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transmissão são marcas comerciais da Illumina, Inc. e/ou de suas afiliadas nos EUA e/ou em outros países. Todos os outros nomes, logotipos e marcas comerciais são de propriedade de seus respectivos proprietários.
Histórico de revisões
N.º do documento Data Descrição da alteração
Material n.º 20000262
Documento n.º 15027617_PTB v01
Setembro de 2015
O nome do guia foi alterado de Guia do usuário do sistema MiSeq para Guia do sistema MiSeq. Novo no MCS v2.6, foram adicionadas informações do BaseSpace Onsite.
Foram reorganizadas as informações do guia para ficarem em torno de tarefas em vez de telas. Todas as referências à tela Welcome (Boas-vindas) foram alteradas para a tela Home (Página inicial). Foram adicionadas informações que estão nos Guias de preparação dos reagentes dos kits de reagentes do MiSeq, incluindo tipos de lâminas de fluxo, conteúdo do cartucho de reagentes e instruções para descongelar o cartucho de reagente. Visite o site da Illumina para obter mais informações de kits de reagentes do MiSeq
support.illumina.com/sequencing/sequencing_ kits/miseq_reagent_kit.html.
Foi corrigido o volume de enxágue esperado de uma limpeza de manutenção de 17,25 ml para 51,75 ml.
Foi atualizada a ordem das etapas de fluxo de trabalho para preparar primeiro o cartucho de reagente e depois, se necessário, desnaturar e diluir bibliotecas.
Foram movidas as informações de solução de problemas para o Apêndice A.
Foram movidas as informações de pasta de saída e bloco da lâmina de fluxo para o Apêndice B. Foram movidas as informações sobre o gerenciamento de arquivos para o capítulo Manutenção.
Foram movidas as instruções de limpeza após a execução do capítulo Manutenção para o capítulo Sequenciamento.
O nome do capítulo Realização de uma execução é agora Sequenciamento.
Foram alteradas as referências de análise primária para análise do software RTA.
Foram atualizadas as instruções de diluição para o procedimento de limpeza após a execução com uma
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBN.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de peça 15027617_PTB Rev. O Setembro
de 2014
Foram atualizadas as seguintes informações:
•Novo no MCS v2.5, foi atualizada a opção de
limpeza após a execução para incluir uma limpeza da linha de modelo
•Foram atualizadas as instruções para uma limpeza
após a execução com hipoclorito de sódio para a limpeza da linha de modelo
•Foi adicionado o volume de enxágue esperado
para uma limpeza após a execução
Foram adicionadas as informações de fluxo de trabalho do VeriSeq PGS sobre recursos adicionais, opções de execução, opções de análise secundária, lavagens de instrumento e cor da tampa da lâmina de fluxo.
N.º de peça 15027617 Rev. N Junho de
2014
Apenas disponível em inglês.
Foram adicionadas informações aplicáveis ao fluxo de trabalho do VeriSeq PGS.
Foram atualizadas as informações de métricas de execução para clusterização e densidade.
Foram removidas as informações de software antivírus. Consulte Guia de preparação para instalação
do sistema MiSeq.
N.º de peça 15027617_PTB Rev. M Janeiro de
2014
Atualização para a mudança introduzida no MCS v2.4:
Foi adicionado o recurso Bundle logs (Agrupar logs) para o envio de arquivos para a solução de
problemas.
N.º de peça 15027617 Rev. L Outubro de
2013
Apenas disponível em inglês.
Foi adicionada a reinicialização do software do sistema como uma etapa pré-execução.
Foram adicionados os tubos de microcentrífuga à lista de materiais de consumo fornecidos pelo usuário.
Foi eliminado o Software MiSeq como um capítulo separado, e o conteúdo do capítulo foi distribuído ao longo do guia.
Foram removidas as informações sobre as pastas para receitas personalizadas.
Foram removidas as informações sobre as faixas recomendadas de densidade de clusters para os kits de reagentes do MiSeq.
Foram removidos os detalhes sobre os kits de reagentes do MiSeq, e foi adicionada uma visão geral das características do kit de reagentes. Para obter informações, consulte a documentação de preparação de reagentes do kit que você está usando.
Foi adicionado conteúdo ao aviso sobre marcas registradas.
N.º de peça 15027617_PTB Rev. K Agosto de
2013
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N.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de peça 15027617 Rev. J Agosto de
2013
Apenas disponível em inglês.
Foram adicionadas descrições de execução para o MCS v2.3 e o kit de reagentes do MiSeq v3. Foram atualizadas as seguintes informações:
•Kit de reagentes e compatibilidade entre versões
para incluir o kit de reagentes do MiSeq v3
•Descrição da pasta Custom Recipes (Receitas
personalizadas) para incluir uma subpasta v3
•Faixa de densidade de cluster alterada para v2;
faixa adicionada para v3
•Caminho de saída para os arquivos de imagem
Códigos de barra corrigidos da lâmina de fluxo para nanolâminas de fluxo (D) e microlâminas de fluxo (G).
Foram removidas informações sobre o kit de reagentes do MiSeq, incluindo conteúdo e tipos de lâmina de fluxo. Para obter mais informações, consulte Guia de preparação de reagentes do MiSeq (n.º
do documento 15044983).
N.º de peça 15027617_PTB Rev. H Março de
2013
Foi adicionada uma seção intituladaConceitos do
MiSeqque introduz o fluxo de trabalho de análise, o arquivo de manifesto e a planilha de amostras. Foram removidas as informações sobre a geração de arquivos FASTQ, formatos de arquivos de manifesto, detalhes sobre o fluxo de trabalho de análise e detalhes sobre as planilhas de amostras. Para obter informações sobre esses tópicos, consulte o Guia do usuário do MiSeq Reporter, n.º de peça 15028784, ou o Guia de referência rápida da planilha de
amostras do MiSeq, n.º de peça 15028392.
Foram removidas as instruções para a preparação de primers personalizados. Para obter mais informações, consulte Uso de primers personalizados
no MiSeq, n.º de peça 15041638.
N.º de peça 15027617 Rev. G Janeiro de
2013
Apenas disponível em inglês.
Foram removidas as instruções para desnaturação e diluição de bibliotecas de DNA e preparação de um controle do Illumina PhiX. Consulte Preparação de
bibliotecas de DNA para o sequenciamento no MiSeq, n.º
de peça 15039740.
Foram atualizadas as instruções para limpeza do instrumento para adicionar 25 ml de solução de Tween 20 a 10% em 475 ml de água aprovada para uso em laboratório, em vez de 500 ml de água aprovada para uso em laboratório.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBN.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de peça 15027617_PTB Rev. F Novembro
de 2012
Foram adicionadas as seguintes novas informações:
•Foram adicionadas as descrições dos novos kits de
reagentes para o MiSeq: Nanokit de reagentes para o MiSeq e Microkit de reagentes para o MiSeq
•Foi adicionada a visão geral dos tipos de lâmina de
fluxo
•Foi adicionada a descrição do fluxo de trabalho de
análise de enriquecimento
Foram atualizadas as seguintes informações:
•Novidades no MCS v2.1, foi atualizada a tela
Perform Wash (Realizar limpeza) para adicionar uma opção e um comando de limpeza após a execução para levantar os aspiradores de líquidos
•Foi atualizada a tabela de compatibilidade entre
versões para incluir dependências de nano e microkits
•Foram atualizadas informações de
compatibilidade entre versões para incluir novos kits de reagentes
N.º de peça 15027617 Rev. E Outubro de
2012
Apenas disponível em inglês.
