Expressão gênica da resposta à seca em cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUACÃO EM GENÉTICA. MARCELO OLIVA SANTANA. EXPRESSÃO GÊNICA DA RESPOSTA À SECA EM CANADE-AÇÚCAR (Saccharum spp.). Recife 2011.

(2) MARCELO OLIVA SANTANA. EXPRESSÃO GÊNICA DA RESPOSTA À SECA EM CANADE-AÇÚCAR (Saccharum spp.). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação Strictu sensu do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Genética.. Orientador: Prof. Dr. Tercilio Calsa Jr. Coorientadora: Dra. Maria Clara Pestana Calsa. Recife 2011.

(3) Santana, Marcelo Oliva Expressão gênica da resposta à seca em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) / Marcelo Oliva Santana. – Recife: O Autor, 2011. 91 folhas : il., fig., tab. Orientador: Tercilio Calsa Jr Co-Orientador: Maria Clara Pestana Calsa Dissertação (mestrado) – Universidade Pernambuco. CCB. Genética, 2011. Inclui bibliografia, anexo e apêndices. Federal. de. 1. Regulação de expressão gênica 2. Cana-de-açúcar – Melhoramento genético 3. Plantas – Efeito da seca I. Título. 572.865 4. CDD (22.ed.). UFPE/CCB-2011-129.

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(5) Aos meus pais, Angela Cristina e José Carlos, pelo amor e dedicação incondicionais. À minha esposa, Luciana Oliveira Oliva, pelos momentos de companheirismo..

(6) AGRADECIMENTOS. Aos meus pais, José Carlos e Angela Cristina, por terem me criado com muito amor, carinho, dedicação, sempre me ensinando, apoiando-me e estando presentes em todos os momentos da minha vida. A vocês, dedico o meu maior agradecimento. A minha esposa, Luciana Oliveira Oliva, companheira de todas as horas, que sempre me deu amor, carinho e força para seguir em frente. Com você, posso dizer que sou muito feliz e é com você que quero passar o resto da minha vida. A você, dedico o meu amor incondicional. Ao meu orientador Prof. Dr. Tercilio Calsa Junior e minha co-orientadora Dra. Maria Clara. Pestana. Calsa. do. Laboratório. de. Genômica. e. Proteômica. de. Plantas/Genética/UFPE pela oportunidade e importantes ensinamentos na pesquisa científica e auxílio em todo o desenvolvimento do projeto. A vocês, meus sinceros agradecimentos. À Profa. Dra. Rejane Mansur (Laboratório de Fisiologia Vegetal/Biologia/UFRPE), ao Prof.. Dr.. Marcos. Morais. (Laboratório. de. Genética. Molecular. de. Microorganismos/Genética/UFPE) e a Profa. Dra. Ana Christina (Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal/Genética/UFPE) pelas importantes contribuições como membros da banca. À Profa. Dra. Rejane Mansur agradeço também por ter disponibilizado os equipamentos de análise fitofisiológica bem como aos seus orientados pela ajuda no desenvolvimento do trabalho em casa de vegetação. Ao Prof. Dr. Marcos Morais também pelas importantes contribuições da pré-banca além de permitir o uso do equipamento fotodocumentador. Aos seus orientados Adauto e Rafael pela ajuda na utilização deste equipamento. Ao Prof. Dr. Antônio Carlos (Laboratório de Terapia Experimental/Genética/UFPE) por ter permitido a utilização dos equipamentos espectrofotômetro e Rotor Gene 6000, importantes para a realização dos experimentos in vitro. Além disso, agradeço.

(7) a técnica Heide, deste mesmo laboratório, pelas imensas contribuições para a realização das análises de RT-qPCR. À Estação Experimental de Cana-de-açúcar de Carpina/RIDESA por ter fornecido os materiais vegetais. À todos do Laboratório de Genômica e Proteômica de Plantas (LGPP), em especial a Cinthya por ter ajudado imensamente nos meus experimentos em casa de vegetação e laboratório. Ao meu irmão, Marcio Oliva, por transmitir um pouco do seu conhecimento e experiência profissional sempre que nos encontramos. Às minhas avós, D. Laurinete, que hoje não está mais presente, porém continua viva em nossos corações, e D. Bernadete, que toda vez que a encontro é sempre uma alegria. Aos meus sogros, José Carlos e Edna Lucia, pelo carinho e amizade, sempre me tratando como um filho. À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) pela concessão da bolsa de Mestrado e pelo apoio financeiro dado ao projeto. Ao CNPq pelo apoio financeiro dado ao projeto. A todos os meus familiares e amigos que de maneira direta ou indireta contribuíram para que este sonho se tornasse realidade... A todos aqueles que torceram por mim... O meu sincero, obrigado!.

(8) “No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade”. Albert Einstein..

(9) RESUMO O cultivo de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é de grande importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol, sendo o déficit hídrico um dos principais fatores limitantes do crescimento e produtividade desta cultura. A crescente demanda por biocombustíveis tem exigido o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar geneticamente melhoradas e mais eficientes no uso da água. A partir de dados SAGE de cana-de-açúcar previamente anotados, oriundos de bibliotecas de amostras de colmo de plantas cultivadas em campo, e contrastantes para época chuvosa ou seca, foram identificados in silico transcritos potencialmente associados a respostas ao estresse hídrico. Destes, vinte e um genes (incluídos três genes de referência) foram selecionados para análise de expressão gênica e validação via transcrição reversa seguida de PCR em temporeal (RT-qPCR) utilizando duas variedades de cana-de-açúcar contrastantes à resposta ao estresse hídrico, RB92579 (tolerante) e RB72454 (sensível). Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação sob dois tratamentos hídricos diferentes (seco e irrigado). Para cada gene, três réplicas biológicas foram executadas, sendo cada RT-qPCR realizada em triplicata. A especificidade e ausência de contaminação foram avaliadas pela curva de dissociação das PCRs e controles negativos, respectivamente. Para a normalização e processamento dos dados de RT-qPCR, foram utilizados três genes de referência sendo estes analisados quanto a estabilidade utilizando o software geNorm. Da coleção de 46.536 tags distintas analisadas em SAGE, 45,0% mostraram-se inibidas pela seca, 6,3% induzidos pela seca, e 48,7% não apresentaram variação de ratio significativa (0,5 < ratio < 2,0). Dos 21 transcritos selecionados para validação experimental como potencialmente responsivos ao estresse hídrico somente 15 e 12 genes foram monitorados via RT-qPCR em folha e raiz respectivamente. Essas análises resultaram que 2/3 dos genes estudados (Dhyn_98, ERD4, Sip, Dgt, MARK, Pox, Hd-zip, Hsp70, PPlase e DnaK) foram diferencialmente expressos sob seca (p<0,05), sendo que 40% e 33,3% deles apresentaram, nas variedades tolerante e sensível, respectivamente, a mesma tendência de expressão que aquela já descrita via SAGE para a espécie. Além disso, em função dos resultados de RT-qPCR, dois genes mais associados com a resposta de tolerância à seca foram selecionados para futura determinação de suas sequências nucleotídicas completas e construções gênicas. Os genes identificados para tolerância a seca poderão ser utilizados não só nos programas de melhoramento das principais culturas de importância econômica, mas também poderão ajudar a entender as redes gênicas envolvidas na tolerância das plantas ao estresse hídrico.. Palavras-chave: RT-qPCR, SAGE, estresse hídrico, seca..

