Fredson Costa Serejo
Precondicionamento Isquêmico:
Caracterização e mecanismo de ação do
fator cardioprotetor endógeno
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 8
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Serejo, Fredson Costa
“
Precondicionamento isquêmico: Caracterização e mecanismo de ação do fator cardioprotetor endógeno”. Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho / 2008.xi / p.111
Tese: Doutorado e m Ciências 1. Infarto
2. Isquem ia e repe rfusão
3. Precondicionamento isquêmico 4. Purif icação .
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho sob orientação dos professores Antônio Carlos Campos de Carvalho e Jose Hamilton Matheus Nascimento e contou com o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq).
“Para alcançar a verdade é preciso, uma vez na vida, desfazer-nos de todas as opiniões que recebemos e reconstruir de novo e desde os fundamentos, todos os sistemas dos nossos conhecimentos”.
Dedico esta tese aos meus pais Francisco e Lavita por me darem todo o apoio necessário à escolha da minha carreira e todas as dificuldades que vieram com ela. Obrigado pelo amor, carinho e compreensão.
Agradeço a Deus a oportunidade de ter colocado em meu caminho essa pessoa tão maravilhosa que é a Paula. Você me trouxe a alegria, a certeza de um futuro próspero e duradouro, a união com minha família, a força nos momentos de desespero, a simplicidade dos atos, a gratidão do cuidar de todos os dias e o amor incondicional. A minha noiva de hoje e futura mulher amanhã o meu muito obrigado por estes últimos meses de luta nessa tese...
RESUMO
O precondicionamento isquêmico do coração com pequenos períodos de isquemia subletal retarda o aparecimento de necrose tecidual durante um subseqüente insulto isquêmico letal. A proteção cardíaca pode ser ativada por transferência do efluente coronariano de corações isquemicamente precondicionados para corações não-precondicionados. Este estudo teve como objetivo testar a hipótese que o efluente precondicionado de corações de ratos purificados com cartuchos de Sep-Pak C-18 podem induzir cardioproteção remota contra injúrias de isquemia/reperfusão através da ativação da via de sinalização da proteína kinase C, canais de potássio sensíveis a ATP e das ciclooxigenases. Corações isolados de ratos foram sujeitos a 30 minutos de isquemia e 60 minutos de reperfusão. As injúrias miocárdicas de isquemia/reperfusão e a proteção do precondicionamento foram medidas através da recuperação da função contrátil ventricular pós-isquêmica, incidências de arritmias de reperfusão e área de infarto.
A área de infarto de corações precondicionado foi de 17±2% versus 37±1% dos corações controle (P<0.001). Corações perfundidos com efluente precondicionado fresco tiveram área de infarto de 16±3% versus 36±1% em corações tratados com efluente não-precondicionado. O efeito cardioprotetor foi perdido quando o efluente foi deixado a temperatura ambiente durante 24 horas (área de infarto, 40±3%) ou aquecido a 70oC (26±4%, P<0.05) ou 100oC (39±1%, P<0.001). A liofilização do efluente manteve a atividade cardioprotetora estável por até 30 dias, e sua purificação na coluna Sep-Pak C-18 resultou em uma fração hidrofóbica que reduziu a área de infarto a 17±2% versus 38±2% para a fração hidrofílica. Cheleritrina, glibenclamida, 5-HD e indometacina foram capazes de inibir os efeitos benéficos do precondicionamento ou da fração hidrofóbica. Mais ainda, a análise cromatográfica da fração hidrofóbica pré-tratada com indometacina mostrou redução do número de picos no cromatograma, evidenciando a participação das ciclooxigenases como ativadores da via de precondicionamento isquêmico. Concluimos que os fatores liberados no efluente coronariano precondicionado são substâncias hidrofóbicas termolábeis com peso molecular maior que 3.5 kDa, atuando através da ativação da via de sinalização de PKC, canais de potássio sensíveis a ATP e da via das ciclooxigenases.