Foram atualizadas as seguintes informações:
•Foram corrigidas as instruções de preparação do
controle PhiX e densidade esperada de cluster do controle de PhiX preparado para 1.000 a
1.200 K/mm²
•Observou-se que o processo de desnaturação e
diluição de bibliotecas, Preparação das bibliotecas, não se aplica a bibliotecas Nextera XT nem a bibliotecas de Amplicon TruSeq
•O nome de atualização foi alterado de Pacote de
expansão do MiSeq para Atualização de hardware do MiSeq
•Foi adicionado o Guia do usuário do MiSeq Reporter
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N.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de peça 15027617 Rev. D Julho de
2012
Apenas disponível em inglês.
Foram atualizadas as descrições do software para MCS v2.0
Foram adicionadas as seguintes novas informações:
•Foi adicionada uma seção intitulada Novidades no
MCS para descrever novos recursos do software,
mudanças na interface e alterações no fluxo de trabalho
•Foram adicionados descrição e número de
catálogo do kit de reagentes do MiSeq v2, 500 ciclos
•Foi adicionada a seção Compatibilidade entre
versões e requisitos
•Foi adicionada a descrição do pacote de expansão
do MiSeq, que é necessário para a geração de imagens de lâmina de fluxo com superfície dupla de 14 blocos
•Foi adicionada a descrição da numeração dos
blocos da lâmina de fluxo com superfície dupla
•Foi adicionado o fluxo de trabalho de análise de
Amplicon de PCR para bibliotecas Nextera XT
•Foi adicionado o uso de Tween 20 a 10% em
procedimentos de limpeza e volumes de enxágue esperados
•Foi adicionada a versão do cartucho de reagente
para o procedimento de falha de leitura de RFID Foram atualizadas as seguintes informações:
•Foram alterados os acrônimos de reagentes para
IMF, CMF e AMX para nomes de reagente v2 IMS, CMS e AMS, respectivamente
•Foi alterada a concentração de PhiX de 8 pM para
12,5 pM
•Foi alterada a concentração máxima recomendada
de NaOH para 1 mM na solução final
•Observou-se que é necessária uma limpeza de
manutenção para remover o instrumento do modo de espera e começar as etapas de configuração para uma próxima execução
•Foi retirada a seção Parâmetros da planilha de
amostras e a etapa de configuração da planilha de amostras no fluxo de trabalho; a Illumina
recomenda criar a planilha de amostras antes da preparação das amostras (consulte o Guia de
referência rápida da planilha de amostras do MiSeq, n.º
de peça 15028392, e o Guia do usuário do Illumina
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBN.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de catálogo 15027617 Rev. C Abril de
2012
Apenas disponível em inglês.
Foram atualizadas as descrições do software para MCS v1.2
Foram adicionados estes novos procedimentos e estas novas seções: Visão geral do BaseSpace, Uso de primers personalizados, Geração de arquivos FASTQ, Solução de problemas de erro de taxa de fluxo, Realização de um teste de volume, Realização de uma limpeza de manutenção e Desativação do instrumento, que inclui uma limpeza para espera. Foram atualizadas as seguintes informações:
•Foi atualizado o nome do fluxo de trabalho de
Amplicon para Amplicon personalizado; foi atualizado o nome do fluxo de trabalho
DenovoAssembly para conjunto; foi adicionado o fluxo de trabalho GenerateFASTQ
•Foram adicionadas descrições de pastas e arquivos
de execução; foi atualizada a nomenclatura da pasta de execução; foi adicionado o tamanho da pasta de dados da execução
•Foi listada a pasta de genoma conforme
necessário para o sequenciamento de Amplicon em Parâmetros da planilha de amostras
•Foram adicionadas instruções para diluição de
NaOH para desnaturar bibliotecas
•Foi atualizada a seção Resolução da falha de
leitura RFID para incluir instruções de autosserviço do MiSeq
•Foram listados os arquivos e as pastas usados
para solucionar problemas de desempenho da execução
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N.º do documento Data Descrição da alteração
N.º de peça 15027617 Rev. B Dezembro
de 2011
Apenas disponível em inglês.
Foram atualizadas as descrições do software para MCS v1.1
Foram adicionadas informações sobre proteção antivírus
Foram atualizadas as seguintes informações:
•Instruções para resolver falhas de RFID
•Preparação de bibliotecas — alterada para 0,2 N
de NaOH
•Convenção de nomenclatura para pasta de
execução
•Espaço em disco e capacidade de armazenamento
necessários
•Etapas de configuração da execução — foram
adicionadas mais informações à seção Configuração da planilha de amostras
•Etapas de configuração da execução — foi
adicionada observação para a eliminação do PR2 restante
•Duração da análise — foi adicionada quando a
análise for superior a duas horas
•Requisitos de entrada de análise — foram listados
os arquivos de manifesto conforme o necessário para as bibliotecas de Amplicon personalizado TruSeq
•Foi corrigido o tamanho do tubo HT1 em
Conteúdo do kit de reagentes do MiSeq
•Foram alteradas as referências de iCom para
MyIllumina
N.º de catálogo 15027617 Rev. A Setembro
de 2011
Apenas disponível em inglês. Lançamento inicial
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBÍndice
Histórico de revisões iii
Índice xi
Capítulo 1 Visão geral
1
Introdução 2
Recursos adicionais 3
Componentes 4
Conceitos do MiSeq 7
Software MiSeq 8
Opções de análise secundária 11
Sequencing Analysis Viewer 13
Espaço em disco necessário 14
Visão geral do kit de reagentes do MiSeq 15
Capítulo 2 Introdução
19
Inicialização do MiSeq 20
Personalizar configurações do sistema 21
Configurar as notificações de atualizações do BaseSpace 22
Definir preferências de e-mail 22
Definir locais de pastas padrão 22
Materiais de consumo fornecidos pelo usuário 24
Capítulo 3 Sequenciamento
27
Introdução 28
Duração da execução 29
Fluxo de trabalho do MiSeq 30
Descongelar o cartucho de reagente 32
Inspecionar o cartucho de reagente 33
Desnaturar e diluir bibliotecas 34
Carregar bibliotecas de amostra 35
Configurar uma execução usando o MCS 36
Limpar a lâmina de fluxo 37
Carregar a lâmina de fluxo 39
Carregar os reagentes 41
Início da execução 44
Monitorar a execução 45
Realizar uma limpeza após a execução 48
Capítulo 4 Manutenção
53
Frequência da manutenção 54
Frequência de manutenção para o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS 55
xii
Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBLive Help (Ajuda ao vivo) 71
Pausar ou interromper uma execução 72
Levantar manualmente os aspiradores de líquidos do cartucho de reagente 73
Resolver os erros de configuração da execução 74
Resolver a falha de leitura de RFID 75
Solucionar erro da taxa de fluxo 77
Realizar um teste de volume 78
Medir os volumes de enxágue esperados 80
Definir as configurações do sistema 81
Apêndice B Pastas e arquivos de saída
83
Pastas de execução 84
Conteúdo da pasta MiSeqOutput 85
Pastas e arquivos do RTA 86
Índice
89
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Capítulo 1 Visão geral
Visão geral
Introdução 2 Recursos adicionais 3 Componentes 4 Conceitos do MiSeq 7 Software MiSeq 8Opções de análise secundária 11
Sequencing Analysis Viewer 13
Espaço em disco necessário 14
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBIntrodução
O sistema MiSeq®da Illumina combina a comprovada tecnologia de sequenciamento por
síntese (SBS) com um fluxo de trabalho revolucionário que permite ir do DNA até os dados analisados em apenas oito horas. O MiSeq integra a clusterização, o sequenciamento e a análise de dados em um único instrumento.
