REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E PROTEINOGRAMA NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE OCULAR CANINA

Texto

(1) . UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E PROTEINOGRAMA NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE OCULAR CANINA. Virginia Tessarine Barbosa Médica Veterinária. JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2011.

(2) . UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E PROTEINOGRAMA NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE OCULAR CANINA. Virginia Tessarine Barbosa Orientador: Prof. Dr. José Luiz Laus Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Cirurgia Veterinária.. JABOTICABAL – SP Julho – 2011.

(3) . B238r. Barbosa, Virginia Tessarine Reação em cadeia da polimerase e proteinograma no diagnóstico da leishmaniose ocular canina / Barbosa, Virginia Tessarine. -- Jaboticabal, 2011 iv, 54 f. :il ; 28cm Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2011 Orientador: José Luis Laus Banca examinadora: Aline Adriana Bolzan, Leucio Camara Alves, Fábio Luiz da Cunha Brito, Newton Nunes Bibliografia 1.. Cão. 2. Leishmania. 3. Conjuntiva. 4. Humor aquoso. I Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:617.7:636.7. Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – UNESP, Câmpus de Jaboticabal..

(4) . DADOS CURRICULARES DO AUTOR. VIRGINIA TESSARINE BARBOSA – nascida em Espírito Santo do Pinhal, no dia 26 de fevereiro de 1977, filha de Neuza Maria Tessarine Barbosa e Pedro Franklin Barbosa é medica veterinária, formada pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP/ Jaboticabal – SP, em 2001. Realizou, nesta instituição, durante os anos de 2002 e 2003, o curso de aprimoramento (residência) na área de Clínica Cirúrgica de Pequenos Animais, sob orientação da Profa. Dra. Cíntia Lúcia Maniscalco.. Em março de 2004, ingressou no Programa de Pós-graduação em. Cirurgia Veterinária, sob a orientação do Prof. Dr. José Luiz Laus, tendo concluído o mestrado em fevereiro de 2006 com a dissertação intitulada: “Efeitos do etilcianoacrilato ou do octil-cianoacrilato sobre lesões corneais experimentais em coelhos”. Em março do mesmo ano ingressou no doutorado na mesma instituição e sob a mesma orientação. Atualmente é professora assistente da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins, em Araguaína, sendo responsável Veterinária.. pelas. disciplinas. Técnica. Operatória. Veterinária. e. Radiologia.

(5) . . “Há homens que lutam um dia e são bons. Há outros que lutam um ano e são melhores. Há os que lutam muitos anos e são muito bons. Porém, há os que lutam toda a vida. Esses são os imprescindíveis." (Bertolt Brecht).

(6) . . Ofereço este trabalho ao meu marido, Marco Augusto Giannoccaro da Silva, pelo apoio e incentivo, sempre com amor, ao longo desta jornada.. .

(7) . Dedico esta batalha à minha mãe Neuza (in memorian) e ao meu pai Pedro. Professores de alunos, dos filhos e da vida. Jamais conseguirei retribuir o quanto recebi. Amo vocês..

(8) . Agradeço.... ... primeiramente a Deus, pela oportunidade de estar viva e poder fazer algo em prol da saúde dos animais que Ele, com sua imensa sabedoria, fez ocupar toda a Terra. ... ao Prof. Dr. José Luiz Laus, por ter aceitado ser meu orientador sem titubear. Foi uma relação muito salutar para minha vida profissional e pessoal. Afora as “injunções” próprias do convívio durante a pós-graduação, o respeito da aluna de ontem que virou professora hoje é exatamente o mesmo. Devo muito a você. ... ao amigo Fábio Brito por, simplesmente, me entregar a idéia do que fazer quando tudo parecia perdido e o tempo estava se esgotando. ... ao Prof. Dr. Leucio Camara Alves por se mostrar disponível a ajudar em tempo “record” sempre com a garantia de que tudo daria certo. Que estes agradecimentos se estendam a toda sua equipe, principalmente ao Rafael. ... à Profa. Dra. Helciléia e sua seleta equipe de “olhinhos muito bem treinados” para o diagnóstico parasitológico da leishmaniose e outros tantos. Que nosso coleguismo renda ainda mais do que fizemos até hoje. Obrigada pela confiança! ... ao Prof. Dr. José Jurandir Fagliari pelo auxílio desde que outras “idéias protéicas” foram postas em prática, pela ajuda e ponderação ao me conduzir para um caminho científico mais certo. ... ao Prof. Dr. Alexandre Lima de Andrade pelo louvável senso de humor e pela quase capacidade de materializar uma lâmpada de fenda “do algodão” quando os obstáculos insistiam em aparecer. Você é demais! ... ao companheiro Luciano Conceição... não tenho palavras! Apenas lhe peço para não esquecer de fazer-me um agradecimento especial quando for receber o Prêmio Nobel da Oftalmologia! Rs... ... à amiga Patrícia Jordão Guimarães dona de todas as capacidades de ajudar aos amigos em qualquer tempo e a qualquer hora. Hoje sei por que Deus nos apresentou naquele dia. Obrigada meisssmo! ... à grande amiga Bianca da Costa Martins, que me ensinou oftalmologia veterinária com muito bom humor e boa vontade. Sempre apostou em mim nos atendimentos e cirurgias..

(9) . ... à toda equipe do Serviço de Oftalmologia Veterinária da FCAV. Diferenças e semelhanças entre gregos e troianos com um objetivo em comum: aprender oftalmologia veterinária. Cada um de vocês é muito especial. Cuidem bem do Laus! ...à equipe de profissionais do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araguaína-TO por me oferecerem a oportunidade e o espaço para desenvolver este trabalho “na hora”! ...à amiga Ana Paula Gering, que “caiu do céu” e me ajudou muito durante as coletas. Ajuda imprescindível na hora perfeita. Obrigada Babidja! ...à colega de trabalho, Raimunda de Sousa, pelo incentivo e ajuda quando este trabalho começou a criar forma. ...aos amigos Paulo, Renata e Cláudia, do Laboratório de Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da FCAV, pelos cafezinhos e esforço a cada dificuldade que enfrentei durante a fase das avaliações proteicas. Vocês foram maravilhosos! ... ao colega Marlos Gonçalves de Sousa, pela avaliação estatística recheada de boas idéias e muita disposição entre um chorinho e outro da sua pequena Julia. Exemplo de profissional. ... de coração à todos os profissionais da Seção de Pós-graduação, por responderem mil vezes à mesma pergunta, sempre prontos a ajudar diminuíndo a distância de 2200km entre mim e Jaboticabal. Vocês foram realmente imprescindíveis! ...à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela bolsa concedida.. Agradeço especialmente.... ... às minhas filhas Maria Julia e Manuella, motivos de toda luta e esforço. Razões do meu viver, seguramente. Mamãe ama vocês! Não se esqueçam nunca! ... aos meus irmãos Camila e Luiz Gustavo que, mesmo sem entender muito esta coisa de “carreira acadêmica”, estavam sempre, sempre torcendo por mim. Vocês são muito importantes na minha vida. Não vamos soltar as mãos!.

(10) . ... à minha prima-irmã Raquel, pessoa que está do meu lado. Obrigada Ray pelos momentos de distração ao te ajudar com o biscuit. Nossa ligação é muito forte. Te amo, te amo, te amo! ... carinhosamente à minha Tia Udi – mulherão – cuida de tudo ao mesmo tempo agora! Imagino o quanto este doutorado esteve presente em suas orações. ... ao meu amado e eterno Simba. Missa demorou tanto para acabar este doutorado que você não pode esperar. Que os anjos do céu estejam com você no colo quando eu chegar aí! Vou me esforçar para merecer você de novo! ...finalmente a todos os animais que pude ter a graça de tocar, ver, cuidar... Às vezes me pergunto se sou realmente merecedora da tarefa de ser veterinária, pois, para mim, não é uma profissão, é uma dádiva!. Muito obrigada a todos!.

