FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR SOBRE A FERMENTAÇÃO DE XILOSE A XILITOL
Zuzel Rubio Matos
Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca Universitária em Junho/2004
Proc. nº 202/04
Lorena-SP-Brasil 2001
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR SOBRE A FERMENTAÇÃO DE XILOSE A XILITOL
Dissertação de Mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora:
Dr. Silvio Silvério da Silva, FAENQUIL (Presidente) Dr. José Geraldo Pradella, IPT
Dr. Arnaldo Márcio R. Prata, FAENQUIL
Estudante:
Zuzel Rubio Matos
Lorena-SP-Brasil 2001
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR SOBRE A FERMENTAÇÃO DE XILOSE A XILITOL
Este exemplar corresponde a versão final da Dissertação de Mestrado aprovada pela banca examinadora
Dr. Silvio Silvério da Silva
Orientador e Presidente da Banca Examinadora
Lorena-SP-Brasil 2001
A meu marido Santiago e minha mãe E li ades por me darem forças e suportarem com paciência a separação
A Jorge, Electo e minha família pelo carinho e grande incentivo durante todo momento
À Fundação de Amparo à pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro.
Ao Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL) pela oportunidade de estudo.
Ao meu orientador, Dr. Sílvio Silvério da Silva, pela orientação, confiança e amizade recebida.
Aos pesquisadores Dr. João Batista e Dr. Arnaldo Márcio, pelos ensinamentos constante para a conclusão deste trabalho e pela amizade.
Às pesquisadoras Graça e Inês, pelas sugestões.
À Mabel, Ana Maria, Mila, Marta e Ernesto pelos momentos compartilhados e pela grande amizade.
A Cibele pela valiosa ajuda durante todo o trabalho e pela amizade incondicional.
Aos amigos Elia, Debora, Daniela, Marcelo, Gilvani, Julie, Waltinho, Wagner, Ely, Solange, Guiliano, l.arissa, pelos momentos de alegria.
À Rita, Nicanor, Jussara, Renatinho, Luis e Paulinho, pela valiosa ajuda no trabalho experimental.
À Lucinha, Eunice, Cristina, Ludmila, José Carlos e todos os funcionários do DEBIQ que, de um modo ou de outro, são parte deste trabalho.
Avaliação do efeito da hidrólise ãcida do bagaço de cana-de-açúcar sobre a fermentação de xilose a xilitol. Zuzel Rubio Matos. Dissertação de Mestrado.
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Sílvio Silvério da Silva (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C.P.116, 12600- 970, Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Dr. José Geraldo Pradella e Dr. Arnaldo Márcio R. Prata. Dezembro de 2001 .
O bagaço de cana-de-açúcar é um resíduo lignocelulósico com alto conteúdo de xilose. Este açúcar pode ser recuperado da fração hemicelulósica do bagaço através de hidrólise ácida. Durante o processo de hidrólise são gerados subprodutos da degradação dos materiais lignocelulósicos como furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e compostos fenólicos, que são inibidores do crescimento microbiano em processos fermentativos. A xilose recuperada no hidrolisado hemicelulósico e a produção de xilitol por Candida guilliermondii foram avaliadas sob diferentes condições de hidrólise ácida de acordo com um planejamento experimental estatístico. As hidrólises ácida foram realizadas em reator de aço inoxidável de 250 L de capacidade total, a 121ºC. Os experimentos foram conduzidos em reator de bancada BIOFLO Ili com volume útil de 1 ,25 L a 30°C, agitação de 300 rpm e kLa inicial de 36
n'
,
em regime descontínuo. Utilizando-se a metodologia de superfície de resposta foi possível verificar que a máxima recuperação de xilose (22, 71 g/L) no hidrolisado foi obtida para as condições de 130 mg de H2S04 /gms e 30 min de reação. Entretanto, para as fermentações, o máximo fator de rendimento em xilitol (Yp1s= 0,78 g/g) foi obtido para as condições de 70 mg de H2S04 /gms e 30 min de reação. O modelo matemático obtido no presente trabalho para essa bioconversão é representado pela seguinte equação:Yp,s = 0,56 - 0,053 C.Ac. + 0,066 T + 0,050 C.Ac.2
De acordo com este modelo prevê-se um maior valor de fator de rendimento em xilitol (Yp1s) de 0,83 g/g nas condições de hidrólise utilizando-se 58 mg de H2S04 / gms e 34 min de reação.
EFFECT OF ACID HYDROL YSIS CONDITIONS OF SUGAR CANE BAGASSE ON THE FERMENTATION OF D-XILOSE TO XYLITOL.
Sugar cane bagasse is an important lignocellulosic residue with high contents of D-xylose. This sugar can be recovered from the hemicellulosic fraction of sugar cane bagasse by acid hydrolysis. During hydrolysis products from degradation of lignocellulosic materiais such as furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and phenolic compounds are produced, these compounds can inhibit the microbial growth in fermentation processes. The recuperation of 0-xylose of hemicellulosic hydrolysates and subsequent utilization for xylitol prodution by Candida guilliermondii were evaluated under different acid hydrolysis conditions, according to a statistical factorial design. The acid hydrolysis were performed in a 250 L steainless steel reactor, at 121°C. The experiments were performed in a lab- Scale fermentar BIOFLO Ili with a volume of 1.25 L, at 30°C, agitation of 300 rpm and initial kLa of 36 h-1, in batch scheme. From the response surface methodology it was possible to verify that the maximum recuperation of D-xylose (22. 71 g/L) of the hydrolysates was obtained for the conditions 130 mg of H2S04 I g of dry sugar cane bagasse and 30 min of reaction time. For the fermentations the maximum xylitol yield factor was obtained for the conditions 70 mg of H2S04 I g of dry sugar cane bagasse and 30 min of reaction time. The mathematical model obtained of the present work for this bioconversion is represented by the following equation:
Yp1s
=
0.56 - 0.053 C.Ac. + 0.066 T + 0.050 C.Ac.2According to the model it is posible to predict the maximum xylitol yield factor of 0.83 g/g utilizing the condition of acid hydrolysis of 58 mg of H2S04 / g of dry sugar cane bagasse and 30 min of reaction time.
RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 2.1. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 3 2.1.1. Bagaço de cana-de-açúcar 6
2.1.2. Fundamentos da Hidrólise dos Materiais Lignocelulósicos 7
2.1.3. Processos de fracionamento da biomassa vegetal. 8
2. 1.3. 1. Tratamento com vapor ("Steam-explosion'; 8
2.1.3.2. Processo Acetosolv 9
2. 1.3.3. Tratamento alcalino 9
2. 1. 3.4. Hidrólise enzimática 9
2.1.3.5. Hidrólise ácida 10
2.2. XILITOL 12
2.2.1. Propriedades, usos e aplicações 12
2.2.2. Processos de produção 14
2.2.2.1. Via química 15
2.2.2.2.-Via mícrobiológica 15
2.3. INIBIDORES DO METABOLISMO MICROBIAN0 19
2.3.1. Ácido Acético 19
2.3.2. Furfural e Hidroximetilfurfural 20
2.3.3. Compostos fenólicos 21
3.1. OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS 23
3.2. CONCENTRAÇÃO E TRATAMENTO DOS HIDROLISADOS 26
3.3. MICRORGANISMO E PREPARO DE INÓCUL0 26
3.4. MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃ0 26
3.5. ANALISE ESTATÍSTICA 28
3. 5. 1. Determinação de um modelo matemático representativo da recuperação
de xilose no hidrolisado e do fator de rendimento em xilitol em função da
concentração de ácido e do tempo de reação 28
3.5. 1.1. Modelo linear 28
3. 5. 1. 2. Modelo quadrático 30
3.6. MÉTODOS ANALÍTICOS 30
3.6.1. Caracterização química do bagaço de cana-de-açúcar 30
3.6.1.1. Preparo
das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar para análise 303.6.1.2. Determinação do peso seco 31
3.6.1.3. Determinação de carboidratos presentes no bagaço de
cana-de-açúcar 31
3.6.1.4. Determinação de lignina insolúvel. 32
3.6.1.5. Determinação do teor de cinzas no bagaço de cana 32
3.6.2. Determinação das concentrações de açúcares, ácido acético e xilitol. 33
3.6.3. Determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural. 33
3.6.4. Concentrações de compostos fenólicos nos hidrolisados 34
3.6.5. Determinação do pH 34
3.6.6. Determinação da concentração celular 34
3.6.7. Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio
(kLa) 35
3.7 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS 35
3.7.1. Fator de rendimento em Xilitol (Ypis) 35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃ0
37
4.1. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. 37
4.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS HIDROLISADOS HEMICELULÕSICOS
DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. 38
4.2.1. Hidrolisados originais (anterior à etapa de concentração) 38
4.2.2. Hidrolisados concentrados 40
4.3. ANÁLISE DOS EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO E DO TEMPO
DE REAÇÃO NA CONCENTRAÇÃO DE XILOSE RECUPERADA. .45
4.3.1. Análise Estatística .46
4.4. ANÁLISE DOS EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO E TEMPO DE
REAÇÃO NA FERMENTAÇÃO DE XILOSE A XILITOL. 51
4.4.1. Análise estatística · 58
4.4.2. Análise das fermentações realizadas para o planejamento rotacional. 62 4.4.3. Análise estatística para o planejamento rotacional. 67
5
.
