz de formar ligações com oxigênio (O2). 9
Os três estados funcionais da tirosinase são o met, oxi e desoxi.10 A met-tirosinase é normalmente a forma nativa da enzima, que possui dois átomos de Cu (II) em seu centro ativo, ligados a um ou dois grupos hidroxila. Na forma desoxi, ambos os átomos de cobre se apresentam na forma de Cu (I). Na forma oxi, os átomos de oxigênio na forma peróxido estão ligados aos dois átomos de Cu (II). 9,10
O mecanismo catalítico da tirosinase (Figura 2) acontece da seguinte forma: a met-tirosinase oxida o difenol e é reduzida, convertendo-se em desoxi-tirosinase, que reage com o oxigênio e converte-se em oxi-tirosinase, capaz de oxidar mono e difenóis, formando orto-quinonas. Este é o processo realizado pela enzima na melanogênese. 11,12
Figura 2 - Mecanismo da atividade da monofenolase e da difenolase da tirosinase
2.2. Envelhecimento Capilar
Um importante fator estético para a maioria das pessoas é a aparência do cabelo, sendo que o aparecimento de fios grisalhos apresenta uma grande preocupação. O envelhecimento capilar afeta a coloração, produção e força dos fios. As causas em relação ao envelhecimento podem ser intrínsecas, ou seja, relacionadas a fatores genéticos, ou fatores externos, que estão relacionados ao estilo de vida como fatores ambientais, a alimentação, utilização dos produtos químicos, estresse, etc. É um processo natural que afeta pessoas de diversas idades. 14, 15,16
O cabelo grisalho está relacionado ao envelhecimento dos folículos capilares, resultando em uma diminuição da atividade dos melanócitos, que resulta em menor produção de melanina, a qual proporciona pigmento aos fios de cabelo. A atividade da enzima catalase também está relacionada a despigmentação capilar. Devido ao envelhecimento ocorre uma diminuição em sua atividade, resultando em um acúmulo de peróxido de hidrogênio, o que causa a descoloração dos fios. 14, 15,16
A forma mais comum de combater a despigmentação capilar é a utilização de tinturas. Porém, com o aumento de mercado em busca de solução para o envelhecimento capilar, a área da cosmetologia busca apresentar uma maior variedade de produtos com o intuito de retardar, diminuir e até mesmo reverter os seus efeitos. Assim, o estudo da atividade enzimática da catalase é de grande interesse.16
2.2.1. Catalase
Encontra-se a catalase em diversas células de animais, plantas, fungos e bactérias. 17 Sua atividade enzimática é responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio (Esquema 1). Isso serve como uma proteção, uma vez que o peróxido é tóxico para as células, devido à sua capacidade de oxidação de proteínas e lipídios de membranas. 17, 19
Esquema 1: Decomposição do peróxido de hidrogênio
2 H2O2 Catalase 2H2O + O2 Fonte: NICHOLLS et al. (2000)17
A enzima catalase pode ser classificada em três tipos: monofuncional, peroxidasse e pseudocatalase, sendo o tipo mais comum a monofuncional,
encontrada em mamíferos, plantas e fungos.A sua estrutura é um tetrâmero com quatro subunidades, sendo que cada uma contém um grupo heme. O mecanismo da ação da catalase é dividido em dois estágios, como apresentado no Esquema 2. 17
Esquema 2 – Ação da catalase
1. Enz(Por-FeIII) + H2O2 → Comp I (Por+-FeIV=O) + H2O 2. Comp I (Por+-FeIV=O) + H2O2 → Enz(Por-FeIII) + H2O + O2
Fonte: NICHOLLS et al. (2000)17
O primeiro estágio inicia com a reação do peróxido de hidrogênio em que o ferro (FeIII) do grupo heme é oxidado, formando um composto I (Comp I) intermediário, sendo um cátion radical porfirina (Por+) e a espécie (FeIV =O). No segundo estágio, o composto I altamente oxidante reage com outra molécula de peróxido de hidrogênio, que reduz o composto e, assim, regenera a enzima (Enz), formando também água e oxigênio. 17,18, 19
2.3. Eletroforese Capilar
A eletroforese é uma técnica analítica de separação desenvolvida pelo químico sueco Arne Tiselius na década de 30 em sua tese sobre a separação das proteínas do soro sanguíneo. A técnica baseia-se na diferença de migração de espécies neutras, iônicas ou ionizáveis quando submetidas a ação de um campo elétrico. 20
Um dos problemas apresentados pela técnica é o calor gerado pela passagem da corrente pelo condutor, chamado de efeito joule, que devido a uma ineficiente dissipação de calor, faz com que o gradiente de temperatura e a temperatura do sistema aumentem. Isso resulta em problemas na separação, como uma baixa resolução e eficiência, pois afeta a mobilidade dos analitos, sendo necessário utilizar voltagens mais baixas para minimizar o efeito, o que resulta em tempos de análises maiores. 21
Com base nesses problemas, na década de 80 foi desenvolvida a eletroforese capilar por Jorgenson e Lukacs, que permite a separação ocorrer em tubos capilares, conseguindo dissipar o calor gerado com maior eficiência. Isto permite o uso de voltagens mais elevadas, aumentando a resolução e eficiência, e diminuindo o tempo de análise, além do baixo consumo de amostra. 20,21
2.3.1. Instrumento
O equipamento da eletroforese capilar (Figura 3) é composto de uma fonte de alta tensão, que serve para gerar um campo elétrico. Esta está ligada aos eletrodos, que estão conectados aos reservatórios que contém o eletrólito adequado. O capilar de sílica fundida é preenchido pela injeção do eletrólito. Quando aplica-se uma diferença de potencial no capilar preenchido, é gerado um fluxo eletrosmótico capaz de arrastar o analito até a janela de detecção presente no capilar, onde o sinal é detectado e registrado no computador, que está ligado ao detector para a obtenção de dados. 20,22
Figura 3 - Instrumentação da Eletroforese capilar onde — R1 e R2 reservatórios com eletrólito, e1 e e2 os eletrodos, F a fonte de alta tensão, D o detector, C o
computador, EOF o fluxo eletrosmótico gerado no capilar.