(11) ) . SUMÁRIO Página Resumo.............................................................................................................. iii. Abstract.............................................................................................................. iv. 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1. 2. REVISÃO DA LITERATURA..... .................................................................... 3. 2.1 Leishmaniose visceral canina................................................................... 3. 2.2 Imunologia da leishmaniose visceral canina............................................ 5. 2.3 Leishmaniose ocular canina .................................................................... 6. 2.4 Proteinograma........................................................................................... 9. 3. OBJETIVOS .................................................................................................. 13. 4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 14. 4.1 Aspectos éticos ....................................................................................... 14. 4.2 Animais..................................................................................................... 14. 4.3 Exame oftálmico e grupos......................................................................... 14. 4.4 Procedimento anestésico ......................................................................... 15. 4.5 Coleta de material biológico...................................................................... 15. 4.5.1 Sangue................................................................................................ 15. 4.5.2 Linfonodos ......................................................................................... 16. 4.5.3 Citologia conjuntival............................................................................ 16. 4.5.4 Humor aquoso..................................................................................... 16. 4.5.5 Biópsia conjuntival ............................................................................. 17. 4.6 Avaliações laboratoriais ............................................................................ 17. 4.6.1 Dosagem sérica da proteína total ....................................................... 17. 4.6.2 Exame Parasitológico. ......................................................................... 17. 4.6.3 Proteinogramas ................................................................................... 18. 4.6.4 Diagnóstico molecular ........................................................................ 19. 4.6.4.1 Extração do DNA............................................................................ 19. 4.6.4.2 Amplificação do DNA de Leishmania spp ..................................... 19 4.6.4.3 Amplificação do Complexo Leishmania (Leishmania) donovani... 20. 4.6.4.4 Amplificação do Complexo Leishmania (Viannia) braziliensis........ 20.

(12) )) . 4.6.4.5 Eletroforese...................................................................................... 21. 4.7 Análise estatística ..................................................................................... 21. 5. RESULTADOS............................................................................................... 23. 5.1 Achados ao exame oftálmico..................................................................... 23. 5.2 Exame parasitológico ................................................................................ 25. 5.3 Diagnóstico molecular ............................................................................... 27. 5.3.1 Reação em cadeia da polimerase - conjuntiva ................................... 27. 5.4.2 Reação em cadeia da polimerase - humor aquoso............................ 29. 5.4 Proteinograma .......................................................................................... 30. 5.4.1 Proteinograma sérico........................................................................... 31. 5.4.2 Proteinograma do humor aquoso........................................................ 32. 5.4.3 Correlação protéica entre soro e humor aquoso................................. 33. 6. DISCUSSÃO ............................................................................................... 35. 7. CONCLUSÕES............................................................................................ 41. 8. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 42.

(13) ))) . REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E PROTEINOGRAMA NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE OCULAR CANINA RESUMO – A leishmaniose ocular canina envolve um complexo de alterações decorrentes da atuação do agente nos diversos tecidos oculares. Valendo-se de cães com sorologia positiva para a doença, portadores (G1) ou não (G2) de alterações oftálmicas, com este estudo avaliou-se: o exame parasitológico de esfregaço a partir de swab conjuntival, a presença do parasito, pela PCR, em fragmento conjuntival e no humor aquoso (HA) e as concentrações protéicas, pela eletroforese, no HA. O parasitológico de esfregaço a partir do swab conjuntival foi positivo em 60% e 38,1% dos animais do G1 e do G2, respectivamente, com a oddsratio de 2,438 para positividade em tal parâmetro nos cães do G1, comparativamente aos do G2. A positividade na PCR de fragmento conjuntival foi maior no G1 (p < 0,005), com oddsratio igual a 17,31 quando comparados G1 e G2. O parasito não foi detectado no HA de qualquer dos grupos. Houve correlação fracopositiva entre as concentrações de IgG e de albumina séricas e do HA. Diferenças significativas foram encontradas entre os grupos, quando comparadas as proteínas totais, IgG, e proteína de peso molecular 33 kDa no HA. A haptoglobina foi detectada apenas no HA dos cães do G1. Os dados apontam para uma tendência dos cães com sinais oftálmicos serem positivos no parasitológico de esfregaço a partir do swab conjuntival e na PCR de conjuntiva, podendo, o método ser útil no diagnóstico parasitológico da leishmaniose visceral canina. Proteínas de fase aguda merecem mais avaliações quanto ao seu valor diagnóstico para esta enfermidade.. Palavras-chave: cão, Leishmania, conjuntiva, humor aquoso.

(14) ); . POLIMERASE CHAIN REACTION AND PROTEINOGRAM IN THE DIAGNOSIS OF CANINE OCULAR LEISHMANIASIS ABSTRACT – Canine ocular leishmaniasis involves several ophthalmic alterations owing to the action of the parasite in numerous ocular tissues. Therefore, dogs serologically positive for leishmaniasis either presenting (G1) or not (G2) ocular alterations were enrolled in this study to evaluate the conjunctival cytology as a method for the diagnosis of this disease, the detection of the parasite in conjunctival tissue samples and in the aqueous humor using PCR, as well as the serum and aqueous humor protein concentrations determined by electrophoresis. The parasitological evaluation of the swabs disclosed 60% and 38.1% of positivity in dogs of groups 1 and 2, respectively, with a calculated oddsratio of 2.438 for a single animal testing positive in this procedure when ocular changes existed. The documented PCR results were more expressive in G1 dogs (P<0,005), with an oddsratio of 17,81 for the animals of this group testing positive using this method as compared to G2. The parasite was not found in the aqueous humor of either group. A weak positive correlation was calculated between the serum and aqueous humor IgG and albumin concentrations, and significant differences were found to exist between groups regarding total protein, IgG, and 33 kDa protein measured in the aqueous humor. Also, haptoglobin was detected only in the aqueous humor of G1 dogs. Our data suggest a tendency of dogs with ocular signs testing positive on the conjunctival swab exams and PCR, being these methods useful in the diagnosis of canine leishmaniasis. However, acute phase proteins require a more detailed evaluation concerning its diagnostic value for this disease. . KEY WORDS: dog, Leishmania, conjunctive, aqueous humor.

(15) T . 1. INTRODUÇÃO. As leishmanioses constituem-se de um amplo espectro de doenças transmitidas por insetos flebotomíneos infectados com parasitas do gênero Leishmania, podendo manifestar-se nas formas cutânea, mucocutânea ou visceral (AKILOV et al., 2007). Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2011), a doença ameaça 350 milhões de pessoas, em 88 países do mundo, sendo, destes, 72 considerados países em desenvolvimento. Acredita-se, ainda, que hajam de um a dois milhões de novos casos por ano no mundo. O agente etiológico das leishmanioses é um protozoário do reino Protista, subreino Protozoa, filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora, ordem Kinetoplastidae, subordem Trypanosomatina, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (SHAW & LAINSON, 1987). A ocorrência das leishmanioses limita-se à distribuição geográfica dos vetores que são insetos denominados flebotomíneos, pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, estando o gênero Lutzomyia relacionado à ocorrência da enfermidade nos países do Novo Mundo e o gênero Phlebotomus nos países do Velho Mundo (SHAW & LAINSON, 1987). A transmissão se dá pela picada da fêmea do inseto vetor ao depositar as formas flageladas (promastigotas) na pele do hospedeiro que, após serem fagocitadas, se diferenciam em aflageladas (amastigotas) e, por divisão binária, replicam-se resultando na lise do macrófago. O processo tem continuidade quando as mesmas são novamente fagocitadas por tecidos ricos em células do sistema mononuclear fagocitário, desencadeando a enfermidade. Os vetores têm contato com as formas amastigotas quando ingerem sangue com macrófagos parasitados em um hospedeiro infectado. Tais formas diferenciam-se em formas infectantes no intestino do inseto e o ciclo tem continuidade (CASTRO, 1996). Relatos sobre a recorrência em focos (GRADONI et al., 2003; CURTI et al., 2009; SOCCOL et al., 2009), surgimento de novos focos epidêmicos (COSTA, 2005;.