Recursos
} Automação Walkaway — depois de configurar a execução, o que inclui carregar o
cartucho de reagente pré-carregado, frasco de solução tampão e lâmina de fluxo, não será necessária mais nenhuma atividade prática.
} Cartucho de reagente carregado — um cartucho descartável de reagente
pré-carregado projetado especialmente fornece reagentes para a clusterização e o
sequenciamento, incluindo reagentes de sequenciamento do tipo paired-end e reagentes de indexação. O controle integrado de identificação por radiofrequência (RFID, Radio Frequency Identification) permite o rastreamento preciso dos materiais de consumo. } Controles de interface — a interface do MiSeq Control Software (MCS) oferece
controles para configurar o instrumento, configurar e monitorar as execuções e executar procedimentos de manutenção.
} Carregamento simples da lâmina de fluxo — um mecanismo de trava posiciona
automaticamente a lâmina de fluxo enquanto ela é carregada no instrumento. O controle integrado de identificação por radiofrequência (RFID, Radio Frequency Identification) permite o rastreamento preciso dos materiais de consumo.
} Arquitetura do fluxo de reagentes inovadora — o sistema do fluxo de reagentes do
MiSeq permite uma eficiência incomparável no tempo do ciclo químico durante o sequenciamento.
} Real-time analysis (RTA) — o software de análise integrado realiza a análise de dados
do instrumento em tempo real durante a execução do sequenciamento, o que inclui a análise de imagens e a identificação de bases, e economiza um tempo valioso na análise posterior.
} MiSeq Reporter — o software de análise secundária integrado processa os dados da
análise do RTA para realizar o alinhamento e fornecer informações sobre cada amostra analisada.
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Recursos adicionais
A documentação a seguir está disponível para download no site da Illumina.
Recurso Descrição
Guia de preparação do local do sistema MiSeq
Fornece especificações para área do laboratório, requisitos elétricos e considerações ambientais.
Guia de conformidade e segurança do sistema MiSeq
Fornece informações sobre rotulagem de instrumentos, certificações de conformidade e considerações de segurança.
Guia do usuário do Illumina Experiment Manager
Fornece instruções para a criação de placas de amostra e planilhas de amostra para diferentes fluxos de trabalho e tipos de biblioteca.
Guia de referência para o
gerenciamento do fluxo de trabalho BlueFuse
Fornece instruções para a criação de placas de amostra e planilhas de amostra para uso com o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS.
Guia de referência rápida de planilhas de amostras do MiSeq
Apresenta informações sobre a adição de configurações da planilha de amostras à sua planilha de amostras.
Como preparar bibliotecas de DNA para sequenciamento no MiSeq
Fornece instruções para a desnaturação e a diluição das bibliotecas de amostras preparadas antes do sequenciamento no MiSeq, e para a preparação de um controle do PhiX. Essa etapa se aplica à maioria dos tipos de bibliotecas.
Uso de primers personalizados no MiSeq
Fornece instruções para preparação e carregamento de primers personalizados, e para edição da planilha de amostras para primers personalizados.
Guia do usuário do MiSeq Reporter
Fornece uma visão geral sobre processos de análise, fluxos de trabalho de análise e arquivos de saída gerados pelo MiSeq Reporter, e também requisitos de computação, instruções de instalação à exceção do instrumento e informações sobre solução de problemas.
Guia de referência do BlueFuse Multi
Fornece uma visão geral abrangente dos procedimentos de análise, dos fluxos de trabalho de análise e dos arquivos gerados pelo BlueFuse Multi, bem como requisitos de computação e informações de solução de problemas. Utilize esse guia com o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS.
Ajuda on-line do MiSeq Reporter Apresenta instruções de uso do software MiSeq Reporter.
Guia do usuário do BaseSpace Fornece instruções de uso do BaseSpace e descrições dos gráficos gerados para cada fluxo de trabalho de análise.
Guia do sistema do BaseSpace Onsite
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBComponentes
O MiSeq tem os seguintes componentes externos:
A Compartimento da lâmina de fluxo — contém o estágio que abriga a lâmina de fluxo
durante a execução. Os motores do estágio da lâmina de fluxo movem a plataforma para fora do módulo óptico para o carregamento da lâmina de fluxo e retorna-a quando a execução é iniciada.
B Módulo óptico fechado — contém componentes ópticos que permitem a aquisição da
imagem da lâmina de fluxo.
C Barra de status — ilumina em três cores para indicar o status do instrumento. A cor azul
indica que o instrumento está processando, laranja indica que o instrumento precisa de atenção e verde indica que o instrumento está pronto para começar a próxima execução.
D Monitor da tela de toque — permite a configuração do instrumento e a configuração da
execução com o uso da interface do software.
E Portas USB externas — facilitam a transferência de arquivos e dados para o computador do
instrumento a partir do monitor da tela de toque.
F Compartimento de reagentes — contém reagentes em temperaturas adequadas, soluções de
limpeza e o frasco de resíduos. A porta do compartimento de reagentes é protegida por uma trava magnética.
A interface do MiSeq orienta você nas etapas de configuração da execução usando o monitor da tela de toque. Para carregar os componentes da execução, é preciso acessar o compartimento de reagentes e o compartimento da lâmina de fluxo.
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Compartimento da lâmina de fluxo
A Estágio da lâmina de fluxo
B Porta do compartimento da lâmina de fluxo
C Trava da lâmina de fluxo
D Lâmina de fluxo
E Botão para liberação da trava da lâmina de fluxo
O compartimento da lâmina de fluxo abriga o estágio da lâmina de fluxo, a estação térmica e as conexões de fluxo de reagentes para a lâmina de fluxo. O estágio da lâmina de fluxo segura a lâmina de fluxo, e a trava da lâmina de fluxo prende e posiciona a lâmina de fluxo. Quando a trava da lâmina de fluxo é fechada, dois pinos próximos à dobradiça da trava posicionam a lâmina de fluxo automaticamente.
A estação térmica, localizada sob o estágio da lâmina de fluxo, controla as alterações na temperatura da lâmina de fluxo, necessárias para a clusterização e o sequenciamento.