(10) ABSTRACT The cultivation of sugarcane (Saccharum spp.) is of great economic importance to Brazil by the production of sugar and ethanol, but water deficit is one of the main limiting factors for growth and productivity of this crop. Growing demand for biofuels has recquired the development of sugarcane varieties genetically improved and more efficient in water use. Based on previous sugarcane SAGE annotated data, from stem samples of plants grown in the Field, and contrasting for rainy or dry cultivation season, were identified in silico transcripts potentially associated to drought tolerance responses. From these, twenty-one genes (including three reference genes) were selected for expression analysis through reverse transcription followed by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) on two sugarcane varieties contrasting for drought tolerance, RB92579 (tolerant) and RB72454 (sensitive). The experiments were conducted in greenhouse under two different water treatments (irrigated and dry). For each gene, three biological replicates were performed, and each RT-qPCR was performed in triplicates. The specificity and absence of contamination were assessed by dissociation curve of PCR and negative controls, respectively. For normalization and RT-qPCR data processing, three reference genes were used, whose stability was analyzed using software geNorm. From the collection of 46,536 distinct tags analyzed in SAGE database, 45.0% showed to be inhibited by drought, 6.3% were drought-induced, and 48.7% showed no significant variation ratio (0.5 < ratio < 2.0). Out from 21 transcripts selected for experimental validation as potentially responsive to water stress, only 15 and 12 were monitored by RT-qPCR in leaves and roots, respectively. These analyses resulted that 2/3 of studied genes (Dhyn_98, ERD4, Sip, Dgt, MARK, Pox, Hd-zip, Hsp70, PPlase e DnaK) were differentially expressed under drought (p<0,05), and 40% and 33.3% of them presented, respectively in tolerant and sensitive varieties, the same expression profile than that already described via SAGE for the species. In addition, according to RT-qPCR results, two genes more associated to drought tolerance response were selected to future determination of their complete nucleotide sequences and gene constructions. Genes identified for drought tolerance may be used not only in breeding programs of main crops of economic importance, but also to help the understanding the gene networks involved in plant tolerance to water stress. Key words: RT-qPCR, SAGE, water stress, drought..

(11) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Página Figura 1 – Ilustração de uma cana-de-açúcar (Saccharum spp.) evidenciando. o. sistema. de. numeração. foliar. de. van. Dillewijn. (1952)............................................................................................................... 20. Figura 2 – Cultivo dos rebolos em bandejas de polietileno e transferência das. plantas. juvenis. de. cana-de-açúcar. (Saccharum. spp.). para. vasos................................................................................................................ 35. Figura 3 – Medição do potencial hídrico foliar em câmara de pressão Scholander (A) e coleta de solo para cálculo da medida da umidade relativa do solo (B)........................................................................................... 36. Figura 4 – Esquema ilustrativo do procedimento de coleta de folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para as análises moleculares. A e B – corte de folha e raiz, respectivamente; C e D – acondicionamento em tubos Falcon; E – conservação do material vegetal em nitrogênio líquido............................................................................................................... 37. Figura 5 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de folha.................................................................................................................. 38. Figura 6 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de raiz..... 39. Figura 7 – Número de tags identificados como sendo inibidos (ratio ≤ 0,5), sem variação (0,5 < ratio < 2,0) e induzidos (ratio ≥ 2,0) pela seca, a partir do banco de dados SAGE para cana-de-açúcar (Saccharum spp.) (CALSA Jr., 2006)……………………………………........................................................ 43. Figura 8 – Análise de eletroforese em gel de agarose 1% a partir de RTPCR mostrando a amplificação dos genes para teste dos primers................ Figura 9 – Potencial hídrico foliar das duas variedades (RB92579 e RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos. 47.

(12) irrigado e seco.................................................................................................. 47. Figura 10 – Umidade relativa do solo das duas variedades (RB92579 e RB72454) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) sob os tratamentos irrigado e seco.................................................................................................. 48. Figura 11 – Sinais visíveis em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) submetidas aos tratamentos de irrigação (I) e seca (S). (A) Parte aérea; (B) solo e (C) sistema radicular........................................................................ 48. Figura 12 – Integridade do RNA total extraído de folha das variedades RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da análise por eletroforese em gel de agarose 1%............................................... 50. Figura 13 – Integridade do RNA total extraído de raiz das variedades RB92579 e RB72454 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da análise por eletroforese em gel de agarose 1%............................................... 50. Figura 14 – Confirmação da síntese de cDNA em amostras de folha via RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4............................................................ 50. Figura 15 – Confirmação da síntese de cDNA em amostras de folha via RT-PCR utilizando o gene HK.rpl35_4............................................................ 51. Figura 16 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes selecionados como possíveis genes de referência em folha para cana-deaçúcar (Saccharum spp.)................................................................................. 54. Figura 17 – Valores médios de estabilidade de expressão (M) dos genes selecionados como possíveis genes de referência em raiz para cana-deaçúcar (Saccharum spp.)................................................................................. 55. Figura 18 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em folha via PCR em tempo real.................... 56. Figura 19 – Genes diferencialmente expressos por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo real...................... 57.

(13) Figura 20 – Genes que não se expressaram significativamente por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em folha via PCR em tempo real........................................................................................................ 58. Figura 21 – Genes que não se expressaram significativamente por seca nas variedades tolerante e/ou sensível de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) a partir da expressão quantitativa relativa em raiz via PCR em tempo real................................................................................................................... 59. Figura 22 – Modelo molecular e fisiológico representativo (adaptado de WANG et al., 2003) dos mecanismos de resposta ao déficit hídrico para os genes que apresentaram diferenças significativas na expressão em folha. O tamanho das setas é proporcional ao nível de indução do gene por seca na variedade tolerante (verde) e sensível (vermelha).. Os números. sobrescritos indicam as participações desses genes nos tipos de mecanismos de resposta à seca...................................................................... 67.

(14) LISTA DE TABELAS. Página Tabela 1 – Agrupamento por categoria e anotação das tags/genes no banco de dados TIGR Gene Index de cana-de-açúcar selecionadas a partir de bibliotecas SAGE para a análise de expressão gênica via RTqPCR................................................................................................................ 44. Tabela 2 – Pares de iniciadores (primers) desenhados pela seleção in silico a partir dos dados SAGE associados a genes de resposta à seca.................................................................................................................. 46. Tabela 3 – Quantificação e qualidade do RNA extraído de amostras de folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), sob seca ou irrigação nas. variedades. tolerante. (RB92579). e. sensível. (RB72454)........................................................................................................ 49. Tabela 4 – Eficiências das reações e R2 (coeficiente de correlação de Pearson). correspondentes. aos. genes. utilizados. via. RT-. qPCR................................................................................................................ 51. Tabela 5 – Valores médios ± desvio padrão de Cqs resultantes das análises de RT-qPCR em tempo real quantitativa em folha e raiz dos genes selecionados. a. partir. do. banco. de. dados. SAGE............................................................................................................... 53. Tabela 6 – Razão de expressão entre os tratamentos seca/irrigado dos genes. significativamente. expressos. por. seca. via. RT-qPCR. e. SAGE............................................................................................................... 60.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS. Sigla. Definição. cDNA. Ácido desoxirribonucléico complementar ao mRNA. cDNA-AFLP. cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfismo de tamanho de fragmento amplificado. EECAC. Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina. EST. Etiqueta de sequência expressa. IVB. Índice de Velocidade de Brotação. mRNA. Acido ribonucléico mensageiro. pb. Pares de base. PCR. Reação em cadeia da polimerase. qPCR. Reação em cadeia da polimerase quantitativo. RT-PCR. Transcrição reversa seguida de PCR. RT-qPCR. Transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo-real. SAGE. Serial Analysis of Gene Expression - Análise serial da expressão gênica. TIGR. The Institute for Genome Research - Instituto de Pesquisas Genômicas. Tm. Temperatura de dissociação. TPT. Tags por mil.

