RENAN MODESTO MONTEIRO

NOVAS PROPRIEDADES DAS V H

-ATPases DE

Saccharomyces cerevisiae: REGULAÇÃO DA ENZIMA PELOS

CÁTIONS DIVALENTES CÁLCIO E MANGANÊS E PELA GLICOSE

EXTRACELULAR

RENAN MODESTO MONTEIRO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES / RJ FEVEREIRO – 2010

i

NOVAS PROPRIEDADES DAS V H

-ATPases DE

Saccharomyces cerevisiae: REGULAÇÃO DA ENZIMA PELOS

CÁTIONS DIVALENTES CÁLCIO E MANGANÊS E PELA GLICOSE

EXTRACELULAR

RENAN MODESTO MONTEIRO

Orientador: Prof. Dr. Lev Alexandrovitch Okorokov

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES / RJ FEVEREIRO – 2010

“Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia”

ii

NOVAS PROPRIEDADES DAS V H

-ATPases DE

Saccharomyces cerevisiae: REGULAÇÃO DA ENZIMA PELOS

CÁTIONS DIVALENTES CÁLCIO E MANGANÊS E PELA GLICOSE

EXTRACELULAR

RENAN MODESTO MONTEIRO

Aprovada em 22 de fevereiro de 2010 Comissão examinadora:

Prof. Dr. Alessandro Coutinho Ramos - UVV

Profa Dra. Anna Lvovna Okorokova Façanha – UENF

Dra. Flavia Emenegilda da Silva - UENF

Prof. Dr. Lev Alexandrovitch Okorokov - UENF

“Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia”

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Aos meus pais, Itamar e Luzia,

A minha irmã Karina,

A minha namorada Thatiane

por todo amor, carinho e compreensão.

iv

AGRADECIMENTOS

À Deus por ter me dado forças para superar todas as dificuldades.

Ao professor Lev, por ter aceitado me orientar; por sua amizade, ensinamentos, paciência e grande dedicação.

Aos meus pais, Itamar e Luzia, por todo amor e por terem me apoiado e minha irmã Karina, por todos os momentos bons e por toda ajuda e carinho.

A minha namorada Thatiane, por todos os momentos inesquecíveis que passamos juntos, pelos conselhos e principalmente pelo carinho.

Ao prof. Alessandro, a profa. Anna e profa.Flavia por terem aceito o convite de participar da banca.

Ao professor Carlos Eduardo por revisar a dissertação.

A todos os membros e amigos do grupo de trabalho: Camila, Flavia, Layz, Géssika, Mariana pelo suporte e ótimo convívio.

Aos amigos do LFBM, Flávias, Ana Cristina, Ludmila, Viviane, André, Humberto, Izabela, Érika, Suzana, Mariângela, Luiz, Luana pelo convívio e amizade.

Aos professores do LFBM Anna, Valdirene, João e Júlio pelo convívio e pelos ensinamentos.

À UENF, CNPq e FAPERJ por terem financiado esse projeto e tornado possível a realização do mesmo.

v

SUMÁRIO

1.3.1 - Estrutura das V H+-ATPases... 05

1.3.2 - Diferentes formas de V H+-ATPases... 09

1.3.3 - Regulação das V H+-ATPases... 10

1.3.3.a Regulação pela glicose extracelular... 10

1.3.3.b Formação de ligações dissulfeto... 10

1.3.3.c Atividade de canais aniônicos... 11

1.3.3.d Outras formas de regulação... 12

1.3.4 - Inibidores de V H+_{-ATPases... 15} 2- OBJETIVOS... 16 2.1 - Objetivo principal... 16 2.2 - Objetivos específicos... 16 3- MATERIAL E MÉTODOS... 17 3.1- Cepa de levedura... 17

vi

3.3- Preparo do pré-inóculo... 17

3.4- Preparo da levedura para o isolamento... 17

3.5- Isolamento de membranas e fracionamento subcelular... 18

3.5.1- Obtenção de células... 18

3.5.2- Obtenção dos esferoplastos... 18

3.5.3- Pré-incubação dos esferoplastos com glicose... 19

3.5.4- Obtenção de membranas totais... 19

3.5.5- Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente de densidade de sacarose... 20

3.6- Determinação do ∆pΗ (transporte de H+) (Okorokov & Lichko, 1983)... 21

3.7- Determinação do conteúdo de proteína (Bradford, 1976)... 22

3.8- Determinação da hidrólise de ATP... 23

4- RESULTADOS... 24

4.1 Efeito do Ca2+ sobre o transporte de H+ realizado pela V H+-ATPase... 24

4.2 Efeito do Mn2+ sobre o transporte de H+ realizado pela V H+-ATPase... 26

4.3 Efeito do KNO3 sobre a atividade hidrolítica das V H+-ATPases... 29

4.4 Efeito do KNO3 sobre o transporte de H+ mediado pela V H+-ATPase... 34

4.5 Efeito da glicose sobre a ativação e o acoplamento da V H+-ATPase... 37

5 – DICUSSÃO... 42

6- CONCLUSÕES... 45

vii

ABREVIATURAS

Abs Absorbância

ACMA 6-amino-6cloro-2-metoxiacridina

ATP Adenosina Trisfosfato

ATPase Adenosina trifosfatase

DO Densidade ótica DTT Ditiotreitol EM Potencial de membrana Fmáx Amplitude máxima g Gravidade GDP Guanosina Difosfato

GDPase Guanosina Difosfatase

H+-ATPase ATPase translocadora de próton

MOPS Ácido 3-[N-morfolino] propano sulfônico

pH Potencial hidrogeniônico

P H+-ATPase ATPase translocadora de próton de membrana plasmática

RE Retículo endoplasmático

rpm Rotação por minuto

V H+_{-ATPase ATPase translocadora de próton vacuolar}

Vo Velocidade inicial do transporte de H+

Vmáx Velocidade máxima

YEPD Yeast Extract Peptone Dextrose ∆

∆ ∆

viii

RESUMO

As V H+-ATPases são enzimas-chaves em diversos processos importantes,

como endocitose, tráfico de proteínas, transporte ativo e armazenamento de metabólitos, fusão e fissão de membranas. O primeiro objetivo do nosso trabalho foi

comparar o efeito de íons Ca2+ _{e Mn}2+ _{no transporte de H}+ _{mediado por V H}+

-ATPase das organelas da via de secretória em Saccharomyces cerevisiae após a

energização das membranas com glicose extracelular. A velocidade inicial (V0) do

transporte de H+ _{nessas membranas foi inibida diferentemente pelo Ca}2+ _{e o Mn}2+

estimulou seletivamente a V0. O efeito do Ca2+ e Mn2+ na formação do ∆pH em

vacúolos foi interpretada supondo que os cátions são transportados por trocadores

Me2+/H+ e o Ca2+ fecha o canal de ânions, enquanto o Mn2+ abre convertendo o ∆µH

in EMCa2+ e ∆pH, respectivamente. Os dados suportam a idéia da presença de

diferentes formas da enzima no RE, Golgi, vacúolos e envelope nuclear da levedura.

O segundo objetivo foi compreender como a V H+-ATPase pode ser regulada pela

glicose extracelular, uma vez que o complexo catalítico V1 não dissocia da

membrana. Nós constamos que: (i) os estados ativado e semi-ativado da enzima mostram a mesma sensibilidade da inibição da ATPase pelo nitrato, sugerindo a

ligação idêntica do complexo V1 com a membrana; (ii) a velocidade inicial de

transporte de H+ _{foi inibida de forma de forma mais eficaz do que a atividade de}

ATPase, apontando para a atividade de desacoplamento do nitrato, que é significantemente maior para a enzima não ativada; (iii) a bomba ativada exibiu maior acoplamento; (iv) a população das moléculas da enzima ativada de MT consiste de sub-populações que mostra acoplamento diferente apresentando maior resistência ao efeito de desacoplamento pelo nitrato. Nós sugerimos que uma alteração bioquímica e a modulação do acoplamento da bomba são fatores chave do

ix

ABSTRACT

The V H+-ATPases are key enzymes in several important processes including

endocytosis, trafficking proteins, active transport and storage of metabolites, fusion and fission of membranes. The first aim of our work was to compare the effect of ions

