PNA ISH Detection Kit
N.º de Código K5201
9 ª edicão
Para hibridização in situ usando as sondas PNA conjugadas de imunofluorescência.
O kit contém quantidades de reagentes suficientes para 40 testes.
* Número de testes baseados na utilização de 25 µL de sondas e 150 µL de outros reagentes por lamela.
Índice Página Utilização prevista... 2 Princípio da metodologia ... 2 Reagentes A. Material fornecido... 3
B. Materiais necessários, mas não fornecidos ... 3
C. Preparações dos reagentes... 4
Precauções... 4
Armazenamento ... 6
Procedimento de hibridização in situ de um dia para a detecção de ARN por intermédio de sondas de APN Reidratação ... 7 Pré-tratamento ... 7 Hibridização ... 7 Lavagem adstringente ... 7 Detecção ... 7 Contrastação e montagem ... 7 Observações metodológicas:... 8
Utilização prevista
Para utilização em diagnósticos in vitro.
O kit de detecção PNA ISH é indicado para a detecção das sondas de ácido nucléico péptido conjugado com a fluoresceina (PNA) hibridizadas no RNA alvo nas preparações tecidular ou celular.
Princípio da metodogia
Este kit fornece ao utilizador com todos os reagentes necessários para desempenhar uma hibridização in situ para detectar o RNA celular, exceto para a sonda PNA conjugada com a fluoresceína específica.
Numa secção tecidular ou esfregaço celular (fornecido pelo utilizador) uma sonda de ácido nucléico conjugado com a fluoresceína (PNA) é hibridizada de acordo com o procedimento dado abaixo.
A hibridização é seguida pela lavagem de pós hibridização com uma solução de lavagem adstringente a 55 °C por 25 minutos.
A F(ab’) anti-FITC de coelho conjugada com a fosfatase de alcalina é então indicada e a amostra é incubada em temperatura ambiente por 30 minutos seguido de lavagem. O uso do fragmento de anticorpo F(ab’) assegura que ligação não específica com a amostra é mantida no mínimo.
O substrato (substrato de enzima, BCIP/NBT) é adicionado e a amostra é incubada em temperatura ambiente por 30-60 minutos seguido pela lavagem.
É opcional o contracorante leve com a hematoxilina.
Finalmente a amostra é montada. A coloração positiva é reconhecida ao microscópio como uma cor azul escura /preta no local da hibridização.
Reagentes
A. Materiais fornecidos Frasco 1 (2 mL)
Proteinase K (x 10)
10 x proteinase concentrada K em 50 mmol/L de Tris/HCl, 15 mmol/L de azida sódica, pH 7,5. Como proteinase K é auto degradável. É muito importante armazenar o frasco 1 a 2-8 °C.
Frasco 2 (0,5 mL)
Sonda controlo negativo PNA/FITC (pronta para utilizar)
Sondas PNA aleatórias conjugadas com a fluoresceína na solução de hibridização. Contém 30% de formamida.
Frasco 3 (0,5 mL)
Sonda controlo negativo PNA/FITC (pronta para utilizar)
Sonda PNA conjugada com a fluoresceína direccionada contra a desidrogenase de fosfato 3 gliceraldeído na solução de
hibridização. Contém 30% de formamida.
Frasco 4 (0,5 mL)
Solução de lavagem adstringente (x 60)
Solução de lavagem adstringente concentrada x 60
Frasco 5 (6 mL)
Anti-FITC/AP (pronta para utilizar)
Anticorpo conjugado de fosfatase de alcalina para a fluoresceína (F de coelho isolada por afinidade(ab’)). Em 50 mmol/L de
tampão Tris, 5 mmol/L de MgCl2, 0,25 de mmol/L ZnCl2, 3% de BSA, estabilizador, preservativo, pH 7,5.
Frasco 6 (6 mL)
NP026 (pronto para utilizar)
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) e tetrazolium de nitroazul (NBT). Em 100 mmol/L de Tris, 100 mmol/L de NaCl, 50
mmol/Lde MgCl2, preservativo, pH 9,0. Contém 1,7% de N,N-dimetilformamida.
TBS (Salina com tampão Tris, pH 7,5)
3 embalagens de alumínio cada para 1 l de tampão, pH 7,5. Cada embalagem contém Tris-Base 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. 8.75 g de NaCl ± 4%. Dissolver o conteúdo de cada
embalagem de alumínio em 1l de água pura.
B. Materiais necessários, mas não fornecidos
2. Equipamento e sonda PNA conjugada com a fluoresceína específica necessária para a etapa de hibridização.
3. Imersão em água ajustada para 55 °C. Capacidade de vibração é necessária para a lavagem adstringente.
4. Lamelas silanizadas Dako, nº de código S3003. 5. Dako Caneta, nº de código S2002 (opcional). 6. Água pura (ex. água Milli-Q ou destilada).
7. Meio de montagem Dako Faramount, n.º de código S3025, ou Glicergel, n.º de código C0563.
C. Preparações dos reagentes
Tampão TBS Dissolver o conteúdo de uma embalagem de folha de TBS em 1 l de água pura.