(16) SUMÁRIO. Página DEDICATÓRIA………………………………………………………………. iv. AGRADECIMENTOS……………………………………………………….. v. EPÍGRAFE…………………………………………………………………..... vii. RESUMO…………………………………………………………………….... viii. ABSTRACT………………………………………………………………….... ix. LISTA DE ILUSTRAÇÕES………………………………………………….. x. LISTA DE TABELAS………………………………………………………... xiii. LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS............................ xiv. 1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 17. 2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 19. 2.1. Importância econômica da cana-de-açúcar (Saccharum spp.)......... 19. 2.2. Aspectos gerais e melhoramento da cana-de-açúcar ...................... 20. 2.3. Estresse hídrico e mecanismos de resposta em plantas.................. 22. 2.4. Ferramentas de análises transcricionais........................................... 25. 2.5. Aspectos gerais da metodologia RT-qPCR...................................... 26. 3. OBJETIVOS......................................................................................... 31. 3.1. Objetivo Geral................................................................................... 31. 3.2. Objetivos Específicos........................................................................ 31. 4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 32. 4.1. Identificação e seleção de transcritos in silico.................................. 32.

(17) 4.2. Desenho de iniciadores..................................................................... 33. 4.3. Material vegetal e tratamentos hídricos............................................ 34. 4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA............................................... 37. 4.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR............................................. 41. 4.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RTqPCR........................................................................................................ 42. 5. RESULTADOS.................................................................................... 43. 5.1. Identificação e seleção de transcritos in silico.................................. 43. 5.2. Desenho de iniciadores……………………………………………….... 45. 5.3. Material vegetal e tratamentos hídricos............................................ 47. 5.4. Extração de RNA e síntese de cDNA............................................... 49. 5.5. Eficiência da amplificação e RT-qPCR............................................. 51. 5.6. Seleção do gene de referência, normalização e análise de RTqPCR........................................................................................................ 54. 6. DISCUSSÃO........................................................................................ 62. 7. CONCLUSÕES.................................................................................... 69. 8. REFERÊNCIAS................................................................................... 70. 9. APÊNDICES……………………………………………………………….. 79. 10. MEMORIAL………………………………………………………………. 88. 11. ANEXOS.......................................................................................... 11.1. Atividades complementares............................................................ 89 89. 11.2. Resumos publicados em anais de congressos durante o desenvolvimento do mestrado................................................................. 90.

(18) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... 1. INTRODUÇÃO. O crescimento e a produtividade das plantas são adversamente afetados por vários fatores bióticos e abióticos de estresse, sendo os últimos as principais causas da diminuição do rendimento nas principais culturas. As plantas são frequentemente expostas a várias condições simultâneas de estresse tais como baixas ou altas temperaturas, salinidade, seca, inundações, aquecimento, estresse oxidativo e toxidade por metais pesados. Várias atividades antropogênicas têm acentuado a existência desses fatores. (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). O déficit hídrico destaca-se como principal fator limitante do crescimento das plantas e da produtividade agrícola. As previsões de alteração climática e escassez de água em diversas regiões e a crescente demanda por biocombustíveis tornam necessário o desenvolvimento de variedades de espécies vegetais fonte de biomassa e bioenergia mais eficientes no uso da água. Assim, genótipos de canade-açúcar, por exemplo, capazes de sustentar os níveis de produtividade em condições de restrição de água, contribuirão para sustentabilidade e viabilidade econômica, uma vez que evitarão o aumento do uso de irrigação. Um desafio atual é explorar a grande quantidade de informações disponibilizadas pelo desenvolvimento de bibliotecas ESTs e SAGE de cana-deaçúcar, a fim de produzir cultivares melhoradas e aumentar o conhecimento sobre a complexa fisiologia da planta. Além disso, identificar os genes regulados pelo estresse hídrico constitui uma excelente estratégia para o aumento da tolerância das plantas a períodos prolongados de seca ou menor disponibilidade hídrica, permitindo assim a seleção de variedades aptas ao cultivo nos ambientes que apresentam tais condições edafo-climáticas. O presente estudo objetivou a identificação e seleção de genes de resposta à seca a partir de blibliotecas SAGE disponíveis para cana-de-açúcar, bem como a validação experimental via RT-qPCR utilizando variedades com maior e menor tolerância ao déficit hídrico para essa espécie. Os resultados esperados poderão ser úteis como marcadores funcionais para seleção de genótipos de cana-de-açúcar mais tolerantes à deficiência hídrica. Tal abordagem favorecerá o desenvolvimento de novas estratégias nos programas de melhoramento e da agroindústria canavieira 17.

(19) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... na região semiárida do Nordeste. Além disso, as respostas gênicas diferenciais entre as cultivares contrastantes poderão ser úteis visando à identificação e a incorporação de características morfofisiológicas de tolerância em cultivares novas.. 18.

(20) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. Importância econômica da cana-de-açúcar (Saccharum spp.). A cultura de cana-de-açúcar apresenta raízes antigas na economia brasileira. Mudas dessa planta chegaram ao Brasil por volta de 1515, vindas da Ilha de Madeira (Portugal). O primeiro engenho de açúcar foi construído em 1532, na capitania de São Vicente, mas foi no Nordeste, principalmente em Pernambuco e Bahia, que os engenhos se multiplicaram atuando como os maiores produtores e fornecedores mundiais de açúcar até o século XVII. Devido à enorme capacidade de acumular sacarose nos entrenós, a cana-de-açúcar transformou-se em uma importante fonte de energia para o homem e conseqüentemente, de potencial econômico (MOORE, 2005). O potencial de produção da cana-de-açúcar para a geração de subprodutos (açúcar, etanol e energia elétrica, entre outros) faz dessa cultura uma das mais importantes atividades da agroindústria nacional (BEAUCLAIR et al., 2009). Países como Brasil, Índia e China são considerados os maiores produtores mundiais de cana-de-açúcar. O primeiro responde sozinho por 45% de todo açúcar mundial comercializado, enquanto que para o etanol, juntamente com os EUA, é responsável por 70% da produção (GRIVET e ARRUDA, 2002; MING et al., 2006). De acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab) e o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), foi realizado o terceiro levantamento da safra 2010/11 de cana-de-açúcar no Brasil que chegou a 624,99 milhões de toneladas em uma área de 8,1 milhões de hectare, sendo 46,2 % destinados a produção de açúcar e os 53,8% restantes, a produção de etanol. Entre os estados produtores de açúcar destacam-se São Paulo (61%), Minas Gerais (8,39%), Paraná (7,93%), Alagoas (6,08%), Goiás (4,74%), Pernambuco (4,25%) e Mato Grosso do Sul (3,85%). Já a produção de etanol é concentrada principalmente nas regiões centro-oeste e sudeste que respondem por 87,46% produzido no País, sendo os maiores produtores os estados de São Paulo (54,26%), Goiás (11,61%), Minas Gerais (10,35%) e Mato Grosso do Sul (7,39%) (CONAB, 2011).. 19.

