Fundação Parque Tecnológico da Paraíba Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Algodão. Relatório Final

Fundação Parque Tecnológico da Paraíba Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Embrapa Algodão

Relatório Final

Determinação do fluxo gênico entre lavouras de algodão e entre

lavouras de algodão e populações naturais de Gossypium

barbadense visando fornecer subsídios para a liberação de

variedades transgênicas de algodão

Campina Grande – Paraíba 2004

Índice

1. Introdução... 2

2. Resumo ... 4

3. Revisão de literatura ... 5

4. Metodologia ... 12

4.1 Caracterização in situ e coleta de plantas de G. barbadense no estado do Mato Grosso ... 12

4.2. Plantio das estacas ... 12

4.3. Extração do DNA ... 13

4.4. Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso – RAPD. ... 14

4.5 –Seqüências Simples Repetidas – SSR... 14

4.6 Coloração do gel de acrilamida... 15

4.7. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro ... 15

5. Resultados ... 17

5.1. Fluxo gênico entre populações naturais de algodão e o algodão cultivado ... 17

5.1.1 Caracterização in situ das populações... 17

5.1.2 Caracterização molecular das plantas de G. barbadense... 32

5.2. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro ... 33

5.2.1 Experimento para verificar a eficiência de barreira de 100 metros de milho... 33

5.2.2 Experimento para verificar o efeito da distância física sem barreiras na redução da taxa de cruzamento... 38

5.2.3. Experimento para verificar a taxa de cruzamento dentro de um campo de algodão... 40

7. Discussão... 42

8. Conclusões ... 47

1. Introdução

A legislação brasileira somente permite a liberação de variedades transgênicas para comercialização e plantio após a realização de diversos estudos que comprovem que o cultivo e consumo em larga escala de produtos geneticamente modificados oferecem os mesmos riscos de danos ao meio ambiente, à saúde humana e animal do que os assumidos por variedades convencionais. No Brasil, a transferência de genes de lavouras transgênicas para lavouras não transgênicas e para populações naturais do gênero Gossypium deve ser o principal entrave para a liberação de variedades geneticamente modificadas de algodão.

G. barbadense é uma espécie sexualmente compatível com o algodoeiro

herbáceo cultivado (G. hirsutum var. latifolium). Populações naturais e semi-selvagens são encontradas em algumas regiões brasileiras, inclusive no estado do Mato Grosso. A ocorrência de fluxo gênico de variedades transgênicas para plantas de G. barbadense pode afetar a capacidade de sobrevivência das populações em seu ambiente. Em casos extremos, a introdução de genes que desfavoreçam o desenvolvimento pode comprometer a existência da população no longo prazo. Embora no caso de algodoeiros esta hipótese seja bastante remota, genes que confiram maior capacidade de competição e adaptação ao ambiente podem tornar a população agressiva o suficiente para ser considerada daninha no ambiente natural. Já o fluxo gênico entre lavouras convencionais e transgênicas pode ser um problema durante a produção de sementes e na certificação de produtos não transgênicos. Na produção de sementes pode ser necessário adotar procedimentos diferentes dos atualmente utilizados para garantir que variedades convencionais não possuam o transgene, pois além da pureza genética desejada, problemas de propriedade intelectual podem surgir. Em casos em que se necessita produzir produtos não transgênicos, o fluxo gênico pode inviabilizar o comércio da fibra para o mercado que se havia sido planejado, que muitas vezes pode fornecer uma remuneração adicional ao produtor, como no caso do algodão orgânico.

Para que os riscos do fluxo gênico sejam minimizados é preciso determinar ações que dificultem ou mesmo impeçam a transferência dos transgenes para outras variedades e populações nativas. Um passo importante neste sentido, e primordial para a liberação de variedades transgênicas, é estabelecer a intensidade do fluxo

gênico entre lavouras e de lavouras para populações naturais sob diferentes distâncias e cercadas por barreiras para a contenção do pólen.

Este projeto realizou estudos preliminares para a definição do fluxo gênico existente entre campos de algodão, e campos de algodão e populações de

2. Resumo

Este projeto foi desenvolvido para quantificar o fluxo gênico existente entre campos de algodão e entre campos de algodão e populações de Gossypium

barbadense no estado do Mato Grosso. Para atingir o primeiro objetivo foram

montados três experimentos a campo, utilizando como a ausência de glândulas de gossipol, marcador morfológico controlada por dois genes recessivos. No primeiro, cujo propósito foi estimar o efeito de uma barreira de 100m de milho na contenção do cruzamento via pólen, verificou-se taxa de cruzamento média de 0,15%, com valores mais altos nas linhas mais próximas à lavoura fonte de pólen. O segundo experimento foi realizado para verificar a taxa de cruzamento dentro de uma lavoura comercial de algodão do Mato Grosso, sendo observada uma taxa média de cruzamento de 7,7%. Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de cruzamento em pontos mais próximos ou mais distantes da bordadura do talhão. O terceiro e último experimento, que consistiu de parcelas armadilhas a distâncias crescentes de uma lavoura de algodão, permitiu verificar que a taxa de cruzamento tende a reduzir a medida que a distância física sem barreira aumenta. Também foi realizada uma expedição para caracterização in situ e coleta de material para estudo de fluxo gênico de G. barbadense existente nas regiões do Pantanal e do Cerrado do Mato Grosso. Verificou-se que G. barbadense ocorre, principalmente, na forma de plantas de fundo de quintal. De modo geral, as plantas encontradas tem entre 1 a 2 anos, são usadas como medicinal, pertencem à variedade botânica brasiliensis e estão presentes em pequeno número por quintal (1 a 3). Foram realizadas extrações de DNA e reações com RAPD e SSR para iniciar a avaliação da variabilidade genética presente e o fluxo gênico com algodoeiro herbáceo cultivado.

3. Revisão de literatura

O fluxo gênico em vegetais pode ocorrer pela fecundação de flores com pólen proveniente de outro genótipo ou pela introdução de propágulos em locais onde originalmente não estavam presentes. Atenção especial tem sido dada ao fluxo gênico depois do advento das plantas geneticamente modificadas (GM). Conforme consideraram Dale et al. (2002), algumas alterações causadas pelo melhoramento usando plantas GM provavelmente têm paralelos com as ocasionadas pelo melhoramento convencional, e que, portanto, o impacto causado pela hibridização entre variedades convencionais e populações naturais pode ser instrutivo para a interpretação dos efeitos da hibridização entre alguns tipos de variedades GM e populações naturais.

Segundo Dale et al. (2002), a probabilidade de ocorrência de fluxo gênico e a sua conseqüência são determinadas por cinco elementos básicos: i) a distância que pólen percorre; ii) a sincronia do florescimento entre a cultura e a população a receber o pólen; iii) a compatibilidade sexual entre as espécies; iv) a ecologia da espécie receptora; v) a natureza do novo gene.

Espécies de Gossypium encontradas no Brasil

As três espécies do gênero Gossypium encontradas no Brasil apresentam compatibilidade sexual entre si, havendo diferentes proporções de viabilidade dos híbridos, que é, geralmente, alta. As características de cada espécie e raça são brevemente descritas:

Gossypium hirsutum L. var. latifollium: É o algodoeiro amplamente cultivado no

Brasil, também denominado de algodoeiro herbáceo. É um alotetraplóide originário da América Central, sendo uma das 50 espécies classificadas do gênero Gossypium (Craven et al., 1994). As taxas de fecundação cruzada variam muito com genótipo, o local, as condições ambientais e a freqüências de insetos polinizadores, havendo relatos de níveis de polinização cruzada no Brasil desde 2% até 88% (Freire & Costa, 1999). Sua distribuição no Brasil é ampla, sendo cultivado em quase todos os

estados. A área cultivada na safra 2001/2002 foi de cerca de 750 mil hectares, e abrangia regiões de ocorrência de G. barbadense.