Fonte: SPUDEIT et al. (2012)20
Os capilares utilizados geralmente são de sílica fundida, de diâmetro interno entre 15 a 100 µm e apresentam boa condutividade térmica e transparência na região do UV-Vis. 22 Na camada interna do capilar existem grupos silanóis (−SiOH) que apresentam caráter ácido na camada interna do capilar e são responsáveis pela geração do fluxo eletrosmótico (EOF, do inglês Electroosmotic Flow). 20 Em contato com soluções de pH acima de 3, alguns desses grupos são ionizados, fazendo com
que a camada interna do capilar se torne negativa quando um campo elétrico é imposto. Forças elétricas causam um movimento nos cátions da camada interna, que são atraídos ao eletrodo negativo e uma vez que estão solvatados arrastam o solvente.
O fluxo eletrosmótico (Figura 4) normalmente possui uma vazão capaz de arrastar íons individuas de espécies positivas, neutras e negativas até o detector. Mesmo que os analitos com carga consigam migrar dentro do capilar, a vazão do fluxo é normalmente maior. No capilar existe o plano de cisalhamento, que é a região entre a fase imóvel ligada à camada interna do capilar e a fase móvel. 20,22
Figura 4 - Fluxo Eletrosmótico
Fonte: SPUDEIT et al. (2012)20 2.3.2. Detectores
Na eletroforese capilar podem-se utilizar diversos detectores, entre os mais utilizados estão espectrofotômetro UV-vis e o espectrômetro de massa. 20
A detecção por UV-vis pode ser realizada por modo direto ou indireto. No modo direto o analito pode ser detectado somente se apresentar absorção na região do UV-vis. No modo indireto, o analito não apresenta absorção na região UV-vis e se utiliza um agente cromóforo no eletrólito de corrida. 20
O espectrômetro de massa envolve a conversão do analito em íons gasosos, separando-os de acordo com a sua relação massa/carga, e então registra a abundância relativa de cada tipo de íon. A vantagem em relação aos detectores de UV-vis é a sua maior sensibilidade e capacidade de fornecer informações em relação a estrutura dos analitos. (ASSUNCAO et a. 2008).
2.3.3. Eletroforese para análise de reação enzimáticas
Na eletroforese capilar existem dois modos de analisar reação enzimáticas, off-line e onoff-line, que dependerá se a reação enzimática ocorrerá no equipamento de análise ou fora. 23 No modo online, também chamado de microanálises mediadas por eletroforese capilar (EMMA, do inglês electrophoretically mediated microanalysis), a reação enzimática ocorre no capilar utilizado para análise. Nesse caso os componentes são injetados como plugs e são misturados dentro do próprio capilar. No modo off-line, a reação enzimática é realizada fora do capilar, em um recipiente que se realiza a misturas dos reagentes, depois é realizada a incubação da mistura e após um determinado tempo se faz a análise. Porém, diferente do modo online, só é possível realizar a análise dos substratos e produtos separadamente. 23
2.3.4. Injeção Múltipla
Na eletroforese capilar existe a possibilidade de utilizar estratégias de injeção múltipla, que fornecem a capacidade de analisar múltiplos analitos em uma única corrida experimental. 29,32
Uma estratégia utilizada é conhecida como MISER (Figura 5). Esta possui como princípio a utilização de um espaçador de eletrólito entre as injeções de distintas amostras, causando um deslocamento no sinal obtido e permitindo a análise de cada amostra injetada em diferentes regiões do eletroferograma. O deslocamento do sinal no eletroferograma está diretamente relacionado ao tamanho do espaçador de eletrólito utilizado.29,32
Figura 5 - Esquema de Injeção múltipla MISER. Onde: A – Analito 1; B - Analito 2; E – Espaçador; D – Detector e EOF representa o fluxo eletrosmótico
Fonte: Autor. 2.3.5. Peróxido de Hidrogênio
A molécula de peróxido de hidrogênio absorve luz em comprimentos de onda na região do Ultravioleta com faixa de 220nm a 185nm (SHIHABI et al. 2006). Entretando, o sinal é muito fraco para ser detectado de forma direta. Logo, faz-se necessário a utilização de uma solução tampão borato para realizar a análise do peróxido de hidrogênio no modo de detecção direta com o detector UV-vis. 25
A complexação do peróxido de hidrogênio com o tetrahidroxiborato (Esquema 3) forma um ânion peroxoborato que possui uma melhor absorção na mesma faixa, sendo possível realizar a detecção de forma direta. 26
Esquema 3: Reação do peróxido de hidrogênio e ácido bórico.