Compartimento de reagentes
A Refrigerador dos reagentes
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTB Durante a execução, o refrigerador de reagentes mantém um cartucho de reagentesdescartável. Durante a limpeza do instrumento, o refrigerador de reagentes sustenta a bandeja de limpeza. O software automaticamente abaixa os aspiradores de líquidos em cada reservatório do cartucho de reagentes no momento apropriado durante uma execução, dependendo do processo que está sendo executado.
No lado direito do refrigerador de reagentes, há aberturas sob medida para o frasco de PR2 e o de resíduos. A alça do aspirador de líquidos mantém as garrafas no lugar e abaixa o aspirador de líquidos apropriado em cada frasco. Os reagentes são bombeados pelo
aspirador de líquidos e pelas linhas de fluxo de reagentes e seguem para a lâmina de fluxo. Os resíduos do reagente são colocados no frasco de resíduos durante todo o processo.
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Conceitos do MiSeq
Os seguintes conceitos e termos são comuns a todas as etapas de configuração da execução no MiSeq.
Conceito Descrição Analysis Workflow
(Fluxo de trabalho de análise)
Um procedimento de análise secundária realizado pelo MiSeq Reporter. O fluxo de trabalho de análise para cada execução é especificado na planilha de amostras.
Manifest (Manifesto) O arquivo que especifica um genoma de referência e as regiões de referência buscadas para serem usadas na etapa de alinhamento. Para fluxos de trabalho que necessitem de um manifesto, o arquivo de manifesto é especificado na planilha de amostras e copiado para a pasta de manifesto designada no MCS.
Reference Genome (Genoma de referência)
Arquivo no formato FASTA que contém as sequências de genoma usadas durante a análise. Para a maioria dos fluxos de trabalho de análise, o arquivo do genoma de referência está especificado na planilha de amostras.
Run Folder (Pasta de execução)
A estrutura de pastas preenchida pelo software RTA (pasta MiSeqOutput) ou a pasta preenchida pelo MiSeq Reporter (MiSeq
Analysis). Para obter mais informações, consultePastas de execução na
página 84.
Sample Sheet
(Planilha de amostras)
Um arquivo de valores separados por vírgula (*.csv) que contém as informações necessárias para configurar e analisar uma execução de sequenciamento, incluindo uma lista de amostras e suas sequências de índices.
A planilha de amostras deve ser fornecida durante as etapas de configuração da execução no MiSeq. Após o início da execução, a planilha de amostras é renomeada para SampleSheet.csv e copiada nas pastas de execução: MiSeqTemp, MiSeqOutput e MiSeqAnalysis.
Para obter mais informações sobre os fluxos de trabalho da análise e os formatos do arquivo de manifesto, consulte o Guia do software MiSeq Reporter (n.º do documento 15042295).
Para obter mais informações sobre as planilhas de amostras, consulte o Guia de referência rápida da planilha de amostras do MiSeq (n.º do documento 15028392).
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBSoftware MiSeq
Os seguintes aplicativos do software são pré-instalados no computador do instrumento: } MiSeq Control Software (MCS) — controla a operação do instrumento. A interface do
MiSeq Control Software (MCS) orienta você nas etapas para carregar a lâmina de fluxo e os reagentes antes de iniciar a execução. Uma visão geral das estatísticas de
qualidade aparece conforme a execução avança.
} Durante a execução, o MCS opera o estágio da lâmina de fluxo, dispensa reagentes, controla as temperaturas da lâmina de fluxo e captura as imagens de clusters na lâmina de fluxo. O MCS realiza a execução de acordo com os parâmetros especificados na planilha de amostras.
} Software Real-time analysis (RTA) — é um software integrado que realiza a
identificação de bases e a análise de imagens, além de atribuir uma pontuação de qualidade a cada base para cada ciclo. As imagens são armazenadas temporariamente na pasta de execução para processamento pelo RTA e depois automaticamente
excluídas quando a análise do RTA é concluída.
} MiSeq Reporter — executa a análise secundária. O software de análise MiSeq Reporter
processa as identificações de bases geradas pelo software RTA e produz informações sobre o conjunto de elementos contíguos, alinhamento e variantes para cada genoma solicitado. O fluxo de trabalho de análise especificado na planilha de amostras
determina o tipo de análise realizado. Para obter mais informações, consulteVisão geral
do MiSeq Reporter na página 12.
Os softwares opcionais usados à exceção do instrumento incluem o Sequencing Analysis Viewer (SAV). Para obter mais informações, consulteSequencing Analysis Viewer na
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Ícones de status
No canto superior direito da tela Home (Página inicial), há um ícone de status que indica todas as mudanças nas condições durante a configuração da execução ou durante a execução.
Ícone de status Nome do status Descrição
Status OK Nenhuma mudança. O sistema está normal.
Atenção Informação importante. Uma ação é recomendada.
Advertência As advertências não interrompem uma execução, mas
podem exigir uma ação antes de prosseguir.
Erro Os erros geralmente interrompem uma execução e
normalmente exigem uma ação antes de prosseguir com a execução.
Quando ocorre uma alteração em uma condição, o ícone muda para a imagem associada e pisca para alertar. Selecione o ícone para abrir a janela de status e exibir uma descrição da condição.
Selecione qualquer item listado para ver uma descrição detalhada da condição e instruções para resolver a condição, se for o caso.
Selecione Acknowledge (Confirmar) para aceitar a mensagem e Close (Fechar) para fechar a caixa de diálogo.
É possível filtrar os tipos de mensagens que aparecem na janela de status, selecionando os ícones ao longo da margem superior da janela. A seleção de um ícone alterna entre exibir ou ocultar a condição.
Indicadores de atividade
Vários ícones estão localizados no canto inferior direito de cada tela da interface. Cada ícone é um indicador de atividade que mostra qual atividade está sendo executada pelo instrumento.
Figura 1 Indicadores de atividade
Da esquerda para a direita, os indicadores de atividade representam as seguintes atividades:
} Movimentação do estágio Y } Movimentação do estágio Z
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBIndicadores de sensor
Os indicadores de sensor, que aparecem na base de cada tela de interface, representam o status de um componente do instrumento.
Figura 2 Indicadores de sensor
Da esquerda para a direita, os indicadores de sensor representam os seguintes componentes:
} Porta do compartimento da lâmina de fluxo na posição aberta ou fechada } Temperatura do refrigerador do reagentes em °C
} Temperatura da lâmina de fluxo em °C
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Opções de análise secundária
Os dados de sequenciamento do MiSeq podem ser analisados no computador do
instrumento por meio do MiSeq Reporter, em um servidor em rede utilizando o BaseSpace Onsite ou na nuvem usando o BaseSpace. Se executar o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS, use o software BlueFuse Multi para análise. O BaseSpace, o BaseSpace Onsite e o MiSeq Reporter produzem informações sobre o conjunto de elementos contíguos, alinhamento e variantes para cada genoma solicitado e para cada amostra de uma execução com diversas amostras.
