Nutrição e Crescimento Bacteriano

Nutrição e Crescimento

Bacteriano

Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior

Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências – UNESP

Tel. 14 3880.0412/0413 ary@ibb.unesp.br

Características básicas das

bactérias

Estudos de Biologia Celular

95% do peso seco da

Crescimento bacteriano + Motilidade, Luminescência, etc

Cultura:

Propagação do microrganismo

em condições adequadas

(Exigências Nutricionais e Ambientais)

Nutrição:

Fornecimento de substâncias

nutritivas para o crescimento

bacteriano

FATORES NUTRITIVOS

(in vitro = in vivo)

Ex: Haemophilus influenzae

Hemina (fator X), NAD+ _{(fator V)}

Fastidiosos

N

H

Classificação dos Meios de Cultura

Líquido (Turvação do meio) Sólido (1,5 a 2,0%) (Colônias)

Classificação dos Meios de Cultura

(Estado fisico)  Agar

Semi-Sólido (0,5%)

(Enriquecidos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

Agar Sangue

Agar Chocolate

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

(Meio seletivo para Bacillus cereus) (MAS – Manitol Salt Agar)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

Agentes seletivos  cloridrato de lítio e o tellurite de potássio

A gema de ovo  Produção de lecitinase e a atividade da lipase . Colônias preta devido à redução de telurito ;

Ação da lecitinase  causam zonas claras em torno das respectivas colônias.

Zona opaca de precipitação devido à atividade da lipase ( S.aureus ).

Baird Parker Agar

(Seletivos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Diferencial)

(Agar Sangue) (Padrão de Hemólise)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Diferencial)

(Meio de Tetrationato) (Meio de Selenito Cistina)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(De Enriquecimento)

FATORES NUTRICIONAIS

ÁGUA - Solvente; Elevado Calor Específico;

Regula Pressão Osmótica; Participação em Reações Químicas, Estrutura de

Macromoléculas, etc

FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio

*Fotossintetizantes  Fototróficas

Quimiossintetizantes  Quimiotróficas (Quimiolitotróficas e Quimiorganotróficas)

RECEPTORES DE HIDROGÊNIOS

Respiração aeróbia  O₂. Respiração anaeróbia  NO₃-_{, SO}

4-, CO2..

Fermentação  Fermentação Lática, Alcoólica, etc.

Respiração anaeróbia  receptor inorgânico ≠ do O₂ (ex: SO₄2-_{, NO}

3-, CO2, S)

Salmonella, the host and its microbiota. S. Typhimurium uses its virulence factors (flagella, T3SS-1 and T3SS-2) to invade the epithelium and

survive in mononuclear cells. The ensuing inflammatory response results in the epithelial release of an antimicrobial (lipocalin-2) that sequesters iron chelators (enterobactin) produced by the microbiota, but not an iron chelator (salmochelin) produced by S. Typhimurium. ROS generated by neutrophils migrating into the intestinal lumen oxidize an endogenous sulfur compound (thiosulfate) to generate a respiratory electron acceptor (tetrathionate) that enables S. Typhimurium to edge out the fermenting microbiota, thereby enhancing transmission of the pathogen.

Thiennimitr et al, 2011. Salmonella: the host and its microbiota. Current opinion in Microbiology, v.15, n.02, p.108-114, 2012.

4 H₂ + SO₄2- _{+ H}+  HS +4 H

Fermentação Composto orgânico produzido durante o próprio processo fermentativo.

CARBONO (Composição dos Compostos Orgânicos

-Compostos orgânicos - Quimio-heterotróficos. -CO₂ (Fotossíntetizantes) - Fotoautotróficos.

NITROGÊNIO (Proteínas, Ácidos Nucléicos, Coenzimas)

Orgânica - Aminoácidos, Sais Orgânicos de Amônia.