B(OH)4- + H2O2 → B(OH)3(OOH)- + H2O Fonte:ADAMS et al. 1983 26.
Com o desenvolvimento de um método para determinação de peróxido de hidrogênio por CE é possível determinar a atividade da catalase acompanhando o consumo deste em função do tempo.
3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral
Desenvolver métodos analíticos para a determinação da atividade enzimática da catalase e tirosinase utilizando eletroforese capilar.
3.2. Objetivos específicos
Analisar a atividade da catalase e tirosinase por eletroforese capilar com detecção direta em UV-vis.
Analisar a atividade tirosinase por eletroforese capilar acoplada a um detector de espectrômetro de massas.
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Instrumentação
Utilizaram-se dois modelos de equipamento de eletroforese capilar acoplados a diferentes detectores, sendo estes:
Eletroforese capilar modelo 3D HP, acoplado a um detector de arranjo de diodos UV-vis (DAD), utilizando-se um capilar de sílica fundida (Polymicro Technologies) de diâmetro interno 75 μm, com comprimento total de 48,5 cm e comprimento efetivo de 40 cm.
Eletroforese capilar 7100 da marca Agilent Technologys, acoplado a um detector de espectrômetro de massa (CE-MS) modelo quadruplo simples 6120 com bomba e desgaseificador do líquido auxiliar modelo 1260 infinity da marca Agilent Technologies, utilizando-se um capilar de sílica fundida (Polymicro Technologies) com diâmetro interno de 75 μm, comprimento total e efetivo de 80 cm.
Utilizaram-se em ambos os equipamentos o software ChemStation para a aquisição e tratamento dos dados.
4.2. Reagentes
Utilizaram-se os reagentes: tetraborato de sódio (TBS), L-tirosina e ácido fórmico da marca Sigma Aldrich, peróxido de hidrogênio da marca LabSynth, hidróxido de sódio da marca LabSynth e água deionizada em sistema Milli-Q.
4.3. Amostras e extratos
A amostra de cogumelo foi escolhida para análise da atividade da tirosinase. Um extrato foi preparado conforme a Figura 6. A amostra de cogumelo (Agaricus bisporus) foi comprada no dia 25 de outubro de 2020, da marca João e Maria com peso líquido de 200g. O extrato da amostra foi preparado pesando 77,331 g do cogumelo, que foi processado em 93 mL de água deionizada utilizando-se um mixer de mão da marca Britânia.
Figura 6 – Preparação do extrato da mostra de cogumelo
Fonte: Autor.
Uma amostra de batata foi escolhida para realizar análise da atividade da catalase. Preparou-se o extrato conforme a Figura 7. A amostra de batata (Solanum tuberosum L.) foi comprada em 27 de outubro de 2020 com peso de 180g. O extrato da amostra foi preparado descascando o tubérculo e pesando 5,0 g. Este foi processado em 10 mL de água deionizada utilizando-se um mixer de mão e em seguida filtrado com um papel de filtro.
Figura 7 - Preparação do extrato da amostra de batata
Fonte: Autor. 4.4. Preparo das soluções
O eletrólito foi escolhido de acordo com o detector. Para o detector de arranjo de diodos UV-vis foi utilizada uma solução de tetraborato de sódio 100 mmol L-1 em água e adicionadas alíquotas de NaOH 1 mol L-1 até atingir o pH 9,1. Depois diluiu-se em vários volumes de água para obter soluções com diferentes concentrações. Para
o detector de espectrômetro de massas foi utilizado como eletrólito uma solução estoque de ácido fórmico em água com concentração de 1,0 mol L-1, em um pH de 1,8.
A solução de tirosina foi preparada em água com concentração de 1000 mg L- 1 utilizando-se uma gota de NaOH 100 mmol L-1 para homogeneizar e então diluiu-se em diferentes volumes de água para obter as diversas soluções com concentrações desejadas. Para preparar a solução de peróxido de hidrogênio utilizou-se a solução estoque com concentração de 1500 mg.L-1 e depois diluiu-se com água para a concentração desejada.
4.5. Método utilizando injeção simples
Foi realizada uma injeção automática do analito. Sendo que para análise algumas condições foram mantidas fixas: Tempo de injeção de 3 s, pressão de 50 mbar e temperatura de 25º C. O eletrólito foi escolhido de acordo com o detector.