CONCLUÇÕES
76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78
APÊNDICE
FIGURA 2.1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL,
WEGENER, 1989) 4
FIGURA 2.2. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns grupos substituintes. Xyl
=
1,4-D-xilopiranose; Ara=
L-arabinofuranose; (4-Me)-GlcA = ácido (4-0-metil)-D-glucopiranuronico; Ac = acetil; FA = ácido ferúlico; DDFA = ácido desidroferúlico (McDOUGAL et ai., 1993) 5 FIGURA 2.3. Unidades fenilpropano precursoras da lignina (FENGEL, WEGENER,1989) 6
FIGURA 2.4. Mecanismo de hidrólise ácida das ligações glicosídicas (PARISI,
1989) 11
FIGURA 2.5. Produção de xilitol por via química (HYVONEN
et
ai., 1982) 16 FIGURA 2.6. Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras dexilose baseado no esquema proposto por HAHN-HAGERDAL et ai.
(1994) 18
FIGURA 3.1. Reator de hidrólise ácida empregado no presente trabalho para
obtenção dos diferentes hidrolisados 24
FIGURA 3.2. Concentrador de 4L de capacidade usado no presente trabalho ... 27 FIGURA 3.3. Reator BIOFLO Ili com 1,25 L de capacidade volumétrica utilizado
no presente trabalho 29
FIGURA 4.1. Remoção mássica de furfural, HMF e compostos fenólicos dos hidrolisados hemicelulósicos após o tratamento químico 43 FIGURA 4.2. Esboço do planejamento fatorial 22 com ponto central, mostrando a variação da concentração de xilose (g/L) em função da concentração de
de reação (valores codificados) 49
FIGURA 4.4. Curvas de nível descritas pelo modelo que representa a concentração de xilose (g/L) em função da concentração de H2S04 e do tempo
de reação (valores codificados) 50
FIGURA 4.5. Concentrações de Xilose (•), Xilitol ( 1!111 ), Células ('Y) e Ác. acético te) durante as fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar nas condições experimentais de hidrólise ácida: 1 (70 mg de H2S04
I gms e 1 O min de reação) e 2 (70 mg de H2S04 I gms e 30 min de
reação) 53
FIGURA 4.6. Concentrações de Xilose (• ), Xilitol ( 11 ), Células (T) e Ác. acéfico Ie) durante as fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar nas condições experimentais de hidrólise ácida: 3 ( 130 mg de H2S04 I gms e 10 min de reação) e 4 (130 mg de H2S04 I gms e 30 min de
reação) 54
FIGURA 4.7. Concentrações de Xilose (•), Xilitol ( 11111 ), Células (T)
e
Ác. acético te) durante as fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar nas condições experimentais de hidrólise ácida 5, 6, 7(100 mg de H2S04 / gms e 20 min de reação) correspondente ao ponto central. 55FIGURA 4.8. Esboço do planejamento fatorial 22 com ponto central, mostrando a variação do Yp,s (g/g) em função da concentração de H2S04 e do tempo de
reação 59
FIGURA 4.9. Concentrações de Xilose (•), Xilitol ( 11 ), Células (T) e Ác.
acétíco
Ie) durante as fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar nas condições experimentais de hidrólise ácida: 8 ( 142 mg de H2S04 I gms e 20 min de reação) e 9 (58 mg de H2S04 I gms e 20 min dereação) 64
FIGURA 4.10. Concentrações de Xilose (•), Xilitol ( 11 ), Células (T)
e
Ác. acético( •) durante as fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-
açúcar nas condições experimentais de hidrólise ácida: 1 O (100 mg de H2S04 I gms e 34 min de reação) e 11 (100 mg de H2S04 I gms e 6 min de
reação) 65
FIGURA 4.11. Distribuição de resíduos do modelo proposto que representa o fator de rendimento em xilitol, em função das condições de hidrólise ácida, durante a fermentação por C. guilliermondii em sistema descontínuo 70
tempo de reação (valores codificados) 72
FIGURA 4.13. Curvas de níveis descrita pelo modelo que representa o fator de
rendimento em xilitol (g/g) em função da concentração de H2S04 e do tempo
de reação (valores codificados) 73
FIGURA 4.14. Concentrações de Xilose (•), Xilitol ( 1111 ), Células (T) e Ác. acético
(•) durante a fermentação do hidrolisado hemicelulósico nas condições de hidrólise ácida de 58 mg de H2S04 I gms e 34 min de reação 74
TABELA 2.1. Composição aproximada de alguns resíduos lignocelulósicos
(PARISI, 1989, KUHAD, SINGH, 1993) 3
TABELA 2.2. Propriedades físico-químicas do xilitol (BAR, 1986) 13
TABELA 2.2. Concentração de xilitol em algumas frutas e legumes 14
TABELA 3.1. Fatores e níveis do planejamento fatorial 22 com ponto central. 25
TABELA 3.2. Matriz codificada do planejamento fatorial (22 com ponto central e
em estrela) 25
TABELA 4.1. Composição do bagaço de cana-de-açúcar. 37
TABELA 4.2. Caracterização química dos hidrolisados iniciais quanto a pH e
açúcares 39
TABELA 4.3. Caracterização química dos hidrolisados iniciais quanto a
compostos inibidores 40
TABELA 4.4. Caracterização química dos hidrolisados concentrados quanto a pH
e açúcares 41
TABELA 4.5. Caracterização química dos hidrolisados concentrados quanto a
compostos inibidores 42
TABELA 4.6. Concentrações de furfural, HMF e compostos fenólicos nos
hidrolisados tratados 44
TABELA 4.7. Xilose recuperada e matriz do planejamento fatorial 22 com ponto
central. , 45
TABELA 4.8. Estimativa dos efeitos, erros padrão e teste t de "Student" para o planejamento fatorial 22 com ponto central que representa a concentração de
TABELA 4.1 O. Análise da curvatura para o planejamento fatorial 22 com ponto central que representa a concentração de xilose no hidrolisado 48 TABELA 4.11. Concentrações de Xilitol e Células nas fermentações dos
hidrolisados 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 por Candida guilliermondi 51
TABELA 4.12. Consumo de Ácido Acético e pH inicial e final das fermentações
dos hidrolisados 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 56
TABELA 4.13. Concentrações de glicose e arabinose durante as fermentações
dos hidrolisados 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 57
TABELA 4.14. Parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol por
Candida guilliermondii nos hidrolisados 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 58
TABELA 4.15. Fator de rendimento em xilitol (Yp1s) e matriz do planejamento
fatorial 22 com ponto central. 60
TABELA 4.16. Estimativa dos efeitos, erros padrão e teste t de "Student" para o
planejamento fatorial 22 com ponto central que representa o fator de
rendimento em xilitol. 60
TABELA 4.17. Análise de variância das estimativas dos efeitos concentração de
H2S04 (C.Ác.) e tempo de reação (T) frente ao fator de rendimento em xilitol
por Candida guilliermondii 61
TABELA 4.18. Análise da curvatura para o planejamento fatorial 22 com ponto
central que representa o fator de rendimento em xilitol.. 62
Tabela 4.19. Concentrações de Xilitol e Células nas fermentações dos
hidrolisados 8, 9, 10 e 11 por Candida guilliermondi 63
TABELA 4.20. Consumo de Ácido Acético e pH inicial e final das fermentações
dos hidrolisados 8, 9, 1 O e 11 66