(16) U . SOCCOL et al., 2009), potenciais novos vetores (DANTAS-TORRES et al., 2010) e ineficiência nas formas de controle atualmente empregadas (COSTA-VAL et al., 2007) não são raros. Soma-se, ainda, a estes desafios, o importante impacto econômico que a doença suscita (BAÑULS et al., 2007). O cão assume importância quando se trata da epidemiologia da enfermidade por ser o principal reservatório dos parasitas e considerado alvo em programas de erradicação da doença, à similitude do que ocorre com a raiva (OLIVEIRA-DOSSANTOS et al., 1993). Dentre a diversidade de sinais clínicos relacionados à leishmaniose em cães, a ocorrência de alterações oculares é frequente e, às vezes, única, o que reforça a necessidade do estabelecimento de relações entre as oftalmopatias e o diagnóstico da doença. Valendo-se da necessidade quanto ao estabelecimento de mais diretrizes sobre a patogenia da enfermidade, em cães, e em concordância com a Organização Mundial de Saúde, que propõe a execução de ações voltadas para o diagnóstico precoce com estratégias de controle flexíveis, distintas e adequadas para cada padrão de transmissão, com o presente estudo visou-se o diagnóstico laboratorial da enfermidade no âmbito da oftalmologia veterinária..

(17) V . 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 Leishmaniose visceral canina. A leishmaniose em cães geralmente cursa com envolvimento sistêmico de caráter crônico e, na maioria dos casos, com envolvimento cutâneo (BENETH & AROCH, 2008). Entretanto, a ocorrência de anormalidades tegumentares com ausência de sinais sistêmicos é rara (SLAPPENDEL & GREENE, 1990). No Brasil, a espécie envolvida é a Leishmania (L.) chagasi (COSTA, 2005). Há alguns anos os autores referem-se às espécies Leishmania (L.) chagasi e Leishmania (L.) infantum como sinônimos (KAYE et al., 2004; FERREIRA et al., 2008; DANTAS-TORRES et al., 2010). Relativamente aos sinais clínicos podem ser observados febre, perda de peso crônica, atrofia muscular, vômito, diarréia, melena, hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatia generalizada, dermatite granulomatosa ou ulcerativa com alopecia facial sem prurido, hiperceratose, descamação, úlceras mucocutâneas, onicogrifose, uveíte anterior, conjuntivite, blefarite, rinite, epistaxe, poliartrite neutrofílica, icterícia, entre outros (SHERDING, 2006). Não raro, cães infectados podem se apresentar assintomáticos (SIDERIS et al., 1999), entretanto, potencialmente infecciosos para o vetor (MOSHFE et al., 2009). Correlações entre o grau de parasitismo e a apresentação clínica da doença nos cães tem sido motivo de investigações por apresentar influência direta com o diagnóstico. da. enfermidade.. Alguns. autores. classificam. os. animais. em. assintomáticos (ausentes de qualquer sinal clínico, com aparência saudável), oligossintomáticos (apresentando até três sinais clínicos ou comprometimento de até três órgãos) ou polissintomáticos (mais de três sinais clínicos ou com mais de três órgãos acometidos) (QUEIROZ et al., 2009; ASSIS et al., 2010). Os aspectos clínicos somados ao histórico do paciente fundamentam o diagnóstico presuntivo da leishmaniose (SLAPPENDEL & GREENE, 1990; FEITOSA et al., 2000) que se confirma com a visualização das formas amastigotas de.

(18) W . Leishmania em esfregaços de aspirados de linfonodo, medula óssea e baço (SANTANA-ROSA & OLIVEIRA, 1997). O exame parasitológico é considerado o teste “ouro” para o diagnóstico da doença. A observação direta das formas amastigotas do parasito em esfregaços de aspirado de linfonodo, medula óssea, baço, fígado, pele e sangue, corados por Giemsa, Leishman ou Panótico, é uma forma segura, relativamente simples e rápida para o diagnóstico da enfermidade. A especificidade desse método é de 100%, mas a sensibilidade depende do grau de parasitismo, do tipo de material biológico coletado, do seu processamento e da coloração, além da experiência do observador. A sensibilidade pode ser de 50 a 83% em amostras de medula óssea, entre 30 a 85% em amostras de linfonodo e entre 71 a 91% quando ambos os tecidos estão combinados (LAURENTI, 2009). Outros autores relatam valores entre 60 a 75% de sensibilidade para medula óssea (FERRER et al., 1999). e de 30 a 50% para. esfregaço de linfonodo (ALVAR et al., 2004). Considerando a possível variação no número de parasitos para cada amostra, o aumento do tempo de observação e o número de campos observados resulta em maior sensibilidade para o teste (MAIA & CAMPINO, 2008).. O diagnóstico parasitológico pode, ainda, ser realizado pela. detecção do parasito em meios de cultivo específicos (LAURENTI, 2009). Os testes sorológicos ELISA e RIFI são recomendados pelo Ministério da Saúde para o inquérito epidemiológico canino (BRASIL, 2007). Relativamente à sua confiabilidade, um estudo recente elucidou que não há reatividade cruzada do soro de cães positivos para L. (L.) chagasi com antígenos de Ehrlichia canis e de Babesia canis pelo ELISA e RIFI, sendo a coinfecção em cães um achado freqüente em regiões endêmicas para as enfermidades (OLIVEIRA et al., 2008). No que concerne ao Trypanosoma cruzi e à Leishmania (V.) brasiliensis a ocorrência de reações cruzadas é factível (VEXENAT et al., 1996). Intercorrências quanto a resultados falso-negativos, pela sorologia, podem ser solucionadas empregando-se técnicas mais sensíveis como a imunoistoquímica ou técnicas moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), também utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (MANNA et al., 2004;.

(19) X . SOLANO-GALEGO et al., 2004; GOMES et al., 2007; NUNES et al., 2007; FERREIRA et al., 2008; BRITO et al., 2010). Aspirados de linfonodo, baço, medula óssea, entre outros, podem ser selecionados para detecção do DNA da Leishmania spp pela PCR, entretanto, amostras de sangue, pele e conjuntiva podem favorecer coletas menos invasivas e com bons resultados (MANNA et al., 2004; FERREIRA et al., 2008). A PCR em tempo real fornece uma estimativa da quantidade de parasitos presentes no tecido analisado, o que facilita o monitoramento do agente durante o tratamento e torna possível a detecção de predileção tecidual pelo agente (SOLANOGALEGO et al., 2007). Ainda assim, apesar de sua elevada sensibilidade, a PCR é de restrita aplicabilidade, em virtude dos custos implícitos para sua realização e da demanda de profissionais treinados para sua execução (GOMES et al., 2007).. 2.2 Imunologia da leishmaniose visceral canina. As infecções parasitárias caracterizam-se por estimular inúmeros mecanismos imunológicos de defesa, sejam eles mediados por anticorpos ou células, e a eficiência das respostas depende das características do parasita e do estágio de infecção (BRADLEY, 2003). Na infecção canina por Leishmania spp, há estímulo humoral aumentando o número de linfócitos B com produção de quantidade excessiva de imunoglobulinas não protetoras que, ligadas aos antígenos circulantes, não conseguem neutralizá-los formando imunecomplexos que se depositam em vários tecidos (TABOADA & MERCHANT, 1995). Os imunecomplexos são responsáveis pela ocorrência de muitos dos sinais clínicos da leishmaniose (SLAPPENDEL & GREENE, 1990; KOUTINAS et al., 1993) e, ainda, podem causar diminuição da vida média de células sanguíneas. ao. se. ligarem. às. mesmas,. causando. anemia. hemolítica. e. trombocitopenia imunemediadas. Nestes casos, em virtude do estímulo humoral, pode haver produção de autoanticorpos contra as células sanguíneas (MARTINEZMORENO et al., 1995)..