Gossypium hirsutum L. r. marie galante: Trata-se do algodão popularmente

conhecido como mocó ou arbóreo. Seu centro de origem abrange uma grande área, que vai da costa da Colômbia e Venezuela até o sudeste de El Salvador e Antilhas (Stephens, 1973). Sua distribuição também é ampla, estendendo-se do México ao semi-árido nordestino. O algodão mocó já foi amplamente cultivado no Nordeste brasileiro, chegando a ocupar área superior a dois milhões de hectares na década de setenta. A partir de 1983, ano da chegado do bicudo na região, o plantio entrou em declínio. Estima-se que menos de cinco mil hectares sejam cultivados atualmente, sendo as lavouras restritas a região do Seridó paraibano e potiguar. Imigrantes nordestinos mantêm plantas de algodão mocó em alguns municípios da região amazônica para uso medicinal ou caseiro (Freire 2000). A taxa de alogamia do mocó é mais alta do que a do algodão herbáceo, podendo chegar a 100% (Freire & Costa, 1999).

Gossypium mustelinum: É uma espécie alotetraplóide endêmica do nordeste

brasileiro, não havendo relatos na literatura de sua distribuição em outras regiões do mundo. Atualmente, populações naturais somente são conhecidas em sítios específicos nos municípios de Caicó (RN), Macurerê (BA) e Caraíba (BA) (Freire, 2000). Pickersgill et al. (1975) relatam a existência de indivíduos de G. mustelinum herbarizados em 1838, a partir de coleta realizada na cidade do Crato (CE). Porém, expedições recentes para coleta de germoplasma não foram capazes de localizar qualquer população neste local.

Gossypium barbadense

Trata-se de outra espécie alotetraplóide. No Brasil, são encontradas duas variedades, ambas na forma semi-domesticada. O Rim-de-Boi (G. barbadense var.

brasiliense) possui sementes sem linter, fortemente coladas umas as outras, com

aspecto de rim. A outra variedade, (G. barbadense var. barbadense) conhecida como Quebradinho ou Maranhão, possui sementes sem linter e descoladas. É proveniente das do norte do Peru e sul do Equador e deve ter sido introduzida no Brasil por populações indígenas, cujos descendentes até hoje utilizam sua fibra na

confecção artesanal de tecidos, como planta medicinal e para a confecção de pavios para lamparinas. Ambas variedades são arbóreas e perenes. Sua distribuição no Brasil é ampla, sendo preservados por lavradores a muitas gerações. São encontrados na região amazônica, nas terras baixas do Maranhão e do Piauí, nas cidades do ciclo de mineração do Estado do Mato Grosso, nas áreas circunvizinhas ao Pantanal Matogrossense e na Mata Atlântica, desde o Rio Grande do Norte até o Espírito Santo. A dispersão das duas variedades de G. barbadense pelos diferentes locais ocorreu devido a práticas de agricultura (Boulanger & Pinheiro, 1972; Smith & Cothren, 1999).

Dispersão das sementes

Em algodão, o fluxo gênico pode ocorrer de duas maneiras distintas: pela dispersão de pólen e pela dispersão de sementes. A dispersão de sementes dificilmente ocorre a partir das lavouras, visto serem grandes, cobertas por abundante quantidade de fibras e raramente transportadas por animais (Llewellyn & Fitt, 1996). Para germinar, as sementes requerem grande quantidade de água e, quando o fazem em ambientes não agrícolas, as plantas formadas têm pouca chance de sobrevivência devido à sua pequena capacidade colonizadora (Wozniack, 2002). A dispersão das sementes pode ocorrer durante o transporte, ou, mais comumente no Brasil, acompanhando imigrantes e pelo transporte e uso indevido de “caroços”, sementes destinadas à alimentação animal ou na fabricação de óleo comestível, como material propagativo (Freire, comunicação pessoal).

Dispersão do pólen do algodão cultivado e taxa de cruzamento

Os grãos de pólen do algodoeiro são grandes e viscosos, não sendo facilmente disperso pelo vento (Thies, 1953, Wozniack, 2002). Sua dispersão ocorre com o auxílio de insetos, principalmente abelhas (Thies, 1953). Os estudos para verificar a distância percorrida pelo pólen do algodoeiro têm sido realizados sob os mais diferentes designs experimentais, utilizando marcadores colorimétricos, morfológicos, bioquímicos e moleculares (Queiroga et al., 1993; Queiroga et al.,

1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt, 1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000, Yasuor et al., 2000; Moresco, 2001).

Em alguns casos, em distâncias muito pequenas como 20 metros não se encontram mais plantas provenientes de cruzamento a partir de uma determinada fonte de pólen. Contudo, grande parte dos estudos mostram ainda haver fecundação cruzada no distância máxima medida, geralmente menor que 100 metros, embora a freqüência seja pequena. A totalidade dos estudos observou que a dispersão do pólen e/ou a fecundação cruzada diminui a medida que a distância da fonte de pólen aumenta (Queiroga et al., 1993; Queiroga et al., 1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt, 1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000, Yasuor et al., 2000; Jia, 2002). Porém, a distância máxima em que a polinização pode ocorrer é função de fatores que podem apresentar grande variabilidade, como os hábitos dos insetos polinizadores e o tempo que o pólen permanece viável sob condições em que é transportado.

No Estado do Mato Grosso, Moresco et al. (2001) avaliaram as taxas de cruzamento em cinco localidades. Foram verificadas taxas médias que variaram de 68,5% a 6,5%. Os autores atribuíram estas diferenças marcantes pela atividade diferencial dos insetos polinizadores, causada pela presença de maior quantidade de área nativa (de onde devem partir os polinizadores), pelas diferenças no tipo de agricultura praticada e pelo tempo em que o algodão é explorado de modo extensivo na região.

Fluxo gênico entre o algodão herbáceo e outros tipos de algodão e suas conseqüências

O fluxo gênico pode ser uma potente força evolutiva (Slatkin, 1987). Quando os níveis de hibridização são elevados e a taxa de incorporação de alelos externos supera as taxas de mutação, o fluxo gênico torna-se a principal força evolutiva da população (Ellstrand et al., 1999). Os efeitos do fluxo gênico dependem do tipo de ação do alelo na população. Quando o alelo é neutro, a evolução depende da deriva, e é importante, principalmente, em pequenas populações (Wright, 1969).

Quando os alelos introgredidos são desfavoráveis e a freqüência de imigrantes é superior ao coeficiente de seleção contra os alelos imigrantes, a

população reduz seu vigor (Slatkin, 1987). Esta redução de vigor pode, em casos extremos, determinar a extinção da população.

Se os alelos introgredidos são favoráveis, a seleção natural deverá atuar no sentido de aumentar suas freqüências na população. Este tipo de introgressão é relativamente comum entre plantas cultivadas e não cultivadas. O aumento da agressividade das populações é uma das conseqüências de introgressões deste tipo, que pode ocasionar o aumento da capacidade de competição das plantas. Em ambientes agrícolas, este processo pode resultar em uma nova espécie invasora ou no aumento da importância econômica de uma planta que já era considerada daninha. No caso de populações nativas, a maior aptidão a sobrevivência das plantas pode resultar em aumento do tamanho das populações, perturbando ambientes em relativo equilíbrio. O impacto econômico e ambiental dependerá de quanto será o aumento da agressividade (Ellstrand et al., 1999). Genes que conferem maior resistência a doenças e ao ataque de insetos estão entre os que podem aumentar a capacidade de competição, sejam eles provenientes de variedades melhoradas por métodos clássicos ou de variedades transgênicas.

Uma grande quantidade de fluxo gênico por diversas gerações pode também levar a extinção uma espécie rara (Ellstrand & Elam, 1993), principalmente se o gene é benéfico ou neutro.

A única espécie do gênero Gossypium considerada planta invasora é G.

tomentosum, cuja ocorrência se restringe ao Havaí (Holm et al., 1979). Portanto, as

atenções para a introgressão de genes oriundos de variedades cultivadas, transgênicas ou não, em plantas de ocorrência natural devem ser voltadas para o próprio ambiente em que estas plantas ocupam.