Visão geral do BaseSpace e BaseSpace Onsite
O BaseSpace é um ambiente de computação em nuvem da Illumina. O BaseSpace Onsite fornece um ambiente de computação em um servidor dedicado, completo com ferramentas de configuração de execução e opções de análise.
Faça login no BaseSpace ou no BaseSpace Onsite quando você configurar a sequência de execução. Ao usar o BaseSpace ou BaseSpace Onsite, você tem uma opção adicional para armazenar dados de execução localmente. Para obter mais informações, consulte
Personalizar configurações do sistema na página 21.
Quando você começar a execução de sequenciamento, o ícone será alterado para indicar que o MiSeq está conectado ao BaseSpace ou ao BaseSpace Onsite e que os arquivos de dados estão sendo transferidos para o local especificado.
Figura 3 Ícone indicando conexão ao BaseSpace
Figura 4 Ícone indicando conexão com o BaseSpace Onsite
Usando o BaseSpace, os arquivos de dados são criptografados durante o processo, descriptografados durante a análise e criptografados novamente ao serem armazenados. Usando o BaseSpace Onsite, os arquivos de dados são criptografados durante o processo, descriptografados durante a análise e, como opção, podem ser criptografados novamente ao serem armazenados.
O BaseSpace e o BaseSpace Onsite se desconectam automaticamente do MiSeq no final da execução ou assim que todos os arquivos de análise do RTA terminam a transferência. Se a conexão com a Internet for interrompida, o upload dos arquivos de análise continuará depois que ela for restaurada, a partir do ponto em que ocorreu a interrupção.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTB É possível se conectar ao BaseSpace no site basespace.com. Faça o login usando sua conta MyIllumina. Para obter mais informações sobre o BaseSpace, consulte o Guia do usuário do BaseSpace (n.º de documento 15044182) e as páginas de suporte do BaseSpace no site da Illumina.Para obter mais informações sobre o BaseSpace Onsite, consulte o Guia do usuário do BaseSpace Onsite (n.º de documento 15049148) e as páginas de suporte do BaseSpace Onsite no site da Illumina.
Visão geral do MiSeq Reporter
MiSeq Reporter é um aplicativo de serviço do Windows que processa as identificações de bases geradas pelo software RTA. O MiSeq Reporter inicia a análise secundária
imediatamente após a conclusão da análise da execução de sequenciamento feita pelo software RTA.
O MiSeq Reporter é executado no computador do instrumento. No entanto, a interface do software deve ser exibida por um navegador em outro computador conectado à mesma rede do MiSeq Reporter.
Quando a análise secundária é concluída, um arquivo chamado CompletedJobInfo.xml é gravado na pasta de execução. Para mais informações, consulte o Guia do software MiSeq Reporter (n.º do documento 15042295).
Sequenciamento durante a análise
Os recursos de computação do sistema MiSeq são dedicados ao sequenciamento ou à análise. Se uma nova execução de sequenciamento for iniciada no MiSeq antes de a análise secundária de uma execução anterior ser concluída, a análise do MiSeq Reporter será interrompida automaticamente.
Será possível reiniciar a análise do MiSeq Reporter usando o recurso Requeue (Recolocar na fila) na interface do MiSeq Reporter depois que a nova execução de sequenciamento for concluída. Nesse ponto, a análise secundária começa do início.
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Sequencing Analysis Viewer
É possível monitorar a execução de forma mais detalhada sem interferir com ela usando o Illumina Sequencing Analysis Viewer (SAV). O MiSeq deve estar conectado para exibir os resultados da análise primária com o SAV.
O SAV permite analisar as métricas durante uma execução conforme elas são geradas, e também mais tarde, depois da conclusão da execução. Instale o SAV em um computador independente do MiSeq, com acesso à mesma rede conectada ao instrumento. Após a inicialização do software, vá para a pasta de saída de sua execução.
Após a geração do modelo, o SAV fornece as métricas geradas pelo RTA e organiza-as em lotes, gráficos e tabelas.
OBSERVAÇÃO
O SAV é universal para os sistemas de sequenciamento da Illumina; a maioria deles utiliza uma lâmina de fluxo de oito cavidades. Algumas visualizações incluem listas suspensas que mostram cavidades de um a oito. Como a lâmina de fluxo do MiSeq tem uma única cavidade, selecione All (Todos) ou Lane 1 (Cavidade 1).
Para obter mais informações, consulte o Guia do usuário do Sequencing Analysis Viewer (n.º de documento 15020619).
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBEspaço em disco necessário
O computador integrado do instrumento tem aproximadamente 550 GB de capacidade de armazenamento.
Antes de iniciar uma execução, o software verifica o espaço em disco disponível. Se não houver espaço em disco suficiente para a execução, aparecerá um aviso. A mensagem indica quanto espaço em disco é necessário para a execução e quanto espaço em disco deve ser liberado para que a execução possa prosseguir.
Se você precisar liberar espaço em disco disponível, mova ou exclua as pastas de execução mais antigas, conforme apropriado. Para mais informações, consulteGerenciar arquivos na
página 62. Depois de liberar o espaço adequado em disco, selecione Restart Check (Reiniciar verificação).
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Visão geral do kit de reagentes do MiSeq
Para realizar uma execução no MiSeq, é necessário um kit de reagentes descartável do MiSeq, disponível em diferentes tipos e tamanhos. Cada tipo de kit de reagentes do MiSeq inclui um tipo da lâmina de fluxo específico do kit e todos os reagentes necessários para a realização de uma execução.
A lâmina de fluxo, o frasco PR2 e o cartucho de reagentes fornecidos no kit usam
identificação por radiofrequência (RFID) para rastreamento e compatibilidade precisos dos materiais de consumo.
É preciso usar o cartucho de reagentes associado ao seu tipo de lâmina de fluxo. Se o cartucho de reagentes não for compatível, uma mensagem aparecerá durante a configuração da execução solicitando que você carregue um cartucho de reagente compatível.
Para obter uma descrição dos kits de reagentes disponíveis, acesse o site da Illumina support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/miseq_reagent_kit.html.
Lâmina de fluxo
A Porta de saída
B Área de imagem
C Porta de entrada
A lâmina de fluxo do MiSeq é um substrato descartável com base em vidro no qual são gerados os clusters e é executada a reação de sequenciamento.
Os reagentes entram na lâmina de fluxo através da porta de entrada, passam pela área de imagem de cavidade única e, em seguida, saem da lâmina de fluxo pela porta de saída. Os resíduos que saem da lâmina de fluxo são colocados no frasco de resíduos.
As bibliotecas são carregadas no cartucho de reagente antes de configurar a execução e automaticamente transferidas para a lâmina de fluxo depois do início da execução.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBCor da tampa da lâmina de fluxo
A cor da tampa do receptáculo indica o tipo da lâmina de fluxo:
Lâmina de fluxo Cor da tampa da lâmina de fluxo
Lâmina de fluxo padrão Lâmina de fluxo do PGS
Clara
Microlâmina de fluxo Verde
Nanolâmina de fluxo Amarela
Visão geral do cartucho de reagente
O cartucho de reagente do MiSeq é um material de consumo descartável, composto por reservatórios lacrados com selo de alumínio pré-carregados com reagentes de clusterização e sequenciamento suficientes para sequenciar uma lâmina de fluxo.