(20) Y . Relativamente à resposta imune celular, a leishmaniose visceral canina pode induzir resposta envolvendo linfócitos T auxiliares do tipo 1(Th1), na qual há destruição dos parasitos intracelulares, ou envolvendo linfócitos T auxiliares do tipo 2 (Th2), quando há interação dos linfócitos T com as células B, auxiliando-as na produção de anticorpos, para eliminação dos parasitos extracelulares. A intensidade de cada uma destas respostas será determinante para o controle (cura) ou para a ocorrência da infecção em maior ou menor severidade (REINER & LOCKSLEY, 1995). Estudos permeiam a exploração dos mecanismos empregados pelo parasito e/ou pelo hospedeiro na determinação do tipo de resposta imune instituída (BELKAID et al., 1998; TACCHINI-COTTIER et al., 2000; BORGES et al., 2001; DOMINGUEZ & TORANO, 2001) visando ao desenvolvimento de estratégias de controle (ALMEIDA et al., 2003; ALEXANDER & BRYSON, 2005).. 2.3 Leishmaniose ocular canina. Ao contrário do que se reporta em humanos, a ocorrência de lesões oculares em cães com leishmaniose visceral é relativamente frequente, podendo ser determinada pelo parasitismo direto (KOUTINAS et al., 1999; PEÑA et al., 2008; BRITO et al., 2010) ou como resultado dos sinais sistêmicos (ROZE, 2002). Quanto ao diagnóstico da leishmaniose, a presença de sinais relacionados ao aparelho da visão não é incomum. Citações diversas imprimem a ocorrência de 16 a 80% de manifestações oculares em animais afetados (MOLLEDA et al., 1993; CIARAMELLA et al., 1997; KOUTINAS et al., 1999; PEÑA et al., 2000). Para Peña et al. (2000), esta variabilidade está relacionada aos inúmeros mecanismos patológicos envolvidos nesta enfermidade e à diversidade de respostas imunológicas individuais de cada hospedeiro. A doença ocular pode manifestar-se de forma uni ou bilateral, suscitando, ainda, mais de uma alteração no mesmo olho. O envolvimento dos segmentos oculares remete destaque ao segmento anterior, contudo, ambos podem estar afetados (PEÑA et al., 2000; BRITO et al., 2006)..

(21) Z . Dentre as alterações oftálmicas relativas aos anexos podem-se observar alopecia periocular, blefarite difusa, ulcerativa ou nodular (PEÑA et al., 2000), conjuntivite e secreção purulenta (MOLLEDA et al., 1993; KOUTINAS et al., 1999; PEÑA et al., 2000; BRITO et al, 2006). Quando a córnea é acometida, em geral a ocorrência se faz em conjunto com a inflamação da conjuntiva e úvea anterior (BRITO et al., 2006). Identificam-se sinais como edema difuso ou focal, além de vascularização e infiltrado celular intersticial nas adjacências do limbo (MOLLEDA et al., 1993). A ceratoconjuntivite seca apresenta-se variável dentre as avaliações oftálmicas de cães com leishmaniose visceral sendo relativamente comum para alguns (KOUTINAS et al., 1999; AZEVEDO, 2004; BRITO et al., 2006) e de baixa prevalência para outros (PEÑA et al., 2000). Histopatologicamente, um padrão inflamatório do tipo infiltrado granulomatoso ou piogranulomatoso é o encontrado, principalmente, ao redor dos ductos acinares das glândulas lacrimais, ocasionando dilatação e acúmulo retrógrado de secreção (NARANJO et al., 2005). A inflamação do trato uveal é admitida como a alteração mais frequente em casos de leishmaniose visceral canina (CIARAMELLA et al., 1997; FEITOSA et al., 2000; PEÑA et al., 2000; BRITO et al., 2004; BRITO et al., 2006). Ela é geralmente bilateral, podendo se apresentar associada ou não a edema corneal, miose e deposição de fibrina na câmara anterior. No que concerne ao segmento posterior, há poucas citações que elucidam a corioretinite como achado raramente presente (MOLLEDA et al., 1993; PEÑA et al., 2000; BRITO et al., 2006). Relativamente à imunologia oftálmica, sabe-se que o microambiente ocular é hábil em desencadear respostas imunes inatas e adaptativas, apesar de suas barreiras protetoras especializadas. Sendo assim, quando células ativadas do sistema imune alcançam o interior do olho, elas podem causar danos irreversíveis. Em resposta, fatores solúveis e de membrana são capazes de neutralizar a resposta imune e minimizar a inflamação ocular. Por outro lado, estes mesmos fatores são, também, passíveis de desencadear eventos indesejáveis como não impedir o desenvolvimento de tumores ou permitir o crescimento de algum patógeno.

(22) [ . intraocular. Portanto, manterem-se a inflamação e a imunesupressão em níveis controlados, a partir da ocorrência de injúrias, é essencial para salvaguardarem-se os tecidos oculares (BIROS, 2007). Quando macrófagos entram em contato com o humor aquoso ou com o fator imunomodulador de crescimento e transformação β2 (TGF β2) encontrado na câmara anterior, há estimulação de subpopulações de linfócitos CD8+, que se desviarão da sua maneira usual de apresentação de antígenos, suprimindo a imunidade do tipo celular (Th1). Macrófagos funcionalmente alterados irão, ainda, mediar a respostas do tipo humoral (Th2), induzindo à produção de linfócitos B (BIROS, 2007). A análise do humor aquoso, como forma de avaliação da resposta imune humoral em cães com leishmaniose tem sido pouco empregada. Para Roze (1990), os níveis de anticorpos apresentam-se baixos no humor aquoso dos cães sem sinais oftálmicos e elevados naqueles com comprovada inflamação intraocular. Relatam-se, ainda, aumentos na concentração das proteínas totais, bem como nas dosagens de anticorpos anti-L.chagasi no humor aquoso de cães com leishmaniose (NOVALES et al., 1994; BRITO et al., 2006). A PCR dos fluidos oculares é reconhecida como adjuvante no diagnóstico e no tratamento da uveíte infecciosa. Para Harper et al. (2009), a sensibilidade do exame, nestes casos, está relacionada à prevalência da enfermidade na população analisada, à aquisição das amostras e ao transporte das mesmas. Somada à avaliação clínica sugestiva de enfermidade sistêmica em curso, a presença do parasito já foi confirmada em exames histopatológicos de conjuntiva (LAUGIER & VERRO-BOULANGER, 1992; PEÑA et al., 2008), esclera (MOLLEDA et al., 1993; PEÑA et al., 2008), tecido lacrimal (NARANJO et al., 2005), córnea, trato uveal (PEÑA et al, 2008) e retina (DIAS, 1998). Avaliações imunoistoquímicas oferecem importante valor diagnóstico, por detectarem o agente mesmo em tecidos com baixo parasitismo (TAFURI et al., 2004). Por este método, formas amastigotas já foram confirmadas na túnica fibrosa, terceira pálpebra e no trato uveal (BRITO et al., 2010)..

(23) \ . Técnicas minimamente invasivas como a execução de swab conjuntival para detecção de Leishmania (L.) chagasi pela PCR, em cães, também mostraram seu valor diagnóstico (FERREIRA et al., 2008). Alguns relatos são condizentes com a observação de formas amastigotas em esfregaços a partir de swab conjuntival de animais infectados (PEÑA et al., 2000) e em citologia corneal (BRITO et al., 2007).. 2.4 Proteinograma. A análise do quadro protéico sérico é de particular interesse em virtude das propriedades fisiológicas e do seu significado clínico para o diagnóstico de alterações patológicas. Entre os métodos de qualificação e quantificação protéicas destaca-se a eletroforese, que permite uma avaliação aproximada das concentrações de diversas proteínas. O princípio da separação pela eletroforese é baseado na migração das proteínas em um gel durante a aplicação de uma diferença de potencial elétrico (KANEKO et al., 1997). Em meados do século XX, o meio mais comumente empregado era a membrana de acetato de celulose (KOHN, 1957). Nos anos 90, a técnica em gel de agarose foi implantada e tornou-se bastante popular. Atualmente, faz-se uso do gel de poliacrilamida como eficiente meio de separação. Existe, ainda, a eletroforese bidimensional associada a técnicas proteômicas, capazes de separar as proteínas não. somente. em. bandas. ou. grupos,. mas. identificando. centenas. delas. individualmente (ECKERSALL, 2008). Pacientes caninos com leishmaniose visceral apresentam, em sua maioria, hiperproteinemia (KOUTINAS et al., 1999; ALMEIDA et al., 2005; MARCELLO, 2009) associada à hiperglobulinemia e a elevados níveis séricos das proteínas de fase aguda, decorrentes, respectivamente, da forte resposta imune humoral e intensa resposta inflamatória observadas no curso da enfermidade (MEYER & HARVEY, 2004; MARCELLO, 2009). Entretanto, o aumento de globulinas quase sempre se encontra associado à hipoalbuminemia, como resposta à baixa ingestão protéica nos casos de animais em anorexia ou má-nutrição prolongadas, às perdas decorrentes.