Ellstrand et al. (1999) avaliaram a literatura pertinente a fluxo gênico nas 13 mais importantes espécies de plantas cultivadas e verificaram que em 12 há relatos de hibridação espontânea entre o material cultivado e o selvagem. Em sete eles verificaram indícios de aumento da importância do material selvagem como planta daninha. Em dois o fluxo gênico pode levar a extinção dos materiais selvagens. Entre estes dois está incluído o algodão, G. hirsutum, mas não G. barbadense.

O fluxo gênico entre o algodão cultivado e selvagem já foi documentado. Analisando a morfologia de G. darwinii nas Ilhas Galápagos e G. tomentosum no Havaí, Fryxell (1979) sugeriu que ambas espécies correm risco de extinção devido a

entre G. darwinii e o algodoeiro cultivado foi confirmado por marcadores aloenzimáticos (Wendel & Percy, 1990). Contudo, DeJoode & Wendel (1992) não encontraram evidências de introgressão interespecífica em G. tomentosum utilizando o mesmo tipo de marcador.

Wendel et al. (1994) verificaram que mesmo durante séculos de simpatria com G. barbadense e G. hirsutum, há poucas evidências de introgressão interespecífica dos alelos isoenzimáticos provenientes de outras espécies para G.

mustelinum (Wendel et al., 1994). Os dados também mostraram que o número de

alelos e a heterozigosidade por panmixia foram extremamente baixos, quando comparados a outras espécies do gênero. Os resultados levaram os autores a levantarem a hipótese de que G. mustelinum seja uma espécie paleoendêmica. Estudos morfológicos fornecem mais evidências de que o nível de introgressão de genes de outras espécies para G. mustelinum é baixo (Freire & Moreira, 1998; Freire et al., 1998; Freire et al., 1999).

Dados aloenzimáticos mostraram também existir introgressão interespecífica de genes das duas espécies mais cultivadas de algodão para populações naturais. Wendel et al. (1992) e Brubaker et al. (1993) verificaram que introgressões de G.

barbadense em populações naturais de G. hirsutum eram relativamente comuns em

regiões em que havia simpatria. O nível de introgressão de genes de G. hirsutum em

G. barbadense nativo parece ser bem menor (Percy & Wendel, 1990; Brubaker et

al., 1993). Quando detectado, são mais freqüentes em populações de G.

barbadense provenientes da Argentina e do Paraguai (Percy & Wendel, 1990).

Como G. hirsutum não ocorre em populações naturais nestes países e as plantas em que se observaram introgressão apresentam evidências de manipulação humana, Percy & Wendel (1990) sugerem que elas devem ser resultado do desenvolvimento agronômico mais recente e que os alelos introgredidos foram mantidos por seleção para características agronômicas (Brubaker et al., 1999).

Em relação ao fluxo gênico entre lavouras de algodão, ela é indesejável, principalmente, em duas circunstâncias: i) quando a lavoura que recebe o pólen se destina a produção de sementes; ii) quando o produto a ser comercializado não permite que haja contaminação do produto com transgênico (Moyles & Dale, 1999).

A portaria 607 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, publicada em 14/12/2001 no Diário Oficial da União, determina que um campo destinado à produção de sementes de algodão deve ficar 250 metros de outras

lavouras ou a 100 metros quando o campo de produção de sementes está separado de outra lavoura de algodão por uma barreira de plantas mais altas. Esta distância deve garantir a qualidade genética de sementes básicas, cuja tolerância de plantas fora do tipo é 0,1‰. Não há indicativo neste documento de que os valores tenham sido definidos com base em experimentos em campos grandes o suficiente para observação direta da contaminação genética via pólen. Ele deve ter sido estipulado com base na análise de dados históricos e na extrapolação dos resultados obtidos em experimentos realizados em áreas inferiores às determinadas pela portaria (ver Queiroga et al., 1993; Queiroga et al., 1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt, 1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000). Se o nível de contaminação de sementes transgênicas tolerado for inferior a estes valores, distâncias maiores devem ser respeitadas, principalmente para o caso de plantas Bt, que devem propiciar uma ação mais efetiva dos agentes polinizadores no transporte de seu pólen por utilizarem menor quantidade de inseticidas.

4. Metodologia

4.1 Caracterização in situ e coleta de plantas de G. barbadense no estado do Mato Grosso

Uma expedição de coleta foi realizada em agosto/setembro de 2003 visando caracterizar as populações de G. barbadense ocorrentes nas regiões do Pantanal e do Cerrado do estado do Mato Grosso.

A caracterização in situ das de G. barbadense foi realizada através da entrevista do proprietário da planta e da análise do ambiente em que as plantas estavam inseridas. Foram levantados:

a) Tipo de população b) Idade da planta c) Origem declarada d) Localização geográfica

e) Número de plantas por ponto de coleta f) Variedade botânica

g) Presença de linter nas sementes h) Presença de mancha nas pétalas i) Usos

De cada planta amostrada foram tomadas estacas, tecidos vegetais (folhas e/ou pétalas) e sementes para a realização das análises com marcadores moleculares.

4.2. Plantio das estacas

Pelo menos seis estacas de 20 a 30cm, sem folhas, foram coletadas de cada acesso. As estacas foram acondicionadas em sacos plásticos, umedecidas com água, conservadas em gelo e mantidas na câmara fria a 4˚C até o momento do plantio.

As estacas foram tratadas com solução com 50ml de solução de auxina 0,1% (AIA) por 10 minutos e foram plantadas em sacolas plásticos de 30x40cm, contendo

solo adubado e esterilizado como substrato. Cada acesso foi plantado em uma única sacola.

4.3. Extração do DNA

Para extração de DNA utilizou-se folhas frescas provenientes das estacas ou tecido vegetal desidratado (folhas ou pétalas). O método empregado foi o CTAB, descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998), com modificações, de acordo com os seguintes passos.

1 – Amostras com 40mg de material foliar dessecado ou 240mg de folhas frescas foram acondicionadas em tubos de 2ml;

2 – Adicionou-se 700µl de tampão de extração previamente aquecido a 65˚C e 2% de β-mercaptoetanol;

3 – O tecido vegetal foi triturado no equipamento “fast prep”, homogeneizado em“vortex” e incubado a 65˚C por 60 minutos, em banho-maria.

4 - Acrescentou-se 600µl de CIA (clorofórmio e álcool isoamílico (24:1)), emulsificando as fases aquosa e orgânica por inversões dos tubos;

5 – As fases foram separadas por centrifugação a 12.000rmp por 10 minutos e 450µl da fase aquosa em foram retirados e colocados tubos de 1,5 ml. Os passos 4 e 5 foram repetidos uma vez;

6 – Foi adicionado 400µl de isopropanol mantido a -20˚C misturar gentilmente e incubar por 30min a -20˚C.

7 – Recuperou-se o precipitado (DNA) por centrifugação a 11.000rpm por 15 minutos.

8 – O sobrenadante foi lavado 2 vezes com 500ul de etanol 70% e etanol puro, por 5 min.;

9 - A solução foi descartada e os pellets foram secos à temperatura ambiente.

10 - Acrescentou-se de 20 a 40 µl de solução TE-Rnase (1 M Tris-HCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0) aos tubos, os quais permaneceram por 30 minutos na estufa a 36˚C para a ressuspenção do DNA.

A quantificação do DNA obtido foi realizada pela comparação visual com DNA de concentração conhecida. Posteriormente o DNA foi diluído (1ng/µl) para as reações de RAPD e SSR.

4.4. Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso – RAPD.

Para verificar a qualidade dos DNAs e sua capacidade de servir de molde para a reações PCR foram realizadas reações RAPD.