Cada reservatório do cartucho é numerado. As bibliotecas de amostras são carregadas no cartucho na posição 17, que é rotulada como Load Samples (Carregar amostras).
ADVERTÊNCIA
Este conjunto de reagentes contém formamida, uma amida alifática que pode ser toxina reprodutiva. Podem ocorrer ferimentos por meio de inalação, ingestão e contato com a pele e com os olhos. Use equipamento de proteção, incluindo proteção para os olhos, luvas e jaleco de laboratório. Manuseie os reagentes utilizados como resíduo químico e descarte de acordo com as normas de segurança governamentais para a sua região. Para
obter informações ambientais, de saúde e de segurança, consulte as SDS para este kit em
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Reservatórios reservados
Figura 5 Cartucho de reagente com reservatórios numerados
Posição Nome do reagente Descrição
8 LDR Reagente de desnaturação (contém formamida)
17 Reservado Load Samples (Carregar amostras) (Reservado para
bibliotecas de amostras)
18 Reservado Reservado para primer de leitura 1 personalizado
[Opcional]
19 Reservado Reservado para primer de leitura de índice
personalizado[Opcional]
20 Reservado Reservado para primer de leitura 2 personalizado
[Opcional] Tabela 1 Reservatórios de cartuchos de reagente
OBSERVAÇÃO
Para obter mais informações sobre o uso de primers personalizados no cartucho de reagente do MiSeq, consulte Uso de primers personalizados no MiSeq (n.º de documento
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBC
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Capítulo 2 IntroduçãoIntrodução
Inicialização do MiSeq 20Personalizar configurações do sistema 21
Configurar as notificações de atualizações do BaseSpace 22
Definir preferências de e-mail 22
Definir locais de pastas padrão 22
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBInicialização do MiSeq
OBSERVAÇÃOPara obter um melhor desempenho, deixe o instrumento ligado continuamente. No
entanto, se o instrumento precisar ser desligado, consulteDesligar o instrumento na
página 65. Espere no mínimo 60 segundos antes de colocar o interruptor na posição ON (ligado).
1 Se o MiSeq não estiver ligado, localize o interruptor do instrumento no painel traseiro à direita. Ele está localizado no canto inferior, logo acima do cabo de energia.
Figura 6 Localização do interruptor
2 Coloque o interruptor na posição ON (ligado). O computador do instrumento integrado será iniciado.
3 Faça login no sistema operacional usando o nome de usuário e a senha predefinidos: } Nome de usuário: sbsuser
} Senha: sbs123
Espere até que o sistema operacional termine de carregar. Quando o sistema estiver pronto, o MiSeq Control Software (MCS) será ativado e inicializará o sistema automaticamente.
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Personalizar configurações do sistema
1 Na tela Home (Página inicial), selecione Run Options (Opções de execução). 2 Selecione a guia Run Settings (Configurações de execução).
3 Selecione Post Run Wash (Limpeza após a execução) ou Maintenance Wash (Limpeza de manutenção).
Uma limpeza do instrumento é necessária após cada execução. O software exige que a limpeza seja feita antes de configurar uma execução subsequente. A opção Post-Run Wash (Limpeza após a execução) especifica qual tipo de limpeza é realizada por padrão. A limpeza após a execução leva cerca de 30 minutos. A limpeza de manutenção leva cerca de uma hora.
4 Digite o endereço do local do servidor do BaseSpace Onsite.
É necessário configurar o servidor do BaseSpace Onsite se você usa o BaseSpace Onsite.
5 Marque ou desmarque Send instrument health information to Illumina to aid
technical support (Enviar informações de integridade do instrumento para ajudar o
suporte técnico da Illumina).
Send Instrument Health (Enviar integridade do sistema) é uma opção para ajudar o suporte técnico da Illumina na resolução de possíveis problemas. Os únicos arquivos enviados para Illumina são os arquivos de log (arquivos de interoperabilidade e arquivos de log). O instrumento deve estar conectado a uma rede com acesso à Internet para usar esse recurso.
6 Marque ou desmarque When using BaseSpace or BaseSpace Onsite, replicate
analysis locally on MiSeq (Ao usar o BaseSpace ou o BaseSpace Onsite, replicar
análise localmente no MiSeq).
A configuração Replicate Analysis Locally (Replicar análise localmente) especifica locais de processamento ao usar o BaseSpace ou o BaseSpace Onsite. A configuração fornece a opção de realizar a análise tanto localmente no instrumento e no BaseSpace ou no BaseSpace Onsite.
Se você selecionar essa opção quando usar o BaseSpace ou BaseSpace Onsite, o MiSeq Reporter será iniciado automaticamente após a execução e realizará a análise no local. Se você não selecionar essa opção quando usar o BaseSpace ou BaseSpace Onsite, o MiSeq Reporter não iniciará automaticamente após a execução, e a análise será realizada no BaseSpace ou no BaseSpace Onsite.
Se executar o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS com o BlueFuse Multi, selecione essa opção.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBConfigurar as notificações de atualizações do
BaseSpace
1 Na tela Home (Página inicial), selecione Manage Instrument (Gerenciar instrumento). 2 Selecione Software Update (Atualização de software).
3 Selecione Automatically check for new software updates on BaseSpace (Verificar automaticamente novas atualizações de software no BaseSpace).
Definir preferências de e-mail
O MiSeq poderá ser configurado para enviar um e-mail de notificação quando a análise RTA ou a análise secundária do instrumento forem concluídas ou se ocorrer um erro de software crítico no MiSeq.
1 Na tela Home (Página inicial), selecione Run Options (Opções de execução). 2 Selecione a guia Folder Settings (Configurações de pasta).
3 Digite as seguintes informações:
} Local SMTP email server address (Endereço de servidor de e-mail SMTP local) —
use o teclado da tela para digitar o endereço de servidor de e-mail SMTP local. Se necessário, entre em contato com o administrador da instalação para obter essa informação.
} Sender email address (Endereço de e-mail do remetente) — use o teclado da tela
para digitar o endereço de e-mail do remetente. Pode ser seu endereço de e-mail ou um endereço diferente especificado para o envio de notificações por e-mail. O endereço de e-mail do remetente deve ter o mesmo nome de domínio que o endereço do servidor de e-mail.
} Email addresses (Endereços de e-mail) — use o teclado da tela para digitar os
endereços de e-mail de cada destinatário para receber notificações. Separe cada endereço de e-mail com uma vírgula. Selecione Test (Teste) para enviar um e-mail de teste aos destinatários das notificações.
} Notify via email when (Notificar por e-mail quando) — marque a caixa de seleção
para os eventos da execução que gerarão uma notificação.
Definir locais de pastas padrão
As pastas podem estar em uma rede local ou no computador do instrumento. 1 Na tela Home (Página inicial), selecione Run Options (Opções de execução). 2 Selecione a guia Folder Settings (Configurações de pasta).
3 Informe locais padrão para as seguintes pastas.
} Recipes (Receitas) — define o local padrão para as receitas. Receitas são arquivos
XML que o software usa para realizar a execução de sequenciamento. Uma receita é criada no início da execução com base nos parâmetros da planilha de amostras, então, a receita é copiada para a pasta de saída.