(21) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... 2.2. Aspectos gerais e melhoramento da cana-de-açúcar. A cana-de-açúcar (Saccharum spp., Poaceae) é uma gramínea perene e alógama encontrada em mais de 90 países principalmente nas regiões tropicais e subtropicais dentro da faixa de latitide de 30° do Equador (MING et al., 2006). Os primeiros registros de que se tem sobre a cana-de-açúcar encontram-se nas escrituras mitológicas dos hindus. A teoria mais aceita sobre a origem da cana-deaçúcar considera que esta seja uma espécie nativa das ilhas Arquipélago da Polinésia, sendo Saccharum robustum (espécie mais primitiva) originada no centro de expansão da Nova Guiné (CESNIK e MIOCQUE, 2004). Embora seja uma planta de reprodução sexuada, quando cultivada comercialmente. é. multiplicada assexuadamente. por. propagação. vegetativa. (CAIEIRO et al., 2010). É caracterizada por apresentar inflorescência do tipo panícula, flor hermafrodita, caule cilíndrico composto de nós e entrenós, folhas alternas, opostas, presas aos nós dos colmos, com lâminas de sílica nas bordas, e bainha aberta (MILLER e GILBERT, 2009). As folhas são ordenadas através do sistema de Kuijper (Figura 1) onde a primeira folha de cima para baixo com a lígula exposta recebe a denominação de folha+1 enquanto que as folhas que estão abaixo dela são denominadas sucessivamente de +2, +3, +4 etc. A primeira folha acima da folha+1 recebe a denominação de folha 0 e as que estão acima dela são denominadas de folha -1, -2, -3 e assim, sucessivamente (van DILLEWIJN, 1952).. Figura 1 – Ilustração de uma cana-de-açúcar (Saccharum spp.) evidenciando o sistema de numeração foliar de van Dillewijn (1952).. 20.

(22) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... Devido a sua origem multiespecífica, cultivares atuais de cana-de-açúcar são complexos híbridos interespecíficos (Saccharum spp., 2n=100 a 130) resultante do cruzamento entre S. officinarum, S. barbieri, S. sinense, S. robustum e S. spontaneum (D'HONT et al., 1996; GOVERNMENT, 2004; MING et al., 2006). Para a maioria dos melhoristas de cana-de-açúcar, a espécie S. officinarum, que apresenta alto teor de açúcar, originou-se através da domesticação da espécie S. robustum. Essa domesticação caracterizou-se como resultado de uma introgressão entre S. spontaneous, Eriathus arundinaceus e Miscanthus sinensis (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2004). Da Nova Guiné, a espécie propagou-se para Indonésia, Malásia, China, Índia, Micronésia e Polinésia durante a pré-história. Os produtores holandeses em Java chamavam S. officinarum de cana nobre, e “nobilização” o processo de retrocruzamento entre os híbridos S. spontaneum de S. officinarum (MING et al., 2006). Antes dos programas de melhoramento da cana-de-açucar, as cultivares nobres mais importantes utilizadas pelos povos antigos eram “Otaheite” (Tahiti), “Cheribon” (Java) e “Caledonia” (New Hebrides). O primeiro programa a ser iniciado no mundo ocorreu somente em meados do século XIX (Java e Barbado) com plantas capazes de produzir sementes viáveis (MING et al., 2006). Em seguida foram desenvolvidos programas em diferentes países, por instituições governamentais e particulares ou em sistemas cooperativos formados pelos próprios produtores. Nesse período, houve um intercâmbio muito intenso de material genético de diferentes espécies de cana-de-açúcar entre várias equipes de melhoristas, inclusive no Brasil, o que resultou na disseminação de doenças endêmicas que antes eram encontradas somente em determinadas áreas (CESNIK e MIOCQUE, 2004). Os ataques constantes de doenças, a baixa produtividade e concorrência do açúcar produzido em outros países propiciaram uma preocupação do setor açucareiro brasileiro com relação à melhoria da qualidade da cana como um todo, fazendo-se assim necessárias pesquisas sistemáticas na área. Assim, várias estações experimentais foram criadas tais como a de Campos (RJ), PLANALSUCAR, COPERSUCAR, entre outras (BEAUCLAIR et al., 2009). Em todo o mundo os programas de melhoramento genético buscam obter cultivares de cana-de-açúcar mais produtivas exibindo tolerância a fatores bióticos e abióticos. No Brasil, três grandes programas de melhoramento da cana-de-açúcar têm. sido. realizados. nas. últimas. décadas:. Rede. Interuniversitária. de 21.

(23) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (RIDESA), o Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) e o Instituto Agronômico de Campinas (IAC) (BEAUCLAIR et al., 2009).. Nesses. programas,. são. realizados. preferencialmente. cruzamentos. biparentais entre cultivares elites. Os clones resultantes das diversas fases de seleção são avaliados quanto ao seu desempenho sob diversas condições ambientais. No entanto, o desenvolvimento de uma nova cultivar comercial de canade-açúcar torna-se um processo que demanda muito tempo, podendo levar em média 12 anos para estar disponível comercialmente (ALBINO et al., 2006).. 2.3. Estresse hídrico e mecanismos de resposta em plantas. A disponibilidade de água inadequada é uma limitação crucial para o rendimento de várias culturas de importância econômica na maioria dos ambientes, e tem sido o foco de melhoramento genético por muitos anos (SINCLAIR et al., 2004). O conhecimento das relações hídricas de cultivares modernas utilizadas pelos produtores é fundamental para o manejo em regiões com baixa disponibilidade de água (INMAN-BAMBER e SMITH, 2005). O estresse é a condição fisiológica alterada provocada por fatores que tendem a causar o desequilíbrio na planta. As reações das plantas ao estresse hídrico diferem significativamente em vários níveis de organização, uma vez que depende da intensidade e duração do mesmo, bem como das espécies de plantas e seus estágios de desenvolvimento (CHAVES et al., 2003). Além disso, esse fator abiótico pode surgir de duas condições, ou devido ao excesso de água, ou por déficit hídrico. O fator hídrico mais comum encontrado é o estresse por déficit hídrico conhecido também como estresse por seca. O déficit hídrico pode ser definido como uma situação em que o potencial hídrico da planta e turgescência são reduzidos o suficiente para interferir em suas funções normais (SHAO et al., 2008). Embora os efeitos gerais da seca no crescimento das plantas sejam conhecidos razoavelmente bem, os efeitos primários do déficit hídrico em níveis bioquímicos e moleculares ainda não são bem entendidos (CHAVES et al., 2003; YAMAGUCHI-SHINOZAKI e SHINOZAKI, 2005). O déficit hídrico em plantas iniciase a partir de uma complexa via de respostas, começando com a percepção do 22.