As reações de RAPD foram feitas em termociclador em volume de 13 µl contendo 3ng de DNA, 30nm de primer, uma unidade de Taq DNA polimerase, 0,2mM de dNTP, 0,2ng de BSA, 1,5 mM de cloreto de magnésio e tampão PCR. As reações foram submetidas a 40 ciclos de amplificação após desnaturação inicial a 92° C por um minuto. Cada ciclo era composto por uma denaturação (94°C por um minuto), um anelamento dos primers (um minuto a 35°C) e uma amplificação (dois minutos a 72°C). A reação foi finalizada com uma ex tensão final de cinco minutos a 72°C (Ferreira & Grattapaglia, 1998)

Os primers usados foram o W3 e V17. Os resultados foram analisados em gel de agarose 1,5 % (p/v), utilizando o tampão de corrida TBE 1X. O Ladder 1 kb foi usado como marcador de peso molecular. Os géis foram corados com brometo de etídio e fotografados sob luz UV.

4.5 –Seqüências Simples Repetidas – SSR.

As reações para a detecção de marcadores SSR foram realizadas em termociclador em volume final de 13 µl. Cada reação foi realizada na presença de 3ng de DNA molde, 20ng de cada primer, 1,3 unidades de taq DNA polimerase, 2,5mM de dNTP, 0,25ng de BSA, 1,5mM de cloreto de magnésio e tampão PCR. As reações foram realizadas em 29 ciclos de amplificação após desnaturação inicial a 94° C por 5 minutos. Cada ciclo constituiu de um mi nuto a 94°C, um minuto a 56°C e um minuto a 72 °C. A extensão final foi de 7 minuto s a 72 °C, adaptado de Liu et al. (2000).

Os primers usados foram os BNL 3034, BNL 1440(2) e CM 43, segundo Liu et

al (2000). Os resultados foram visualizados em gel de poliacrilamida 4%, os quais

4.6 Coloração do gel de acrilamida

a) Preparação do gel

Uma solução estoque de acrilamida 40% foi preparada utilizando 380g de acrilamida, 20g de bisacrilamida e água qsp 1000ml. Uma segunda solução estoque (acrilamida 4%) foi realizada utilizando 210g de uréia, 25ml de TBE 10X, 50ml da solução estoque de acrilamida 40% e água qsp 500ml. Para a confecção de cada gel foi misturado 40ml da solução de acrilamida 4% e 274ul de perssulfato de amônia 10%.

A acrilamida 4% foi colocada entre duas placas de vidro separada por espaçadores de 4mm. Uma placa foi previamente tratada com uma solução “bind silane” (995 µl etanol 100%; 5 µl ácido acético e 3 µl de bind silane), e outra com a solução “repel silane”. Após a polimerização do gel, este foi pré-aquecido até atingir a temperatura de 50˚C. As amostras receberam tampão de formamida e foram desnaturadas a 92˚C por 5 minutos. Com o auxílio de uma pipeta multicanal as amostras foram pipetadas nos géis, tendo como marcadores o Ladder 10 kb.

A corrida foi feita em tampão de corrida TBE 1X durante 40 minutos a 2000 V e 100 mA e, a seguir, coradas pelo método de coloração com nitrato de prata conforme descrito por Creste et al. (2001).

As placas foram separadas e a placa contendo o gel foi colocada em solução de oxidação (ácido acético 10% em etanol) por 10 minutos, lavadas em água destilada por 1 minuto, colocadas na na solução de oxidação (ácido nítrico 1,5%) por 3 minutos. Após nova lavagem em água, o gel foi impregnada com nitrato de prata (solução 0,2%) por 20 minutos, lavado novamente com água e as bandas reveladas com solução contendo 3% de carbonato de sódio e 0,02% de formaldeído. Quando as bandas apresentavam contratação adequada, a reação de revelação foi interrompida em solução aquosa de ácido acético 5%.

Foram montados três experimentos na Fazenda Itaquerê, município de Novo São Joaquim, visando determinar taxas de cruzamento do algodoeiro sob diferentes condições.

O primeiro consistiu em parcelas de algodão sem gossipol no interior de um talhão comercial (1850 x 1350m de dimensão) plantado com a variedade ST474. Cada parcela é composta por duas linha de cinco metros. Cinco conjuntos de parcelas foram alocados. Em dos conjuntos, as parcelas distavam 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250 e 1500 metros da bordadura do talhão vizinho a uma área de vegetação nativa. Os demais conjuntos possuem 5 parcelas a 0, 25, 50, 100 e 200m da bordadura do talhão. O manejo utilizado foi o mesmo empregado no talhão. As plantas de cada parcela foram colhidas em bulk. Uma amostra das sementes de cada parcela foi retirada, beneficiada avaliada quanto à presença de glândulas de gossipol.

O segundo experimento foi composto por parcelas de duas linhas de cinco metros, a distâncias de 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500 e 2000m da lavoura comercial fonte de pólen. As parcelas estavam dispostas dentro de uma lavoura de soja. A colheita e o beneficiamento foram realizados da mesma maneira descrita no experimento anterior.

O terceiro experimento consistiu de três parcelas de algodão sem gossipol, sendo cada parcela composta por 10 linhas de 10 metros. As parcelas distavam 100 metros de uma lavoura comercial de algodão, fonte de pólen. A distância entre as parcelas e a lavoura foi preenchida com plantas de milho, utilizadas como barreira. Foram colhidos todos os capulhos de 20 plantas de cada linha (uma planta a cada 0,5 metro), ou seja, de cada parcela foram colhidas 200 plantas individuais, totalizando 600 plantas nas três parcelas.

5. Resultados

5.1. Fluxo gênico entre populações naturais de algodão e o algodão cultivado

5.1.1 Caracterização in situ das populações

A coleta dos materiais para a realização da avaliação do fluxo gênico existente entre o algodoeiro cultivado e o algodoeiro nativo (Gossypium barbadense) foi realizada nos meses de agosto e setembro. Foram coletadas 210 plantas de G.

Barbadense em 15 municípios do Mato Grosso: Cuiabá, Várzea Grande, Santo

Antônio do Leverger, Nossa Senhora do Livramento, Poconé, Cáceres, Jaciara, São Pedro da Cipa, Jucimeira, Rondonópolis, São José do Povo, Pedra Preta, Itiquira, Poxoréu e Primavera do Leste. O tempo gasto para a realização das coletas no Cerrado e na Baixada Cuiabana (incluindo o Pantanal) foi similar. Conforme pode ser observado na Figura 1, o maior número de plantas (128) foi coletado nos municípios do Pantanal e Baixada Cuiabana do que na região dos cerrados (82).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 C u ia b á C á c e re s Iti q u ir a J a c ia ra J u c im e ir a N .S a .L iv ra m e n to P e d ra P re ta P o c o n é P o xo ré u P ri m a ve ra R o n d o n ó p o lis S .P e d ro C ip a S . J o s é d o P o vo S . A n t. L e ve rg e r V á rz e a G ra n d e N ° p la n ta s a m o s tr a d a s

Figura 01. Número de plantas amostradas segundo o município do estado do Mato Grosso.

A maioria das plantas eram jovens, com um a dois anos (77,5%). A planta mais velha encontrada tinha sete anos, segundo declaração dos proprietários

estavam sob condições ambientais bastante adequadas – em solos aparentemente ricos e livre de competição com outras plantas.

42% 33% 19% 5% 1% 0% 1 ano 2 anos 3 anos 4 anos 5 anos 7 anos . Figura 2. Idade declarada das plantas coletadas

Verificou-se que G. barbadense ocorre em fundos de quintais, como bordadura de lavouras de toco e de modo espontâneo (Figura 3). As plantas de fundo de quintal aparecem em freqüência muito mais elevada do que os demais tipos (97%), sendo mantidas com a finalidade principal de serem usadas como plantas medicinais. A grande maioria das plantas localizadas na região do Pantanal e todas as do cerrado eram plantas em fundos de quintal.