TABELA 4.21. Concentrações de glicose e arabinose durante as fermentações
dos hidrolisados 8, 9, 10 e 11 66
TABELA 4.22. Parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol por
Candida guilliermondii nos hidrolisados 8, 9, 10 e 11 67
TABELA 4.23. Fator de rendimento em xilitol (Yp1s) e matriz do planejamento
TABELA 4.25. Análise de variância das estimativas dos efeitos concentração de
H2S04 (C.Ác.) e tempo de reação (T) frente ao fator de rendimento em xilitol por Candida guilliermondii do planejamento fatorial 22 rotacional com ponto
central. 69
TABELA 4.26. Análise de variância de regressão para o modelo quadrático que
representa a conversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii 71 TABELA 4.27. Parâmetros fermentativos obtidos na fermentação do hidrolisado
Os resíduos lignocelulósicos provenientes da exploração florestal e agrícola constituem a biomassa mais abundante disponível na terra e sua importância como fonte de energia renovável tem crescido com o aumento dos problemas de poluição ambiental. No Brasil esses resíduos ocasionam uma significativa perda de fontes de carboidratos potencialmente valiosas, além de seu acúmulo na natureza representar uma das grandes agressões ao meio ambiente.
O bagaço de cana-de-açúcar é um dos resíduos lignocelulósicos mais abundantes no país, gerado pela indústria sucro-alcooleira. Este material, embora apresente algumas aplicações, ainda representa um excedente em grandes proporções, ocasionando sérios problemas de estocagem e poluição ambiental. Entre os açúcares que fazem parte da fração hemicelulósica desses materiais encontra-se a xilose, que pode ser empregada como matéria prima para a obtenção química e/ou biotecnológica de xilitol.
O xilitol é um poliálcool natural, de grande importância tecnológica devido às suas propriedades físico-químicas como alto poder adoçante, propriedades anticariogênicas, e uso por diabéticos, além de outros usos terapêuticos. A via comumente empregada na produção desse adoçante é a hidrogenação catalítica da xilose, porém este método, além de gerar produtos tóxicos durante a reação química, requer soluções puras de xilose, o que aumenta o custo de produção.
Um processo alternativo de produção de xilitol é a conversão biológica da xilose, a qual oferece vantagens quanto ao custo e evita a formação dos compostos tóxicos resultantes da conversão química.
Os açúcares hemicelulósicos, como a xilose, podem ser recuperados da fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos através de hidrólise ácida,
porém o principal problema de se utilizar os hidrolisados hemicelulósicos para produção de xilitol é a presença dos subprodutos da degradação dos materiais lignocelulósicos como furfural, hidroximetilfurfural, compostos fenólicos e ácido acético, que são inibidores do crescimento microbiano e consequentemente da fermentação, limitando assim o potencial de utilização dos materiais lignocelulósicos em bioprocessos. Em estudos realizados, foi constatado que a fermentabilidade dos hidrolisados é ainda baixa em relação à observada em fermentações em meios sintéticos e que a toxicidade dos hidrolisados é o principal fator responsável pelos baixos valores de produtividade obtidos.
Embora alguns estudos já tenham sido realizados à fim de se determinar condições de hidrólise, a maioria destes visou obter xaropes ricos em xilose em detrimento da formação dos inibidores microbianos. Poucos trabalhos relatam metodologias adequadas de forma a se obter, aliado à recuperação de xilose, um hidrolisado com baixa concentração destes compostos.
O presente trabalho é parte integrante de uma linha de pesquisa em desenvolvimento no Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena e teve como objetivo avaliar diferentes condições de hidrólise ácida do bagaço de cana-de- açúcar para a obtenção de um hidrolisado de melhor fermentabilidade. Através deste estudo pretende-se contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia de obtenção de xilitol por via biotecnológica que permita obter melhorias nos parâmetros fermentativos como fator de rendimento em xilitol e produtividade volumétrica.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
A biomassa lignocelulósica oriunda de resíduos agrícolas e florestais é a fonte de compostos orgânicos mais abundante na biosfera, os quais constituem cerca de 50% da biomassa formada no mundo (KUHAD & SINGH, 1993). No Brasil esses resíduos, presentes em grandes quantidades, se acumulam na natureza, resultando uma das grandes agressões ao meio ambiente e gerando sérios problemas de poluição ambiental.
A biomassa lignocelulósica é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina (KUHAD & SINGH, 1993). A TABELA 2.1 apresenta a composição aproximada de alguns destes resíduos.
TABELA 2.1. Composição aproximada de alguns resíduos lignocelulósicos (PARISI, 1989, KUHAD, SINGH, 1993)
Material Celulose Hemicelulose Lignina
(%)
(%)
(%)
Bagaço de cana-de-açúcar 40 30 20 Sabugo de milho 45 35 15 Talo de milho 35 25 35 Palha de cevada 40 20 15 Palha de aveia 41 16 11 Palha de sorgo 33 18 15 Palha de trigo 30 50 15linear de D-glicose, unidas por ligações J3(1-4), que são formadas através da eliminação de uma molécula de água, a partir das hidroxilas dos carbonos 1 e 4 de duas unidades de glicose. As cadeias de celulose se encontram agregadas paralelamente para formar as fibrilas elementares, que são insolúveis em água e apresentam regiões cristalinas e amorfas (FENGEL, WEGENER, 1989). A unidade repetitiva da cadeia de celulose é a celobiose, conforme mostrado na figura 2.1.
~
CH2Cli O
?OH
OH Hx:t3>CH20i O ~H· OH HH O OH H / H / O OH H
'a/
OH H ' / H'-o/
OH H ' H /HH O HH
o
o
H OH CH20H H OH CH2a-t
Unidade de Celobiose ---
FIGURA 2.1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL, WEGENER, 1989)
As hemiceluloses podem representar até aproximadamente 40% do material da parede celular dos vegetais (FERRARI et el., 1992). São compostas por vários açúcares (xilose, . arabinose, galactose, manose e glicose) além de ácido acético e ácido galacturônico, que formam polímeros de cadeias mais curtas e em alguns casos ramificada (FENGEL, WEGENER, 1989).
A cadeia principal pode ser um homopolímero, como no caso das xilanas, ou heteropolímeros, como no caso das glucomananas. Algumas unidades podem conter grupos laterais, tais como arabinose, galactose, ácido 4-0-metilglucurônico e acetil. As hemiceluloses são classificadas basicamente de acordo com os açúcares presentes na cadeia principal do polímero em xilanas, glucomananas e galactanas, entre outras.
As xilanas são homopolímeros formados por moléculas de xilose, unidas através de ligações P-(1-4). A representação esquemática de uma xilana típica de gramíneas está representada na FIGURA 2.2.