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} Sample Sheets (Planilhas de amostras) — define o local padrão para as planilhas de
amostras. As planilhas de amostras são criadas antes da preparação da biblioteca e contêm os parâmetros para a execução.
} Manifests (Manifestos) — arquivos de manifesto são necessários para alguns tipos
de bibliotecas. Consulte a documentação de preparação de amostra para seu kit de preparação de amostras, bem como o Guia de referência rápida da planilha de amostras (n.º do documento 15028392).
} MiSeqOutput — define o local padrão para os arquivos de saída de análise. Altere a
pasta de saída padrão para um local de rede para fazer compartilhamento, armazenamento de longo prazo, e, opcionalmente, para usar o MiSeq Reporter off-line. Para obter mais informações, consultePastas de execução na página 84.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBMateriais de consumo fornecidos pelo usuário
Os materiais de consumo fornecidos pelo usuário a seguir devem estar disponíveis antes do início de uma execução.
Material de consumo Fornecedor Finalidade
1.0 N NaOH, grau de biologia molecular Fornecedor de itens de uso comum do laboratório Desnaturação de bibliotecas de amostra e DNA de controle de PhiX
Compressa com álcool, 70% isopropílico ou 70% etílico VWR, n.º de catálogo 95041-714* Fornecedor de itens de uso comum do laboratório
Limpeza do suporte da lâmina de fluxo
Luvas descartáveis, sem pó
Fornecedor de itens de uso comum do laboratório
Uso geral
Lenço para laboratório, poucos fiapos
VWR, n.º de catálogo 21905-026*
Limpeza do estágio da lâmina de fluxo e do selo de alumínio que cobre o reservatório de carregamento das amostras Papel para limpeza de
lente, 4 x 6 pol.
VWR, n.º de catálogo 52846-001*
Limpeza da lâmina de fluxo Tubos de microcentrífuga Fornecedor de itens de uso comum do laboratório Desnaturação e diluição de bibliotecas de amostras e DNA de controle de PhiX
Tubos MiSeq Illumina,
n.º de peça MS-102-9999
Limpeza da linha de modelo, para uso com o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS (opcional para outros fluxos de trabalho)
NaOCl, 5% Sigma-Aldrich, n.º de
catálogo 239305*
Limpeza da linha de modelo, para uso com o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS (opcional para outros fluxos de trabalho)
Tween 20 Sigma-Aldrich, nº do
catálogo P7949
Limpeza do instrumento Pinças, plásticas com
ponta quadrada (opcional)
McMaster-Carr, nº do catálogo 7003A22*
Remoção da lâmina de fluxo do receptáculo de transporte da lâmina de fluxo
Água, aprovada para uso em laboratório
Fornecedor de itens de uso comum do laboratório
Limpeza do instrumento
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Orientações para água aprovada para uso em laboratório
Utilize sempre água aprovada para uso em laboratório para realizar os procedimentos com o instrumento. Nunca use água da torneira ou água desionizada. A seguir, estão exemplos de água aprovada para uso em laboratório aceitável:
} Illumina PW1
} Água de 18 Megohm (MΩ) } Água Milli-Q
} Água Super-Q
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBC
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Capítulo 3 SequenciamentoSequenciamento
Introdução 28 Duração da execução 29Fluxo de trabalho do MiSeq 30
Descongelar o cartucho de reagente 32
Inspecionar o cartucho de reagente 33
Desnaturar e diluir bibliotecas 34
Carregar bibliotecas de amostra 35
Configurar uma execução usando o MCS 36
Limpar a lâmina de fluxo 37
Carregar a lâmina de fluxo 39
Carregar os reagentes 41
Início da execução 44
Monitorar a execução 45
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBIntrodução
Para realizar uma execução no MiSeq, execute as etapas de configuração descritas neste capítulo. Depois do início da execução, não é necessária nenhuma intervenção do usuário. A execução do sequenciamento pode ser monitorada na tela Sequencing (Sequenciamento) ou remotamente com o uso do Sequencing Analysis Viewer (SAV), um aplicativo opcional que pode ser baixado no site da Illumina.
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Duração da execução
A duração da execução depende do número de ciclos realizados. Com o MCS v2.3, é possível realizar uma execução do tipo paired-end de até 2 x 301 ciclos de sequenciamento, além das leituras de índice.
Além disso, a duração da execução depende da versão dos reagentes do MiSeq usados e das atualizações de melhoria de desempenho instaladas no instrumento.
Para obter informações sobre as durações previstas e outras especificações, visite a página de especificações do sistema MiSeq no site da Illumina
(www.illumina.com/systems/miseq/performance_specifications.ilmn).
Número de ciclos em uma leitura
O número de ciclos realizados em uma leitura é um ciclo a mais do que o número de ciclos analisados. O ciclo extra é necessário para os cálculos de phasing e prephasing.
Por exemplo, uma execução de 300 ciclos do tipo paired-end realiza duas leituras de 301 ciclos (2 x 301) para um total de 602 ciclos. No final da execução, 2 x 300 ciclos são analisados.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBFluxo de trabalho do MiSeq
Prepare o cartucho de reagente pré-carregado para uso.
Desnature e dilua as bibliotecas (não se aplica a todos os tipos de bibliotecas). Consulte Preparação de bibliotecas para sequenciamento no
MiSeq (n.º do documento 15039740).
Coloque a mistura da biblioteca no cartucho de reagente no reservatório designado.
Na interface do software, selecione Sequence (Sequenciar) para iniciar as etapas de configuração da execução.
[Opcional]Conecte-se ao BaseSpace ou ao BaseSpace Onsite. Limpe e seque cuidadosamente a lâmina de fluxo.
Carregue a lâmina de fluxo.
Carregue o frasco de PR2 e verifique se o frasco de resíduos está vazio.
Carregue o cartucho de reagente.
Revise os parâmetros da execução e os resultados da verificação pré-execução.
Selecione Start Run (Iniciar execução).
Monitore a execução pela interface do MCS ou por outro computador usando o Sequencing Analysis Viewer (SAV).
Realize uma limpeza após a execução.
Clusterização
Durante a clusterização, moléculas de DNA em fita simples são ligadas à superfície da lâmina de fluxo e, em seguida, amplificadas por processo de formação de pontes para formar clusters.
Sequenciamento
Após a clusterização, são geradas imagens dos clusters com o uso de combinações de filtro e LED específicas de cada um dos quatro didesoxinucleotídeos marcados de modo
fluorescente. Depois que a geração de imagens de um bloco é concluída, a lâmina de fluxo é movida para o lugar com o objetivo de expor o bloco seguinte. O processo é repetido para cada ciclo de sequenciamento. Após a análise das imagens, o software realiza uma
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Análise
Quando a execução for concluída, o software de análise MiSeq Reporter será iniciado automaticamente para executar a análise secundária, que inclui o alinhamento e a
chamada variante. É possível monitorar a análise secundária usando uma conexão com a Internet de outro computador. Para obter mais informações, consulteVisão geral do MiSeq
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBDescongelar o cartucho de reagente
As instruções a seguir descrevem como descongelar o cartucho de reagente utilizando banho-maria em temperatura ambiente.