Apenas duas plantas foram coletas em situações que permitiram classificá-las como espontâneas, asselvajadas ou ferais. A primeira estava localizada em Várzea Grande, às margens do Rio Cuiabá, em uma pequena população formada por três plantas adultas e cerca de 10 plantas jovens derivadas das plantas adultas. Apesar da não haver indício de cultivo ou tratos culturais recentes, estas plantas estavam ao lado de um caminho utilizado por pessoas para terem acesso ao Rio, dentro de um pomar abandonado contendo mangueiras e outras fruteiras. A outra planta foi encontrada em um terreno baldio no município de Cáceres (Figura 4). No mesmo terreno não foram observadas plantas jovens. Não havia evidências de que o terreno

houvesse sido cultivado anteriormente com algodoeiro arbóreo, mas o terreno aparentava ter uso “agrícola”. O capim napier, planta mais abundante no terreno, tinha sido cortado recentemente em uma parte e em outra foi observado evidências de que também tivesse sido cortado a mais tempo. Em ambos casos as plantas não devem ter surgido de modo natural. Ambas devem ter sido plantadas e posteriormente abandonadas. Apenas no caso de Várzea Grande as plantas podem vir a constituir uma população feral sustentável. A ausência completa de plantas jovens no terreno de Cáceres não deverá permitir a formação de uma população sustentável ao longo do tempo, pois a morte da única planta adulta resultará no desaparecimento da espécie do terreno.

2% 1% 97% Bordadura Espontânea Fundo

Figura 3. Percentual de plantas de G. barbadense coletadas no estado do Mato Grosso segundo o tipo de população

Figura 4. Planta de algodoeiro em terreno baldio em Cáceres (MT) Pontos escuros (seta) são maças abertas.

Foram classificadas como bordaduras de lavoura as plantas encontradas em dois locais em Cuiabá e em dois locais em Poconé, nenhuma no Cerrado. A primeira população encontrada em Cuiabá foi observada na zona rural do município, em localidade conhecida como Rio dos Peixes, próximo à BR 070 (Figura 5). Pelas descrições de como G. barbadense era cultivado no passado, este foi o local em que a tradição foi mantida de modo mais fiel. As plantas de algodão ficavam na bordadura de uma roça de toco, formada em método muito similar aos utilizados por indígenas e caboclos. Diversas roças de toco estavam presentes na propriedade, cada uma com uma idade diferente. Tais roças eram explorados por 5 a 6 anos e depois abandonadas. Apenas a roça mais nova continha plantas de algodão, plantadas na bordadura e separando plantações de cana-de-açúcar e mandioca. Depois de muitos anos, havia sido a primeira vez que o proprietário havia plantado

G. barbadense. As sementes que deram origem aos algodoeiros foram colhidas em

local propriamente dita, mas de uma expansão de um genótipo de fundo de quintal. O proprietário pretendia colher as plantas e enviá-la à uma tecelã para fibra fosse fiada e, posteriormente, confeccionadas redes e mantas.

Figura 5. Roça de toco cultivada em Cuiabá (MT). Setas mostram plantas de G.

barbadense

A segunda população de bordadura de roça encontrada em Cuiabá não pode ser definida propriamente como bordadura. Na verdade era uma lavoura de algodão consorciada com outras espécies, como mandioca e quiabo. Ele se localizava dentro da zona urbana de Cuiabá, às margens de um córrego na Av. Getúlio Vargas, próximo ao número 28 (Figura 6). Esta população contava com 50 a 60 plantas, que já haviam sido colhidas e podadas. O plantio havia sido feito em covas, com 2 a 3 plantas, com espaçamento entre plantas e entre linhas de cerca de 1m. As sementes utilizadas para o plantio foram obtidas junto a uma ex-fiandeira e tecelã de Cuiabá, sendo uma mistura de algodoeiros rim-de-boi. Portanto, da mesma maneira que para a outra população de Cuiabá, o material não se constituía uma variedade local, mas sim uma mistura de sementes de diferentes localidades, que tem similaridade com a mistura de sementes de diferentes variedades que uma algodoeira possui após uma safra. O responsável pela plantação, Sr. Martiniano, pretendia vender o algodão colhido para a mesma pessoa que havia fornecido as

que, devido a idade avançada, havia abandonado a atividade e não poderia comprar a colheita.

Figura 6. Lavoura urbana de G. barbadense localizada dentro do município de Cuiabá (MT). A esquerda córrego canalizado; à direita no fundo uma das vias da Av.

Getúlio Vargas.

As duas populações de bordadura de roça de Poconé não eram exploradas comercialmente, nem sua fibra utilizada para a fiação. A primeira era constituída de poucas plantas, cujas fibras e sementes estavam soltas no chão. Próximo às plantas adultas havia cerca de 10 a 15 plantas jovens, que segundo a proprietária seriam carpidas. A segunda estava localizada em uma roça de toco abandonada e havia apenas uma planta ainda viva, sem plantas jovens que poderiam dar origem a uma população feral.

O número de plantas por ponto de coleta reflete a predominância de plantas de fundo-de-quintal (Figura 7). A grande maioria dos locais visitados possuía apenas uma planta, sendo que os locais em que eram mantidas com uma a três plantas representam 87,6% dos locais.

Número de plantas no local de coleta F re q u e n c ia 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 13 30 45 190

Figura 7. Número de plantas presentes em cada ponto de coleta.

As plantas de fundo de quintal são mantidas principalmente por mulheres, que as usam, de modo geral, como planta medicinal. A atribuição de propriedades medicinais ao G. barbadense é a principal razão para que seja mantido em fundos de quintais. Diversos tipos de efeito terapêutico são citados (Tabela 1), sendo mais freqüentes como cicatrizante e antiinflamatório. A folha é usada na forma de chás, macerados, infusões e extratos foliares (chamados pela população local de sumo), sendo ambos empregados via oral e tópica. Os chás são feitos com folhas jovens e empregados em compressas, banhos de imersão e ingeridos por via oral. O relato mais comum de uso está relacionado a parturientes, que tomam ou chá ou fazem uma banhos de imersão. Usam-no antes e/ou após o parto durante, durante a “dieta” ou “resguardo”. Também foi relatado seu uso para o combate a bronquite, cicatrização de ferimentos e problemas gástricos. O extrato foliar também é muito usado por parturientes, na forma oral. Também foram levantados usos como cicatrizante (oral e/ou tópico), antiinflamatório (oral e/ou tópico) e para problemas respiratórios (oral). O tegumento externo da maça foi relatado mais de uma vez como um agente antifúngico, no combate a micoses.

Tabela 1. Modo de uso das partes de G. barbadense e efeito atribuído Extrato foliar Chá Folha macerada Tegumento da maça Pluma e semente Maçã

Cicatrizante X X X Problemas respiratórios X X X Antiinflamatório X X X X Antifúngico X

As plantas de G. barbadense de fundo de quintal também são usadas para outros fins. Observando a Figura 8, percebe-se que parte dos proprietários declarou utilizar as plantas para mais de um fim, por isso, o número total de usos supera o número proprietários entrevistados.

Tipo de uso F re q u ê n c ia 91 % 75,5% 5,8% 2,6% 2,6% _{1,2% 0,6% 0,6% 0,6%} 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Medicinal Chumaço Têxtil Ornamental Pavio Alimen. animal Alimen. humana Artesan. Comércio

Figura 8. Usos declarados das plantas de Gossypium barbadense

Um percentual elevado dos proprietários declarou usar a pluma do algodão como chumaço ou algodão similar ao comprado em farmácias. Os demais tipos de uso foram declarados por poucos proprietários. O item que mais chama a atenção é o relato de um proprietário, que faz uso de um chá feito com as sementes maceradas como uma bebida quente. Segundo relatos, o uso como pavio já foi mais difundido; declinando sensivelmente com a expansão da rede elétrica para a zona rural.