(24) TS . de acometimento renal e à deficiência na produção quando há insuficiência hepática. A hipoalbuminemia explica-se também pela inibição da produção de albumina pelo fígado, mediada por citocinas inflamatórias, na tentativa de se evitar a hiperviscosidade plasmática, conquanto há aumento considerável das globulinas (KANEKO et al., 1997). Todavia, não raro os pacientes apresentam níveis protéicos séricos totais normais, pois os valores aumentados de globulinas compensam os valores diminuídos de albuminas (KOUTINAS et al., 1999; WERNER et al., 2004). Quanto à resposta de fase aguda, ela é considerada parte da defesa do sistema inato do hospedeiro, responsável por sua sobrevivência até que se desenvolva. resposta. imune. adquirida. (ECKERSALL,. 2000).. Esta. fase. é. caracterizada por efeitos sistêmicos como febre, leucocitose, aumento do cortisol sérico, mudanças metabólicas (gliconeogênese, catabolismo muscular e lipólise) e alterações nas concentrações de ferro e zinco (CÉRON et al., 2005). A lesão tecidual estimula a liberação de citocinas inflamatórias (interleucina-1, interleucina-6, fator de necrose tumoral-α e interferon-γ) que atuam no fígado, estimulando a produção e liberação das proteínas de fase aguda (PFA) positivas, como o fibrinogênio, a haptoglobina, a ceruloplasmina, a proteína C reativa, a α-2 macroglobulina e a α-1 glicoproteína ácida (MEYER & HARVEY, 2004). A albumina e a transferrina são consideradas PFA negativas, pois diminuem durante a resposta inflamatória aguda (THOMAS, 2000). Em recente estudo experimental, Martinez-Subidella et al. (2011) avaliaram o perfil das concentrações séricas das proteínas de fase aguda, em cães, nos períodos pré-infecção, após infecção experimental com Leishmania infantum e durante três meses de tratamento. Os autores observaram uma resposta de fase aguda bastante rápida, com aumento pronunciado nos níveis protéicos antes mesmo do aparecimento dos sinais clínicos, denotando o possível emprego destas avaliações como marcadores precoces e, também, para o monitoramento do tratamento da doença. Existem relatos condizentes com a produção de PFA também por outras células, além dos hepatócitos, como células do epitélio glandular mamário,.

(25) TT . condrócitos, células pulmonares, intestinais, endometriais, renais, adipócitos, leucócitos, dentre outras, sugerindo uma atuação imune inata e moduladora da resposta. inflamatória. local. por. estas. proteínas. (KJELGAARD-HANSEN. &. JACOBSEN, 2011). Em cada espécie animal existem PFA positivas que apresentam resposta discreta, moderada (α-1 glicoproteína ácida, haptoglobina e ceruloplasmina) e intensa (proteína C reativa e amilóide A sérico). No caso das PFA de resposta intensa, suas concentrações podem elevar-se de 100 a 1000 vezes, alcançando seu pico máximo em 24 a 48 horas após a injúria e diminuindo rapidamente durante a convalescência. Já com as PFA de resposta moderada, a elevação das concentrações séricas chegam a valores cinco a dez vezes acima dos normais, alcançam seu pico máximo de resposta de dois a três dias após a injúria e diminuem seus níveis de maneira menos acentuada do que as anteriores. Para as PFA de resposta discreta, o aumento ocorre de maneira gradual em 50 a 100% dos valores basais séricos (ECKERSALL, 2008). O comportamento peculiar destas proteínas, com elevações e decréscimos detectáveis ao longo do curso de injúrias inflamatórias ou infecciosas, tornam-nas bons marcadores de diagnóstico, prognóstico e monitoramento para o tratamento instituído (MARTÍNEZ-SUBIELA et al., 2002). Entretanto, a dificuldade para o estabelecimento de valores de referência é consenso entre a comunidade científica. Para Céron et al. (2005), fatores como idade, raça, sexo, gestação, variações diárias e rítmo circadiano, ambiente e tratamento médico, dentre outras, são causas de variações individuais nas concentrações de proteínas plasmáticas. Para o mesmo autor, uma forma de se obter um padrão de comparação é o emprego de dosagens seriadas do próprio paciente para avaliação da evolução do quadro. Em veterinária, os estudos sobre as PFA direcionam-se para avaliações espécie-específicas, pois sabe-se que o desenvolvimento de técnicas relativas à uma proteína em determinada espécie, por razões técnicas ou biológicas, não reporta possíveis mensurações a outras espécies. Ainda neste contexto, a especificidade reforça-se quando as mensurações protéicas se fazem em outros fluidos biológicos.

(26) TU . além do sangue, gerando informações sobre a enfermidade no compartimento de interesse (KJELGAARD-HANSEN & JACOBSEN, 2011). .

(27) TV . 3. OBJETIVOS. Com o presente estudo pretendeu-se avaliar em cães sorologicamente positivos para Leishmania: •. a detecção do agente em esfregaço obtido a partir de swab conjuntival;. •. a presença do agente no humor aquoso, pela PCR;. •. a presença do agente na conjuntiva, pela PCR;. •. a ocorrência das proteínas de fase aguda no humor aquoso;. •. a correlação entre o proteinograma sérico de do humor aquoso..

(28) TW . 4. MATERIAL E MÉTODOS. 4.1 Aspectos éticos. Cuidados bioéticos, relativamente às normas da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP/Jaboticabal (protocolo nº 004173/11) foram rigorosamente obedecidos.. 4.2 Animais. Foram avaliados 44 cães com raça e idade variadas, machos e fêmeas, com média de peso igual a 12,05 ± 7,0 kg, sorologicamente positivos para Leishmania spp nos exames ELISA e RIFI (Laboratório Central de Saúde Pública de Araguaína/TO), do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araguaína/TO, que seriam submetidos à eutanásia, no cumprimento de exigência do Ministério da Saúde (Decreto Nº 51.838 de 14 de março de 1963) para controle da enfermidade.. 4.3 Exame oftálmico e subdivisão dos grupos. Após pesagem, procedeu-se ao exame oftálmico com a execução seqüencial, em ambos os olhos, das avaliações: teste lacrimal de Schirmer 1, observação da região periocular, avaliação dos reflexos pupilares à luz (direto e consensual), avaliação da câmara anterior2, tonometria de aplanação3 após instilação de colírio anestésico4, oftalmoscopia direta5, 20 minutos após instilação colírio midriático6 e, finalmente, o teste da fluoresceína7. T. #78#"#()6/#6J4(8(./17L67). .)8/4J K L

(29) 41 V 1014#0;)J K W 0#78$7) 1J..#6'0K67). X &8./17 24)1UFX)0)VSSSJ K.#/0( U.

(30) TX . Os sinais oftálmicos considerados como relacionados à leishmaniose visceral canina foram: teste de Shirmer com valor ≤ 10 mm/min; pressão ocular ≤ 15 mm/Hg; edema, hiperemia e alopecia palpebrais; hiperemia conjuntival; quemose; presença de secreção mucopurulenta ou purulenta; xerose, opacidade ou edema corneal; injeção ciliar; turbidez do humor aquoso; edema de íris e rubeosis iridis ou ambos. A apresentação de, no mínimo, três dos sinais descritos acima permitiu alocar o cão no GRUPO 1 - animais com intercorrências oftálmicas de significação clínica (n=21) e a apresentação de até um destes sinais permitiu colocar o animal no GRUPO 2 - animais sem intercorrências oftálmicas dignas de nota (n=23).. 4.4 Procedimento anestésico Findado o exame oftálmico, canulou-se a veia cefálica com cateter vascular8 para aplicação de acepromazina9 na dose de 0,1 mg/kg. Decorridos cinco minutos, também pela via intravenosa, procedeu-se à injeção de tiopental sódico10 na dose média de 15 mg/kg como agente anestésico geral.. 4.5 Coleta de material biológico. 4.5.1 Amostra de sangue. Anestesiados, os cães foram posicionados em decúbito lateral direito para coleta de 5 mL de sangue por venopunção jugular para dosagem sérica de proteína total.. Y. >"6) >.PJ. 10K67). .916#7 #*086)47J4(8(./17K67). [ 0')1 8(UU JK \ #40SFUaJ0);#8K67). TS )14#08=TFS'J6)78.)K67). Z.