Ca2+ e Mn2+ on the H+ transport mediated by V H+-ATPases of the secretory pathway

organelles in Saccharomyces cerevisiae after energization of the membranes with

extracellular glucose. The initial velocity (V0) of H+ transport in those membranes was

inhibited by Ca2+ differently and Mn2+ selectively stimulated V0.. The effect of Ca2+

and Mn2+ _{in the formation of ∆pH in vacuoles was interpreted assuming that cations}

are transported by Me2+_{/H+ exchangers and Ca}2+ _{closes the anion channel while the}

Mn2+ _{opens it converting ∆µHin EM}Ca2+ _{and ∆pH, respectively. The data support the}

idea of the presence of different forms of the enzyme in the ER, Golgi, vacuoles and nuclear envelope of yeast. The second goal was to understand how V H+-ATPase can be regulated by extracellular glucose given that the V1 catalitic complex does not dissociate from membranes.We found that: (i) semi-active and activated enzyme

states

identical binding of their V1

complexes to membrane; (ii) the initial velocities of the H

transport were inhibited more effectively than the ATPase activity, pointing towards the nitrate uncoupling action, which is significantly higher for the not activated enzyme; (iii) the activated pump exhibited a higher coupling; (iv) the population of the activated enzyme molecules of TM consist of the sub-populations showing the different coupling presented higher resistance to the uncoupling effect of nitrate. We suggest that a biochemical modification and the coupling modulation of the pump are

key factors of its regulation which does not require the dissociation of the V1 complex

1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Homeostase iônica

Todos os processos da vida são realizados em condições ideais de íons: H+,

Ca2+_{, Mg}2+_{, K}+_{, Na}+_{, Cl}-_{, Pi entre outros. A homeostase iônica é um evento crítico}

para diversos processos fisiológicos como biossíntese/degradação, enovelamento, endereçamento de proteína, secreção protéica, fusão e divisão de membranas, morfogênese de organelas e células, dinâmica de microtúbulos e divisão celular. Desvios nessa homeostase podem causar doenças/ fenômenos patológicos tanto no homem quanto em animais e plantas (Voet et al., 2000).

A homeostase iônica é mantida pela atividade coordenada de diferentes transportadores. As proteínas transportadoras podem ser agrupadas em três grandes classes: ATPases, carreadores e canais (Voet et al., 2000). Essa classificação é baseada em diferentes formas de utilização da energia: ATPases que são bombas protônicas primárias, que criam o gradiente protônico, utilizando diretamente a energia da hidrólise do ATP, para transportar íons contra um gradiente de concentração; e os transportadores secundários, que utilizam o gradiente protônico para transportar íons, sendo eles os carreadores e os canais (Alberts et al. 1999).

1.2 H+-ATPase

As H+-ATPases, também chamadas bombas de H+, constituem uma grande

família de enzimas que transportam prótons através das membranas contra o

gradiente eletroquímico de H+ usando a energia da hidrólise do complexo ATP-Mg

(Nelson, 1992).

As H+-ATPases são enzimas eletrogênicas, ou seja, possuem a capacidade

de criar uma diferença de cargas elétricas através da membrana, sendo essa

diferença chamada de potencial de membrana (EM), assim como pode criar,

simultaneamente, um gradiente de concentração de prótons (∆pH) (Pedersen & Carafoli, 1987).

Sabe-se da existência de três tipos de H+-ATPases: as H+-ATPases do tipo F

(F1Fo H+-ATPases), H+-ATPases do tipo P (P H+-ATPases) e as H+-ATPases do tipo

As F1Fo H+-ATPases estão localizadas nas mitocôndrias, na membrana de

bactérias (B1Bo H+-ATPases) e cloroplastos (C1Co H+-ATPases), as H+ ATPases do

tipo F são inibidas por azida e oligomicina. Estas enzimas consiste de um setor

catalítico F1, composto das subunidades α, β, γ, δ, ε e o setor da membrana, F0

responsável pelo transporte de prótons é composto pelas subunidades a, b, c (Futai et al., 1989; Boyer, 1997). Funcionalmente, essas H+-ATPases são ATP sintases, pois são responsáveis pela síntese de ATP. Foi mostrado que, in vitro, elas também podem hidrolisar ATP (Pedersen & Carafoli, 1987). Já as ATPases do tipo P e V

utilizam a energia da hidrólise do ATP para criar o gradiente de H+ transmembranar

(Pedersen & Carafoli, 1987).

As P H+-ATPases são enzimas chaves da membrana plasmática de

leveduras, fungos filamentosos e plantas (Serrano, 1983; Pedersen & Carafoli, 1987). Esta enzima fornece energia do gradiente de prótons para transportar íons e metabólitos através da membrana plasmática e possui um papel fundamental na manutenção do pH intracelular (Gouffeau & Slayman, 1981; Axelsen & Palmgreen, 1998; Scarborough, 1999). Essa enzimas são inibidas por ortovanadato, um análogo do fosfato inorgânico (Goffeau & Slayman, 1981; Bowman et al., 1986; Pedersen & Carafoli, 1987).

As ATPases do tipo P são divididas em cinco grupos, baseando-se na seletividade de íons diferentes que transportam. Além da afinidade aos íons, elas também se diferenciam pela estrutura primária (Catty et al., 1997; Axelseen & Palmgreen, 1998).

1.3 V H +-ATPases

As V H+-ATPases possuem como função primária acoplar a hidrólise de ATP

ao transporte de H+ através das membranas biológicas. A força próton motriz gerada

pelas V H+-ATPases em organelas de células eucarióticas é usada em vários

processos secundários na célula (Nelson & Harvey, 1999). Elas são importantes para o transporte secundário de vários solutos, dirigindo uma variedade de sistemas

auxiliares de transporte ativo através dos co-transportadores e trocadores de H+

(Beyenbach & Wieczorek, 2006).

As V H+-ATPases foram primeiramente descritas em estudos sobre a

captação de catecolamina em grânulos de cromafina. Nestes estudos foi demonstrado que uma ATPase energizava essas membranas por uma absorção de

H+ _{dependente de ATP e que o gradiente protônico impulsiona o acúmulo de}

catecolaminas pela troca de prótons. Logo depois foi demonstrado que uma bomba de prótons similar operava em vacúolos de fungos e plantas (Nelson e Harvey, 1999). Foram denominadas ATPases do tipo V por terem sido caracterizadas inicialmente nas membranas vacuolares (Pedersen & Carafoli, 1987; Rea et al., 1987; Bowman & Bowman, 1988; Barkla & Pantoja,1996).

As V H+_{-ATPases são encontradas em membranas intracelulares, incluindo}

endossomos, lisossomos, grânulos de cromafina, vesículas sinápticas, vesículas cobertas de clatrina, Golgi, vesículas secretórias e vacúolo de plantas e eucariotos inferiores (Stevens & Forgac, 1997; Forgac, 1998). Também são encontradas em membranas plasmáticas de células animais especializadas como as células renais, células epididimais, macrófagos, osteoclastos, osteoblastos e células tumorais (Klionsky et al., 1990; Merzendorfer et al., 1997; Nelson. & Harvay, 1999; Wieczorek et al., 1999; Beyenbach & Wieczorek, 2006).

O bombeamento de prótons realizado pelas V H+-ATPases é de vital

importância para vários processos intra e intercelulares, dentre eles a endocitose mediada por receptores, o tráfego de proteínas, neurotransmissões, o transporte ativo e armazenamento de metabólitos (Finbow & Harrison, 1997; Stevens & Forgac, 1997; Nelson & Harvey, 1999; Futai et al., 2000; Nishi & Forgac, 2002). Além do importante papel na regulação do pH do citosol e na acidificação dos lisossomos e vacúolos de plantas e fungos, criando o pH ótimo para o funcionamento das hidrolases, incluindo proteases, glicosidases, lípases, nucleases e fosfatases (Beyenbach & Wieczorek, 2006).

A acidificação de compartimentos dependente da V H+_{-ATPase é crucial para}

a entrada de alguns vírus e bactérias dentro da célula. A hemaglutinina, proteína capsidial do vírus da gripe, por exemplo, atua como um meio de fusão dependente do pH, mediando a fusão entre a membrana viral e a membrana endossomal, isso facilita a liberação do material genético do vírus no citoplasma da célula hospedeira (White, 1992). Da mesma forma, as toxinas, tais como a toxina da difteria e a toxina do antraz, contêm subunidades formadoras de poros que, em resposta ao baixo pH endossomal após a sua interiorização, facilita a inserção da parte citotóxica no citoplasma (Kevin et al., 2008).