(4-M e }·GlcA (4·Me )·GlcA
Ac. 1 Ac Ac 1 Ac
1
<il
1
1
ai
I
2 2 3 3 2 2
• Xyl • p -Xyl- p -Xyl· p -Xyl- f3 ·Xyl-p -Xyl- p -Xyl-f3 -Xyl- j3 -Xyl- p -Xyl- p -Xyl- ~ -Xyl-
3 3 3 3 3
11
1
LigninaI
« J ci1
ª
1
aI
1 1 1 1 1
Ara D-Ara Ara D-Ara Llgnlna-FA--Ara
D
i
DF Ac F
FA-Ara A-Ara A-Ara Ara
1 1 1 1
cil
a.1
cil
af
3 3 3 3
-Xyl- p -Xyl-p -Xyl-fl -Xyl-p -Xyl- p -Xyl- p-Xyl-
f3
-Xyl- p -Xyl- p-Xyl-p -Xyt-p -Xyl-2 . 3 3 2 2
1
1
1
«1 «I
Ac Ac Ac 1 Ac
(4..a., e )·GlcA
FIGURA 2.2. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns grupos substituintes. Xyl
=
1,4-0- xilopiranose; Ara=
L-arabinofuranose; (4-Me)-GlcA=
ácido (4-0-metil)-D-glucopiranuronico; Ac=
acetil; FA=
ácido ferúlico; DDFA=
ácido desidroferúlico (McOOUGALet
ai.,
1993)A lignina, o terceiro maior componente na parede celular dos vegetais, é composta de um conjunto de polímeros amorfos reticulares de alta massa molar,
geralmente associados com celulose e hemicelulose, com estrutura química fortemente aromática, composta por anéis de benzeno que contém grupos fenólicos livres e metilados (KUHAD & SINGH, 1993). A lignina é formada a partir dos precursores álcool p-cumarílico (1), álcool coniferílico (li) e álcool sinapílico (Ili) (FIGURA 2.3 ).
ÇlliOH Çll,zOH flllOH
1
1
1
CH CHfi
li
li
CH CH~40~
~ ~~ OH OH OH1
IIIII
álcool p-curnaríllco álcool conlferflico álcool alnapfllco
FIGURA 2.3. Unidades fenilpropano precursoras da lignina (FENGEL, WEGENER, 1989)
2. 1. 1. Bagaço de cana-de-açúcar
O bagaço de cana-de-açúcar gerado pela indústria sucro-alcooleira, é um dos resíduos lignocelulósicos mais abundantes no Brasil. Este material está composto aproximadamente de 41-44% de celulose, 25-27% de hemicelulose,
20-22% de lignina e 8-10% de outros componentes, entre eles as cinzas (ICIDCA,
A produção de cana-de-açúcar no Brasil é de 335 milhões de toneladas por ano (MENDES, 2000). Para cada tonelada de cana processada obtém-se aproximadamente 280 kg de bagaço (SANTANA, SOUSA, 1984). Como 70% é comumente utilizado como combustível nas indústrias sucro-alcooleiras (MACEDO, 1998), existem aproximadamente 28 milhões de toneladas de bagaço, representando 30% do total, que são aproveitadas também para outros fins como a produção de polpa, papel e produtos aglomerados (MITRANI et ai. 1999). Segundo PROCKNO (2000) há ainda um grande excedente que acarreta graves problemas de estocagem e poluição ambiental. Entretanto, para uma eficiente utilização destes materiais em bioprocessos é fundamental o estágio inicial de separação e obtenção de suas frações (celulose, hemicelulose e lignina), o qual pode ser realizado empregando-se diferentes métodos de tratamentos físicos, químicos e biológicos.
2.1.2. Fundamentos da Hidrólise dos Materiais Lignocelulósicos
Em bioprocessos, normalmente, a celulose tem sido utilizada como fonte de energia pelos microrganismos para a obtenção de produtos químicos de interesses. Entretanto, a hidrólise da celulose é um dos principais fatores envolvidos no estabelecimento de um processo de conversão. A celulose é degradada por um sistema multi-enzimático, o complexo celulase, constituído de pelo menos três tipos de enzimas. A hidrólise da celulose é dificultada pela sua estrutura e configuração, que oferecem resistência a muitos tratamentos enzimáticos (TSAO, 1986). Segundo TSAO (1986) os principais fatores que limitam a hidrólise enzimática da celulose são a baixa estabilidade térmica das enzimas, baixos rendimentos obtidos em consequência da inibição das reações pelos produtos, e a necessidade de tratamento que permitam o acesso das enzimas ao substrato.
A lignina, por sua vez, em virtude de sua estrutura polifenólica, não é convertida em açúcares fermentescíveis (LADISCH, 1979). O polímero pode ser completamente metabolizado por culturas de vários microrganismos tais como fungos e bactérias. De acordo com HÃRTIG, LORBEER (1993) e PUNIYA et ai. (1994) os fungos da podridão branca ("white-rot fungi") são os mais efetivos microrganismos lignolíticos.
Por outro lado, a utilização da hemicelulose em processos fermentativos é favorecida principalmente em função de sua estrutura aberta, que é facilmente hidrolisada a açúcares fermentescíveis por processos físicos, químicos ou enzimáticos (GONG, 1983, JEFFRIES, 1983). A sua configuração molecular facilita a difusão de ácido no polímero o que aumenta a velocidade de hidrólise. Em geral, os açúcares hemicelulósicos podem ser recuperados mais facilmente do que a glicose da celulose (JEFFRIES, 1983, SINGH et ai., 1992).
2.1.3. Processos de fracionamento da biomassa vegetal
Vários processos vem sendo desenvolvidos visando o fracionamento da biomassa vegetal em seus principais constituintes e a posterior utilização da fração hemicelulósica em processos fermentativos.
2.1.3.1. Tratamento com vapor ("Steam-explosion")
No tratamento com vapor ("Steam-explosion") (ROBERTO et ai., 1991; CONVERTI et ai., 2000), os materiais lignocelulósicos são submetidos a pressões de vapor e temperaturas elevadas por um determinado período de tempo. Este tratamento catalisa a despolimerização da hemicelulose e da lignina, resultando em uma abertura das fibras de celulose e aumentando a sua susceptibilidade ao
ataque enzimático. Ocorre também a solubilização da hemicelulose em razão da hidrólise por ácidos orgânicos, principalmente ácido acético, formados durante o tratamento.
2.1.3.2. Processo Organosolv
O processamento de materiais lignocelulósicos por organosolventes surge como uma alternativa aos processos químicos convencionais (PARAJÓ et ai. 1993). Este processo permite uma separação seletiva e recuperação da celulose, hemicelulose e lignina. Algumas das vantagems deste processo são a inexistência de problemas relacionados com odores fortes próximos às industrias e a facilidade para recuperação de polioses e lignina que se apresentam menos degradadas (CARASCHI et ai., 1996). Os processos de polpação que envolvem as misturas etanol/água são os mais estudados, combinam alta razão de deslinificação, facilidade na recuperação do solvente e condições favoráveis de operação, principalmente em países produtores de álcool (KLEINERT, 197 4). Outro processo estudado é usando ácido acético 93% para solubizar a lignina do bagaço de cana- de-açúcar (PARAJO et ai., 1993).
2.1.3.3. Tratamento alcalino
O tratamento alcalino dos materiais lignocelulósicos é também empregado para aumentar a sua digestibilidade e possibilitar sua utilização para alimentação de ruminantes (JACKSON, 1977). Este tratamento rompe a parede celular dos vegetais pela dissolução da hemicelulose e da lignina através da hidrólise dos ésteres de ácido urânico e acético, e por turgescência da celulose. Segundo FOX et ai. (1989) este tipo de tratamento proporciona baixos rendimentos na liberação de açúcares e gera um maior volume de efluentes quando comparado com outros processos de hidrólise.