Solução de lavagem adstringente (solução de concentração)
Diluir o volume necessário de solução de lavagem adstringente, frasco 4, 60 vezes em água pura e pré-aquecer a 55 °C em imersão de água.
Proteinase K (solução de concentração)
Exatamente antes de usar diluir a quantidade necessária da Proteinase K, frasco 1, 1:10 em TBS. Imediatamente após utilização, retornar o frasco 1 para 2-8 ºC. (consultar as notas de procedimentos, 3).
Precauções
1. Para utilizadores profissionais.
2. Os frascos 2 e 3 – as Sondas PNA de controlo negativo e positivo - contêm ≥25-<50% formalina e ≥1-<3% sodium chloride. Os frascos 2 e 3 têm a seguinte indicação:
Perigo
H319 Provoca irritação ocular grave.
H360 Poate dăuna fertilităŃii sau fătului.
P201 Pedir instruções específicas antes da utilização.
P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas
as precauções de segurança.
P281 Usar o equipamento de protecção individual exigido.
P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar
vestuário de protecção.
P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento.
P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte
um médico.
P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar
cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.
P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: consulte um médico.
P405 Armazenar em local fechado à chave.
P501 Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as
3. Frasco 6 - o substrato – contém ≥1-<3% N,N-dimetilformamida e ≥1-<3% trometamol. Frasco 6 tem a seguinte indicação:
Perigo
H360 Poate dăuna fertilităŃii sau fătului.
H373 Pode afectar os órgãos após exposição prolongada ou
repetida.
P201 Pedir instruções específicas antes da utilização.
P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas
as precauções de segurança.
P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar
vestuário de protecção.
P260 Não respirar as vapores.
P314 Em caso de indisposição, consulte um médico.
P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte
um médico.
P405 Armazenar em local fechado à chave.
P501 Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as
regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais.
4. A embalagem em folha de alumínio de TBS (salina de tampão Tris, pH 7,5) contém ≥ 25-<50% trometamol e ≥25-<50% 2-amino-2-(hidroxi-metil)propano-1,3-diol cloridrato. A embalagem em folha de alumínio de TBS são marcadas:
Atenção
H319 Provoca irritação ocular grave.
H315 Provoca irritação cutânea.
H335 Pode provocar irritação das vias respiratórias.
P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial.
P271 Utilizar apenas ao ar livre ou em locais bem ventilados.
P261 Evitar respirar as poeiras.
P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento.
P304 + P340 + P312 EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a pessoa para uma zona ao
ar livre e mantê-la numa posição que não dificulte a
respiração. Caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS/médico.
P302 + P352 + P362-2 + P363
SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes. Retirar a roupa contaminada. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar.
P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: consulte um médico.
P405 Armazenar em local fechado à chave.
P501 Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as
regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais.
5. Frasco 4, solução de lavagem adstringente contém 3,6% de trometamol. Nos produtos concentrados, o trometamol não requer marcação de perigosa. Encontra-se disponível aos utilizadores profissionais, mediante pedido, a folha de dados de segurança.
6. Frascos 1 e 5, Proteinase K e Anti-FITC/AP contêm azida sódica como um preservativo. Azida sódica (NaN3) é um tóxico altamente químico na forma pura. Em concentrações do produto, mesmo não classificadas como perigosas, a azida sódica poderá reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas
altamente explosivas. Ao descartar, lavar com grandes quantidades de água a pressão, a fim de evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização.
7. Frasco 5, Anti-FITC/AP contém material de origem animal. Tal como com qualquer produto derivado de fontes biológicas, é necessário empregar procedimentos de manuseamento apropriados.
Armazenamento
Os reagentes do kit devem ser armazenados a 2-8 °C. Os frascos 2 e 3 devem ser armazenados no escuro. Não utilizar após a data de validade inscrita no frasco. Caso os reagentes sejam armazenados noutras condições para além das que se encontram
especificadas, o utilizador deve verificar tais condições. Não há sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por conseguinte, os controlos positivo e negativo devem ser processados em simultâneo com as amostras do doente. Se for observada uma coloração inesperada que não pode ser explicada por variações nos procedimentos laboratoriais e houver suspeita de problema com os anticorpos, contacte o nosso Serviço Técnico.
Como a proteinase K é auto-degradável é muito importante armazenar o frasco 1 a 2-8 °C e minimizar a exposição a temperatura ambiente.
Procedimento de hibridização in situ de um dia para a Detecção de RNA
por intermédio de sondas de PNA
O procedimento foi desenvolvido para as secções de tecidos embebidas em parafina e fixadas na formalina. Os reagentes incluídos neste kit, bem como as condições de
hibridização e lavagem, foram ajustados de forma a produzirem resultados ideais com as sondas de ácido péptido nucléico (PNA) conjugadas com fluoresceína da Dako. O controlo positivo de tecido deve ser executado simultaneamente com as amostras.