4.6. Método utilizando estratégias de injeção múltipla
Foram realizadas três injeções automáticas, que ocorrem em sequência, em uma pressão de 50 mbar e temperatura de 25º C. A primeira injeção foi feita com tempo de 3,0 s e injetou-se o padrão interno tirosina com contração de 47,5 mg L-1. A segunda injeção foi o espaçador com tempo de 12,0 s, sendo este o próprio eletrólito escolhido. A terceira injeção foi o analito, com tempo de 3,0s. O eletrólito foi escolhido de acordo com o detector e o padrão interno conforme o analito.
4.7. Segurança no Laboratório e Resíduos
Foram seguidas as normas e regras do manual de regras básicas de segurança para Laboratórios de Química do Departamento de Química da UFSC. O vestuário utilizado foi calça comprida, sapato fechado e jaleco. Os experimentos foram realizados com o equipamento de proteção individual (EPIs), sendo estes luvas e óculos de proteção. Também foi utilizada a capela disponível no laboratório sempre que necessário.
Os resíduos gerados foram descartados conforme o sistema de resíduos presente no laboratório e então tratados pelo setor de gestão de resíduos da UFSC.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Método da análise da atividade da enzima tirosinase pelo detector (DAD)
O método se baseia na atividade da enzima tirosinase que, utilizando oxigênio (O2), consome a tirosina para formação da L-dopa. Foi utilizado o equipamento de eletroforese capilar acoplado ao detector de UV-vis (DAD) para a detecção deste consumo.
Desenvolveu-se o método com diferentes eletrólitos, sendo que o Tetraborato de sódio (TBS) mostrou o melhor resultado.
5.1.1. Análise da tirosina utilizando Injeção simples
Primeiramente foi realizado uma análise da solução padrão de tirosina (47,5 mg L-1) no equipamento com o detector (DAD), utilizando o método de injeção simples conforme descrito no item 4.5. As condições experimentais utilizadas foram: eletrólito TBS 20mM com pH de 9,1; Voltagem de 25 kV e analisando no comprimento de onda de 222 nm. Foram obtidos o eletroferograma e o espectro da tirosina (Figura 8), que evidenciam que foi possível detectar a tirosina utilizando o método proposto.
Figura 8 – Eletroferograma e espectro da tirosina 47,5 mg L-1. Onde pico1 – tirosina 47,5 mg L-1
5.1.2. Injeção múltipla e teste do tempo de injeção do espaçador
Na sequência foi aplicado o método utilizando a estratégia de injeção múltipla. Foi realiza um estudo para otimizar as condições de injeção do espaçador, sendo este o próprio eletrólito.
As injeções foram realizadas conforme descrito no item 5.6, variando o tempo de injeção do espaçador em 5 s, 10 s, 15 s e 12s, para a análise da solução padrão de tirosina de 47,5 mg L-1. Utilizaram-se as seguintes condições experimentais: eletrólito o TBS 20 mmol L-1 com pH de 9,1; como padrão interno a tirosina 47,5 mg L- 1; voltagem de 25 kV e a detecção foi realizada no comprimento de onda de 222 nm. Foram obtidos eletroferogramas para cada um dos tempos de injeção, a comparação entre eles está apresentada na Figura 9.
Figura 9 – Comparação dos eletroferogramas da Tirosina 47,5 mg L-1: método de injeção múltipla, variando o tempo de injeção do espaçador em A 5 s; B 10 s; C -15 s; D - 12 s. Onde pico 1 – padrão interno de tirosina 47,5 mg L-1 e pico 2 – analito
tirosina 47,5 mg L-1
Fonte: Autor.
Pela comparação dos eletroferogramas (Figura 9), nota-se que nos tempos de injeção de 5 s e 10 s houve uma sobreposição do sinal do pico 1 e do pico 2, resultando
em uma baixa resolução. Nos tempos de injeção de 15 s e 12 s, houve um maior deslocamento entre os sinais dos picos, apresentando uma resolução adequada. Logo, escolheu-se o tempo de injeção de 12 s, por apresentar a melhor relação entre resolução e menor tempo de injeção.
5.1.3. Curva de calibração da tirosina pelo método de injeção múltipla (DAD)
Para a construção da curva de calibração, foram realizadas análises de soluções padrão de tirosina em diferentes concentrações. Utilizou-se o método conforme descrito no item 5.1.2, com o tempo de 12 s para a injeção do espaçador. Os eletroferogramas obtidos estão apresentados na Figura 10. Os dados foram tratados conforme a Figura 11, integrando os picos para obter o valor da área do padrão interno (PI) e a área do analito, nesse caso a tirosina com diferentes concentrações (AT). Com estes dados calculou-se a área corrigida, que é a razão entre a área do analito e a área do padrão interno. Os dados obtidos estão apresentados na Tabela 1.