Nos endossomos de células renais de hamster, as V H+-ATPases promovem

internos (lipoproteínas de baixa densidade e insulina) de seus receptores (receptores que foram internalizados). Esta liberação permite que os receptores reciclem para superfície celular, onde eles podem ser reutilizados, enquanto os ligantes são direcionados para os lisossomos para a degradação (Claque, 1994).

São também encontradas no Plasmodium falciparum (agente causador da malária) e Toxoplasma gondii (agente causador da toxoplasmose), em suas membranas plasmáticas e vacúolos onde está envolvida na energização de transportes secundários de várias substâncias (Moriyama et al., 2003; Beyenbach & Wieczorek, 2006).

Em plantas, V H+-ATPases estão localizadas no tonoplasto e em outros

compartimentos intracelulares, no RE e no Golgi (Oberbeck et al., 1994). No

tonoplasto as V H+-ATPases correspondem a 6,5-35% do total de proteína, variando

de acordo com a espécie. A V H+-ATPase é indispensável para o crescimento de

plantas sob condições normais devido ao seu papel na energização do transporte de solutos, endereçamento de proteínas, homeostase de íons/metabólitos, fusão/divisão de vesículas de membranas (Clague et al., 1994; Matsouka et al., 1997; Nelson e Harvey, 1999; Forgac, 1999; Ratajczak, 2000; Futai et al., 2000). Sob condições de estresse como salinidade, seca, frio, estresse ácido, anoxia e excesso de metais pesados no solo a sobrevivência da célula depende da manutenção ou ajuste da atividade da V-ATPase (Dietz et al., 2001).

Na membrana plasmática do intestino da lagarta do tabaco Manduca sexta, o

trocador de K+/H+, utiliza o gradiente eletroquímico de H+, criado por V H+-ATPases,

para transporte do K+ _{(Wieczorek, 1991).}

Em leveduras, as V H+_{-ATPases foram descritas não apenas nas membranas}

vacuolares (Ohsumi e Anraku, 1981) mas também em todas as organelas da via secretória (Okorokov, 1997; Okorokov et al, 2001; Samarão, 2003; Teodoro, 2004) e nas vesículas secretórias (Alves, 2006). Elas são essenciais para o acúmulo de aminoácidos básicos como arginina, ácidos orgânicos, purinas, pirimidinas,

S-adenosilmetionina, Ca2+_{, Mg}2+_{, Mn}2+_{, Zn}2+ _{e fosfato inorgânico bem como para}

energizar o balanço osmótico (Okorokov et al., 1980; Oshumi & Anraku, 1983; Okorokov & Lichko, 1983; Okorokov et al., 1985; Harvey, 1992).

Em células animais as V H+-ATPases podem desempenhar um importante

papel na membrana plasmática de células especializadas. Estão envolvidas na maturação e armazenamento de esperma no lúmem epididimal (Breton et al., 1996;

Beyenbach & Wieczorek, 2006). Em células renais as V H+_{-ATPases são}

responsáveis pela secreção de íons de H+ nas células do ducto coletor, túbulos

proximais e segmentos dos néfrons (Gluck, 1992; Gluck et al., 1996), enquanto que

nos macrófagos e neutrófilos estas estão envolvidas na homeostase do H+ _(Swallow

et al., 1993).

Em céluas tumorais as V H+_{-ATPases são direcionadas para a membrana}

plasmática onde elas criam um ambiente extracelular acidífero, o qual é necessário para a metástase tumoral (Zaguilan, 1993).

As V H+-ATPases desempenham um papel importante também nos

osteoclastos, os quais são responsáveis pela reabsorção óssea (Toyomura et al., 2003). O meio ácido promovido por essas enzimas dissolve a matriz óssea e ativa proteases que participam na reabsorção óssea. Pacientes com defeitos genéticos na

isoforma da V H+-ATPase expressa na membrana plasmática de osteoclastos

desenvolvem um distúrbio conhecido como osteopetrose (Frattini et al., 2000), que é caracterizado por um aumento na densidade óssea e defeitos de desenvolvimento, devido à impossibilidade de remodelação óssea (Frattini et al., 2000).

As V H+-ATPases também estão presentes em células do cérebro, nas

vesículas sinápticas (Nelson, 1991). Em vesículas sinápticas, estão envolvidas na transdução de sinal (Graham et al., 2000; Bowman & Bowman, 2002; Inoue & Forgac, 2005; Beyenbach & Wieczorek, 2006).

No homem uma doença neurodegenerativa autossômica progressiva infantil (doença de Batten) com incidência de um para 12500 nascimentos vivos e com aproximadamente 440.000 casos notificados nos Estados Unidos esta envolvida

com problemas na atividade de H+_{-ATPases. Há evidência de que essa doença}

promove o aumento da atividade da V H+_{-ATPase na membrana plasmática.}

(Chattopadhyay et al., 2000; Padilla-Lo´ Pez & Pearce, 2006).

1.3.1 Estrutura das V H+-ATPases

Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos na tentativa de elucidar as propriedades estruturais, funcionais e regulatórias dessa enzima (Nishi & Forgac, 2002; Beyenbach & Wieczorek, 2006). Na segunda metade dos anos oitenta, a

purificação da V H+-ATPase de células animais, de plantas e de fungos revelou a

1985; Xie & Stone, 1986; Bowman et al., 1986; Randall & Sze, 1986; Arai et al., 1987; Moriyama e Nelson, 1987).

Nelson e Harvey (1999) baseados em estudos em que foi mostrada a similaridade entre F-ATPase e ATPase sugeriram atribuir cada subunidade da V-ATPase a uma das 4 partes da “máquina mecânoquímica” de Paul Boyer (proposta para a F-ATPase): (1) unidade catalítica, (2) talo, (3) gancho e (4) turbina. Essas nomenclaturas dadas para cada parte esta relacionada à forma como a enzima trabalha, sendo considerada um “bio-motor”, onde o ATP é o combustível e

transporte de H+ é a ação. O setor catalítico tem a função de ligar e hidrolisar ATP,

promovendo uma rotação momentânea do talo, que por sua vez irá rodar a turbina, o talo também tem a função de manter o setor catalítico no lugar. A turbina tem a

função de conduzir H+ através da membrana e o gancho previne a rotação da

A V H+_{-ATPase é dividida em dois domínios: o domínio catalítico hidrofílico}

(V1) com aproximadamente 570 KDa e o domínio integral de membrana hidrofóbico

(V0) com aproximadamente 260 KDa (figura 1).

O complexo V1 é usualmente descrito como um hexâmero constituído de três

cópias de cada uma das subunidades “A” e “B” (alternadas) e cópias simples das demais subunidades (Forgac, 1999a; Graham et al., 2000) (figura 1). Sabe-se que tanto a subunidade “A” como a “B” são constituintes da unidade catalítica; a subunidade “A” está envolvida na hidrólise de ATP e apresenta similaridade de

Figura 1 – Estrutura e mecanismo da V-ATPase. Modelo baseado na “máquina

mecanoquí-mica” de Paul Boyer (proposta para F-ATPase). (A) Disposição das subunidades da V-ATPase, destacando os domínios V1 (amarelo) e V0 (verde). (B) Mecanismo de rotação da V-ATPase, as subunidades rotatórias são destacadas em azul, enquanto as estacionárias são mostradas em laranja. A hidrólise de ATP causa mudanças conformacionais na subunidade A, que dirige a rotação do rotor (seta vermelha). (C) Mecanismo do transporte de prótons através de V0. Prótons (pontos vermelhos) entram no complexo V0 através de um canal hemi citoplasmático (Cipriano, 2008). Citoplasma Lúmen ou meio extracelular Citoplasma Lúmen ou meio extracelular

seqüências com a subunidade catalítica “β” da F –ATPase (Finbow & Harrison, 1997). Supõe-se que a subunidade catalítica “A” tenha atividade hidrolítica, desde

que os complexos V1 e Vo encontrem-se associados. A subunidade “B”, com função

reguladora, possui homologia com a subunidade “α” de F–ATPase. Essa subunidade possui um sítio de ligação de ATP não catalítico. A subunidade “B” pode contribuir com importantes resíduos para a função catalítica da subunidade “A” (Nelson & Harvey, 1999).