(31) TY . 4.5.2 Punção de linfonodos. Realizou-se punção dos linfonodos mandibular, cervical superficial e poplíteo esquerdos utilizando-se agulha descartável11 em movimentos regulares de avanço e recuo ao interior do órgão. O material obtido foi imediatamente depositado sobre lâmina para microscopia12 e distribuído sobre a mesma em forma de esfregaço.. 4.5.3 Citologia conjuntival Após delicada lavagem do saco conjuntival com solução fisiológica13, utilizouse uma pinça de conjuntiva para preensão e tração da face palpebral da conjuntiva da terceira pálpebra exteriorizando sua porção bulbar. Ato contínuo realizou-se suave escarificação da porção exposta bem como da região do fórnice conjuntival em toda a sua circunferência, empregando-se swab14 descartável estéril. O material obtido foi depositado em movimentos de rolagem sobre uma lâmina de microscopia para exame parasitológico. O procedimento foi realizado no olho esquerdo de cada animal.. 4.5.4 Amostra de humor aquoso. Aproximadamente 0,8 mL de humor aquoso foram obtidos através de paracentese da câmara anterior com agulha descartável 15 acoplada à seringa 16 , inserida tangencialmente à superfície ocular em córnea clara. O obtido foi imediatamente distribuído em dois tubos 17 esterilizados sendo, aproximadamente, 0,3 mL para realização da reação em cadeia da polimerase e, aproximadamente, 0,5 TT. '9.("#7 68;#.SFZS=UXJ /)0746/) 617 14) 1/#=86#/)""#&17 L= 8J67). TV )7)1.2') 1SF\aXSS/K59)4.#=J67). TW <K61"9 87 0"I#1/I8"IJ67). TX '9.(SFWX=TVJK67). TY #6)0'"#7 68;#."#VFS/JK67). TZ ) 61891V[TSJ44#0"16& TU.

(32) TZ . mL, para o proteinograma. O procedimento foi executado em cada olho separadamente. Os tubos foram conservados em freezer a – 20°C, até sua utilização.. 4.5.5 Biópsia conjuntival. Um fragmento de, aproximadamente, 1cm² de conjuntiva da região do fórnice conjuntival ventro-medial, imediatamente caudal à terceira pálpebra, foi excisado com auxílio de tesoura18 e pinça19 específicas para microcirurgia e, imediatamente, acondicionado em tubo20 esterilizado. O procedimento foi executado em cada olho. Os tubos foram conservados em freezer à – 20°C, até o seu processamento.. 4.6 Avaliações laboratoriais. 4.6.1 Dosagem sérica de proteína total. A avaliação sérica da proteína total foi levada a termo no Laboratório Prisma Diagnósticos21, no município de Araguaína/TO e realizada pelo método colorimétrico enzimático automatizado22.. 4.6.2 Exame parasitológico. O exame parasitológico para pesquisa de protozoário em esfregaço foi realizado no Laboratório de Parasitologia da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia – UFT, Araguaína/TO. Empregou-se o princípio de coloração estabelecida. T[. #7196#78 18846 10,908);L8## 01==J67). )0!"# 10,908); 1/"#08#"#.) "L8##. 01==J67). US ) 61891V[TSJ44#0"16&J UT

(33) SUUVZSXYSSST\S UU .>/497WSS#LJ67). T\.

(34) T[ . por Romanosvsky23 e as lâminas foram avaliadas, à microscopia de luz24, em lente de imersão com aumento de 1000x. A observação de uma única forma amastigota em quaisquer das lâminas refletiu resultado positivo para o animal em questão. Todas as lâminas de esfregaços de linfonodos e aquelas obtidas a partir do swab conjuntival foram analisadas, independentemente da positividade apresentada pelo paciente em questão.. 4.6.3 Proteinogramas. As avaliações relativas às dosagens de proteínas totais do humor aquoso e os proteinogramas foram realizadas no Laboratório de Apoio à Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP/Jaboticabal. O proteinograma sérico foi obtido pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Como padrão de referência utilizou-se uma solução marcadora. 25. contendo pesos moleculares. conhecidos. Obtido o fracionamento protéico, o gel foi imerso em uma única solução (azul de Coomassie 2%) para fixação e coloração, durante 2 horas. Após a fixação/coloração procedeu-se à descoloração do gel em solução contendo metanol, ácido acético e água com trocas sucessivas até que as frações protéicas estivessem nítidas para serem determinadas em densitômetro computadorizado26. Os géis foram armazenados em frascos plásticos completamente imersos em solução de ácido acético a 7%. A mensuração das proteínas totais do humor aquoso foi realizada empregando-se um kit comercial27 com leituras em espectofotômetro28. UV. 028) 14)"1LJ67). )1;.LJ67). UX )'/6-#6 L)'/K UY #07)81/#8#6\VSTL()/"?9J

(35) 41 UZ #07)4618L8#78J67). U[ 59#78)1KUSSSL8#78)'0278) J67). UW.

(36) T\ . Considerando-se os baixos níveis protéicos totais obtidos no humor aquoso quando comparados aos séricos, empregou-se a liofilização de 300µL de cada amostra de humor aquoso para nova suspensão com 20 µL de solução tampão salina fosfato (PBS), visando a aumentar a concentração protéica nas amostras para posteriormente, submetê-las à eletroforese e demais procedimentos, de consoante com o que fora descrito para avaliação sérica. O tempo para coloração/fixação dos géis obtidos das amostras de humor aquoso foi de 12 horas.. 4.6.4 Diagnóstico molecular. O diagnóstico molecular a partir da Reação em Cadeia de Polimerase foi realizado no Laboratório de Doenças Parasitárias da UFRPE – Recife/PE.. 4.6.4.1 Extração do DNA. A extração do DNA da amostra conjuntival e do humor aquoso foi realizada empregando-se um kit de extração29 e seguindo-se as especificações do fabricante.. 4.6.4.2 Amplificação do DNA de Leishmania spp. Foi preparada uma mistura contendo 2,5 µL de tampão (200 mM Tris-HCl; 500 mM KCl; pH 8,4), 1 µL de MgCl2 (1,5 mM), 2 µL de dNTPs (10 mM cada), 2,5 µL de cada primer (10 pmol/µL), 0,25 µL de Taq polimerase (5U/µL) e quantidade suficiente de água multidestilada e deionizada de modo a se obter um volume total de 25 µL, dos quais 5 µL constituíam-se de DNA (10 ng/µL). As reações de amplificação foram conduzidas em termociclador30 da seguinte maneira: 1 ciclo D 94°C – 5 min.; A 65°C – 1 min; E 72 °C – 1 min., 29 ciclos D 94°C – 1 min.; A 65°C – 1 min; E 72°C – 1 min. e E final 72°C – 5 min.. U\. P. . /4 .11")0) )8M N

(37) K#7#6 (KUSS. VS.