Em tempos antigos, a fibra deste algodão era usada para a fabricação de produtos têxteis, principalmente redes (Figura 9), mantas e coxonilhos. Era uma atividade predominantemente feminina, sendo de responsabilidade da mulher o plantio das sementes na bordadura das roças de toco, sua colheita, a preparação dos fios e a tecelagem. O sistema de produção incluía o beneficiamento manual ou em descaroçador de rolo feito de madeira (Figura 9 A), afofado com um instrumento similar à um arco (Figura 9 C), fiado em fusos de madeira (Figura 9 C) ou em rocas (Figura 9 B). Uma pequena parte dos artesãos cardava a fibra antes de fiá-la. O fio era tecido em tear rústico feito de madeira (Figura 9 D) e destinado ao comércio local ou, na maioria das vezes, para consumo próprio. As famílias que não possuíam tear vendiam o fio que produziam ou contratavam alguém para que tecessem suas mantas e redes.

O uso têxtil da fibra do G. barbadense está mais arraigado nos municípios antigos do estado. Em nenhum caso foi observado semelhante uso em municípios novos do cerrado. O bairro da Figueira, em Poconé, foi o único local encontrado em que ainda se produziam têxteis artesanais com a fibra do G. barbadense, sendo que apenas uma família preserva esta tradição. Esta família confecciona redes mesclando fios de G. barbadense, na tonalidade cru, a fios industriais coloridos de herbáceo. Em outros bairros de Poconé (Boi-de-Carro, Canga), Cáceres (Bom Retiro), Cuiabá (Rio dos Peixes, Jardim Independência), Santo Antônio do Leverger (Varginha) e Itiquira (Centro), Poxoréu (Vila Sta Terezinha) e Cáceres (Bom Retiro) foram encontradas pessoas que ocasionalmente ainda fiavam o algodão, sendo o fio destinado à realização de pequenos consertos.

Figura 9. Equipamentos usados na fiação e tecelagem da fibra de G. barbadense e redes artesanais produzidas. A. Descaroçador de rolo; B. Roca; C. Fusos, batedor e novelos; D. Tear; E. Rede; F. Detalhe da rede

A citação mais freqüente é que as mães de mulheres com 50 anos ou mais realizavam atividades têxteis com a fibra de G. barbadense. Em alguns casos, pessoas com idade avançada relataram ter fiado por um determinado tempo, tendo

A B

C D

abandona este trabalho artesanal por motivo de saúde, geralmente problemas de visão, ou devido à facilidade de adquirir fios industrializados.

De modo geral, as plantas apresentavam boas condições fitossanitárias no momento em que as observações foram realizadas. Plantas com sintomas característicos de mosaico comum e doença azul foram encontradas, mas em pequenas quantidades, o mesmo sendo válido para bacteriose.

Três plantas apresentaram grande quantidade de galhas (Figura 10), cujos sintomas se assemelham aos causados em mandioca por Jatrophobia brasiliensis, uma pequena mosca. As galhas foram encontradas nas faces abaxial e adaxial de folhas, em pecíolos de frutos e folhas, em brácteas e em pétalas de flor. Em alguns casos, a intensidade era bastante alta. Contudo, as plantas não aparentavam menor vigor ou capacidade produtiva.

Figura 10. Pecíolo, bráctea e folha de G. barbadense com galhas

O principal problema fitossanitário observado na época em que as coletas foram realizadas foi a infestação das plantas com lagarta rosada, Pectinophora

gossypiella (Figura 11). Muitas plantas apresentavam quase todas as sementes

danificadas pela praga. Em plantas próximas a lavouras de algodão os danos eram mais intensos, embora plantas bastante danificadas tenham sido encontradas a

grandes distâncias de plantações comerciais. Os danos eram ainda maiores quando associados a fungos, que apodreciam as maças causando sua mumificação (carimã).

Figura 11. Danos causados por lagarta rosada em G. barbadense. A) Flor atacada; B) e C) lagarta em sementes; D) Maça mumificada (carimã) após ação de fungo que penetrou em orifício feito pela lagarta; E) Capulho sadio

A variedade botânica de G. barbadense mais freqüentemente encontrada foi a brasiliensis, cujas sementes de uma loja aderidas umas às outras formam uma figura similar a um rim e por isso chamado de rim-de-boi (Figura 12). A predominância da variedade botânica brasiliensis em relação à barbadense (com sementes soltas e por isso chamada de quebradinho) deve ter origem histórica, visto que indígenas e caboclos sempre cultivaram de modo mais intensivo a primeira.

Adicionalmente, há uma crença que as propriedades medicinais de algodoeiros rim-de-boi são mais intensas e que sua fibra apresenta melhor qualidade. Parte das plantas de quebradinho vieram de outras localidades, como Goiás e Minas Gerais. Em onze municípios foram encontradas plantas de quebradinho e rim-de-boi, sendo que apenas em São José do Povo a freqüência de plantas de quebradinho foi mais alta do que de rim-de-boi (Tabela 2).

Tabela 2. Número de plantas de rim-de-boi e quebradinho, segundo o município

Município Rim-de Boi Quebradinho Flor com mancha Flor sem mancha Com Linter Glabra Cáceres 19 2 15 6 20 1 Cuiabá 32 3 34 1 34 1 Itiquira 10 0 10 0 9 1 Jaciara 6 2 8 0 8 0 Jucimeira 4 2 6 0 5 1 N.Sa.Livramento 4 0 4 0 4 0 Pedra Preta 4 2 6 0 5 1 Poconé 35 2 37 0 37 0 Poxoréu 7 0 7 0 7 0 Primavera 17 3 20 0 17 3 Rondonópolis 11 3 14 0 14 0 S. Pedro da Cipa 2 0 2 0 2 0

São José do Povo 4 5 9 0 8 1

Sto Antonio Leverg. 19 1 20 0 20 0

Várzea Grande 9 2 9 2 8 3

Figura 12. Plantas de G. barbadense amostradas no estado do Mato Grosso segundo o tipo de semente.

A presença de linter nas sementes foi verificada exclusivamente em plantas rim-de-boi (Figura 13). Este linter difere daquele verificado em plantas de algodoeiro herbáceo, sendo extremamente curtos e dão um aspecto aveludado às sementes. Tal linter apresentava coloração esverdeada que assumia tonalidades marrons alguns dias após o beneficiamento.

94% 6%

Sem linter Com linter

Figura 13. Sementes de G. barbadense coletas no estado do Mato Grosso com e

linter recobrindo as sementes.

87% 13%

Rim-de-boi Quebradinho

A maioria das plantas apresentava flores com manchas vermelhas nas pétalas (Figuras 14 e 15). Embora a presença de manchas nas pétalas seja predominante na espécie, a ausência é bem documentada na literatura. Portanto, sua ausência não indica, necessariamente, que tenha ocorrido fluxo gênico.

91% 9%

Com mancha Sem mancha

Figura 14. Proporção de plantas de G. barbadense que apresentavam flores com e

sem manchas vermelhas nas pétalas.

5.1.2 Caracterização molecular das plantas de G. barbadense

O DNA foi extraído de todas as folhas e flores desidratadas retirados in situ.

Os acessos em que não foi possível obter tecidos desidratados tiveram seus DNAs extraídos de material fresco proveniente de brotações das estacas plantadas na casa de vegetação. A maior quantidade total de DNA extraída foi de 15.000ng/µl, e a menor foi 500ng/µl, sendo que a média total de DNA extraído foi de 4971,68 ng/µl.

As quantificações foram cruciais para entendimento e verificação da qualidade dos DNAs extraídos. Em cima destes dados calculou-se a quantidade de DNA presente para cada acesso. A partir destes resultados foram feitas as diluições das amostras para 1 ng/µl, volume necessário para realização das reações de PCR.