O canal de prótons, através da membrana, é formado pelo setor Vo que

contém cinco diferentes tipos de subunidades: a, c, c’, c” e d, com massa molecular de 100 KDa, 16 KDa, 17 KDa, 19-23 KDa e 36-38 KDa, respectivamente. Três dessas subunidades, c, c’ e c”, são proteolipídeos altamente hidrofóbicos (Moriyama e Nelson, 1989; Kane, 1992; Finbow e Harrison, 1997; Forgac, 1998; Nelson e Harvey, 1999; Forgac, 1999a; Graham et al., 2000; Ratajczak, 2000; Maeshima, 2001) (figura 1).

Foi proposto que o domínio V0 das V H+-ATPases, com base no estudo da

fusão de vacúolos homotípicos de leveduras, participa ativamente na fusão de membranas, independente do seu papel na acidificação promovida pela enzima. É

sugerido que V0 catalisa diretamente a mistura das duas bicamada lipídica em

virtude da sua composição altamente hidrofóbica (Peters et al. 2001).

O domínio V1 é composto pelas subunidades A e B da cabeça, que tem

massa molecular de 67 a 73 KDa e 55 a 60 KDa, respectivamente, e as subunidades do talo, C (40 a 45 KDa), D (32 a 33 KDa), E (28 a 32 KDa), F (13 a 14 KDa), G (12 a 16 KDa) e H (51 a 54 KDa) (Figura 1).

A subunidade D, constituinte do talo, parece ter um papel importante no

acoplamento do transporte de H+ _{e hidrólise de ATP (Xu & Forgac, 2000). A}

subunidade C é um polipeptídeo encontrado no talo, ela ata monômeros de actina,

durante o processo de desassociação dos complexos da V H+_{-ATPases (V}

o e V1) em

resposta a ausência de glicose (importante mecanismo de regulação da atividade da

V H+-ATPases), a subunidade C é liberada, sugerindo que esta possa ter um papel

importante neste processo (Nelson et al., 1990). A subunidade H parece ser

importante na regulação da atividade enzimática e na comunicação da V H+

-ATPases com outros processo celulares (Finbow & Harrison, 1997; Parra et al., 2000).

Acredita-se que a subunidade c (proteolipídica), constituinte da turbina, seja a principal subunidade envolvida na translocação de prótons através da membrana (Hirata et al., 1997). A subunidade d, também constituinte da turbina, está associada

ao complexo Vo da enzima e possivelmente tem função na associação dos dois

complexos da enzima (Vo e V1) (Bauerle et al., 1993).

A ausência da subunidade F em leveduras impede a associação do complexo

Vo ao V1 (Graham et al., 1994; Finbow & Harrison, 1997; Ratajaczak, 2000).

1.3.2 Diferentes formas de V H+-ATPases

Foi mostrado por nosso grupo que existem formas funcionalmente ativa em cada organela da via secretória, e que em um mesmo isolamento, a atividade da enzima pode ser diferente em cada organela (Samarão et al., 2009).

Samarão e colaboradores (2009) mostraram através de estequiometria que em levedura a razão entre as subunidades A e B de vacúolos é de aproximadamente 1:1, e que em membranas mais densas que o vacúolo essa razão muda, sendo mais alta. Eles imaginaram que modificações pós-translacionais da subunidade A e da subunidade B pode alterar a imunoreatividade e promover o

aumento da estequiometria B:A alterando a velocidade inicial (Vo) de formação do

∆pH nos diferentes compartimentos da via secretória. A modificação parece ser mais provável na subunidade A, pois sua imunoresposta foi mais irregular no RE e no Golgi. Contudo a diferença na razão estequiométrica de 1:1 entre as subunidades A e B pode ser causada por outro motivo como a ligação de diferentes subunidades do

complexo V1 com microtúbulos, enzimas glicolíticas como aldolase e proteínas do

complexo RAVE. Por exemplo, microtúbulos poderiam se ligar às subunidades B livres, bem como a enzima, todas as subunidades B dissociariam desses complexos, na presença de SDS, aumentando o número total de subunidades B em comparação com a subunidades A (Samarão et al., 2009).

Outra diferença esta relacionada a sensibilidade da enzima ao inibidor

bafilomicina, onde foi encontrado que em vesículas de membranas do RE a V H+

-ATPase apresentou maior resistência aquele inibidor (inibição de 50 % foi obtida com 4,4 nM), quando comparada com vesículas de membranas do vacúolo e do Golgi (inibição de 50 % foi obtida com 0,03 nM) (Samarão et al., 2009).

1.3.3 Regulação das V H+_-ATPases

Existem diferentes formas de regulação das V H+-ATPases. Entre elas estão

o controle da atividade enzimática pela glicose extracelular (Kane, 1995), a formação de ligações dissulfeto entre resíduos de cisteina (Forgac, 1999b), a atividade de canais aniônico para a modulação da atividade da enzima além de outros mecanismos.

1.3.3.a Regulação pela glicose extracelular

Um dos mecanismos de regulação da V H+-ATPase é a associação/

desassociação reversível dos complexos V1 e V0. O transporte de H+ feito pela V H+

-ATPase necessita de uma associação funcional dos complexos V1 e V0. A

subunidade C, do complexo V1, pode ser perdida durante o isolamento das

membranas das células não pré-incubadas com glicose (Kane, 1995) (figura 2A). É importante destacar que para avaliação de forma associada da enzima, Kane e

outros autores, usaram a capacidade do detergente E12C9 de solubilizar junto com

as subunidades do complexo V1, as subunidades do complexo V0, principalmente a

subunidade “a”. O baixo conteúdo desta subunidade (20-30%) detectado depois da solubilização das membranas das células incubadas sem glicose, foi interpretada

como indicação de que a maioria dos complexos V1 dissociou do complexo V0 e que

somente 20-30% não foram dissociados (Kane, 1995). A possibilidade que o

complexo V1 da enzima não ativada pela glicose extracelular ainda pode estar ligada

com V0 à membrana mais fracamente, é proposta pelo nosso grupo de trabalho onde

foi avaliado o conteúdo de subunidades A e B do complexo V1 em membranas

isoladas dos esferoplastos incubados com e sem glicose. Foi mostrado que a forte estimulação do transporte de prótons pela glicose extracelular não necessita de um

aumento significativo do número de complexos V1. Também foi observado que as

membranas de vacúolo isoladas de esferoplastos não pré-incubadas com glicose

podem perder a atividade do transporte de H+, ou ter essa atividade baixa, mas tem

quase o mesmo conteúdo de subunidades A e B em comparação com membranas de Golgi e/ou RE nos quais ainda apresentam atividade significativa.

1.3.3.b Formação de ligações dissulfeto

Outro mecanismo proposto para regular a atividade de V H+-ATPase in vivo

sítio catalítico das V H+_{-ATPases. Uma ligação disulfeto inibitória pode ser formada}

entre o Cys 254 e Cys 532 na subunidade A bovina, essa ligação leva à inativação

reversível da enzima (figura 2B). Em concordância com essa afirmação, a mutação

do resíduo correspondente ao Cys 254_{, em levedura leva a uma enzima que é}

resistente à oxidação. O interessante é que uma mutação na cisteina na via biosintética de leveduras pode levar a um defeito na acidificação vacuolar e esse defeito pode ser corrigido pela mutação em Cys261Val, sugerindo que a formação

de ligações disulfeto possam causar a inibição da atividade de V H+_{-ATPase in vivo}

(Forgac, 1999b).

1.3.3.c Atividade de canais aniônicos

O transporte de H+ pela V H+-ATPase é um processo eletrogênico

necessitando de um co-transporte de ânions ou efluxo de H+ em troca com outro

cátion como Ca2+_{, Na}+ _{ou K}+ _{para dissipar o potencial de membrana formado pelo H}+

durante o transporte deste íon (Kakinuma et al., 1981; Okorokov & Lichko, 1983; Arai et al., 1989). As bombas eletrogenicas protônicas são inibidas pelo produto do processo que elas catalisam, ou seja, tanto pelo potencial elétrico da membrana

formado pelo íons H+(EMH+) quanto pela diferença de potencial químico de H+, ∆pH.