NOTA: Todas as incubações são feitas em temperatura ambiente a menos que seja
Mergulhar as lamelas contendo secções de tecido em xileno. 2 x 5 min. Mergulhar em etanol a 99%. 2 x 3 min. Mergulhar em etanol a 96%. 2 x 3 min. Mergulhe em água pura. O frasco não dever ter RNase
*consultar as Observações metodológicas, 1)
3 minutos Traçar um círculo em volta das amostras com a Caneta Dako
Pen, Nº de código S2002. Reidratação
Mergulhar em água pura. 2 x 3 min. Colocar as lamelas numa câmara de humidade (utilizar luvas
limpas).
Imediatamente antes da sua utilização, diluir a quantidade necessária de Proteinase K, frasco 1, 1:10 em TBS, p. ex. empregando 11 gotas da ampola Nº 1 (ou 500 µL) em 4,5 mL de TBS(consultar Notas Processuais, 2).
Adicionar 150 µL de proteinase K diluída a cada secção (consultar Procedimentos, 3).
Imediatamente após a utilização, voltar a colocar o frasco 1 a 2-8ºC.
Incubar. 20-30 min.
Mergulhar as lamelas em água pura. 2 x 3 min. Mergulhar as lamelas em etanol a 96%. ~ 10 seg. Pré-tratamento
Secar as lamelas ao ar 5 min.
Adicione 1-2 gotas de sonda PNA conjugada por fluoresceína na secção do tecido. Adicionar as sondas de controlo, ampolas n.ºs 2 e 3, a secções diferentes.
Cobrir as secções com as coberturas de lamelas.
Colocar as lamelas na câmera úmida (para evitar secar as secções)
Hibridização
Colocar a câmera úmida num incubador (consultar Observações metodológicas, 4).
1 ½ horas a 55ºC Pré-aquecer a solução de concentração de lavagem
adstringente (frasco 4 diluido 1:60) para 55 °C no tanque de imersão
Remover as coberturas.
Imergir as lamelas na solução de concentração de lavagem adstringente
25 min. em 55 °C com mistura Lavagem
adstringente
Ajustar a temperatura das lamelas à temperatura ambiente através da sua imersão em TBS.
10 seg. Colocar as lamelas numa câmara de humidade.
Adicionar 2 a 5 gotas de Anti-FITC/AP, ampola Nº5, a cada secção.
Incubar. 30 minutos
Remover o anticorpo com ligeiras pancadas.
Mergulhar as lamelas em TBS. 2 x 3 min. Mergulhar as lamelas em água pura. 2 x 1 min. Colocar as lamelas numa câmara de humidade.
Adicionar 2-5 gotas de substrato, frasco 6, para cada secção (consultar Notas Processuais, 5)
Incubar. 30-60 min.
Remover o Substrato com ligeiras pancadas. Detecção
Mergulhar as lamelas em água da torneira. 5 minutos Contrastar com hematoxilina, se necessário. 5-10 seg. Contrastação e
montagem Montagem em Dako Faramount, Nº de código S3025, ou em Glicergel, Nº de código C0563.
Observações metodológicas:
1. A partir desta fase do procedimento e até que o processo de hibridização tenha sido concluído, é importante evitar contaminar as secções com Rnases, devendo-se tocar nas lamelas apenas com luvas limpas, descartáveis (consultar também a secção de
“Precauções”). Os artefactos de vidro podem ser feitos sem Rnase por incubação durante a noite a 200 °C.Outros métodos para a inactivação da Rnase nas soluções são descritas em Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Clonagem molecular, um manual de laboratório. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (consultar também Precauções).
2. Dissolver o conteúdo de uma embalagem de alumínio contendo o TBS em 1 l de água pura (livre de Rnase).
3. Como a proteinase K é auto degradável. É muito importante armazenar o frasco 1 a 2-8 °C e minimizar a exposição a temperatura ambiente. A digestão proteolítica ideal pode variar entre diferentes blocos de tecido. Para secções congeladas e proteinase K de citospins deve ser diluido mais do que 1:10; como uma directriz dilui 1:100-1:1000, dependendo da fixação.
4. Determinámos que um período de incubação de 1½ horas resulta em níveis ideais de sensibilidade, embora se possam obter resultados satisfatórios se diminuir o período de incubação para 15 a 30 minutos, dependendo da quantidade de alvo presente na
amostra.
5. Determinámos que o substrato (BCIP/NBT), incluído no kit de Detecção Dako PNA ISH, proporciona os níveis mais elevados de sensibilidade, mas que o New Fuchsin Dako (nº de código K0625) proporciona resultados muito satisfatórios.
6. Não sacudir o frasco 6 antes de utilizar. I substrato forma ocasionalmente uma precipitação que pode afectar os resultados de coloração se a solução for sacudida.
Explica ção dos símbolos
Núme ro do catál ogo Li mites de tempe ratura C ódi go de l ote Fa brica nte
Disp ositivo mé dico p ara dia gnó sti co in vitro
Man te r a o abri go da l uz sol ar (consu ltar a secção de a rmazen amen to )
Ad icio nar ág ua
Símbo lo GHS ( co nsul tar a secção r ela ti va às p reca uçõe s)
Con sultar as in stru ções de util izaçã o
Co nteúd o suficie nte para
<n > testes U sar até
Símbo lo GHS ( co nsul tar a secção r ela ti va às p reca uçõe s)
Produzido por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca
Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95