A hidrólise enzimática é um processo que tem sido muito estudado pela sua especificidade e por originar poucos subprodutos, mas é um processo lento e de pouca viabilidade técnico-econômica devido à estrutura e configuração espacial do complexo lignina-celulose-hemicelulose (COWLING, 1975; PULS, SCHUSEIL, 1993). As enzimas que participam da hidrólise enzimática da hemicelulose são a endo-1,4-~-D-Xilanase (EC 3.2.1.8) e a exo-1,4-~-D-Xilosidase (VIIKARI et ai.,
1993).
2.1.3.5. Hidrólise ácida
A hidrólise ácida é outro tratamento de grande eficiência que visa aumentar a recuperação de pentases da hemicelulose (PAIVA, 1980; PEREGO et ai., 1990; WU, LEE, 1997). PAIVA (1980) destaca ainda que, em 1931, BERGIUS desenvolveu o processo de hidrólise com ácido clorídrico concentrado, enquanto que em 1935 SCHOLLER, desenvolveu um processo utilizando ácido sulfúrico diluído, obtendo rendimentos de 50% na hidrólise da celulose. Segundo PAIVA (1980) o emprego de ácido clorídrico como catalizador na hidrólise da celulose foi desaconselhado, devido a sua alta ação corrosiva nos equipamentos.
No mecanismo de hidrólise ácida proposto por FENGEL, WEGENER (1989) (FIGURA 2.4), o próton do catalisador ácido interage rapidamente com o oxigênio da ligação de duas unidades glicosídicas, formando o chamado ácido conjugado. Neste passo, ocorre alteração na configuração da molécula de glicose acompanhada de vagarosa clivagem da ligação C-0, originando um cátion carbono. Essa protonação pode também ocorrer com menor probabilidade no oxigênio do anel de glicose, resultando na sua abertura com formação de um cátion carbono acíclico. Finalmente inicia-se uma rápida adição de uma molécula de água no cátion carbono, originando um produto estável e liberando um próton (FENGEL, WEGENER, 1989; Parisi, 1989; citados por PESSOA Jr, 1991 ).
O fator controlador da hidrólise, segundo PARIS! (1989), provavelmente é a energia rotacional requerida na dobra do anel de glicose. Este autor afirma
M.COII "vºVOII •···
q~·:
:·'Oi
OH ...H OH li OH
.OH H_OH
L '
Celobiose Ácido Conjugado
l
1
'
m
Cãtion carbono acíclico Cátion carbono
~OII
);;;I'
Glicose
---~· Sentido predominante
FIGURA 2.4. Mecanismo de hidrólise ácida das ligações glicosídicas (PARISI, 1989)
também que a celulose é mais lentamente hidrolisada que a hemicelulose, devido à rigidez dos anéis de glicose, unidos na estrutura cristalina, determinada por pontes de hidrogênio entre os grupos hidroxil e os átomos de hidrogênio das cadeias adjacentes.
Para se obter um melhor aproveitamento dos carboidratos presentes no material lignocelulósico, tem sido estudada a hidrólise ácida em dois estágios (HARRIS et ai., 1985). O primeiro estágio deste processo consiste na hidrólise da fração hemicelulósica em condições moderadas de temperatura (até 160°C), pressão (de 2 a 3 kgf/cm2) e ácido (1 %). Após a remoção do hidrolisado hemicelulósico, contendo xilose, condições mais drásticas de hidrólise são empregadas a fim de se hidrolisar o complexo lignina-celulose. Este tratamento aumenta consideravelmente o rendimento em açúcares.
A recuperação de açúcares da hemicelulose é função do tempo de residência, da temperatura, e da concentração de ácido (KLING et ai., 1987). O ácido sulfúrico tem sido o mais utilizado em virtude de seu baixo custo e alta eficiência na hidrólise. Pela hidrólise ácida, rendimentos em xilose da ordem de 80% tem sido obtidos (HSU et ai., 1996).
A fermentação dos açúcares contidos nos hidrolisados hemicelulósicos,
principalmente a xilose, resulta em diversos produtos de elevado valor comercial,
dentre estes merece destaque o xilitol ( SILVA et ai., 1998, PARAJÓ et ai., 1998, CONVERTI et ai., 2000).
2.2. XILITOL
2.2.1. Propriedades, usos e aplicações
O xilitol é um poliol, cujas propriedades encontram-se apresentadas na TABELA 2.2 (BAR, 1986), e é um produto intermediário do metabolismo de carboidratos em humanos e animais (MANZ et ai., 1973).
TABELA 2.2. Propriedades físico-químicas do xilitol (BÃR, 1986) Propriedades Fórmula química Massa molar Aparência Odor Sabor Poder adoçante Valor calórico Solubilidade a 30°C Viscosidade da solução 60% Ponto de fusão Ponto de ebulição Densidade CsH120s 152, 15 g/mol
Pó critalino de cor branca Inodoro
Doce
Igual ao da sacarose, maior que o do sorbitol 2,4 Kcal/g
68g/1 OOg solução (igual à da sacarose) 20,63 cP
92 - 96 ºC 216 ºC
1 ,50 g/cm3
Este é preparado quimicamente através da hidrogenação catalítica da xilose, obtida por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos (HYVONEN et ai.,
1982). O xilitol apresenta várias características peculiares que o tornam um produto de grande valor para as indústrias alimentícia, farmacêutica e odontológica (MANZ et ai., 1973). Apresenta propriedades anticariogênicas, podeedo ser utilizado em programas de prevenção de cáries e na formulação de gomas de mascar. Além disto, pode ser também empregado como substituto do açúcar na dieta de pacientes portadores de diabetes mellitus, bem como ser utilizado por pessoas obesas, uma vez que exerce também um efeito normalizante sobre o metabolismo das gorduras. Pode ser utilizado também no tratamento de portadores de insuficiência de glicose 6-P desidrogenase, a qual pode ocasionar anemia hemolítica.
O consumo de xilitol na forma de xaropes ou goma de mascar por crianças foi considerado efetivo na prevenção de otites, diminuindo a necessidade de antimicrobianos (UHARI et ai., 2000).
Em combinação com glicose, o xilitol é usado no campo da traumatologia para a preparação de poliésteres ramificados, utilizado na imobilização de lesões traumatológicas (SANROMÁN et ai., 1991).
2.2.2. Processos de produção
O xilitol é encontrado em muitas frutas e legumes (TABELA 2.3), porém em baixas concentrações, não sendo economicamente viável sua extração a partir destas fontes (EMODI, 1978; WINKELHAUSEM et et., 1998). No entanto, o xilitol pode ser obtido por via química e por via microbiológica.
TABELA 2.3. Concentração de xilitol em algumas frutas e legumes
Produto Xilitol (mg/1 OOg matéria seca)
Banana 21,0 Franboesa 268,0 Morango 362,0 Cenoura 86,5 Cebola 89,0 Alface 131,0 Beringela 180,0 Setas brancas 128,0 Alface risada 273,0 Abóbora 96,5
2.2.2. 1. Via química
O xilitol, em escala comercial, é convencionalmente produzido por processo químico, através de hidrogenação catalítica de xilose pura, obtida da hidrólise de materiais lignocelulósicos contendo altos teores de xilana (FIGURA 2.5).
Este processo envolve desde a hidrólise da matéria-prima para a obtenção da xilose pura até sua hidrogenação a xilitol, sendo necessárias várias etapas de purificação muito intensas, correspondendo a operações de troca iônica, descoloração e fracionamento cromatográfico para obter uma matéria-prima pura.