(24) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... estresse, o qual desencadeia uma cascata de eventos moleculares, sendo finalizada em vários níveis de respostas fisiológicas, metabólicas. e de desenvolvimento. (BRAY, 1993). As respostas celulares são iniciadas principalmente pelas interações entre os componentes extracelulares e as proteínas da membrana plasmática. A molécula extracelular é chamada de ligante (ou elicitor) e a proteína de membrana, a qual se liga e interage com a mesma, é chamada de receptor. Vários sinais de estresses abióticos, bem como bióticos, servem como ligantes às proteínas de membranas celulares das plantas. Os caminhos sinalizantes de estresse ativam os receptores de membrana celular cujos sinais são transduzidos, gerando mensageiros secundários que incluem cálcio, espécies reativas de oxigênio (ROS) e fosfato inositol. O fosfato inositol modula os níveis intracelulares de cálcio que são percebidos pelos sensores de cálcio. Estes, por sua vez, interagem com outras proteínas levando normalmente a uma cascata de fosforilação, o que resulta na ativação dos principais genes ou fatores de transcrição que controlam os genes de tolerância ao estresse. Assim, os produtos gênicos, em última instância, levam à adaptação da planta e ajudam-na a sobreviver e a superar as condições desfavoráveis. Com isso, as plantas respondem inicialmente ao estresse como células individuais e sinergicamente como um organismo inteiro (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). Os processos metabólicos que são ativados em resposta ao estresse aumentam a concentração de solutos na célula, resultando na diminuição do potencial osmótico e aumento da turgescência foliar. Assim, muitos componentes são sintetizados para a manutenção do equilíbrio osmótico, da proteção de membrana e macromoléculas. Estes componentes incluem prolina, glutamato, glicina-betaina, carnitina, manitol, sorbitol, fructans, poliois, trealose, sacarose, oligossacarídeos e íons inorgânicos como K+ (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). Além disso, as kinases de histidina (MAPKK, MAPKK e MAPK) também respondem ao estresse hídrico, ajudando a restabelecer o balanço osmótico e induzindo a ativação de outros genes de resposta ao estresse tais com as proteínas abundantes em fase tardia da embriogênese (LEA) (MAHAJAN e TUTEJA, 2005). Os. vários genes responsivos ao estresse. podem ser. amplamente. categorizados em genes de resposta inicial e genes de resposta tardia. Os genes de resposta inicial são induzidos dentro de minutos após a percepção do sinal e 23.

(25) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... normalmente a expressão ocorre de forma transitória. Vários genes transdutores de sinais e reguladores tais como os fatores de transcrição (TF), proteínas kinases, proteínas fosfatases, enzimas envolvidas no metabolismo dos fosfolipídios e outras moléculas sinalizantes (ex. proteínas ligantes de calmodulina), estão incluídos nessa lista. Em contraste, a maioria dos genes ativados mais tardiamente (após horas da percepção ao estresse) possui uma expressão normalmente contínua. Esses genes que mais provavelmente funcionam diretamente na tolerância ao estresse incluem as chaperonas, proteínas responsivas a desidratação, proteínas responsivas e induzidas por frio, proteínas LEAs, osmotinas, proteínas anti-congelantes, proteínas ligantes de mRNA, enzimas chaves para biossíntese de osmólitos, proteínas de canais de água, transportadores de açúcar e prolina, enzimas de detoxificacão, várias proteases, entre outros (SHINOZAKI et al., 2003; MAHAJAN e TUTEJA, 2005; SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). Estudos genômicos e moleculares têm mostrado que vários genes com diversas funções são induzíveis por estresse a seca e frio, e que vários fatores de transcrição estão envolvidos na regulação desses genes (SHINOZAKI et al., 2003). Os fatores de transcrição induzidos por estresses inclui membros da família de proteínas ligantes a elementos responsíveis a desidratação (DREB), a famílias dos fatores ligantes a elementos responsíveis a etileno (ERF), a família dedo de zinco, a família WRKY, a família MYB, a família hélice volta hélice básica (bHLH), a família zíper de leucina de domínio básico (bZIP), a familia NAC e a família dos fatores de transcrição de homeodomíneos. Esses genes podem regular vários genes induzidos por estresse cooperativamente ou separadamente, e pode constituir muitas redes gênicas (SHINOZAKI et al., 2003). Os fatores de transcrição que desempenham papéis fundamentais na resposta da planta ao estresse (SEKI et al., 2003) são agrupados em duas vias ABA dependentes (I e II) e outras duas ABA não dependentes (III e IV). A via ABA dependente tipo I requer a síntese de certas proteínas para ativar os fatores de transcrição MYC/MYB (ABE et al., 1997) e/ou bZIP, os quais se ligam a regiões do DNA como os ABREs – Elemento responsível a ABA e elementos tais como CE1 e CE3 – Elemento de acoplamento (SHEN et al., 1996). A via ABA dependente tipo II ativa o fator de transcrição bZIP (NAKAGAWA et al., 1996), o qual aciona a expressão gênica pela ligação com os elementos ABA responsivos ABREs. A via ABA não dependente tipo III compreende alguns genes induzidos pela seca que não 24.

(26) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... respondem à ABA nem ao frio. Estes genes incluem o ERD1 – Resposta inicial a desidratação 1, que codifica para uma subunidade regulatória da protease Clp (ClpD). A via ABA não dependente tipo IV induz a expressão gênica pela ativação de DREBP – Proteína ligante de resposta a desidratação que se liga ao elemento de resposta à seca DRE/CRT – Elemento de resposta a seca / C-repetido, conduzindo para a indução de genes estimulados por seca e frio. (NAKASHIMA et al., 1998). O. promotor. do. gene. induzido. por. seca,. frio. e. alta. salinidade. RD29A/COR78/LTI78 contém dois principais elementos de ação cis, o elemento ABRE e o elemento DRE/C-repeat que estão envolvidos na expressão de genes induzidos por estresses (SHINOZAKI et al., 2003; VALLIYODAN e NGUYEN, 2006). A identificação de genes responsáveis por promover qualidades agronomicamente desejáveis e sua posterior manipulação por meio de técnicas de biologia molecular pode ajudar a obtenção de variedades bem sucedidas, reduzindo drasticamente as perdas na agricultura, bem como, permitir o aproveitamento de solos até então não utilizáveis.. 2.4. Ferramentas de análises transcricionais. Os maiores avanços nas tecnologias de quantificação da expressão global ocorreram na última década. Diversas metodologias foram desenvolvidas tais como ESTs (Expressed Sequence Tags), macro e microarranjos de cDNA, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression ), cDNA-AFLP (cDNA ampliﬁed fragment length polymorphism) e MPSS (Massive Parallel Signature Sequencing), porém com limitações específicas as quais produzem bancos de dados distintos, nem sempre interconversíveis ou comparáveis. Além disso, essas tecnologias induzem a necessidade de integrar a biologia molecular, automação e sistemas de manejo das informações de laboratório (LIMS) e análise de dados (DONSON et al., 2002; CALSA JR et al., 2004). Em cana-de-açúcar, análises de expressão gênica em larga escala via ESTs (VETTORE et al., 2003), microarranjos (PAPINI-TERZI et al., 2005; ROCHA et al., 2007); e SAGE (CALSA JR e FIGUEIRA, 2007) identificaram genes envolvidos na sinalização celular, resistência a pragas, metabolismo, desenvolvimento e resposta a 25.