(38) US . Os primers utilizados para a PCR de Leishmania spp (L1 e L2) foram aqueles descritos por Michalsky et al. (2002): L1: (5’ – GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA – 3’) e L2: (5’ – GGC CCA CTA TAT TAC ACC AAC CCC – 3’). Para todas as PCRs realizadas foram utilizados controles e negativos. Como controle positivo procedeu-se a extração de DNA de amostras de promastigotas de L. (L.) chagasi mantidas em meio de cultura no referido laboratório. O controle negativo consistiu-se de água multidestilada e deionizada.. 4.6.4.3 Amplificação do complexo Leishmania (Leishmania) donovani. Foi preparada uma mistura contendo 2,5 µL de tampão (200 mM Tris-HCl; 500 mM KCl; pH 8,4), 1 µL de MgCl2 (1,5 mM), 2 µL de dNTPs (10 mM cada), 2,5 µL de cada primer (10 pmol/µL), 0,25 µL de Taq polimerase (5U/µL) e quantidade suficiente de água multidestilada e deionizada de modo a se obter um volume total de 25 µL, dos quais 5 µL constituíam-se de DNA (10 ng/µL). As reações de amplificação foram conduzidas em termociclador com ciclos de: 1 ciclo D 94°C – 2 min, e 30 ciclos D 94°C – 20 seg, A 60 °C – 20 seg, E 72°C – 30 seg, E final 72°C – 5 min . Os primers utilizados para a PCR do complexo L. (L.) donovani (MC1 e MC2), foram aqueles descritos por Cortes et al. (2004): MC1: (5’ – GTT AGC CGA TGG TGG TCT TG – 3’) e MC2: (5’ – CAC CCA TTT TTC CGA TTT TG – 3’). 4.6.4.4 Amplificação do complexo Leishmania (Viannia) braziliensis. Em um volume final de 25 µl foi usada a seguinte mistura: 2,5 µL de Tampão (200 mM Tris-HCl; 500mM KCl; pH 8,4), 1,5 µLde MgCl2 (1,5 mM), 2 µL de dNTPs (10mM cada), 2,5 µL de cada primer (10 pmol/µL), 0,125 µL de Taq polimerase (5U/µL), quantidade suficiente de água ultrapura para completar 20 µL e 5 µL de DNA (10ng/µL). As reações de amplificação foram conduzidas em termociclador com ciclos de: 1 ciclo D 95°C – 5 min, e 35 ciclos D 94°C – 1 min, A 60,5 °C – 1 min, E 72°C – 1 min, E final 72°C – 10 min . Para a reação foram usados os primers B1: (5’ –.

(39) UT . GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG – 3’) e B2: (5’ – CTA ATT GTG CAC GGG GAG G – 3’).. 4.6.4.5 Eletroforese. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio (0,5 μl/mL) em solução tampão de corrida TEB 1X pH 8,0 (44,58 M Tris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mM EDTA). A eletroforese foi realizada a 100 V sob corrente de 50 mA, durante 90 minutos, fazendo-se uso de um marcador de peso molecular de 100 pares de bases, bem como de controle positivo e negativo como parâmetros para melhor caracterização. dos. produtos. amplificados.. Após as corridas, os géis foram. visualizados e analisados por meio de um transluminador ultravioleta acoplado a um computador com programa de análise de imagens31.. 4.7 Análise estatística. Relativamente aos dados não paramétricos, realizou-se análise estatística descritiva com o cálculo dos percentuais de ocorrência das observações. Na análise dos parâmetros cujos resultados definem-se como positivo ou negativo foi empregado o teste exato de Fisher para comparações entre os grupos. Empregou-se, ainda, o oddsratio (Razão de Chance) para determinação da interferência de grupo para a positividade no exame parasitológico e na PCR de conjuntiva. Os dados paramétricos foram analisados por meio de teste T não pareado visando à comparação entre os grupos 1 e 2. Para avaliação da intensidade da associação entre as concentrações protéicas séricas e do humor aquoso, empregou-se o teste de correlação de Pearson. VT. '.#K># F868'#0#PF.

(40) UU . Para todas as análises, considerou-se p < 0,05 como sendo significativo. A análise estatística foi realizada em software específico32.. VU. 61'6/ 64(4"6)7/XISVK)0"1<7F 64(4"1&8<6#PF0)#'1F.)&260)FUSS\.

(41) UV . 5. RESULTADOS. 5.1 Achados ao exame oftálmico. As médias estimadas e desvio padrão para a variável produção lacrimal aquosa, nos olhos direito ou esquerdo, dos cães dos grupos 1 e 2, encontram-se apresentadas na Tabela 1. Houve diferença significativa entre os grupos (p < 0,05). Não houve diferença significativa entre os olhos direito e esquerdo tanto para o grupo 1 (p= 0,1627) quanto para o grupo 2 (p= 0,5993). $")#78)/"#"#7;)14"61";6);#.461"9!1. 6)/.5917F0171.(17")6#)8119#759#6"1 4617'69417T#UF#/ #77161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#IJL

(42) 18) .FJ67).FUSTTI #78#"# ()6/#6M//J/)0N. .(1. .16"#4. 6941T. 6941U. )6#)81. ZFXXeWFUY. TWFYXeVFU\. dSFSSST. 759#6"1. \FWSeVF\X. TWFTVeVFV[. dSFSSST. Legenda: grupo 1 – animais com intercorrências oftálmicas de significação clínica; grupo 2 – animais sem intercorrências oftálmicas dignas de nota.. As médias estimadas e o desvio padrão obtido na aferição da pressão intraocular, para os olhos direito ou esquerdo, nos cães dos grupos 1 e 2 encontramse apresentadas na Tabela 2. Houve diferença altamente significativa entre os grupos (p < 0,05). Não houve diferença significativa entre os olhos direito e esquerdo tanto para o grupo 1 (p= 0,7860) quanto para o grupo 2 (p=0,8527). $")7#78)/"7#"#7;)14"6146;6);#.46#771)0861 9.6F0171.(17")6#)8119#759#6"1 4617'69417T#UF#/ #77161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#IJL

(43) 18) .FJ67).FUSTTI .(1. 6#771)0861 9.6. .16"#4. 6941T. 6941U. )6#)81. TUFW[eWF[X. T\FXUeXFU\. dSFSSST. 759#6"1. TUF[YeWFTX. T\F[VeXFZX. dSFSSST. Legenda: grupo 1 – animais com intercorrências oftálmicas de significação clínica; grupo 2 – animais sem intercorrências oftálmicas dignas de nota..

(44) UW . Demais condições oftálmicas apresentaram ocorrência bilateral em 19 animais (90,5%) do grupo 1 e em 7 pacientes (30,4%) do grupo 2. No geral, e em ordem de frequência, quando considerados os animais do grupo 1, foram: hiperemia conjuntival (14/21), ceratoconjuntivite seca (13/21), uveíte anterior (10/21), blefarite difusa (07/21), alopecia periocular (05/21), ceratoconjuntivite (04/21) e conjuntivite (01/21). Quanto aos pacientes do grupo 2, encontrou-se hiperemia conjuntival de grau leve em 30,4% (7/23). Na Tabela 3, encontra-se a frequência absoluta e relativa das alterações oculares encontradas nos animais do grupo 1. ("171 9.6#7#/&6#59%0 )71.98M0N#6#.8);MaNF17#6;"17017'69417T#UF#/ #7 7161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#I 6941T 6941U ("11 9.6 0 a 0 a #681 10,908);)8#7# . TZ. [SF\. K. K. )4#6#/) 10,908);.. TW. YYFY. SZ. VSFW. ;#*8#08#6)16. TS. WZFY. K. K. .#&6)8#")&97. SZ. VVFV. K. K. .14# )4#6)1 9.6. SX. UVF[. K. K. 10,908);)8#. ST. WFZ. K. K. Legenda: grupo 1 – animais com intercorrências oftálmicas de significação clínica; grupo 2 – animais sem intercorrências oftálmicas dignas de nota.. A alopecia periocular, observada em 23,8% (5/21) do grupo 1, apresentava. aspecto ressecado com descamação cutânea superficial. Em dois dos sete cães com blefarite difusa (28,6%), observaram-se edema, hiperemia e meibomite. Hiperemia conjuntival associada à presença de secreção mucupurulenta, próprias da conjuntivite, foram observadas em um paciente (4,7%) do grupo 1. A associação destes sinais à xerose corneal e valor de teste de Schirmer I ≥ 14 mm/min, conferiu a 80,9% (17/21) do grupo 1 o diagnóstico de ceratoconjuntivite seca. Destes, 29,4% (5/17) apresentaram teste de Schirmer I < 5 mm/min, caracterizando a enfermidade em grau severo. Nos cães do grupo 2 encontrou-se hiperemia conjuntival como achado ocular isolado em 7 animais (30,4%)..