O processo de hidrogenação catalítica requer altas temperaturas e pressões de trabalho, além da utilização de um catalisador de níquel-Raney (HYVONEN et ai., 1982). Neste processo ocorre a geração de diversos compostos indesejáveis, o que demanda a necessidade de várias etapas de purificação final do produto, acarretando um elevado preço do produto final (MELAJA, HÃMÃLÃINEN, 1977; HEIKKILÃ et ai., 1992).
2.2.2.2. Via microbiológica
A via microbiológica de produção de xilitol se apresenta como alternativa à via química, uma vez que a bioconversão ocorre diretamente no hidrolisado. Além disto, o processo microbiológico opera em condições muito mais brandas de pressão e temperatura (FELIPE et ai., 1993).
A bioconversão xilose-xilitol ocorre devido à ação da enzima intracelular xilose redutase que catalisa a redução de xilose em xilitol na presença dos cofactores NADPH ou NADH no primeiro passo do metabolismo da xilose. Posteriormente participa a enzima xilitol deshidrogenase que emprega NADP+ ou NAD+ como cofactor, oxidando o xilitol a xilulose (BARNETT, 1976; JEFFRIES, 1983; SLININGER et ai., 1987). A xilulose é convertida em piruvato, um intermediário que conecta a via das pentase fosfato com a glicolítica (TAYLOR et ai., 1990). Estas enzimas encontram-se presentes nos microrganismos
Traços de : Xilose ·
mlftfsws.-
Aci$BJ.A,Ba M~t
Material Rico em Pentase TROCA IÔNICA E DESCOLORA CÃO·l
. PURIFICAÇÃO Traços de Xilose..
. FRACIONAMENTOr- ·
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Melaço de Pentose . HIDROGENAÇÃO...
Solução de Poliol Melaço de Polioleucarióticos fermentadores de xilose (LEE et ai., 1996). Dentre estes, destacam- se as leveduras, especialmente as do genêro Candída (SILVA & AFSCHAR, 1994; VANDESKA et ai., 1995). Dentre estas, Candída guíllíermondíí tem-se mostrado como levedura promissora e potencial em produzir xilitol tanto em meio sintético (SILVA et ai., 1996) quanto em hidrolisado de materiais lignocelulósicos (ROBERTO et ai., 1996; FELIPE et ai., 1996). A FIGURA 2.6 mostra o esquema da fermentação de xilose por leveduras.
O acúmulo de xilitol e sua excreção no meio de fermentação é regulado pela disponibilidade de oxigênio no meio. Segundo VANDESKA et ai. (1995) a taxa de consumo de oxigênio determina quando a xilose é utilizada em processos respiratórios ou fermentativos. Sob condições anaeróbias a xilose não pode ser assimilada, não pela falta das enzimas específicas para o metabolismo de xilose, mas pelo fato de que o NADH produzido não pode ser regenerado através da fosforilação oxidativa (NOLLEAU et ai., 1993). Em condições de forte aeração, a fermentação é direcionada para a produção de biomassa acarretando em um decréscimo no rendimento de xilitol (GIRIO et ai., 1990).
Segundo FURLAN et ai. (1996) o oxigênio oxida o NADH à NAD+ e uma alta relação NAD+ / NADH leva à oxidação do xilitol à xilulose, reduzindo a quantidade de xilitol acumulado no meio. Assim o nível de 02 que favorece a
produção de xilitol está na faixa da limitação de oxigênio (VANDESKA et ai., 1995).
OJAMO et ai. (1988) observaram que sob baixa velocidade específica de consumo de oxigênio, o sistema de transferência de elétrons não é capaz de reoxidar o NADH produzido por respiração e/ou fermentação. Como consequência, a concentração intracelular de NADH aumenta, resultando na redução da taxa de reação da enzima xilitol desidrogenase dependente de NAD+ e aumentando portanto a excreção de xilitol.
Xilose
1
Glicose Consumo de Açúcares
1
Xilose Glicose
redutase NADPH
*
NADH r:I ATP+ NADP+
NADP NAC+ NADPH~ J --- ADP
Xilitol ~ Glicose 6P
NAD~ co- 6 Fosfogluconato
t
l
NADH Xilitol -~ 1
• · deshidrogenas~ ~ ~... Frutose 6P
Xilulose Ribulo.se 5P NAOPH NAoP•
ç
ATP1 -:
\
,/::-·-·.·.---F~~.6P
Xilulose 5P Rl~ SP,' '' ~'"'---
7
/~
f
"\
1 , Gliceraldeído 3P ~ Dihidroxi / ' , Sedoheptulose 7P I acetona P Xilose Frutose 6P I 1 I NADHr
NAOH ~ NAO+ Glicerol 3Pl
/ / ,. Frutose6P ' Gliceraldeido 3P ~ , ' Glicerol NAo• Píruvato --- - NAº~}~NADH CO:z ~ ~ CO:z
y
Ciclo TCA - Acetil CoA Acetaldeído ( "') Etanolr>
~ ~
NADH NAO+Cadeia NAD• NAO•
R . esp1r: na ató. NAOH Acetato NADH
FIGURA 2.6. Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de xilose baseado no esquema proposto por HAHN-HÃGERDAL
et ai.
(1994)2.3. INIBIDORES DO METABOLISMO MICROBIANO
O hidrolisado hemicelulósico obtido após o tratamento do material lignocelulósico por ácido e/ou calor contém, além dos açúcares hemicelulósicos,
vários inibidores do crescimento microbiano (KUHAD, SINGH, 1993; LARSSON et
ai., 1999). A quantidade dessas substâncias no hidrolisado depende das
condições de hidrólise e da biomassa utilizada. Entre esses compostos, de natureza desconhecida, estão os produtos da degradação de açúcares, como furfural, hidroximetilfurfural, ácido levulínico, ácido fórmico e ácido acético, os compostos fenólicos derivados da lignina, tais como seringaldeído e vanilina, os extrativos, representados pelas resinas ácidas, taninos e terpenos (KUHAD,
SI NGH, 1993; PARAJÓ et ai., 1998; LARSSON et ai., 1999).
2.3.1. Ácido Acético
O ácido acético é o principal derivado dos grupos acetil liberados das xilanas acetiladas nos hidrolisados hemicelulósicos. O modo de ação nas células de leveduras pode ser pela redução do pH intracelular a valores inferiores ao limite admissível, resultando em diminuição do crescimento e do metabolismo celular (VOGEL-LOHMEIR et ai., 1998).
A toxicidade do ácido acético na conversão de xilose em xilitol por Candida
guil/iermondii tem sido constatada quando este está presente em concentrações
acima de 3 g/L (FELIPE et ai., 1995). O ácido acético é considerado um potente inibidor do metabolismo da glicose em leveduras e seu efeito é função da concentração da sua forma não dissociada (pKa 4,75) e, portanto, depende do pH do meio de fermentação. No pH ótimo para a fermentação por leveduras (pH 4,0- 5,0) o ácido acético encontra-se em sua maioria sob a forma não dissociada, a qual difunde-se livremente para dentro do citoplasma, onde dissocia-se causando um decréscimo no pH intracelular. As leveduras são capazes de regular seu pH interno por bomba de prótons mediante a ATPase situada na membrana. Quando
o pH intracelular diminui, verifica-se também um aumento da atividade da ATPase, prejudicando a dissipação de ATP (KUSUMGI et ai., 1998). Acima de uma certa concentração de ácido acético, o catabolismo celular não pode gerar quantidade suficiente de ATP, portanto, o gradiente de prótons na membrana não é mantido, a produção de energia é desacoplada e o transporte de vários nutrientes é prejudicado (HERRERO et ai., 1985; du PREEZ et ai., 1991 ).
FELIPE (1994) observou que nenhuma bioconversão ocorreu quando a levedura Candída guíllíermondíí cresceu em hidrolisado hemicelulósico de cana- de-açúcar contendo ácido acético em concentrações maiores que 5 g/L e pH inferior a 4,5.