(27) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... estresses bióticos e abióticos, inclusive a seca. A tecnologia SAGE (VELCULESCU et al., 1995), ou análise serial da expressão gênica, baseia-se na contagem em alta escala de regiões específicas (tags) constituídas por 9 -10 pb, obtidas de uma população de transcritos. As principais vantagens da SAGE são a medida absoluta da expressão gênica ao invés de análise relativa, a dados. digitais. passíveis. de novas. inclusões. geração e. o. de conjuntos de. menor. custo. de. sequenciamento por transcrito amostrado. Comparativamente à análise de ESTs, a SAGE é cerca de 10 vezes mais eficiente para a detecção de transcritos raros (CALSA JR et al., 2004). A tecnologia de microarranjos, útil em identificar genes alvos para fatores de transcrição relacionados ao estresse, abre também caminhos na análise de redes gênicas em resposta a estresse abiótico. Um exemplo disso, foi a utilização de microarranjo de cDNA de comprimento máximo para monitorar o perfil de expressão de 7000 genes de Arabidopsis sob condições de estresse a seca, frio, alta salinidade e tratamentos com ABA (SEKI, M. et al., 2002; SEKI, MOTOAKI et al., 2002). Um desafio atual é explorar a grande quantidade de informações obtidas pelo desenvolvimento de bibliotecas ESTs e SAGE e microarranjos de cana-de-açúcar, a fim de aumentar o conhecimento sobre a complexa fisiologia da planta. Além disso, identificar os genes regulados por estresse hídrico constitui uma excelente ferramenta para o estabelecimento de estratégias visando ao aumento da tolerância das plantas a períodos prolongados de seca, permitindo assim, o desenvolvimento de variedades aptas ao cultivo em ambientes que apresentam tal condição edafoclimática.. 2.5. Aspectos gerais da metodologia RT-qPCR. A transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) difere da PCR convencional (ou endpoint) por medir o produto de PCR amplificado a cada ciclo durante a reação. Ao contrário da PCR convencional, a RT-qPCR permite que a amplificação seja seguida em tempo real durante a fase exponencial da reação bem como determinada a quantidade cDNA alvo inicial. Além disso, uma das principais vantagens dessa metodologia é a sua rapidez em provê dados confiáveis (GACHON et al., 2004). 26.

(28) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... A RTqPCR é o principal método de análise de expressão gênica. Em geral, duas estratégias de quantificação podem ser executadas nessa metodologia: quantificação absoluta ou relativa. Na primeira, determina-se com precisão o número de cópias do RNA alvo pela comparação com uma curva padrão apropriada, enquanto que, na última expressa-se em termos de quantidade relativa de transcritos em relação a um outro gene adotado como referência (PFAFFL, 2004). Este último método é na maioria das vezes adequado para a investigação das mudanças fisiológicas da planta baseadas nos padrões de expressão gênica (GACHON et al., 2004). Contudo, etapas que antecedem as análises de expressão tais como desenho de iniciadores (primers), extração de RNA e síntese de cDNA são procedimentos importantes para a obtenção de dados de expressão confiáveis. Durante a etapa de desenho de primers, os iniciadores devem ser cuidadosamente desenhados e avaliados quanto a presença de estruturas secundárias indesejáveis (alças, auto-complementariedade, dímeros e dímeros cruzados) a fim de facilitar a obtenção da eficiência de amplificação máxima. Além disso, as sequências do par de primers devem ser específicos a um produto de amplificação (BUSTIN et al., 2005). Na etapa de extração de RNA, é importante observar a integridade e qualidade do RNA total extraído. A primeira pode ser avaliada pela visualização em gel das bandas 18S e 28S do RNA ribossomal e a última, pela observação dos valores da razão de absorbância 260/280 acima de 1.8 (FLEIGE e PFAFFL, 2006; FLEIGE et al., 2006). Na etapa de síntese de cDNA, três tipos de primer podem ser utilizados (primers randômicos, oligo-dT, geneespecífico), bem como a combinação de dois (oligo-dT e randômico). A escolha do primer ideal é baseada nos tipos de experimentos e/ou resultados que se deseja chegar. Para a análise de quantificação relativa em função dos níveis de expressão gênica, em geral, o primer oligo-dT sozinho, é o mais utilizado (VETTORE et al., 2003; RODRIGUES et al., 2009). A RT-qPCR é um método que requer detecção precisa e sensível dos produtos de amplificação (FRAGA et al., 2008). A alta sensibilidade para detectar DNA ou cDNA é devido à combinação da amplificação feita pela etapa de PCR e do sistema de detecção. A detecção é baseada na medida de florescência emitida por sondas ou agentes intercalantes em função dos produtos da PCR formados (amplicons). Agentes intercalantes (SYBR Green I) e sondas fluorogênicas (TaqMan Molecular Beacons, Scorpions) são os dois tipos de moléculas utilizados para 27.

(29) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... detectar amplicons. Ensaios com SYBR Green I geram detecção mais precisa e produz um sinal de decaimento mais linear do que a detecção por TaqMan além de possuir um custo mais baixo (SCHMITTGEN et al., 2000). O SYBR Green I indiscriminadamente se liga ao DNA fita dupla bem como outros produtos da PCR, tais como dímeros de primer podendo ser detectados junto com o gene alvo. Para verificar a detecção de apenas um produto de PCR, as amostras são submetidas a realização da curva de dissociação (melting) ao final de cada reação de PCR (RAJEEVAN et al., 2001). A conversão de RNA em cDNA é considerada um importante contribuinte para a variabilidade e falta de reprodutibilidade frequentemente observada nos exprerimentos de RT-qPCR. Como muitos experimentos não apresentam 100% de eficiência de amplificação, é importante avaliar a eficiência exata dos genes antes das análises de expressão para minimizar as possíveis variações que possam ter ocorridas na etapa de sítese de cDNA. As três principais razões são: (i) o estado dinâmico das células promovem variações inerentes em RNA extraídos de amostras biológicas; (ii) os RNA purificados podem ser de qualidades variáveis e (iii) a eficiência da conversão do RNA em cDNA é dependente da abundância do RNA alvo (BUSTIN et al., 2005). Existem duas abordagens para a construção da curva padrão a fim de estimar a eficiência da reação: (1) o uso de diluições seriadas de uma das amostras de cDNA sob investigação, e (2) o uso de uma série crescente de quantidades de RNA total como entrada na etapa de transcrição reversa (RAMAKERS et al., 2003). A primeira abordagem, em geral, é a mais utilizada, sendo que valores de eficiência e coeficiente de correlação de Pearson acima de 90% e 0,99, respectivamente, são considerados valores adequados para as análises de expressão gênica (BIOSYSTEMS, 2002). A RT-qPCR, cada vez mais utilizada em pesquisas biológicas, está se tornando o principal método de escolha para perfil de expressão de genes selecionados (VANDESOMPELE et al., 2002; JAIN et al., 2006). A alta sensibilidade em detectar transcritos raros, especificidade e simplicidade, juntamente com a introdução permanente de novas químicas, instrumentação e protocolos mais confiáveis, têm feito dela a metodologia de referência para a detecção e/ou comparação dos níveis de expressão gênica (SCHMITTGEN et al., 2000; BUSTIN et al., 2005). 28.