Tanto as reações de RAPD quanto as reações de SSR foram realizadas para que se pudesse avaliar a qualidade do DNA extraído de algodão e, no caso do SSR, avaliar o funcionamento dos pares de primers à temperatura de anelamento de

56°C, além da escolha dos primers mais polimórficos para realização das primeiras

reações. Os três pares de primers para SSR mais polimórficos escolhidos foram BNL

3034, BNL 1440(2) e o CM 43, os quais foram testados em todos os indivíduos. Os produtos de amplificação das reações de SSR foram analisadas em gel denaturante de poliacrilamida 4% corado com prata, a qual se mostrou eficiente. A análise preliminar com os marcadores SSR mostrou haver grande diversidade genética em G. barbadense no estado do Mato Grosso. O modo com que esta

5.2. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro

A identificação visual de sementes com e sem glândulas de gossipol (Figura 16) pode ser facilmente realizada a olho nu. Quando dúvidas a respeito da presença das glândulas persistiam, foi utilizado uma lupa de bolso para confirmar a presença.

Figura 16. Sementes de algodoeiro com glândulas de gossipol (esquerda) e sem glândulas de gossipol (direita).

5.2.1 Experimento para verificar a eficiência de barreira de 100 metros de milho

Foram analisadas 600 plantas de algodoeiros, duzentas por parcela. De cada planta foram avaliadas 200 sementes ou o número total de sementes produzidas pelas plantas, totalizando 102.249 sementes. Destas, 155 apresentaram glândulas de gossipol e 102.094 não possuíam glândulas. Portanto, a taxa média de cruzamento foi de 0,15%. O croqui da área experimental pode ser visualizado na Figura 17.

Algodoeiro

Figura 17. Croqui do experimento em que parcelas de algodoeiro foram circundadas por barreira de 100 metros de milho.

As taxas médias de cruzamento de cada linha podem ser observadas na Figura 18. Verifica-se que as maiores percentagens de sementes com glândulas, foram obtidas nas linhas mais próximas à lavoura fonte de pólen (0,4%). À medida que as linhas ficavam mais distantes da fonte de pólen, as taxas foram reduzindo. O coeficiente de correlação linear observado foi de -0,82 (p<0,05). Apesar da correlação linear ter sido significativo, a equação com melhor ajuste foi exponencial (r2=0,91).

A observação da Figura 19 permite verificar que, em média, a posição da planta dentro da linha não foi um fator importante na distribuição da fecundação cruzada. O coeficiente de correlação linear verificado foi de 0,09 (p>0,71). Isto deve

ter acontecido em razão de todas as plantas dentro de cada linha estarem a mesma distância da fonte externa de pólen. Caso a orientação das parcelas experimentais fosse diferente, com as linhas dispostas de maneira perpendicular à fonte de pólen, é provável que fosse verificado que o efeito da posição da planta dentro da linha, conforme verificado em Santa Helena de Goiás (Barroso, dados não publicados).

Linha S e m e n te s c o m g lâ n d u la ( % ) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 18. Percentagem média de sementes com glândulas de gossipol nas plantas amostradas em cada linha.

Distância da extremidade esquerda da parcela (m) S e m e n te s c o m g lâ n d u la ( % ) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 19. Percentagem média de sementes com glândulas de gossipol, segundo a posição da planta dentro da linha.

A Figura 20 mostra a localização das plantas que apresentaram sementes com glândula gossipol de dentro de cada parcela, considerando a média de todas as parcelas. Pode-se observar que a quantidade de plantas em que foram detectados cruzamento dentro das linhas foi relativamente homogênea. Também se observa que o número de plantas com glândulas de gossipol tendeu a ser mais alto nas linhas mais próximas à fonte de pólen.

Distância da margem esquerda da parcela (m) L in h a 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Figura 20. Locais em que se observou sementes oriundas de cruzamento com cruzamento dentro das parcelas.

Para comprovar que o número de plantas que apresentavam pelo menos uma semente com glândulas de gossipol foi independente da posição das plantas dentro da linha, foi realizada uma contagem considerando quatro grupos: o primeiro composto pelas plantas amostradas mais a esquerda, o segundo pelas plantas centrais a esquerda, o terceiro pelas plantas centrais a direita e o quarto pelas cinco plantas mais a direita (Tabela 3). A comparação das contagens pelo teste de qui-quadrado revelou que o número de plantas com glândulas foi similar entre os quartos (p>0,10).

Já a divisão das linhas em dois grupos, um formado pelas cinco linhas mais próximas à fonte de pólen (linhas 1 a 5) e outro pelas cinco restantes (linhas 6 a 10), revelou que o número de plantas com glândulas em cada grupo foi diferente segundo o teste de qui-quadrado (Tabela 3)

Tabela 3. Número de plantas que apresentaram glândulas de gossipol de acordo com a posição das plantas na linha e a linha a que pertencem.

Posição da planta na linha

1° quarto1 2° quarto2 3° quarto3 4° quarto4 Tota l

Plantas com glândula 16 26 13 16 71

Qui-quadrado 6,30 P=0,10

Linha 1 a 5 6 a 10 Total

Plantas com glândula 45 26 71

Qui-quadrado 5,08 P=0,02

1 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas mais a esquerda de cada linha. 2 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas a centro-esquerda de cada linha 3 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas a centro-direita de cada linha. 4 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas mais a direita de cada linha.

Os resultados observados permitem concluir que as taxas de cruzamento verificadas neste experimento foram muito baixas, sendo a barreira de 100 metros de milho bastante eficiente no controle da polinização cruzada. O fato de haver redução na taxa de cruzamento dentro das parcelas à medida que se distancia da fonte de pólen é uma forte evidência de que o próprio algodão pode se constituir em uma importante barreira para conter pólen vindo de áreas externas. Portanto, a associação de barreiras de milho e algodão podem propiciar um isolamento reprodutivo bastante eficiente.

Para que sementes com gossipol sejam produzidas em plantas sem gossipol é necessário que os agentes polinizadores, provavelmente abelhas (Figura 21), visitem flores de plantas com gossipol, adquiram pólen e, depois, depositem este pólen sobre estigmas de flores de plantas sem gossipol. O mecanismo de contenção do cruzamento observado neste experimento deve abranger dois fatores: a) uma redução da quantidade de abelhas que visitaram as flores da lavoura antes de entrar nas parcelas; b) a perda do pólen durante o vôo e a movimentação das abelhas, que deve ser tanto maior quanto maior o tempo entre a visita às flores da lavoura e da parcela. Estes dois fatores, juntos, devem explicar a baixa de sementes com gossipol verificadas dentro da área.

A redução da taxa de cruzamento nas linhas mais distantes da lavoura pode ter ocorrido pela deposição do pólen oriundo de plantas com glândulas durante as primeiras visitas, que devem ter ocorrido nas primeiras linhas. Nestas visitas, as abelhas também adquiririam pólen das plantas da parcela, ou seja pólen de plantas sem gossipol. Isto faria com que os grãos de pólen de flores externos à parcela (produzidos em plantas sem gossipol) que ainda estivessem sobre o corpo das abelhas ficassem em menor quantidade do que o pólen das plantas sem gossipol.

Este processo de diluição do pólen externo no corpo do polinizador reduz a probabilidade de que haja cruzamentos entre as plantas sem gossipol da parcela e as plantas com gossipol da lavoura de algodão.

Figura 21. Abelhas africanizadas sobre flores de plantas sem gossipol. (A) Abelha entrando no flor, (B) se alimentando no néctar floral e (C) deixando a flor.

5.2.2 Experimento para verificar o efeito da distância física sem barreiras na redução da taxa de cruzamento

Estes experimento mostrou que quanto maior a distância entre a parcela armadilha e a lavoura fonte de pólen, em média, menor a taxa de fecundação (Figura 22). Contudo, os resultados experimentais não foram apresentaram a mesma consistência observada no experimento anterior. As taxas de cruzamento entre 300 e 1000m foram maiores do que se poderia prever pelo comportamento das primeiras e últimas parcelas armadilhas. Os resultados mais consistentes foram obtidos quando apenas as parcelas armadilhas entre 20 e 200m são consideradas (Figura 23), no qual se percebe uma redução quase linear da taxa de cruzamento.