Sendo que o efeito inibitório pelo EMH+ é mais significativo comparando com o efeito

do ∆pH. Importante também lembrar que a conversão de EMH+ em EM formado por

outro cátion, por exemplo K+, Na+ ou Ca2+ em resultado a troca de H+ com esses

cátions ativa a bomba protônica, ou seja a libera do controle negativo pelo EMH+

(Okorokov & Lichko, 1983; Okorokov et al., 1985). A dissipação é realizada por

ânions que entram através de um canal de Cl-, e a sua atividade é controlada por

fosforilação dependente de proteína kinase A (figura 2C). A defosforilação do canal

de Cl- pela proteína fosfatase diminui a sua condutância e a acidificação dependente

de ATP, enquanto que a fosforilação pela proteína kinase A aumenta as duas atividades (Mulberg et al., 1991).

O conhecimento da importância do canal aniônico para a modulação da

atividade de V H+-ATPase foi proposta para explicar os efeitos do Ca2+, Mn2+ e Mg2+

sobre a atividade de V H+-ATPase e formação de ∆µH+ em membranas de vacúolos

inteiros (Okorokov et al., 1985). Sugeriu-se que o Ca2+ poderia fechar o canal

aniônico. A troca do Ca2+ com o H+ (trocador de Ca2+/H+) estimulou a hidrolise de

simultaneamente a V0 e Fmax da formação de ∆pH foram diminuídas por causa de

rápida troca de prótons com Ca2+_{. O Mn}2+ _{apresentou um efeito contrário indicando}

que este pode abrir o canal aniônico, mas não pode ser transportado rapidamente

pelo trocador Mn2+/H+. O Mn2+ evitou a formação do EM e transformou este em ∆pH.

O Mg2+ pode abrir parcialmente o canal aniônico e estimular a formação de ∆pH e de

EM. Assim, cátions bivalentes como Ca2+, Mg2+ e Mn2+, na levedura S.

carlsbergensis, podem regular a atividade da V H+-ATPase e modificar a

contribuição de ∆pH e potencial de membrana em ∆µH+ e com isso regular as

atividades de transportadores secundários os quais usam o ∆pH (para trocar Ca2+,

arginina, lisina ou Zn2+) e EM (para co-transportar citrato e α-ketoglutarato)(Okorokov

et al., 1985). O gradiente eletroquímico (∆µH+) é a força impulsora resultante da combinação entre o gradiente de concentração e o gradiente elétrico para cada soluto carregado através da membrana (Alberts et al. 1999).

1.3.3.d Outras formas de regulação

A atividade das V H+-ATPase pode ser modulada pela variação da eficiência

de acoplamento entre a hidrólise de ATP e o transporte de H+_{, sendo acoplamento}

atribuído às diferentes formas da enzima. Esta diferença na eficiência do acoplamento foi proposta para explicar a diferença no pH das diferentes organelas (Nishi & Forgac, 2002; Forgac, 2007; Nelson, 2003; Kawasaki-Nishi et al., 2001) (figura 2D).

Foi proposto também que alguns lipídios específicos podem afetar a atividade

das V H+-ATPase. Mais especificamente, foi mostrado em levedura que

esfingolipídeos com um grupo acil C26 são necessários para a geração do complexo

V1 com atividade ATPásica (Chen et al., 2004). Curiosamente, vários inibidores de V

H+-ATPase, mostraram incorporar-se à bicamada lipídica e afetar a flexibilidade

estrutural da enzima (Dixon et al. 2004; Dixon et al. 2008).

As V H+-ATPases podem ser inativadas a 0 ºC, sendo que nessa temperatura

na presença de Mg2+ e ATP a atividade de ATPase pode cair 50% em apenas 10

min. Enquanto que em temperatura ambiente a mesma diminuição da atividade é

obtida em 60 min. Foi mostrado que a inativação por baixa temperatura da V H+

-ATPase resulta na dissociação do complexo V1 periférico da membrana (Moriyama & Nelson, 1989).

Alguns íons como o Mg2+_{, Ca}2+ _{e Mn}2+ _{causam mudanças na eficiência no}

acoplamento do transporte de prótons e hidrólise de ATP. O aumento na

concentração de Mg2+ livre até 1,5 mM estimulou a formação de ∆pH e de potencial

de membrana em 6,6 e 2,9 vezes, respectivamente (Okorokov et al., 1985). A

hidrólise de ATP foi estimulada em 10%. Isso significa que o Mg2+ _{livre funciona}

como fator de acoplamento do transporte de H+ e hidrólise de ATP, mas o

mecanismo do acoplamento é desconhecido (Okorokov et al., 1985).

Altas concentrações de ATP causam diminuição no acoplamento funcional

entre o transporte de H+ e a hidrólise de ATP pela V H+-ATPase, onde a hidrólise do

ATP continua a aumentar mas o transporte de H+ chega ao platô e começa a

diminuir (Arai et al., 1989).

A proteólise também causa diminuição no acoplamento, uma vez que o tratamento com baixas concentrações de tripisina promove uma perda na atividade

de transporte de H+, mesmo apresentando 50% da hidrólise de ATP (Adachi et al.,

Figura 2 – Regulação das V H+-ATPases. (A) dissociação reversível da enzima promovida pela

glicose extracelular, após o esgotamento da glicose, o complexo V1 se dissocia do complexo V0.

(B) a formação de ligações dissulfeto reversíveis entre os resíduos Cys-254 e Cys-532 da

subunidade A bloqueia o sítio catalítico em uma conformação que é incapaz de hidrolisar ATP. (C) alterações no potencial de membrana. (D) mudança na eficiência de acoplamento da bomba. (Fonte - Kevin et al., 2008 com modificações)

1.3.4 - Inibidores de V H+_-ATPases

Os inibidores mais estudados das V H+-ATPases identificados até agora são

os antibióticos Bafilomicina A1 (Bowman & Bowman, 1988) e Concanamicina A

(Dröse et al., 1993).

A Bafilomicina foi o primeiro inibidor específico de V H+_{-ATPase identificado}

(Bowman et al., 1988), alguns autores afirmam que a Bafilomicina A1 se liga ao setor

Vo da V H+-ATPase. Zhang et al. (1994) sugerem que a Bafilomicina A1 impede a

atividade do transporte de prótons, ligando-se a subunidade “a” (100 KDa). Contudo,

Bowman e Bowman (2002) mostraram que o local de ligação da Bafilomicina A1 ao

setor Vo é na subunidade “c” (16 KDa).

A bafilomicina A1 inibe a atividade da V H+ -ATPase de diferentes organismos

em concentrações muito baixas (nanomolares). A atividade da P H+-ATPase também

pode ser inibida por este antibiótico em concentrações mil vezes maiores (Bowman & Bowman., 1988).

A concanamicina A, outro inibidor das V H+-ATPases, é mais efetivo que a

Bafilomicina A1. A concentração ótima para inibição da V H+-ATPase está em torno

de um décimo da concentração de Bafilomicina A1 (Dröse & Altendorf, 1996;

Matsuoka et al., 1997). Em células vegetais a inibição ótima de V H+-ATPase por

Concanamicina A é obtida com concentrações em torno de 1 nM (Dröse & Altendorf, 1996; Matsuoka et al., 1997).

O ânion caotrópico nitrato em altas concentrações, aproximadamente 100mM

em baixa temperatura ( 0 ºC), libera cinco polipeptídeos do complexo catalítico V1

inibindo as V H+_{-ATPases, podendo chegar a 70% de inibição nesses casos,}

contudo na maior parte das condições a inibição é reversível, ou seja depois da retirada do agente a maior parte da atividade da enzima é restaurada (Moriyama & Nelson, 1989a).

2 – OBJETIVOS

2.1 - Objetivo principal

Avaliar a regulação da V H+-ATPase por meio da análise dos efeitos de

diferentes concentrações de Ca2+ e Mn2+ sobre o transporte de H+ pelas V H+

-ATPases através de membranas de diferentes organelas da via secretória e também

o efeito de diferentes concentrações de KNO3 sobre a atividade de transporte de H+

e hidrólise de ATP das V H+-ATPases em MT de Saccharomyces cerevisiae.

2.2 - Objetivos específicos

• Verificar se os efeitos do Mn2+ e Ca2+ sobre a velocidade inicial (V0) e a

amplitude máxima (Fmax) da formação do ∆pH pelas V H+-ATPases de

membranas do RE, Golgi, vacúolo e envelope nuclear energizadas pela glicose in vivo são seletivas ou não.