Figura 10 – Eletroferogramas obtidos para a curva de calibração da tirosina. Onde pico 1 - padrão interno (PI) tirosina 47,5 mg L-1, pico 2 - analito (AT) tirosina de
concentração variada.
Figura 11 - Eletroferograma da tirosina 76 mg L-1 com integração dos picos. Onde pico 1 - padrão interno (PI) tirosina 47,5 mg L-1, pico 2 - Analito (AT) tirosina
76 mg L- 1
Fonte: Autor.
Tabela 1 – Dados dos eletroferogramas obtidos para a curva de calibração da tirosina.
Concentração
Tirosina (mg L-1) Área Tirosina (AT) Área Padrão Interno (PI) Área Corrigida (AT/PI)
19,0 16,5 36,2 0,455801 28,5 20,8 34,3 0,606414 38,0 27,2 34,6 0,786127 47,5 34,6 34,7 0,997118 66,5 52,3 43,5 1,202299 76,0 43,3 34,6 1,251445 Fonte: Autor.
A partir dos dados da Tabela 1 foram construídas duas curvas (Figura 12). A curva 2 foi calculada utilizando a área da tirosina pela concentração da tirosina. A curva 1 foi calculada utilizando a área corrigida pela concentração da tirosina.
Figura 12 - Comparação entre as curvas de calibração da tirosina.
Fonte: Autor.
Tabela 2 - Dados das curvas de calibração da tirosina
Curva Equação R²
1- Área Corrigida (AT/PI) y = 0,0144x + 0,2211 0,9778
2- Área Tirosina y = 0,5831x + 5,6745 0,8816
Fonte: Autor.
Pelo coeficiente de determinação (R2) das duas curvas é possível analisar o parâmetro de linearidade. A curva com a área corrigida apresenta uma melhor relação linear, mostrando que a injeção dupla com o padrão interno pode minimizar os erros de injeção da eletroforese capilar.
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram calculados utilizando o método da relação sinal-ruído. Usa-se o valor do ruído da linha de base e a medição do sinal da amostra tirosina na menor contração, obtidos a partir do eletroferograma. Foi estabelecida uma concentração mínima que pode ser detectada e quantificada. Os valores obtidos são apresentados na tabela 3. (RIBANI, M. et al. 2004)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 10 20 30 40 50 60 Áre a Corrigida (AT /PI) Áre a Tiros ina (A T) Concentração Tirosina(mgL1)
Curva 2 - Área tirosina Curva1 - AT/PI
Tabela 3 - Limite de detecção e quantificação para a tirosina utilizando o método sinal-ruído para o detector (DAD)
Sinal do ruído da linha de base 0,18 (mAu)
Sinal do Pico de concentração 19 mg L-1 7,50 (mAu) Relação Sinal-Ruído para concentração de 19,0 mg L-1 41,67
Limite de Detecção (LOD) 1,52 mg L-1
Limite de Quantificação (LOQ) 4,56 mg L-1
Fonte: Autor.
5.1.4. Análise da amostra Cogumelo
O método descrito no item 5.1.1 foi aplicado para a análise do extrato de cogumelo preparado. A primeira análise foi realizada com o vial (1) contendo 250 µL do extrato mais 250 µL de água. Em seguida, realizaram-se mais três análises adicionando-se 50 µL da solução padrão de tirosina de 47,5 mg L-1 ao vial (1) para cada uma das análises. Obtiveram-se os eletroferogramas e espectros das duas análises (Figuras 13-16) e foi realizada a comparação entre estes (Figura 17).
Figura 13 – Eletroferograma e espectro da primeira análise do vial (1) com o extrato de cogumelo. Onde os picos 1 e 2 são referentes ao sinal da amostra de cogumelo
Figura 14 – Eletroferograma e espectro da segunda análise do vial (1) com extrato de cogumelo e 50 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a
amostra de cogumelo
Fonte: Autor.
Figura 15 – Eletroferograma e espectro da terceira análise do vial (1) com extrato de cogumelo e 100 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a
amostra de cogumelo
Figura 16 – Eletroferograma e espectro da quarta análise do vial (1) com extrato de cogumelo e 150 µL solução de tirosina. Onde os picos 1 e 2 são referentes a
amostra de cogumelo
Fonte: Autor.
Figura 17 - Comparação entre os eletroferogramas das Figuras 13, 14, 15 e 16. Onde os picos 1 e 2 são referentes a amostra de cogumelo
Pela comparação dos eletroferogramas (Figura 17), nota-se que conforme a adição da solução de tirosina ao extrato, tem-se um aumento no sinal do pico 2.
Em seguida, realizou-se a análise do extrato de cogumelo utilizando a estratégia de injeção conforme descrito no item 5.1.3. Realizou-se uma análise do vial (1) mais 150 µL solução de tirosina 47,5 mgL-1. O eletroferograma e os espectros da análise estão apresentados na Figura 18.