Distância da fonte de pólen P ro p o rç ã o d e s e m e n te s c o m g lâ n d u la ( % ) 0 2 4 6 8 10 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Figura 22. Taxa de cruzamento verificada em parcelas armadilha dispostas de 10 a 2000m de uma lavoura de algodão.

Distância da fonte de pólen

P ro p o rç ã o d e s e m e n te s c o m g lâ n d u la ( % ) 0 2 4 6 8 0 40 80 120 160 200 240

Figura 23. Taxa de cruzamento verificada nas parcelas armadilha dispostas de 20 a 200m de uma lavoura de algodão.

As razões que levaram ao aumento da taxa de cruzamento nas parcelas de 300 a 1000m não foram detectadas. Mas, pode-se especular alguns fatores que podem ter ocasionado tais resultados, como a presença de colméias de abelhas nas imediações destas parcelas, que aumentariam a atividade de polinizadores nas parcelas. Como trata-se de uma informação importante, experimentos com características similares foram montados em 2003/2004 em Novo São Joaquim e Porto Alegre do Norte. Para evitar que os resultados tivessem a mesma fragilidade interna, foram realizadas melhorias metodológicas.

5.2.3. Experimento para verificar a taxa de cruzamento dentro de um campo de algodão

Foram avaliadas 15.200 sementes, sendo verificadas 1176 sementes com glândulas de gossipol e 14.024 sementes sem glândulas. As taxas de cruzamento dentro do campo de algodoeiro foram 51,6 vezes mais altas do que as verificadas quando utilizada a barreira de milho (0,15%), com média de 7,74%.

Considerando o conjunto contendo 18 parcelas, com distância máxima da bordadura vizinha ao cerrado de 1500 metros, verifica-se que as taxas de cruzamento foram similares, não havendo acréscimos ou decréscimos significativos (Figuras 24). O valor máximo foi verificado a 200 metros da bordadura, com taxa de 17,5%. A correlação linear da taxa de cruzamento das parcelas com a distância da bordadura foi nula, –0,01 (p>0,98), corroborando a independência das taxas em

relação ao início do talhão.

Os quatro conjuntos de parcelas que se estendiam até 200 metros da bordadura do talão apresentaram comportamento similar ao conjunto de parcelas descrito acima, ou seja, não houve relação (r = –0,18, p>0,77) entre a localização da

parcela dentro da lavoura e o percentual de sementes com glândulas de gossipol (Figura 25).

Distância do início do talhão (m)

T a x a d e c ru z a m e n to ( % ) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Figura 24. Taxas de cruzamento verificadas em parcelas com plantas sem gossipol dentro de uma lavoura comercial de plantas de algodão com gossipol, segundo a

distância da parcela à extremidade do talhão mais próxima ao cerrado.

Distância da bordadura do talhão (m)

T a x a d e c ru z a m e n to ( % ) 2 3 4 5 6 7 8 0 25 50 75 100 125 150 175 200

Figura 25. Taxas de cruzamento verificadas em parcelas com plantas sem gossipol dentro de uma lavoura comercial de plantas de algodão com gossipol, segundo a

distância da parcela à bordadura do talhão.

Como já descrito, para que as sementes com glândulas sejam produzidas em plantas sem glândulas, é necessário que o agente polinizador, provavelmente uma abelha, tenha anteriormente visitado flores de plantas normais (com glândulas). Neste experimento as plantas sem glândulas de gossipol não estavam separadas das plantas com gossipol por nenhum tipo de barreira, estando as plantas sem glândulas de gossipol ao lado de plantas com glândulas. Logo, a perda do pólen e a diluição do pólen vindo de plantas externas não existiu neste experimento.

Considerando os resultados, pode-se inferir que a visitação de abelhas foi relativamente homogênea no campo de algodão.

7. Discussão

A) Fluxo gênico entre materiais cultivados comercialmente e outros tipos de algodões

A discussão será realizada pensando na possibilidade de ocorrência de fluxo gênico entre variedades transgênicas e as plantas de G. barbadense.

Ocorre simpatria entre as plantas de G. barbadense e lavouras de algodão no

cerrado do estado do Mato Grosso. Nos municípios do cerrado pôde-se encontrar plantas de G. barbadense na periferia das cidades, bairros rurais e em propriedades

rurais, principalmente dos pequenos produtores. A quantidade e densidade de plantas nestas cidades é, geralmente, menor do que a encontrada nos municípios da Baixada Cuiabana e Pantanal.

Em município novos, como Primavera do Leste, pode-se perceber claramente que a maioria das plantas estão em residências de pessoas provenientes do próprio Mato Grosso ou de outros estados da região Centro-Oeste, cujo uso da espécie como planta medicinal é um aspecto cultural. Para aquelas pessoas provenientes de estados sem tradição de uso de G. barbadense, como Rio Grande do Sul e Paraná,

a manutenção de plantas em suas casas corresponde a um processo de aculturação pelo qual estão passando.

Embora possa haver cruzamentos com algodoeiros transgênicos próximos às cidades, o problema deverá ser mais acentuado quando indivíduos de G. barbadense estiverem em bairros rurais ou em pequenas propriedades próximas a

grandes lavouras, como verificado no assentado aos fundos da Fazenda São Francisco, em Rondonópolis, e no bairro ou distrito de Ouro Branco do Sul, em Itiquira. A proximidade entre a lavoura e as plantas nestes locais é menor, propiciando condições mais favoráveis para que cruzamentos ocorram. Este fato será estudado na continuidade deste projeto.

A análise preliminar realizada com os marcadores SSR permitiu observar grande diversidade genética nos entre os acessos coletados no estado. As análises com marcadores que estão sendo executadas em 2004 devem determinar a diversidade existente nos diferentes locais e o nível de fluxo gênico existente. Caso se verifique que a diversidade é maior entre populações, a estratégia de

manutenção da variabilidade in situ deverá privilegiar a preservação de G. barbadense em diversos locais. Em contrário, ou seja, a diversidade seja maior

dentro de populações, a manutenção das populações com maior diversidade deve ser suficiente para a adequada conservação in situ. Neste caso, deve-se considerar

também a possibilidade de ocorrência de fluxo gênico com algodoeiros herbáceos cultivados (transgênicos e convencionais) para a escolha das populações a serem preservadas, priorizando aquelas cuja probabilidade de cruzamento com cultivares é mais baixa. Como o cultivo de algodoeiro nos estado do Mato Grosso não é realizado na Baixada Cuiabana e no Pantanal, estas populações devem ser preferidas para a conservação caso apresentem alta diversidade.

A utilização das sementes das plantas de fundo de quintal é esporádica, resumindo-se ao replantio e fornecimento para parentes, vizinhos e amigos que desejam possuir uma planta. O número de plantas mantido em cada quintal é pequeno, de modo geral, de uma a três plantas. Segundo relato dos proprietários, a renovação é feita de modo espontâneo: as sementes caem no chão e germinam. Como a quantidade de novas plantas germinadas é maior do que os proprietários desejam manter, este excesso de plantas é eliminado com a capina do terreno. Logo, a quantidade usada para gerar novas plantas representa uma fração ínfima do total de sementes produzidas, mesmo naqueles locais em que o ataque de pragas, como a lagarta rosada, é alto.

Para aqueles transgênicos que conferem maior tolerância às lagartas que atacam os capulhos, o plantio de sementes híbridas deve conferir maior capacidade à planta de gerar sementes, fato ainda a ser comprovado pela experimentação ou durante o monitoramento após a liberação para cultivo comercial de algodoeiros geneticamente modificados.

Este fato deve ser interpretado sob três pontos de vista:

a) Aumento da capacidade competitiva das plantas em ambientes agrícolas

As espécies do gênero Gossypium possuem baixa capacidade competitiva. G. barbadense não foge à regra. O incremento na agressividade e competitividade

que eventualmente as plantas contendo o transgene possa adquirir não deve ser suficiente para torná-las plantas daninhas em ambiente agrícola, pois não deverá