• Estudar o efeito de diferentes concentrações de KNO3 na hidrólise de ATP em

membranas totais energizadas ou não pela glicose extracelular, para saber se a atividade ATPásica é inibida diferente por esse ânion caotrópico.

• Avaliar o efeito de diferentes concentrações de KNO3 sobre a velocidade

inicial e a amplitude máxima de formação do ∆pH pela V H+_{-ATPase em}

membranas totais energizadas ou nao pela glicose in vivo, para saber se essas atividades são inibidas de forma diferenciada por esse ânion.

3 – MATERIAL & MÉTODOS

3.1 - Cepa de levedura

Levedura Saccharomyces cerevisiae cepa “wild type” X-2180, genótipo (MATa SUC2 mal mal gal2 CUP1). Essa cepa foi, generosamente, doada ao Prof. Ludwig Lehle (Regensburg, Alemanha) pelo Prof. Hans Rudolph (Institut für Biochemie der Universitat Stuttgart, Alemanha).

3.2 - Meio de cultura e manutenção da cepa

Foi utilizado o meio de cultura YEPD contendo: 1% de extrato de levedura (Difco ou Oxoid); 2% de glicose (Vetec); 2% de bactopeptona (Difco ou Oxoid).

O meio YEPD sólido contém adicionalmente 2% de ágar (Vetec). Os meios foram autoclavados a 0,5 atm (marcados no manômetro), 110 ºC por 30 min. O meio sólido foi vazado em placas de Petri estéreis e levado a estufa a 37 ºC durante 24 horas para a realização do controle de esterilidade. Após este procedimento, algumas colônias de S. cerevisiae (X-2180) foram retiradas com o auxílio de uma alça bacteriológica, do meio YEPD sólido de estocagem e semeadas em um novo meio YEPD sólido.

3.3 - Preparo do pré-inóculo

Algumas colônias de levedura foram retiradas do meio sólido YEPD e colocadas em 40 mL do meio YEPD líquido, de forma que a densidade ótica (DO) inicial do pré-inóculo no espectrofotômetro no comprimento de onda (λ) de 600 nm ficasse em torno de 0,1. As células cresceram a 30 ºC sob agitação constante de 250 rpm até a fase estacionária, aproximadamente por 24 horas.

3.4 - Preparo da levedura para o isolamento

O volume do pré-inóculo a ser adicionado em 200 mL do meio YEPD (Erlenmeyers de 1000) foi calculado, considerando o tempo de geração da cepa X-2180, que é de 2 horas, de acordo com a curva de crescimento. De forma que, após aproximadamente 17 horas a 30 ºC em agitação de 250 rpm, as células crescessem

até o meio da fase logarítimica. Após o crescimento celular, foi realizado o isolamento das vesículas de membranas de S. cerevisiae.

3.5 - Isolamento de membranas e fracionamento subcelular

O isolamento foi feito de acordo com o método descrito por Okorokov & Lehle (1998) com modificações. Todos os procedimentos foram realizados no gelo. Soluções, tubos, rotores e centrífugas foram previamente resfriados.

3.5.1 - Obtenção de células

As células de S. cerevisiae X-2180 foram inoculadas em meio YEPD e colocadas para crescer no shaker (250 rpm a 30 ºC) até o meio da fase logarítimica,

no caso da levedura X-2180 até aproximadamente 5 DO(600 nm/mL). A cultura de

suspensão celular foi centrifugada a 4000 x g por 6 min. a 4 ºC. Em seguida foi feito o descarte do meio e determinado o peso úmido das células.

3.5.2 - Obtenção dos esferoplastos

Para cada 1 g de peso úmido de células foi adicionado 5 mL de tampão de esferoplastos (Sorbitol 1,2 M, Tris 10 mM, pH 7.4), 1 mg do complexo de enzimas líticas (liticase) e 12 µL β−mercaptoetanol (concentração final 30 mM). Essa suspensão celular em tampão de esferoplastos foi incubada a 37 ºC sob fraca agitação.

O monitoramento cinético da hidrólise da parede celular foi realizado espectrofotometricamente no λ de 600 nm, misturando 10 µL dessa suspensão

celular em 990 µL H2O. Esse monitoramento foi feito a cada 5 ou 10 min a partir do

tempo 0 (zero) de incubação até o tempo máximo de 50 min ou até que a absorbância chegasse ao valor entre 20 a 10% do valor inicial.

O tubo onde continha a suspensão de esferoplastos foi transferido para o gelo e a reação de hidrólise da parede celular foi paralisada pela adição do Tampão de parada (“stop solution”), nas concentrações finais de 10 mM de Tris-HCl pH 7,4 e 1 mM de EDTA (solução estoque 20 vezes concentrado: Sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 200 mM pH 7,4, EDTA 20 mM), concentração final de Benzamidina 1 mM (200 mM estoque) e concentração final de PMSF 1 mM (200 mM estoque).

A suspensão de esferoplastos (~15 mL) foi adicionada sobre 30 mL da solução de Sorbitol 1,4M, Tris-HCl 50 mM pH 7,4 no tubo de centrífuga. Isto foi feito com o auxílio de uma pipeta, devagar e inclinadamente evitando a mistura da suspensão de esferoplastos com a solução colchão. Esse material foi centrifugado a 4000 x g por 6 min a 4°C. Esse passo do procedimento foi realizado com o objetivo de eliminar os resíduos de enzimas líticas.

O sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as paredes dos tubos foram secas com papel filtro para evitar que possíveis enzimas líticas atuem nos esferoplastos.

3.5.3 - Pré-incubação dos esferoplastos com glicose

Os esferoplastos foram incubados a 30 ºC por 10 min com 20 mL de solução

de incubação com glicose (glicose 100 mM, Sorbitol 1,2 M, MgSO4 3 mM, KH2SO4

10 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,2). Após a centrifugação os esferoplastos foram centrifugados a 4000 x g por 6 min a 4 °C.

3.5.4 - Obtenção de membranas totais

O sedimento obtido das duas versões foram ressuspensos em 20 mL de tampão de lise (sacarose 12,5% MOPS-KOH 20 mM pH 7,6), DTT 1 mM, 1 µg/mL, coquetel de inibidores de proteases (solução estoque do coquetel de inibidores de proteases é composto de quimiostatina, pepstatina, antipaina, leupeptina e aprotinina na concentração de 1 mg/mL cada um), benzamidina 1 mM (200 mM estoque), PMSF 1 mM (200 mM estoque).

A ressuspensão foi homogeneizada, em homogeneizador de vidro com pistilo de teflon (“potter”), com 21 ciclos completos (“strokes”). O homogeneizado foi centrifugado a 4000 x g por 6 min a 4 °C.

O sedimento foi desprezado e o sobrenadante (suspensão de membranas totais) foi transferido para o tubo da ultracentífuga e centrifugada a 45000 x g por 45 min a 4 °C.

3.5.5 - Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente de densidade de sacarose

O sedimento (membranas totais) foi ressuspenso em, aproximadamente, 1,5 mL (dependendo do conteúdo de membranas) de solução de resuspensão (10 mL do Tampão de lise, 1,17g de glicerol, 10 µL de coquetel de inibidores de proteases (1 mg/mL), 25 µL benzamidina 200 mM, 25 µL PMSF 200 mM e 4 µL DTT 500 mM. Esse volume foi adicionado gradativamente, geralmente de 300 em 300 µL misturando bem, até que o volume final determinado fosse atingido. A ressuspensão de membranas totais foi colocada no homogeneizador de vidro com o pistilo de teflon (“potter”) e homogeneizada com 7 ciclos completos (“strokes”).