(30) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... O maior obstáculo da técnica de RT-qPCR não é o isolamento do mRNA, nem a síntese de cDNA em si, mas a coordenação dos experimentos e a organização eficiente dos dados coletados (MULLER et al., 2002). A PCR é composta por três fases características: a fase exponencial, fase linear e fase de platô. Na fase exponencial da amplificação existe uma relação direta entre a quantidade de DNA complementar alvo inicial e o produto da reação a qual é utilizada para quantificar com reprodutibilidade e confiabilidade (PFAFFL, 2004). O ciclo de amplificação no qual a fluorescência detectada na amostra excede o limite (threshold) definido acima da fluorescência de fundo (background) é denominado ciclo de quantificação (Cq) sendo o valor gerado, utilizado para realizar a análise de expressão quantitativa (HEID et al., 1996; BUSTIN e NOLAN, 2004). Valores de Cq obtidos na fase exponencial são inversamente proporcional a quantidade de amostra-alvo inserida na reação pois uma amostra que contém mais cópias de cDNA alvo deverá atingir o threshold em ciclos mais cedo do que àquela amostra com baixo número de cópias alvos (SCHMITTGEN et al., 2000). Contudo, é importante observar as variações intraespecífica que pode ocorrer entre as réplicas experimentais. Valores de Cq entre as réplicas são considerados similares e com boa reprodutibilidade quando os desvios padrões estão abaixo de 0,5 (HEID et al., 1996). Desvios muito altos tendem a ser gerados por erro de pipetagem (BIOSYSTEMS, 2004). Antes da análise quantitativa relativa da expressão é necessário normalizar os dados utilizando um gene de referência para controlar as variações não específicas internas da RT-qPCR tais como diferenças na quantidade de RNA total inserido na etapa de síntese de cDNA e variações das eficiências de amplificações (HUGGETT et al., 2005). Há um fluxo constante de publicações defendendo o uso de um ou mais genes de referência, geralmente para mais e mais aplicações especializadas. (VANDESOMPELE. et. al.,. 2002;. PFAFFL. et. al.,. 2004;. VANDESOMPELE et al., 2009; MAROUFI et al., 2010). Estas por sua vez, destacam o fato de que nenhum único gene é capaz de cumprir todos os critérios exigidos de um gene de referência universal. Assim, todos os genes são regulados até certo ponto nos mais variados tipos de células e/ou órgãos, ou condições experimentais. Para avaliar a estabilidade do gene de referência, diversos softwares (geNorm, General, Pattern, Recognition, BestKeeper entre outros) estão disponíveis para a utlização, sendo o geNorm o software mais utilizado nas pesquisas com RTqPCR (VANDESOMPELE et al., 2009). Para as análises de quantificação relativa, testes 29.

(31) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... estatísticos como o Kruskal-Wallis podem ser utilizados (WEN et al., 2005; WALTER et al., 2008), admitindo-se como níveis de significância valores de p≤0,05. Vários fatores têm contribuído para a transformação desta tecnologia em uma importante ferramenta de pesquisa como: (i) é um ensaio homogêneo, que evita a necessidade de processamento pós-PCR; (ii) possui ampla faixa dinâmica (> 107 vezes) que permite comparar diretamente diferenças de abundância de RNA e (iii) apresenta potencial inerente de transformar a PCR quantitativa em qualitativa. Comparado a técnica de northern blot, a PCR em tempo real apresenta alta velocidade e especificidade nas análises de expressão gênica. Isto tem resultado em extensivas aplicações de estudos de genômica funcional, medicina molecular, forense, virologia, microbiologia e biotecnologia (GACHON et al., 2004; NOLAN et al., 2006). A quantificação dos níveis de expressão gênica pode render valiosas pistas sobre a função gênica. Por meio desse método, podem ser revelados níveis de expressão individual em um estado biológico definido (doença, desenvolvimento, diferenciação, etc), detecção de alterações no nível de expressão gênica em resposta a estímulos biológicos específicos (fator de crescimento, agente farmacológico, estresse bióticos e abióticos em plantas etc) e detecção do tipo de célula ou órgão onde o gene está sendo expresso (FRAGA et al., 2008).. 30.

(32) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... 3. OBJETIVOS. 3.1. Objetivo Geral. Identificar diferentes genes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) associados com a tolerância ao déficit hídrico e validar experimentalmente esta correlação.. 3.2. Objetivos Específicos. Identificar in silico e selecionar sequências transcritas associadas a genes de resposta à seca.. Desenhar iniciadores para análise quantitativa da expressão dos genes selecionados.. Validar. experimentalmente. a. correlação. da. expressão. dos. genes. selecionados, em folha e raiz de variedades de cana-de-açúcar mais e menos tolerantes à seca.. Selecionar dois genes de tolerância à seca para estabelecer construções gênicas, úteis para transformação genética de cana-de-açúcar e análises funcionais in vivo.. 31.

(33) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... 4. MATERIAL E MÉTODOS. 4.1. Identificação e seleção de transcritos in silico. A identificação in silico e a seleção de sequências transcritas (tags) potencialmente associados a genes de resposta à seca foram realizadas com base em quatro bibliotecas SAGE de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) (CALSA JR, 2006). Estas bibliotecas totalizam aproximadamente 46.000 tags únicas oriundas de amostras de colmo, exceto epiderme lignificada, derivadas de plantas F1 de cruzamento entre duas variedades comerciais SP/CTC (Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba, SP). As etapas a seguir foram realizadas em planilha utilizando o software Microsoft Excel 2007 (Microsoft). As frequências das tags das bibliotecas analisadas foram normalizadas separadamente em tags por mil (TPT). Em seguida, foi determinada para cada tag, a razão de variação entre as médias das freqüências normalizadas em cada época de coleta (média dos dois genótipos com alto e dois com baixo teor de sacarose), comparando-se a média no período seco (S) com a do período chuvoso (C). O valor da razão de variação (ratio) foi obtido por S/C. Valores de ratio ≤ 0,5 foram considerados indicativos de inibição da transcrição; entre 0,5 e 2,0 indicando tags sem variação significativa; e ratio ≥ 2,0 referidos como indicadores de indução transcricional. Além do parâmetro ratio, foram consideradas para a identificação dos genes as anotações e ontologias gênicas presumíveis publicadas para este banco de dados. Foram realizadas buscas de palavras-chave (drought, water deprivation, dehydration, irrigation e dehydrin). Após a identificação, os genes/transcritos foram selecionados e agrupados segundo a anotação (conhecida ou desconhecida), ontologia gênica (estresse oxidativo, fator de transcrição ou proteínas de choque térmico) e referência (sem variação de ratio). Exceto para a categoria referência, o critério de inserção das tags nos grupos propostos foi possuir os maiores ou os menores ratios. As tags selecionadas foram alinhadas contra o banco de dados de acesso público do Instituto de Pesquisas Genômicas (TIGR) Gene Index/Saccharum 32.