OBSERVAÇÃO
Como alternativa, você pode descongelar os reagentes durante a noite armazenando-os em uma temperatura entre 2 °C e 8 °C. Os reagentes ficam estáveis por até uma semana quando armazenados nessa temperatura.
1 Remova o cartucho de reagente do armazenamento de -25 °C a -15 °C.
2 Coloque o cartucho de reagente em um banho-maria contendo uma quantidade
suficiente de água desionizada em temperatura ambiente para fazer a base do cartucho de reagentes submergir. A água não pode ultrapassar a linha de água máxima
impressa no cartucho de reagente. Figura 7 Linha de água máxima
3 Deixe o cartucho de reagente descongelar em banho-maria em temperatura ambiente até que esteja completamente descongelado.
} Cartuchos MiSeq v3 — aprox. 60 a 90 minutos. } Cartuchos MiSeq v2 — aprox. 60 minutos.
4 Retire o cartucho do banho-maria e bata-o levemente na bancada para retirar a água da base do cartucho. Seque a base do cartucho.
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Inspecionar o cartucho de reagente
1 Inverta o cartucho de reagente 10 vezes para misturar os reagentes descongelados e, em seguida, inspecione se todas as posições estão descongeladas.
2 Inspecione os reagentes nas posições 1, 2 e 4 para certificar-se de que eles estão totalmente misturados e sem precipitados.
3 Bata o cartucho levemente na bancada para reduzir as bolhas de ar nos reagentes. OBSERVAÇÃO
Os tubos do aspirador de líquidos do MiSeq vão para o fundo de cada reservatório com o objetivo de aspirar os reagentes; portanto, é importante que os reservatórios não tenham bolhas de ar.
4 Coloque o cartucho de reagente no gelo por 6 horas ou reserve entre 2 °C e 8 °C até que você esteja pronto para configurar a etapa de execução. Para obter melhores resultados, prossiga diretamente para o carregamento da amostra e a configuração da execução.
ADVERTÊNCIA
Este conjunto de reagentes contém formamida, uma amida alifática que pode ser toxina reprodutiva. Podem ocorrer ferimentos por meio de inalação, ingestão e contato com a pele e com os olhos. Use equipamento de proteção, incluindo proteção para os olhos, luvas e jaleco de laboratório. Manuseie os reagentes utilizados como resíduo químico e descarte de acordo com as normas de segurança governamentais para a sua região. Para
obter informações ambientais, de saúde e de segurança, consulte as SDS para este kit em
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBDesnaturar e diluir bibliotecas
Se for necessário para seu tipo de biblioteca, desnature e dilua as bibliotecas e adicione o controle opcional do PhiX. Consulte Preparação das bibliotecas de DNA para o sequenciamento no MiSeq (n.º de documento 15039740). Se você estiver executando o fluxo de trabalho do VeriSeq PGS, consulte o Guia de preparação de bibliotecas do VeriSeq PGS (n.º de documento 15052877).
Essa etapa não se aplica a todos os tipos de bibliotecas. Alguns métodos de preparação de
amostras Illumina resultam em uma concentração normalizada de bibliotecas agrupadas pronta para uso. Consulte o guia de preparação de amostras do kit utilizado para preparar bibliotecas de amostras.
OBSERVAÇÃO
Se você estiver usando primers personalizados, prepare-os e configure a planilha de amostras conforme descrito em Uso de primers personalizados no MiSeq (n.º de
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Carregar bibliotecas de amostra
Quando o cartucho de reagente estiver completamente descongelado e pronto para uso, você estará pronto para carregar bibliotecas preparadas dentro do cartucho.
1 Limpe o selo de alumínio que cobre o reservatório denominado Load Samples (Carregar amostras) com um lenço para laboratório com poucos fiapos. 2 Perfure o selo de alumínio com uma pipeta limpa de 1 ml.
3 Com a pipeta, adicione 600 µl das bibliotecas preparadas no reservatório Load
Samples (Carregar amostras). Evite tocar o selo de alumínio.
Figura 8 Carregamento de bibliotecas
4 Vá diretamente para as etapas de configuração da execução usando a interface do MiSeq Control Software (MCS).
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTBConfigurar uma execução usando o MCS
1 Na tela Home (Página inicial), selecione Manage Instrument (Gerenciar instrumento). 2 Selecione Reboot (Reiniciar) para reiniciar o software do sistema.
3 [Opcional]Na tela Run Options (Opções de execução), verifique os locais de pasta para receitas, planilhas de amostras, manifestos e a pasta MiSeqOutput. Para obter mais informações, consulteDefinir locais de pastas padrão na página 22.
4 Na tela Home (Página inicial), selecione Sequence (Sequenciar) para iniciar as etapas de configuração da execução. A tela BaseSpace Options (Opções do BaseSpace) se abrirá.
Quando você seleciona Sequence (Sequenciar) na tela Home (Página inicial), várias telas de configuração de execução são abertas na seguinte ordem: BaseSpace Option (Opção do BaseSpace), Load Flow Cell (Carregar lâmina de fluxo), Load Reagents (Carregar reagentes), Review (Revisão) e Pre-Run Check (Verificação pré-execução).
Definir a opção BaseSpace ou BaseSpace Onsite
1 Na tela BaseSpace Options (Opções do BaseSpace), marque ou desmarque as caixas de seleção Use BaseSpace for storage and analysis (Usar o BaseSpace para
armazenamento e análise) e Use BaseSpace Onsite for storage and analysis (Usar o BaseSpace Onsite para armazenamento e análise).
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Limpar a lâmina de fluxo
1 Coloque um novo par de luvas sem pó.
2 Usando uma pinça plástica, segure a lâmina de fluxo pela base do cartucho plástico e retire do receptáculo da lâmina de fluxo.
Figura 9 Remoção da lâmina de fluxo
3 Enxágue levemente a lâmina de fluxo com água aprovada para uso em laboratório, tirando cuidadosamente o excesso de sais do vidro e do cartucho plástico.
O excesso de sais pode afetar o assentamento da lâmina de fluxo no instrumento. Se os sais secarem na área de imagem, a imagem também pode ser afetada.
Figura 10 Enxágue da lâmina de fluxo
4 Com cuidado, em torno da junta preta das portas da lâmina de fluxo, seque
completamente a lâmina de fluxo e o cartucho plástico usando um tecido para limpeza de lentes sem fiapos. Seque delicadamente a área da junta e o vidro adjacente.
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Material n.º 20000262 Documento n.º 15027617 v01 PTB Figura 12 Secagem da lâmina de fluxo6 Seque o álcool em excesso com um tecido de limpeza de lentes sem fiapos.
7 Certifique-se de que as portas da lâmina de fluxo não têm obstruções e de que a junta está bem assentada em torno das portas da lâmina de fluxo.
Se a junta parecer estar desalojada, pressione-a suavemente de volta no lugar até que esteja bem em volta das portas da lâmina de fluxo.