Foi colocado 1,2 mL de ressuspensão de membranas totais sobre um gradiente descontínuo e simplificado de densidade de sacarose com as

concentrações de 25, 38 e 50% (cada concentração de sacarose foi preparada

peso/peso (p/p) em tampão MOPS-NaOH 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,2),

complementado com glicerol afim de que todas as bandas formadas por diferentes concentrações de sacarose tivessem a mesma osmolariade que a de maior concentração (50%). Essas concentrações foram utilizada afim de se obter bandas enriquecidas com vacúolo (25%), Golgi (38%), RE/MP (50%) e sedimento (Membranas mais densa que RE, provavelmente RE/EN/MP) foi ressuspenso em sacarose 50%. O gradiente foi centrifugado a 140000 x g por 2 horas e 45 minutos a 4 °C. O volume de membranas totais restante foi aliquotado em tubos cônicos de 1,5 mL (“eppendorfs”), congelado em nitrogênio líquido e armazenado no freezer a -70

o_{C até o momento de ser analisado.}

As vesículas de membranas, separadas em gradiente descontínuo e simplificado de densidade de sacarose, foram fracionadas pela retirada das bandas que se encontravam acima da concentração de sacarose, com o auxílio de uma pipeta, retirando apenas as bandas enriquecidas com as membranas citadas anteriormente. Após a distribuição das bandas em tubos cônicos (“eppendorfs”), sendo colocado 100 µL de membrana em cada tubo, as frações de vesículas de membranas foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas no freezer a -70 °C até o momento da análise.

3.6 - Determinação do ∆pΗ (Η (Η (Η (transporte de H+)))) (Okorokov & Lichko, 1983)

Foi registrado a formação do ∆pΗ através das membranas das organelas da

via secretória, a partir do transporte de H+ _{realizado pela V H}+-_{- ATPases ou P H}+-_-

ATPases.

Para tal, foi utilizado tampão de incubação contendo KCl 20 mM, MgSO4 2,5

mM, solução de MOPS-KOH (sacarose 12,5 %, MOPS-KOH 20 mM, pH 7,4) em quantidade suficiente para complementar 2,0 mL de volume final, 3 µL de ACMA 1 mM (dissolvido em etanol) e suspensão de vesículas de membranas com volume variando entre 10 a 30 µL, dependendo da atividade apresentada, de modo que a

amplitude máxima (Fmáx ) não ultrapasse o valor de 50%.

Após três minutos de incubação a 30 oC (ou o tempo necessário para

estabilização da fluorescência) foi acrescentado ATP 1 mM pH 7,2 e foi observado a extinção da fluorescência da cinética enzimática no espectrofluorímetro, nos λ de excitação 415 nm e emissão em 485 nm com abertura de 5 nm/10 nm. Após um tempo aproximado de 600 seg, ou o suficiente para atingir o aquilíbrio entre reação.

Foi usado NH4Cl para desfazer o gradiente protônico estabelecido.

Para calcularmos a densidade relativa de fluorescência utilizaremos a formula

(1) e para determinarmos a V0 utilizaremos a formula (2) (esquema 1) onde:

(1) ∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100;

(2) V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100

V0: velocidade inicial de formação do ∆pH;

F0: Fluorescência dependente de V0, num tempo “T”, determinada pela extrapolação

de uma reta tangente à maior inclinação inicial para o eixo do tempo;

Fmáx: fluorescência máxima (total);

T: tempo em minutos;

Feq: fluorescência de equilíbrio, determinado como fluorescência do platô que reflete

Na presença de ATP a fluorescência diminui demonstrando o transporte de

prótons e a conseqüente formação do gradiente de H+ das vesículas de membranas.

Ao atingir a fluorescência máxima e o equilíbrio, adiciona-se NH4Cl, que desfaz o gradiente protônico.

3.7 - Determinação do conteúdo de proteína (Bradford, 1976):

Transferem-se 28 mg de Comassie Brilliant Blue G 90% para um Becker, devidamente envolvido com papel alumínio a fim de evitar a entrada de luz, contendo 12 mL de etanol absoluto. Deixa-se sob agitação por 1 hora a temperatura ambiente (25-30 °C). Foi adicionado 25 mL de ácido ortofosfórico (85%) e após homogeneização completa-se o volume para 250 mL com água destilada em balão volumétrico. Filtra-se a solução em papel de filtro por três vezes. Armazena-se em um vidro âmbar.

Para determinação da curva padrão é utilizada uma solução de albumina de soro bovino na concentração 1 mg/mL, armazenada a 0°C . Medem-se volumes de 2 µL a 20 µL da solução de albumina 1mg/mL, completa-se para quantidade suficiente Esquema 1. Determinação da velocidade inicial e amplitude máxima do transporte de H+ _por

membranas de S. cerevisiae, cepa X-2180. Velocidade inicial (V0=[F0/(Ftotal*T)]*100); Amplitude

de 100 µL com água destilada e adiciona-se 1 mL da solução de Bradford, em intervalos de 30 em 30 seg. Aguarda-se exatamente 10 min, à temperatura ambiente e procede-se as leituras em espectrofotômetro no λ de 595 nm obedecendo ao mesmo intervalo utilizado anteriormente.

Determina-se o conteúdo de proteína utilizando-se entre 5 e 15 µL de suspensão de membranas, completando-se o volume para 100 µl com água destilada e adicionando-se 1 mL da solução de Bradford em intervalos de 30 seg. Aguardam-se 10 min à temperatura ambiente e procede-se as leituras em espectofotômetro no λ de 595 nm obedecendo ao mesmo intervalo de tempo utilizado anteriormente. Para os valores do conteúdo de proteína que ficaram fora da faixa de linearidade, ou seja, nas extremidades da curva padrão, os seguintes procedimentos foram realizados: (1) ou foi aumentado o conteúdo de membranas (2) ou foram diluidas as membranas com água destilada, a fim de que essas leituras permanecessem, preferencialmente, entre os valores médios na curva padrão.

3.8 - Determinação da hidrólise de ATP

A atividade ATPásica foi medida pelo aumento da quantidade de fosfato

inorgânico (Pi) resultante da hidrólise de ATP.

O preparo dos ensaios de hidrólise de ATP (ATPase total) foi feita sob refrigeração (gelo). Nos tubos de ensaio foram colocados 10 µL de suspensão de

vesículas de membranas e 230 µL da solução D (MES-KOH 30 mM, MgSO4 3,75

mM, molibdato de amônio 262 µM pH 6,5 – para obter as concentrações finais de

MES 23 mM, MgSO4 2,1 mM e molibdato de amônio 192 µM), 10 µL de ATP-NaOH

50 mM pH 7,2 (ATP 1,62 mM concentração final) e 50 µL de água destilada necessária para completar 300 µL. O meio de reação foi incubado a 30 °C por 30 min. Após o tempo de incubação os tubos foram colocados no gelo novamente, foi completado o volume da reação de hidrólise para 1 mL com água destilada gelada, afim de parar a reação, e adicionou-se 2 mL da solução C (mistura 100:1 da solução A e a solução B, que deve ser preparada próximo à adição desta na reação (solução A:

0,5% molibdato de amônio, 0,5% SDS, 2% H2SO4; solução B: 10% ácido ascórbico). A

solução foi incubada por 10 min, em banho maria a 30 °C, seguida imediatamente da leitura da absorbância no espectrofotômetro no λ de 750 nm.

4 – RESULTADOS

4.1 Efeito do Ca2+ _{sobre o transporte de H}+ _{realizado pela V H}+_-ATPase

Analisamos o efeito do Ca2+ sobre a atividade das V H+-ATPases em relação a formação do ∆pH em populações de vesículas de membranas ativadas por glicose, derivadas das organelas da via secretória e separadas em gradiente de densidade de sacarose (Figuras 3 e 4). Sendo que nessas análises foram usadas as

concentrações: 0,1; 0,5 e 1 mM de Ca2+.

Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de Ca2+ _{(MES), sobre a Fmàx, em frações} enriquecidas pelas membranas das organelas da via secretória, energizadas pela glicose in

vivo. Os valores em porcentagem foram aproximados e foram calculados levando em consideração

que os valores obtidos nas análises sem Ca2+ e com K2SO4 em um determinado compartimento

seria de 100% para o mesmo. A concentração de sacarose em que as frações foram recolhidas no gradiente foram: vacúolo=25%, Golgi=38%, RE=50% e membranas mais densas=pellet. Todas as membranas foram pré-incubadas com 100 µM de vanadato para inibir P H+-ATPase. Média de 3 experimentos. 0 200 400 600 800 1000 1200

vacúolo Golgi RE / MP membranas

mais densas que o RE/MP F m áx /m g d e p ro te in a KCl 0mM de Ca + K2SO4 0,1mM de Ca + K2SO4 0,5mM de Ca + K2SO4 1mM de Ca + K2SO4 13 0% 12 5% 40 % 80 % 10 0% 12 0% 11 5% 10 0% 90 % 13 0% Fm ax ( u n id ad e re la ti va d e fl u o re sc ên ci a) / o rg an el a 16 0% 90 % 93 % 10 0% 10 0% 90 % 10 0% 90 % 10 0% 10 5%

Vacúolo Golgi RE / MP Membranas

mais densas que o RE/MP

Em relação à Vo de formação do ∆pH pelas V H+-ATPases, verificamos que

em todos os compartimentos ela foi inibida de forma dependente ao aumento da

concentração de Ca2+_{. A diminuição da V}

0 em nosso experimento foi de

aproximadamente: 1,7 vezes para as vesículas de membranas vacuolares, 2 vezes para o Golgi, 50 vezes para o RE e de 1,4 vezes para vesículas de membranas mais

densas, sendo esses resultados encontrados na presença de 1 mM de Ca2+_{. Esse}

efeito é observado também quando a concentração de Ca2+ _{foi 0,5 mM e em ambas}

concentrações ele foi mais evidente em membranas do RE (tabela 1). Sendo que no

vacúolo e no Golgi por 0,5 mM foi próxima a obtida com 1 mM de Ca2+ (tabela 1).

Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de Ca2+ _{(MES), na V}

o de formação do ∆∆∆∆pH, em frações enriquecidas pelas membranas das organelas da via secretória, energizadas pela glicose in vivo. Os valores em porcentagem foram aproximados e foram calculados levando em

consideração que os valores obtidos nas análises sem Ca2+ _{e com K}

2SO4 em um determinado

compartimento seria de 100% para o mesmo. A concentração de sacarose em que as frações foram recolhidas no gradiente foram: vacúolo=25%, Golgi=38%, RE=50% e membranas mais densas=pellet. Todas as membranas foram pré-incubadas com 100 µM de vanadato para inibir P H+ -ATPase. Média de 3 experimentos.

0 200 400 600 800 1000 1200

vacúolo Golgi RE / MP membranas

mais densas que o RE/MP V o /m g d e p ro te in a KCl 0mM de Ca + K2SO4 0,1mM de Ca + K2SO4 0,5mM de Ca + K2SO4 1mM de Ca + K2SO4 29 0% 50 % 15 0% 70 % 60 % 10 0% 55 % 55 % 10 % 10 0% 90 % 15 5% 70 % 70 % 15 0% 10 0%

Vacúolo Golgi RE / MP Membranas

mais densas que o RE/MP 10 0% 10 0% 2% Vo ( ∆∆∆∆ p H / m in .) 10 0%

Em relação à Fmáx de formação do ∆pH (figura 3), observamos que apenas no

Golgi e no RE ocorreu uma queda com o aumento da concentração de Ca2+, e essa

diminuição foi bem menos evidente do que a obtida para a Vo (figura 3).

Observamos que 1 mM de Ca2+ inibiu a V0 de formação de ∆pH na seguinte

ordem (comparando com V0 na presença de Cl-): RE (75 vezes), Golgi (5,8 vezes),

Vacúolo (2,6 vezes) e membranas mais densas (2 vezes). A inibição da enzima

promovida pelo Ca2+ ocorre de forma diferenciada nas organelas da via secretória de

Saccharomyces cerevisiae, A mesma tendência de inibição da acidificação do lúmen

de organelas pelo Ca2+ observamos para a formação da Fmáx. Interessante que em

células HeLa o pH do lúmen do RE é quase igual ao pH do citosol (pH 7,1) e é um pouco baixo no Golgi (pH 6,2-7,0) e finalmente atinge valores mais baixos em lisossomos (pH 5,0) (Wu et al., 2000; Paroutis et al., 2004).

4.2 Efeito do Mn2+ _{sobre o transporte de H}+ _{realizado pela V H}+_-ATPase

Em seguida analisamos o efeito do Mn2+ sobre a atividade das V H+-ATPases

em relação a formação do ∆pH em populações de vesículas de membranas ativadas, derivadas das organelas da via secretória e separadas em gradiente de densidade de sacarose (Figuras 5 e 6). Sendo que nessas análises usamos as

concentrações: 0,1; 0,5 e 1 mM de Mn2+. 0 mM Ca2+ ( Ca2+ não foi adicionado) 0,1 mM Ca2+ 0,5 mM Ca2+ 1 mM Ca2+ Vacúolo 1 1 1,8 1,7 Golgi 1 1,4 1,8 2 RE 1 1,4 10 50 Sedimento 1 1 1,1 1,4

Tabela 1. Inibição da Vo de formação de ∆pH pela V H+-ATPase através de vesículas de

membranas de organelas da via secretória, dependente da concentração de Ca2+_{. Os dados em}

porcentagem da figura 4 para essas concentrações de Ca2+ foram divididos por 100%, dando a quantidade de vezes que a Vo foi inibida.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

vacúolo Golgi RE / MP membranas

mais densas que o RE/MP F m áx /m g d e p ro te in a KCl 0mM de Mn + K2SO4 0,1mM de Mn + K2SO4 0,5mM de Mn + K2SO4 1mM de Mn + K2SO4 Fm ax ( u n id ad e re la ti va d e fl u o re sc ên ci a) / o rg an el a

Figura 5. Efeito de diferentes concentrações de Mn2+, sobre a Fmàx, em frações enriquecidas pelas membranas das organelas da via secretória, energizadas pela glicose

in vivo. Os valores em porcentagem foram aproximados e foram calculados levando em

consideração que os valores obtidos nas análises sem Mn2+ e com K2SO4 em um determinado

compartimento seria de 100% para o mesmo. A concentração de sacarose em que as frações foram recolhidas no gradiente foram: vacúolo=25%, Golgi=38%, RE=50% e membranas mais densas=pellet. Todas as membranas foram pré-incubadas com 100 µM de vanadato para inibir P H+-ATPase. Média de 3 experimentos.

10 0% 11 5% 15 0% 13 0% 10 0% 80 % 80 % 10 0% 65 % 70 % 10 0% 80 % 100%

Vacúolo Golgi RE / MP Membranas

mais densas que o RE/MP 11 5% 15 0% 75 % 13 0% 60 % 12 0% 12 0%

Apenas as frações de vesículas de membranas do vacúolo e membranas

mais densas apresentaram uma Fmáx maior na presença de 1 mM de Mn2+ do que as

obtidas na presença de KCl, enquanto nas vesículas de membrana do Golgi e do RE

a Fmáx foi menor do que o controle sem Mn2+ _{(Figura 5). Esses dados mostram que}

o aumento da Fmáx no vacúolo estão em concordância com os dados obtidos por Okorokov et al. (1985).

Nós observamos que o Mn2+ _{estimulou a V}

o em todas as organelas. Como

podemos observar na figura 6, no vacúolo com a concentração mais baixa de Mn2+

(0,1 mM) o ∆pH foi 2,8 vezes superior ao obtido com KCl, já no Golgi e no RE a

concentração intermediária de Mn2+ (0,5 mM), promoveu o aumento na V0 de 1,2 em

ambos, em relação ao obtido na presença de KCl, no caso das membranas mais

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

vacúolo Golgi RE / MP Membranas

mais densas que o RE/MP V o /m g d e p ro te in a KCl 0mM de MnSO4 + K2SO4 0,1mM de MnSO4 + K2SO4 0,5mM de MnSO4 + K2SO4 1mM de MnSO4 + K2SO4

Figura 6. Efeito de diferentes concentrações de Mn2+, na Vo de formação do ∆∆∆∆pH, em

frações enriquecidas pelas membranas das organelas da via secretória, energizadas pela glicose in vivo. Os valores em porcentagem foram aproximados e foram calculados levando em

consideração que os valores obtidos nas análises sem Mn2+ e com K2SO4 em um determinado

compartimento seria de 100% para o mesmo. A concentração de sacarose em que as frações foram recolhidas no gradiente foram: vacúolo=25%, Golgi=38%, RE=50% e membranas mais densas=pellet. Todas as membranas foram pré-incubadas com 100 µM de vanadato para inibir P H+-ATPase. Média de 3 experimentos.

10 0% 14 50 % 24 0% 29 0% 10 0% 26 0% 15 0% 27 5% 12 0% 210% 17 5% Vo ( ∆∆∆∆ p H / m in .) 20 0% Golgi RE / MP Membranas mais densas que o RE/MP 45 5% 18 0% Vacúolo 66 5% 11 30 % 10 0% 24 0% 19 0% 10 0%