Segundo estudos realizados por SILVA (2001 ), o efeito inibitório do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candída guíllíermondíí pode ser potencializado pela presença de outros compostos tóxicos no hidrolisado tais como furfural, hidroximetilfurfural e fenóis.
2.3.2. Furfural e Hidroximetilfurfural
A influência do furfural na via metabólica de utilização de açúcares e no crescimento microbiano é dependente da concentração deste no meio de cultivo. Na fermentação alcoólica empregando Saccharomyces cerevísíae, AZHAR et ai. (1981 ), verificaram a inibição da multiplicação da levedura, em presença de furfural na concentração de 3,0 gil. Para Candída guíl/íermondíí, o furfural mostrou-se um potente inibidor do metabolismo oxidativo quando em concentrações acima 1,0 g/L (SANCHES, BAUTISTA, 1988; OJAMO et ai., 1988). Segundo estudos realizados com Píchia stíptis, o efeito tóxico do furfural foi relacionado à inibição na respiração e da fosforilação oxidativa (PARAJÓ, 1998). WEIGERT et ai. (1988), atribuíram a inibição pelo furfural à sua interferência direta no transporte de elétrons na mitocôndria.
O hidroximetilfurfural, devido ao fato de ser muito reativo, está usualmente presente em baixas concentrações. Sob condições favoráveis para sua formação
ocorrem reações subsequentes, resultando na formação de outros compostos (HARRIS et ai., 1985). A presença de hidroximetilfurfural em concentrações de 1,5 g/L em meio contendo uma mistura dos açúcares glicose, manose e xilose não afetou o tempo total de fermentação, verificando-se inclusive um efeito estimulatório na produção de xilitol por Candida parapsilosis (PREZIOSI-BELLOY etal., 1997).
2.3.3. Compostos fenólicos
Durante a hidrólise ácida, uma pequena fração da lignina é degradada, resultando na liberação de compostos aromáticos. Destes, os compostos fenólicos de baixa massa molar têm sido considerados os de maior força inibitória (CLARK, MACKIE, 1984). Segundo VILLA et ai. (1998) os compostos fenólicos presentes no hidrolisado, embora em baixas concentrações, inibem a conversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii. Segundo estes autores concentrações maiores que O, 1 g/L mostraram efeito inibitório na velocidade de consumo da xilose, crescimento celular e produção de xilitol.
A inibição da fermentação em hidrolisado hemicelulósico de algodão decresceu quando manômeros e ácidos fenólicos foram removidos por tratamento com a enzima lacasse (Jõnsson et ai., 1998; citados por PALMQVIST, HAHN-HAGERDAL, 2000). O ácido 4-hidroxibenzóico tem sido usado como um composto modelo para o estudo da influência dos compostos fenólicos na fermentação (PALMQVI ST et ai., 1999b ). Seu efeito inibitório na fermentação com
S. cerevisiae tem sido relatado quando encontra-se presente em concentrações
acima de 1 g/L.
PARAJÓ ( 1998) verificou que a maioria dos produtos da degradação da lignina são mais tóxicos que o furfural e o hidroximetilfufural e apresentam uma alta potencialidade inibitória a baixas concentrações.
-
2.3.4. Cátions Metálicos
Cátions metálicos, provenientes do equipamento da hidrólise, também influenciam a atividade das enzimas que participam do metabolismo da xilose (LEE, McCASKEY, 1983; HEIKKILA et ai., 1992; VOGEL-LOHMEIR et ai., 1998). Estudos realizados indicam que Ca2\ Mg2+ e Mn2+ não afetam a atividade da xilitol
desidrogenase, no entanto esta enzima pode ser fortemente inibida por Zn2\ Cd2+
e Co2+ (Girio et ai., 1996; citados por PARAJÓ, 1998).
WATSON et ai. (1984) estudaram os efeitos de íons sobre o crescimento celular de Pachyso/en tannophi/us, para a produção de xilitol e constataram que os íons Cu2+ e
e>
nas concentrações de até 0,004 e O, 1 O g/L, respectivamente, nãoafetaram significativamente a atividade máxima da enzima, mas a presença de íons Ni2+ na concentração de O, 1 O g/L resultou na redução de 60% no valor deste
parâmetro.
Já ficou comprovado que o processo fermentativo de produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico proveniente da hidrólise do bagaço de cana- de-açúcar apresenta ainda algumas limitações, principalmente quanto à produtividade, devido à presença dos compostos inibidores do metabolismo microbiano presentes no material, tais como furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e derivados da lignina (PARAJÓ et ai., 1998).
O presente trabalho foi realizado nos laboratórios do Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia - DEBIQ da Faculdade de Engenharia Química de Lorena - FAENQUIL, Lorena, SP.
3.1. OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS
Os hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar foram obtidos por hidrólise ácida realizada em reator de aço inoxidável de 250 L de capacidade total (FIGURA 3.1 ), operando-se em sistema descontínuo a 121 ºC, em diferentes condições de concentrações de ácido sulfúrico como catalizador e tempos de reação, de acordo com o planejamento fatorial 22 e metodologia proposta por BARROS NETO et ai (1995). Foi usada uma relação líquido-sólido de 1 O: 1 e 20 Kg de bagaço por cada hidrólise.
Os hidrolisados obtidos foram centrifugados em equipamento piloto para eliminar as partículas sólidas.
A TABELA 3.1 apresenta os fatores e os diferentes níveis estudados. Três experimentos foram realizados no ponto central para determinar o erro experimental. Realizados todos os experimentos prescritos por este planejamento, novas hidrólises foram conduzidas nas condições de planejamento em estrela. A TABELA 3.2 apresenta os fatores e níveis codificados deste planejamento.
FIGURA 3.1. Reator de hidrólise ácida empregado no presente trabalho para obtenção dos diferentes hidrolisados
TABELA 3.1. Fatores e níveis do planejamento fatorial 22 com ponto central
Fatores Níveis
-1
o
+1Concentração de ácido sulfúrico
(mg/gms)
70
100
130
Tempo de reação (min)
10
20
30
Nível superior: +1; nível inferior: -1 e nível central: O
TABELA 3.2. Matriz codificada do planejamento fatorial (22 com ponto central e em estrela)
Condições de hidrólise Valores codificados Experimentos H2S04 (mg/gms) Tempo (min) X1 X2 ~-r.·· E 1
70
10
-1
-1
o (.) 270
30
-1
1
N N iij iij 3130
10
1
-1
·e: "- o-
e:-
ctS CI) ~ o 4130
30
1
1
oo
-
e: e: CI)-
o
o
5100
20
o
E e. ctS·ar
e: 6100
20
o
o
ctSe:
7100
20
o
o
o 8142
20
+1,4142
o
-
e: ctS CI) ãi 9 5820
-1
,
4142
o
E-
"- ctS"'
·-
CI) 10100
34
o
+1,4142
CI) E e: ctS CI) a. 11100
6o
-
1,4142
3.2. CONCENTRAÇÃO E TRATAMENTO DOS HIDROLISADOS
Os hidrolisados obtidos foram concentrados à vácuo em um evaporador de 4 L à 70 ºC (FIGURA 3.2) a fim de se obter um teor de xilose em torno de 60 g/L.
Os hidrolisados concentrados foram submetidos a tratamento com adição de óxido de cálcio comercial até pH 7,0, redução do pH com ácido fosfórico P.A até 5,5 e posterior adição de carvão ativo 2,4%. A mistura foi submetida à agitação em agitador rotatório (New Brunswick Scientific Co., lnc-Edison-New Jersey-USA) à 30°C e 200 rpm durante 1 hora. A cada alteração de pH e após a agitação por 1 hora, os hidrolisados foram filtrados para remoção do precipitado formado e autoclavados à 111 ºC por 15 min.