Inorgânica - NH₃, NO₃-_{, N}

ENXOFRE (Aminoácidos Sulfurados, Vitaminas) -Forma orgânica (Radicais sulfidrilas);

-Forma inorgânica ( SO₄- _{, H}

2S)

-Forma elementar

FÓSFORO (ATP, Ácidos Nucléicos, Fosfolipídeos, Coenzimas)

-Fosfato inorgânico (PO₄2- ₎

ATIVADORES DE ENZIMAS

Minerais na forma de sais:

-Mg++_{e K}+ _(Ribossomos)

-Fe++ _{(citocromos e peroxidases)}

ELEMENTOS TRAÇOS - Cobalto, Zinco (Atividade de

Enzimas), Molibdênio

FATORES DE CRESCIMENTO - Ex: Vitaminas,

Aminoácidos, Bases Nitrogenadas, Ácidos Graxos, etc.

FATORES AMBIENTAIS

pH

Temperatura Aeração (O₂) Osmolaridade

FATORES AMBIENTAIS

pH – Estrutura e funções das proteínas

Maioria na faixa ótima de pH entre 6 e 8. Ex. Thiobacillus - 1 e 2 (Acidófila)

Vibrio comma - 10 (Alcalinófila)

Obs. Normalmente os meios de cultura são tamponados.

Organismo Mínimo Ótimo Máximo Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-2,8 4,0-6,0 Sulfolobus acidocaldarius 1,0 2,0-3,0 5,0 Bacillus acidocaldarius 2,0 4,0 6,0 Zymomonas lindneri 3,5 5,5-6,0 7,5 Lactobacillus acidophilus 4,0-4,6 5,8-6,6 6,8 Staphylococcus aureus 4,2 7,0-7,5 9,3 Escherichia coli 4,4 6,0-7,0 9,0 Clostridium sporogenes 5,0-5,8 6,0-7,6 8,5-9,0 Erwinia caratovora 5,6 7,1 9,3 Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6-7,0 8,0 Thiobacillus novellus 5,7 7,0 9,0 Streptococcus pneumoniae 6,5 7,8 8,3 Nitrobacter sp 6,6 7,6-8,6 10,0

Valores mínimos, ótimos e máximos de pH durante o cultivo para algumas bactérias

Acidofílicas

Neutrofílicas

Temperatura - Velocidade das reações químicas Concentração elevada de ácidos graxos insaturados garante fluidez da membrana plasmática Patogênicas ao homem e animais)

Organização tridimensional das proteínas permite a manutenção da estrutura adequada para sua ação em elevadas

Aeração - Metabolismo energético Aeróbio estrito (18-21% ) P. aeruginosa, Mycobacterium Anaeróbio estrito (<0,5%) C.haemolyticum Facultativo (<0.5-21%) Enterobactérias Microaerófilo aeróbio (1-5%) Campylobacter, Neisseria Microaerófilo anaeróbio (Aerotolerante) (2-8%) Bacteroides, Clostridium

Bactérias aeróbias e facultativas

O₂ Metabolismo

Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas

enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados em sistemas vivos na presença de O₂.

A distribuição destas enzimas nas células determina a capacidade destas células existirem na presença de O₂ .

Sistema de desintoxicação Produtos não tóxicos O₂ + 2 e- _{+ 2 H}+ _{ H} 2O2 O₂ + e- _{ O} -2 O₂ +H₂O₂  OH* O -2 + H2O2  O2 + OH2- + OH* H₂O₂ + e- _{+ H}+ _{ H} 2O + OH* Produtos tóxicos

Bactérias anaeróbias estritas

Danos ao DNA, destroem componentes lipídicos, inativam enzimas Morte bacteriana O₂ Metabolismo O₂ + 2 e- _{+ 2 H}+ _{ H} 2O2 O₂ + e- _{ O} -2 O₂ +H₂O₂  OH* O -2 + H2O2  O2 + OH2- + OH* H₂O₂ + e- _{+ H}+ _{ H} 2O + OH* Produtos tóxicos Ausência do sistema de desintoxicação

Reação positiva produzida por Bacillus sp,

Staphylococcus sp;

Reação negativa produzida por Clostridium sp,

Streptococcus sp.