Figura 18 – Eletroferograma e espectros dos picos da análise do vial (1) com extrato de cogumelo e 150 µL solução de tirosina, utilizando injeção múltipla. Onde picos 1 e
2 – referentes a amostra de cogumelo; pico 3 – padrão interno tirosina 47,5 mg L-1
Fonte: Autor.
Apesar da adição da tirosina ao extrato de cogumelo causar um aumento no sinal do pico 2, na Figura 18 podemos comparar os espectros do pico 2 e pico 3 e nota-se que há uma diferença entre o pico do extrato em relação ao padrão de tirosina. Isso indica que a amostra de cogumelo apresenta interferentes na mesmo região de migração que a tirosina.
5.2. Método da análise da atividade da enzima tirosinase no detector (CE-MS)
Utilizando um equipamento com detector de espectrômetro de massas acoplado a eletroforese capilar, foi feita a análise com o mesmo princípio apresentado no item 5.1.
Foram utilizadas as seguintes condições experimentes para o detector: voltagem da Agulha 4 kV (modo positivo); líquido auxiliar formiato de amônio 5 mmol L- 1 50% metanol; fluxo do líquido auxiliar: 5 L min-1; fluxo de gás de secagem 6 L min-1; temperatura do gás de secagem 275 °C; pressão do nebulizador 20 psi e voltagem do fragmentador 50 V.
5.2.1. Injeção simples para análise da tirosina e amostra de cogumelo
Foi realizada a análise da solução do padrão de tirosina, 47,5 mg L-1, utilizando o equipamento com o detector acoplado ao CE-MS, seguindo o método descrito no item 4.5, com as seguintes condições: eletrólito ácido fórmico 1 mol L-1 com pH de 1,8 e voltagem de 15 kV.
Para o detector de CE-MS utilizou-se o valor da massa molar da tirosina protonada (182,19 g mol-1) para a análise, devido ao pH ácido do eletrólito.31
Figura 19 - Eletroferograma da tirosina 47,5 mg L-1
Na sequência foi realizado uma análise para o extrato da amostra de cogumelo utilizando o mesmo método. Comparando-se o sinal do padrão de tirosina (Figura 19) com o sinal da amostra de cogumelo (Figura 20), nota-se que o extrato já contém uma certa concentração de tirosina.
Figura 20 – Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo.
Fonte: Autor.
Então, analisou-se o extrato novamente adicionando a solução de tirosina 47,5 mg L-1. Realizaram-se três corridas com diferença de 1 hora entre cada análise para verificar o consumo da tirosina pela atividade da enzima. Completado esse processo, fez-se uma comparação entre os eletroferogramas obtidos (Figura 21-23).
Figura 21 – Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da solução de tirosina 47,5 mg L-1
Fonte: Autor.
Figura 22 – Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da solução de tirosina 47,5 mg L-1 após 1h
Figura 23 – Eletroferograma do extrato da amostra de cogumelo com adição da solução de tirosina 47,5 mg L-1 após 2 h.
Fonte: Autor.
Figura 24 – Comparação do eletroferogramas das figuras 23 e 22
Fonte: Autor.
Pela comparação dos eletroferogramas (Figura 24), nota-se que não houve diminuição no sinal da tirosina na amostra de cogumelo. Isso mostra que não houve consumo da tirosina e que o extrato de cogumelo não possui atividade da enzima tirosinase. A causa disto pode ter sido: a amostra de cogumelo não possui a enzima ou método utilizado para o preparar o extrato foi ineficaz.
5.2.2. Curva de calibração da tirosina pelo método de Injeção múltipla (CE-MS)
Primeiramente foi realizada a análise da solução padrão de tirosina de 47,5 mg L-1, utilizando o método de injeção descrito no item 4.6, com as seguintes condições: eletrólito ácido fórmico 1 mmol L-1 com pH de 1,8; padrão interno tirosina 47,5 mg L-1; voltagem de 15 kV e analisando na massa molar de 182,19 g mol-1; tempo de injeção do espaçador de 12 s, sendo este o próprio eletrólito. O eletroferograma resultante pode ser visto na Figura 25.
Figura 25 - Eletroferograma da injeção múltipla da tirosina 47,5 mg L-1. Onde pico 1 – padrão interno; pico 2 – analito.
Fonte: Autor.
Após fez-se as análises para a curva de calibração variando a concentração da solução de tirosina, obtendo-se os eletroferogramas (Figura 26). Os dados foram adquiridos de forma similar ao descrito no item 5.1.3, resultando na Tabela 4.
Figura 26 - Eletroferogramas obtidos para a curva de calibração. Onde pico 1 – Padrão interno tirosina 47,5 mg L-1; pico 2 – Tirosina de concentração variada.
Fonte: Autor.
Tabela 4 - Curva de calibração da tirosina no detector de CE-MS. Dados obtidos a partir da Figura 21
Concentração
Tirosina (mgL-1) Área Tirosina (AT) Área Padrão Interno (PI) Área Corrigida (AT/PI)
09,5 13449,1 69995,4 0,192142 19,0 23364,8 64282,4 0,363471 28,5 43123,5 69464,7 0,620797 38,0 59934,5 70391,3 0,851447 47,5 70510,9 73873,6 0,954480 Fonte: Autor.