3.3. MICRORGANISMO E PREPARO DE INÓCULO
Foi utilizada a levedura Candída guíl/íermondíí FTI 20037 mantida em tubos de ensaio inclinados contendo ágar-Malte a 4°C. O inóculo foi preparado em meio contendo 30 g/L de xilose, 3 g/L de sulfato de amônia, O, 1 g/L de cloreto de cálcio e 20 g/L de extrato de farelo de arroz. O cultivo foi realizado em frascos Erlenmeyer de 125 ml com 50 ml do meio a 30 ºC, em agitador rotatório a 200 rpm, por 24 horas.
3.4. MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO
As fermentações foram realizadas em meio a base de hidrolisados tratados, autoclavados a 111 ºC por 15 min e suplementados com 3 g/L de sulfato de amônia, O, 1 g/L de cloreto de cálcio e 20 g/L de extrato de farelo de arroz.
Os experimentos foram conduzidos em fermentador BIOFLO Ili (New Brunswick Scientific Co., lnc-Edison, New Jersey, Estados Unidos) (FIGURA 3.3) com capacidade volumétrica total de 2 L, contendo 1,25 L de meio. O fermentador foi equipado com eletrodo de oxigênio dissolvido (METTLER TOLEDO), termopar, agitador com 2 pás tipo "flat-blade". As fermentações ocorreram em sistema descontínuo, à 30 ºC, agitação de 300 rnin" e KLa inicial de 36 h". A concentração inicial de células no fermentador foi de 0,5 g/L, para todos os ensaios.
3.5. ANALISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando a metodologia de superfície de resposta (HORITSU et ai., 1992). Foi empregado o programa Statgraphics 6.0, considerando como fator de resposta a concentração de xilose recuperada no hidrolisado para avaliar as condições de hidrólise ácida e o fator de conversão de xilose em xilitol para avaliar o efeito destas condições na fermentação.
3.5.1. Determinação de um modelo matemático representativo da recuperação de xilose no hidrolisado e do fator de rendimento em xilitol em função da concentração de ácido e do tempo de reação
3.5.1. 1. Modelo linear
Baseado no planejamento fatorial 22 proposto no referido trabalho, tentou-
se determinar um modelo matemático linear do tipo:
Equação 1 Onde:
Constante
FIGURA 3.3. Reator BIOFLO Ili com 1,25 L de capacidade volumétrica utilizado no presente trabalho
para representar os fatores estudados em função da recuperação de xilose no hidrolisado e do fator de rendimento em xilitol na fermentação. Foi realizada uma regressão empregando-se os sete primeiros experimentos mostrados na TABELA 3.2.
3.5.1.2. Modelo quadrático
Nesta etapa tentou-se ajustar os resultados obtidos segundo a TABELA 3.2 a um modelo quadrático do tipo:
Equação 2 Onde:
bo Constante
b1 , b2 , b3 , b4 Estimativas dos parâmetros do modelo
Para isto foram empregados os experimentos realizados no planejamento 22 e
aqueles efetuados em estrela, totalizando 11 experimentos ( TABELA 3.2).
3.6. MÉTODOS ANALÍTICOS
3.6.1. Caracterização química do bagaço de cana-de-açúcar
Para análise do bagaço de cana-de-açúcar, as amostras foram secas em estufa FANEM a 60
ºe
,
de 24 a 36 horas, até um teor de umidade inferior a 10% (p/p). Após este procedimento, o bagaço foi moído a 20 "mesh" em moinho de facas (Manesco & Ranieri Ltda tipo MR 340).3.6.1.2. Determinação do peso seco
O peso seco das amostras em estudo foi determinado em balança de determinação de umidade METTLER LP15, onde as amostras são colocadas e aquecidas a 100
ºe
sob a ação de raios infravermelhos e secagem até peso constante.3.6. 1.3. Determinação de carboidratos presentes no bagaço de
cana-de-açúcar.
A determinação dos carboidratos foi feita conforme método sugerido por DUNNING & DALLAS (1949), que se fundamenta na sacarificação quantitativa dos polissacarídeos de diferentes matérias primas vegetais, seguida da dosagem dos monômeros formados.
Uma amostra de 2 g de bagaço de cana moído foi transferido para um becker de 100 ml e tratada com 1 O ml de H2S04 72% (p/p ), sob vigorosa agitação, em banho termostatizado a 50
ºe
por 7 min. A reação foi interrompida com adição de 50 ml de água destilada. A amostra foi transferida quantitativamente para um Erlenmeyer de 500 ml, usando-se 250 ml de água.Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, o Erlenmeyer foi fechado com papel alumínio e autoclavado por 30 min a 121°C. Após a descompressão da autoclave, o frasco foi retirado e resfriado à temperatura ambiente. A mistura foi primeiramente filtrada em papel de filtro para um balão volumétrico de 500 ml, o qual foi posteriormente completado com água destilada.
A solução foi armazenada para posterior determinação do teor de açúcares por HPLC, como descrito no item 3.6.2.
3.6.1.4. Determinação de lignina insolúvel
Os sólidos retidos no papel de filtro foram lavados com aproximadamente 1,2 L de água destilada e secos em estufa a 105°C até massa constante. O material foi calcinado de acordo com o procedimento descrito no item 3.6.1.5. A quantidade de cinzas foi determinada e a massa de lignina determinada por diferença. A porcentagem de lignina foi determinada pela seguinte equação:
Lignina ( % )
= [
Mlignina / PSAmostra] x 100 Equação 3 Onde:Mlignina - massa da lignina, em g
PSAmostra - peso seco da amostra de bagaço, em g
3.6.1.5. Determinação do teor de cinzas no bagaço de cana
A determinação do teor de cinzas foi feita conforme metodologia descrita por SILVA (1995). Cerca de 1,8 a 2,0 g de bagaço de cana, com umidade conhecida, foram pesados em um cadinho de porcelana previamente tarado. Em seguida a amostra foi calcinada a 800°C por 2 horas. Após a calcinação, o material foi resfriado em dessecador e a massa de cinzas determinada. A massa de cinzas da lignina foi usada para corrigir o teor de lignina insolúvel, determinado no item 3.6.1.4.
O teor de cinzas foi calculado pela equação:
Onde:
Czs (%)
=
porcentagem em massa de cinzasM1 = massa do cadinho calcinado vazio, em g M2 = massa do cadinho com cinzas, em g M3
=
massa da lignina seca, em g3.6.2. Determinação das concentrações de açúcares, ácido acético e xilitol
As concentrações de açúcares (xilose, glicose, arabinose), xilitol e ácido acético foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em equipamento SHIMADZU (Kyoto, Japão), nas seguintes condições: coluna 810 RAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura da coluna, 45°C, detetor de índice de refração WATERS 410; eluente ácido sulfúrico 0,01 N, fluxo 0,6 ml rnin" e volume de amostra 20µL. As amostras , após diluídas, foram filtradas em filtro Sep Pak C18 (MILLIPORE) e o eluente, filtrado a vácuo em membrana HAWP 0,45µm de poro, 47 mm de diâmetro (MILLIPORE) e simultaneamente degaseificado em banho de ultra-som (THORTON) por 25 minutos.
3.6.3. Determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural
As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram determinadas por cromatografia líquido de alta eficiência (HPLC), em equipamento SHIMADZU (Kyoto, Japão), nas seguintes condições: coluna HEWLETI-PACKARD RP 18 (200 mm), temperatura da coluna 25°C, com detetor ultravioleta UV-2487; eluente,
solução de acetonitrila/água (1 :8) com 1 % de ácido acético, fluxo 0,8 ml rnin' e volume de amostra 20µL. Os hidrolisados foram filtrados em filtros Swennex em membrana Minisart 0,22µm (MILLIPORE). Na composição do eluente, a água bidestilada foi filtrada a vácuo empregando-se membrana HAWP 0,45µm