Método da vela acesa (microaerofilia)

Grampo de rosca Tampa com anel selador Catalisador de paládio em pastilha Envelope contendo bicarbonado de sódio e boroidreto de sódio Placas de Petri Indicador de anaerobiose (azul de metileno)

Controle da Osmolaridade Transporte ativo de K+ _{para interior da célula e}

eliminação de PUTRESCINA

Osmolaridade - Concentração de solutos no

Aumento no número de células no meio de cultivo

Meio líquido  Turvação do meio de cultivo; Meio Sólido  Formação de colônias

Concentração Celular = Núm. Cel. / Vol. meio Densidade Celular = Massa Cel./ Vol. meio

CRESCIMENTO BACTERIANO

Após inoculação no meio de cultura (= “semeadura”) em condições ótimas

Contagem bacteriana (Plaqueamento)

NMP

(Número Mais provável)

Tubos de meio nutriente (grupo de cinco tubos Número de tubos positivos por grupo Volume de inóculo para cada grupo de cinco tubos Combinação de tubos positivos Índice de NMP/100mL _{Inferior Superior} Limites com 95% de confiabilidade

Fases do crescimento bacteriano

Fase Lag (Fase de Demora)

Número de bactéria permanece constante em função do tempo.

(Fisiologicamente Ativas)

Fase Logarítmica ou Exponencial

Progressão Geométrica (Crescimento >> Morte) (células viáveis)

Tempo de geração ?????????

Fase Estacionária Máxima

(Crescimento  Morte)

Morte  ??????

(O₂, Nutrientes, pH, Produtos Tóxicos, etc )

Fase de Declínio ou Morte

Morte >> Crescimento

Taxa de Crescimento x Tempo de

Geração

Semeadura = Inocular (transferir o microrganismo a um meio de cultura)

SEMEADURA POR ESGOTAMENTO

Semeadura Correta

Princípios de Alguns Testes

Bioquímicos

2 H₂O₂ 2 H₂O + O₂

Catalase

Comum em bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas

Oxidase (Citocromo oxidase)

Oxidação do Citocromo C pelo O₂

Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor vermelha

Prova de OF

(Oxidação - Fermentação) (Carboidrato Ácido)

Azul de Bromotimol: pH Alcalino (Azul), pH Ácido (Amarelo)

Glicose Enterobactérias, Staphylococcus

Fermentação de Açúcares

Produção de Ácido ou Ácido mais gás

Açúcar a ser estudado + indicador de Andrade (vermelho em pH ácido)

Enterobactérias  Glicose (Todas), Lactose (Algumas espécies apenas)

Família Enterobacteriaceae

Lactose

-

+

Vermelho de Metila (VM):

(Glicose Acidos Orgânicos)

Vermelho de Metila em pH ácido (4,5) fica Vermelho

Voges-Proskauer (VP)

Glicose Acetilmetilcarbinol (= Acetoina) 2,3 butilenoglicol

Acetoina + Creatinina  composto vermelho

Indol

Triptofanase

Triptofano Indol

Para Dimetilaminobenzaldeído = Reativo de Kovacs + indol  Composto vermelho.

E. coli (+), Klebsiella-Enterobacter (-)

Citrato de Simnons

Citrato de Sódio como única fonte de C

Se bactéria usa (Cresce) – Alcaliniza o meio  Azul (Azul de Bromotimol)

Uréia

(Urease) Amônia

Alcalinização do meio (Vermelho Fenol  Vermelho)

Fenil-Alanina

Desaminação da Fenil-alanina  Ácido Fenilpirúvico Ac. Fenilpirúvico + Cloreto Férrico  Hidrazina (Cor

verde-garrafa)

Característica de todas espécies de Proteus

+

-

Movimento

Crescimento em meio semi-sólido (0,5% de Ágar) Imóvel - Cresce só no local da picada: K. pneumoniae

EPM, MILI

Tríplice Açúcar com ferro TSI