Pelos dados da tabela 4 foi construído uma curva de calibração da tirosina utilizando-se os valores da área corrigida em função da concentração (Figura 27). O ponto de 47,5 mg L-1 do analito foi desconsiderado para a construção da curva por ser considerado discrepante.
Figura 27 - Curva de calibração para a tirosina usando a área corrigida.
Fonte: Autor.
Tabela 5 – Dados da curva calibração da tirosina (área corrigida).
Curva Equação R²
Área Corrigida y = 0,0235x - 0,0518 0,994
Fonte: Autor.
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram calculados utilizando-se, o método relação sinal-ruído de forma similar ao item 5.1.3. Os resultados são os valores apresentados na tabela 6.
Tabela 6 - Limite de detecção e quantificação para a tirosina utilizando o método sinal-ruído, para o detector (CE-MS)
Sinal do ruído da linha de base 175 (Norm)
Sinal do Pico de concentração 09,5 mg L-1 1285 (Norm) Relação Sinal-Ruído para concentração de 09,5 mg L-1 07,34
LOD 0,043 mg L-1 LOQ 0,13 mg L-1 Fonte: Autor. y = 0,0235x - 0,0518 R² = 0,994 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Áre a Corrigida (AT /PI) Concentração Tirosina (mg L-1)
Realizou-se a análise do extrato de cogumelo pelo método anteriormente descrito, obtendo-se o eletroferograma da Figura 28. Foi feita a integração para a aquisição das áreas do pico para o cálculo da área corrigida.
Figura 28 - Eletroferograma da análise do extrato de cogumelo pelo método da curva de calibração. Onde pico 1 – Padrão interno tirosina 47,5 mg L-1; pico 2 – Analito
extrato de cogumelo.
Fonte: Autor.
Tabela 5 – Dados do Eletroferograma da análise do extrato de cogumelo Área Extrato (AT) Área Padrão Interno (PI) Área Corrigida(AT/PI)
17769,6 76266,7 0,232993
Fonte: Autor.
Utilizou-se a curva de calibração e o valor da área corrigida obtida da Figura 28 para calcular a concentração de tirosina presente no extrato de cogumelo. O resultado obtido foi uma concentração de 12,12 mg L-1 de tirosina na amostra.
5.3. Método da análise da atividade da enzima catalase pelo detector (DAD)
O método tem como base a determinação da atividade da enzima pelo consumo de peróxido de hidrogênio. Foi necessária a utilização do eletrólito tetraborato de sódio, que forma um complexo com peroxido de hidrogênio, para que este pudesse ser detectado utilizando o detector de arranjo de diodos (DAD).
5.3.1. Injeção simples para análise do peroxido de hidrogênio
Utilizou-se o método de injeção simples conforme descrito no item 4.5 com as condições experimentais: eletrólito TBS 20 mmol L-1 com pH de 9,1; voltagem de 25 kV e analisando no comprimento de onda de 198 nm. Primeiramente se fez a análise de água destilada (Figura 29) e em sequência do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1 (Figura 30).
Figura 29 - Eletroferograma da água destilada
Figura 30 - Eletroferograma do peroxido de hidrogênio 150 mg L-1. Onde pico 1 – peróxido de hidrogênio.
Fonte: Autor.
A partir da figura 30 foi possível detectar o sinal do complexo de peróxido de hidrogênio formado, porém a voltagem de 25 kV e a concentração do eletrólito TBS em 20 mmol L-1 mostrou-se problemática devido ao alto valor de corrente gerada.
No equipamento de eletroforese capilar limita-se o valor de corrente a 100 mA. Escolhe-se esse valor para que se tenha uma melhor resolução, além de evitar que o capilar de sílica fundida quebre. Logo foi necessário diminuir a voltagem para que a corrente não ultrapassasse este limite.
5.3.2. Teste da melhor concentração de eletrólito para o método
Realizou-se um teste utilizando o método do item 5.3.1, mas modificando a voltagem para 15 kV. Foi necessário avaliar a melhor concentração de eletrólito tetraborato de sódio (TBS) para aprimorar a formação do complexo com o peróxido de hidrogênio e diminuir o efeito da corrente, melhorando o sinal nessa voltagem.
As análises foram feitas utilizando peróxido de hidrogênio 150 mg L-1 e variando a concentração do eletrólito TBS (5 mmol L-1, 10 mmol L-1, 20 mmol L-1, 30 mmol L-1, 40 mmol L-1). Obtiveram-se os eletroferogramas (Figuras 31 – 35).
Figura 31 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 5 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio
Fonte: Autor.
Figura 32 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 10 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio
Figura 33 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 20 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio
Fonte: Autor.
Figura 34 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 30 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio
Figura 35 - Eletroferograma do peróxido de hidrogênio 150 mg L-1; TBS 40 mmol L-1. Onde pico 1 – complexo de peróxido de hidrogênio
Fonte: Autor.