(45) UX . Relativamente à uveíte (anterior), sua manifestação se deu em 10 animais (47,6%) do grupo 1, com hiperemia, edema, miose e valores de pressão intraocular abaixo de 14 mm/Hg. Três destes pacientes apresentavam, ainda, injeção ciliar. Não foram encontradas alterações no segmento posterior de qualquer um dos animais. Nenhum dos pacientes exibiu ceratite ulcerativa.. 5.2 Exame parasitológico. Realizado com o fito de avaliar a presença de formas amastigotas de Leishmania em amostras dos linfonodos mandibular, cervical superficial e poplíteo de cães sorologicamente positivos para leishmaniose, os resultados (positivo ou negativo) encontram-se apresentados na Tabela 4. As parcelas ausentes (a*) referem-se ocorrência de material insuficiente para o diagnóstico. Ao serem consideradas as três avaliações realizadas para cada indivíduo, 100% dos animais do grupo 1 e 95,5 % dos animais do grupo 2 apresentaram positividade para o exame parasitológico em, pelo menos, um dos linfonodos examinados. Ao se considerarem todos os animais e o conjunto de linfonodos avaliados, a positividade do teste valor igual a 97,7%..

(46) UY #79.8"1F#/&6#59%0 )71.98M0N#6#.8);MaNF417)8);1190#'8);1F46

(47) 744 01#=/#467)81.2') 1"17.)0&101"17/0")9.6F #6;) .794#6&) ).#414.*8#1"# #7 7161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#IJL6'9*0FJ67).FUSTTI .16"#4 7869896 6941 O & a & a a .)0&101"1 /0")9.6 .)0&101"1 #6;) . 794#6&) ). .)0&101"1 414.*8#1. 4#.1/#017 9/.)0&101"1. T. TY. [WFU. SV. TXF[. TSSFS. SU. U. TV. YTF\. S[. V[FT. TSSFS. SU. 18.. U\. ZUFX. TT. UZFX. TSSFS. SW. T. US. TSSFS. S. S. TSSFS. ST. U. TX. ZTFW. SY. U[FY. TSSFS. SU. 18.. VX. [XFW. SY. TWFY. TSSFS. SV. T. T[. \SFS. SU. TSFS. TSSFS. ST. U. TZ. [XFS. SV. TXFS. TSSFS. SV. 18.. U\. ZUFX. TT. UZFX. TSSFS. SW. T. UT. TSS. SS. SS. TSSFS. SS. U. UT. \XFX. ST. UFX. TSSFS. ST. 18.. WU. \ZFZ. ST. UFV. TSSFS. ST. SFTYU[ SFSUSZ TFSSSS TFSSSS . #'#0"H 6941TL0)/)7 1/)08#6 166%0 )71&8./) 7"#7)'0)&) !1 .*0) G 6941UL0)/)77#/)08#6 166%0 )71&8./) 7 ")'07"#018GOc46 #.797#08#7G;.16"#4464.) !1"1#78##=81"#)7 (#6I. A avaliação parasitológica de esfregaços a partir de swab conjuntival mostraram positividade em 60% dos cães do grupo 1 em 38,1% dos cães do grupo 2 (Tabela 5). Não houve diferença significativa entre os grupos estudados (p= 0,2167). As parcelas ausentes (a*) referem-se à ocorrência de material insuficiente para o exame. Aplicou-se a análise oddsratio (razão de chance) para a positividade entre os grupos 1 e 2, a qual expressou valor igual a 2,438..

(48) UZ #79.8"1#/&6#5:%0 )71.98M0N#6#.8);MaNF417)8);1190#'8);1F46

(49) 01#=/#467)81.2') 1"##7&6#'!118)"1468)6"# 10,908);.F#/ #77161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#IJL6'9*0FJ67).F USTTI 6941 O ;.16"#4 0 a 0 a T. TU. YSFS. S[. WSFS. TSSFS. ST. U. S[. V[FT. TV. YTF\. TSSFS. SU. 18.. US. W[F[. UT. XTFU. TSSFS. SV. SFUTYZ. UFWV[. K. K. #'#0"H 6941TL0)/)7 1/)08#6 166%0 )71&8./) 7"#7)'0)&) !1 .*0) G 6941UL0)/)77#/ )08#6 166%0 )71&8./) 7")'07"#018GOc46 #.74#6")"7I. 5.3 Diagnóstico molecular. 5.3.1 Reação em cadeia da polimerase de fragmento conjuntival. A Tabela 6 expressa os resultados positivo (unilateral ou bilateral) ou negativo para reação em cadeia da polimerase realizadas em amostras de fragmento conjuntival. Encontrou-se diferença significativa entre os grupos 1 e 2 quando considerada a positividade na PCR de conjuntiva (p = 0,0002). A análise oddsratio para positividade, em tal parâmetro, nos cães do grupo 1 frente àqueles do grupo 2 foi igual a 14,03 (p< 0,0001). A Figura 1 ilustra a identificação de bandas positivas para Leishmania (L.) chagasi, quando comparadas ao controle positivo (C+), em seis das 13 amostras extraídas de fragmento conjuntival de cães com sorologia positiva para leishmaniose..

(50) U[ . #79.8"1#/&6#59%0 )71.98M0N#6#.8);MaNF417)8);1190#'8);1F461.(1")6#)81F1.(1 #759#6"119)0");*"91F"46

(51) #//1786 10,908);."# #7 7161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#IJ# )&#FK67).FUSTTI .16"#4 )'0278) 1 6941 O 0 a 0 a a 1.(1")6#)81 1.(1#759#6"1 )0");*"91. T. TZ. [TFS. SW. T\FS. TSSFS. SS. U. SX. UVF[. TY. ZYFU. TSSFS. SU. T. TY. [SFS. SW. USFS. TSSFS. ST. U. SX. UTFZ. T[. Z[FV. TSSFS. SS. T. T\. \SFX. SU. \FX. TSSFS. SS. U. S[. VWF[. TX. YXFU. TSSFS. SS. SFSSSX. TVFYS. SFSSSU. TWFWS. SFSSSU. TZF[T. #'#0"H 6941TL0)/)7 1/)08#6 166%0 )71&8./) 7"#7)'0)&) !1 .*0) G 6941UL0)/)77#/)08#6 166%0 )71&8./) 7")'07 "#018GOc46 #.797#08#7G;.16"#4464.) !1"1#78##=81"#)7 (#6I. . . .

(52) I.#861&16#7##/'#."#'617#Ta/17860"10"7#74# *&) 746

(53) M/17867"#TVTYFUT#UXN"#8# 8"7427#=86!1"#"#&6'/#081 10,908);."# #7 1/7161.1')417)8);46.#)7(/0)17#I0"#HLH 10861.# 0#'8);1GbH 10861.#417)8);1#H/6 "16"#4#71/1.# 9.6IJ# )&#FL 67).FUSTTI.

(54) U\ . 5.3.2 Reação em cadeia da polimerase em humor aquoso. Não houve detecção do parasito em quaisquer das amostras analisadas. Como exemplificado na Figura 2, não observou-se banda compatível com o resultado positivo na detecção do parasito pela PCR, após extração do DNA do humor aquoso de cães com sorologia positiva para leishmaniose. . .

(55) I.#861&16#7##/'#."#'617#Ta7#/#;)"%0 )"#0"7#74# *&) 7 46

(56) #//17867"#(9/1659171"# #7 1/ .#)7(/0)17#I0"#HLH 10861.#0#'8);1GbH 10861.#417)8);1#H /6 "16"#4#71/1.# 9.6IJ# )&#FL67).FUSTTI. .

(57) VS . 5.4 Proteinograma. Uma vez escaneados os géis (Figura 3) obtidos após a eletroforese, procedeu-se a identificação das proteínas de interesse clínico nos traçados densitométricos (Figura 4) para determinação da concentração de cada proteína.. . . 4. . 4.

(58) I $)7ML NF427 1.16!1#"#7 1.16!1F18)"17468)6"#.#861&16#7#"#/178677$6) 7MN# "17(9/16#7591717MNF"# #7 1/7161.1')417)8);46.#)7(/0)17#I6!"14"61M4N 1/ 4#717/1.# 9.6#7 10(# )"17#/ IJL

(59) 18) .FJ67).FUSTTI.

(60) VT . . .

(61) 6!"1"#07)81/$86) 17$6) 1MNF 1/UV4) 174618$) 17)"#08)&) "17#"1(9/1659171MNF 1/T[4) 174618$) 17)"#08)&) "17#/ #77161.1') /#08#417)8);1746.#)7(/0)17#I JL