(34) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... (http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/Blast/index.cgi), específico para cana-deaçúcar, através do programa SAGE14. Para cada tag, foi identificado o cluster (agrupamento de ESTs alinhados) ou singleton (EST não agrupado em cluster) mais associado, e cuja sequência consenso foi utilizada para o desenho de iniciadores específicos (primers). Foram consideradas as anotações presumíveis de cada cluster/singleton disponíveis no TIGR/Gene Index/Saccharum.. 4.2. Desenho de iniciadores. A partir das sequencias consenso obtidas do TIGR/ Gene Index/Saccharum, pares de primers específicos para os genes selecionados foram desenhados in silico utilizando o programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3). Em geral, foram utilizados parâmetros padronizados, exceto: tamanho do amplicon variando entre 100 e 350 pb; tamanho do primer entre 18 e 22 pb (ótimo a 20 pb); temperatura de melting do primer (Primer Tm) entre 50 e 60ºC (ótimo a 55ºC); conteúdo de GC% entre 40 e 60% (ótimo a 50%); fator de autocomplementariedade máxima igual a 3; e fator de auto-complementariedade máxima na região 3´ igual a 0. Após serem desenhados, os pares de primers foram avaliados quanto a formação de estruturas secundárias indesejáveis (alças, auto-complementariedade, dímeros e dímeros cruzados) e especificidades de anelamento nas sequências gênicas.. Para. o. primeiro. foi. utilizado. o. programa. NetPrimer. (http://www.premierbiosoft.com/netprimer), enquanto que para o segundo, foi usada a ferramenta de alinhamento de sequências de nucleotídeos (Blastn) no banco de dados TIGR Gene Index de cana-de-açúcar. Os iniciadores foram considerados adequados quando não apresentaram estruturas secundárias e anelaram em apenas um gene. Os. iniciadores. liofilizados. (Invitrogen). foram. ressuspendidos. para. concentração estoque de 100 μM em água ultrapura (Milli-Q) estéril. Desta solução, foi preparada outra para uso, diluída a concentração de 5 μM. Ambas as soluções (estoque e uso) foram armazenadas a -20ºC. A integridade dos primers foi verificada em eletroforese de 1 µg em gel de agarose 1%. Todos os pares de primers foram. 33.

(35) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... testados experimentalmente via RT-PCR utilizando-se amostras de cDNA de folha e raiz.. 4.3. Material vegetal e tratamentos hídricos. O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, no Departamento de Genética da Universidade Federal de Pernambuco (Recife, PE, 08º03´03"S e 34º56´54"W), no período de 25 de março a 24 de maio de 2010. Os segmentos de colmo, contendo uma gema lateral (rebolos) de cana-de-açúcar, utilizados foram gentilmente cedidos pela Estação Experimental de Cana-de-acúcar de Carpina, PE (EECAC), da Universidade Federal Rural de Pernambuco, vinculada ao Programa de Melhoramento Genético de Cana-De-Açúcar da Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (PMGCA-RIDESA). Inicialmente, foram cultivadas duas variedades: uma conhecidamente tolerante à seca (RB92579), com 30 rebolos, e outra sensível (RB72454) com 28 rebolos. Estas variedades são o resultado de genealogias e seleção para várias características de importância agroindustriais tais como brotação, maturação, florescimento, perfilhamento, teor de açúcar, teor de fibras, entre outros, inclusive tolerância a seca. De modo geral, os rebolos cultivados tiveram em média 2,8 cm (variação de 2,0 cm a 3,6 cm) de diâmetro e 4,9 cm (3,2 cm a 6,0 cm) de comprimento onde foram distribuídos de forma eqüidistante (~4,5 cm) em bandejas de polietileno (41 cm x 27 cm x 4 cm) contendo terra vegetal composta comercial (Viva o Verde ). Em seguida, estes foram regados diariamente com água fornecida pela Companhia de Abastecimento de Água de Pernambuco (Compesa) uma vez por dia, no horário compreendido entre 8 h e 10 h da manhã. Um mês após o plantio dos rebolos, nove plantas de cada variedade com tamanhos. similares. (~. 10. cm). foram. transferidas. para. vasos. contendo. aproximadamente 7 kg de substrato, onde foram cultivadas três plantas (Figura 2). Os experimentos foram conduzidos a 32±1°C e 71±4% UR (umidade relativa do ar), sendo estes parâmetros mensurados diariamente no mesmo período da rega com o auxílio de termo-higrômetro digital (CE).. 34.

(36) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... Figura 2 – Cultivo dos rebolos em bandejas de polietileno e transferência das plantas juvenis de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para vasos.. Os experimentos foram realizados sob dois tratamentos hídricos distintos: o primeiro, consistindo de suspensão de rega durante 15 dias consecutivos, denominado no presente estudo, de tratamento seco (TS); e o segundo, no qual a rega foi diária, sendo por isso denominado tratamento irrigado (TI). Este último foi considerado como situação controle do experimento. Do total de nove réplicas utilizadas para cada cultivar, seis foram destinadas à condição de seca e três para a de irrigado. No 15º dia após aplicação dos tratamentos citados foram determinados ao meio-dia o potencial hídrico foliar e a umidade relativa do solo, sendo então coletado o material vegetal (folhas e raízes). O potencial hídrico foliar foi verificado em câmara de pressão Scholander (Soilmoisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA) para a folha 0 (Figura 1). O valor do potencial foi registrado no momento em 35.

(37) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... que houve a exsudação inicial da seiva bruta devido à pressão exercida pelo gás nitrogênio no interior da câmara (Figura 3A). A umidade relativa do solo foi determinada coletando-se amostra do substrato dos vasos com o auxílio de gabarito cilíndrico em PVC (1,5 cm de diâmetro x 25 cm de comprimento) (Figura 3B). Esta amostra foi acondicionada em frasco de vidro limpo e com tampa, sendo conduzida ao laboratório para pesagem em balança analítica (ANDHR 200) no mesmo dia. Após a medição dos pesos, os frascos contendo as amostras foram colocados em estufa a 60ºC até peso constante a fim de obter o solo seco para nova pesagem. O valor final da umidade do solo foi obtido subtraindo-se o peso do solo úmido com o peso do solo seco.. A. B. Figura 3 – Medição do potencial hídrico foliar em câmara de pressão Scholander (A) e coleta de solo para cálculo da medida da umidade relativa do solo (B).. A coleta do material vegetal foi realizada após a medição do potencial hídrico e umidade relativa do solo, cortando-se com tesoura, as folhas +1 e raízes nas regiões próximas ao pecíolo e rebolo, respectivamente. O material coletado foi 36.

(38) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... acondicionado em tubos do tipo Falcon de 50mL (Fisherdrand) e imediatamente imersos em nitrogênio líquido, sendo posteriormente armazenado em freezer -80°C (Figura 4). Para cada variedade e tratamento hídrico, foram separadas três réplicas biológicas (plantas do mesmo vaso), tomando-se como critério a menor variação do valor do potencial hídrico foliar entre elas. Estas réplicas foram posteriormente utilizadas para as análises de expressão gênica.. A. B. C. D. E. Figura 4 – Esquema ilustrativo do procedimento de coleta de folha e raiz de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) para as análises moleculares. A e B – corte de folha e raiz, respectivamente; C e D – acondicionamento em tubos Falcon; E – conservação do material vegetal em nitrogênio líquido.. 4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA As amostras de folha e raiz coletadas a partir das duas variedades foram devidamente identificadas em códigos e esquematizadas conforme as Figuras 5 e 6 de. modo. que. estes. códigos. serão. utilizados. a. partir. deste. ponto. 37.

(39) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... Figura 5 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de folha.. 38.

(40) SANTANA, M.O. Expressão gênica da resposta à seca.... Figura 6 – Esquema ilustrativo para a identificação das amostras de raiz.. 39.