O pico 1 das Figuras 31-35 representa o sinal obtido do complexo de peróxido de hidrogênio formado. Nas concentrações de TBS de 5 mmol L-1 e 10 mmol L-1, o sinal do peróxido de hidrogênio migra para uma região muito próxima do fluxo, causando interferência e diminuindo a resolução. Enquanto a resolução dos picos nas concentrações de 30 mmol L-1 e 40 mmol L-1 foi melhor, o valor da corrente foi alto, passando do limite de 100 mA e causando o mesmo problema anterior. Assim, a concentração de 20 mmol L-1 apresentou a melhor relação entre a resolução dos picos e o valor da corrente, sendo esta a utilizada para o método.
5.3.3. Análise da amostra de Batata
Utilizou-se o método do item 5.3.2 para a análise do extrato de batata e para avaliar a atividade da enzima catalase presente na amostra. As análises foram realizadas em diferentes reservatórios de amostra (vial): vial (1) 500 µL do extrato; vial (2) 250 µL do extrato mais 250 µL de água e 50 µL de peróxido de hidrogênio 450 mg L-1; vial (3) 250 µL do extrato mais 250 µL de água e 150 µL de peróxido de hidrogênio 450 mg L-1. Obtiveram-se os eletroferogramas apresentados nas Figuras 36-38.
Figura 36 - Eletroferograma do vial (1) com extrato batata. Onde pico1 e 2 são referentes ao sinal da amostra de batata
Fonte: Autor.
Figura 37 – Eletroferograma do vial (2) com extrato de batata + 50 µL de peróxido de hidrogênio 450mgL-1. Onde pico 1 -referente ao complexo de peroxido de hidrogênio
formado; pico 2 - referente ao sinal da amostra de batata.
Figura 38 – Eletroferograma do vial (3) com extrato de batata + 150 µL de peróxido de hidrogênio 450mgL-1. Onde pico 1 -referente ao complexo de peroxido de
hidrogênio formado; pico 2 - referente ao sinal da amostra de batata.
Fonte: Autor.
Nas Figuras 36 - 38 nota-se que houve um alargamento do pico 1 com a adição de peróxido de hidrogênio ao extrato de batata. Isto indica que na batata existe interferentes que apresentam sinal na mesma região em que o peróxido de hidrogênio complexado migraria.
Para o teste da atividade da enzima na amostra de batata, realizou-se a análise utilizando o vial (3) com extrato de batata e 150 µL de peróxido de hidrogênio 450 mg L-1. Depois foram feitas mais duas análises, após 30 mim e 1 h, adicionando peroxido de hidrogênio à amostra para observar se houve o consumo do peroxido hidrogênio adicionado em função do tempo. Obtiveram-se os eletroferogramas apresentados na Figura 39 e realizou-se a comparação entre estes.
Figura 39 - Comparação dos eletroferogramas do vial (3) em diferentes tempos: A – inicial; B – após 30 min; C – após 1 h. Onde pico 1 – Referente ao complexo e
peroxido de hidrogênio
Fonte: Autor.
Destes eletroferogramas obtiveram-se os valores das áreas dos picos. Nota-se que não houve grande diferença no valor das áreas dos picos das análises, indicando que no extrato da amostra de batata não houve consumo de peróxido de hidrogênio. Isso pode ser devido ao método de extração da catalse utilizado para amostra ter sido ineficaz.
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que foi possível desenvolver métodos para análise da tirosinase e da catalase utilizando a técnica de eletroforese capilar.
O método para a análise da atividade da tirosinase utilizando o equipamento acoplado ao detector de espectrofotômetro UV-vis de arranjo de diodos foi capaz de detectar o sinal da tirosina. Comparando as formas de injeção simples e injeção múltipla com padrão interno, a última se mostrou mais eficaz não só por apresentar uma maior frequência analítica, mas também pela capacidade de corrigir o erro de injeção da técnica de eletroforese capilar. Para o método utilizando o equipamento acoplado ao detector de espectrômetro de massas foram obtidos resultados similares. A aplicação de ambos os métodos para o extrato de uma amostra de cogumelo mostrou que a esta não consumiu o padrão de tirosina injetado, o que significa que não apresentou atividade enzimática. Isso pode ter ocorrido tanto pelo fato de a amostra não possuir a enzima ou o método para o preparo do extrato não ter sido adequado.
Para a atividade da catalase, o resultado mostrou que a utilização do tetraborato de sódio como eletrólito, para complexação do peróxido de hidrogênio e a realização da análise, utilizando um detector de arranjo de diodos foi possível. A análise do extrato da amostra de batata não apresentou o consumo de peróxido de hidrogênio, mostrando que esta não possui atividade da enzima. Isto pode ser consequência de o método utilizado para a preparação do extrato ter sido ineficaz.
Uma perspectiva para os trabalhos desenvolvidos sobre a eletroforese capilar será a aquisição das enzimas catalase e tirosinase isoladas para a análise de sua atividade enzimática.
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