ABSTRACT
Ischemic preconditioning of the myocardium with short episodes of sublethal ischemia delays the onset of necrosis during subsequent lethal ischemic insult. Myocardial protection can be achieved by transfer of coronary effluent from ischemically preconditioned to non-preconditioned hearts. This study was designed to test the hypothesis that preconditioned effluent from rat hearts purified by Sep-Pak C-18 cartridges could induce remote cardioprotection against ischemia/ reperfusion (I/R) injury through the activation of protein kinase C, ATP-sensitive potassium channels and cyclooxygenase signaling pathway. Buffer-perfused rat hearts were subject to 30 min ischemia and 60 min reperfusion. The myocardial I/R injury and preconditioning protection were assessed by postischemic contractile function recovery, reperfusion arrhythmias and infarct size.
Infarct size was 17±2% in preconditioned versus 37±1% in control hearts (P<0.001). Hearts perfused with fresh preconditioned effluent had infarct sizes of 16±3% versus 36±1% in hearts treated with non-preconditioned effluent. The cardioprotective effect was lost when the effluent was left at room temperature during 24 h (infarct size, 40±3%) or heated to 70oC (26±4%, P<0.05) or 100oC (39±1%, P<0.001). The lyophilized effluent was stable for 30 days, and its purification in a Sep-Pak C-18 column resulted in a hydrophobic fraction that reduced the infarct size to 17±2% versus 38±2% for the hydrophilic fraction. Chelerythrine, glybenclamide, 5-HD and indomethacin were able to abrogate the beneficial effects of preconditioning or hydrophobic fraction. Moreover, chromatographic analysis of hydrophobic fraction with reduction of peaks in presence of indomethacin demonstrated the participation of cyclooxygenases as preconditioning triggers. In conclusion, the cardioprotective factors released in the coronary effluent by IPC are thermolabile hydrophobic substances with molecular weights higher than 3.5 kDa, acting through PKC activation, ATP-sensitive potassium channels and cyclooxygenase signaling pathway.
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP – adenosina trifosfato
AMPc –adenosina monofosfato cíclico
dP/dt – derivada da pressão sobre o tempo (é um índice que mede a contração e o relaxamento)
ECA – enzima conversora de angiotensina NO – óxido nítrico
NOS – óxido nítrico sintase
eNOS – óxido nítrico sintase endotelial nNOS – óxido nítrico sintase neuronal iNOS – óxido nítrico sintase induzida DNA – ácido desoxiribonucleico PLC – fosfolipase C
PLD – fosfolipase D DAG – diacilglicerol PKC – proteína cinase C
PMA – acetato de forbol miristato
MAPK – proteínas cinases ativadas por mitose ERK – sinal extracellular regulado por cinase JNK – c-Jun NH2 -terminal cinase
HSP – proteína de choque térmico KATP – canal de potássio sensível a ATP 5HD – 5-hidroxidecanoato
TTC – cloridrato de trifeniltetrazólio PMSF – fenilmetil sulfonil fluoreto
EDTA – ácido etileno diaminotetracético SDS –dodecilsulfato de sódio
PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência
ÍNDICE
Pág.
INTRODUÇÃO 1
Principais Ativadores do Precondicionamento Isquêmico 5
Adenosina 5 Opióides 7 Bradicinina 9 Óxido Nítrico 11 Radicais Livres 13 Prostaglandinas 14
Mediadores do Precondicionamento Isquêmico 16
Proteína G e Fosfolipases 16
Proteína Cinase C 18
Tirosina Cinase 20
MAP Cinases 20
Efetores Finais do Precondicionamento Isquêmico 22
Proteínas de Choque Térmico 22
Canal de Potássio Sensível a ATP (KATP) 22
Poro de Transição de Permeabilidade da Mitocôndria 24
Precondicionamento Remoto “à Distância” 25
OBJETIVOS
27
MATERIAL E MÉTODOS 28
Preparação dos Corações Isolados 28
Eletrocardiograma 29
Determinação do Tamanho da Área de Infarto 30
Medida da Pressão Desenvolvida pelo Ventrículo Esquerdo 31
Protocolo Experimental de Isquemia/Reperfusão 31
Protocolo Experimental do Precondicionamento Isquêmico 32
Grupos experimentais 33
Atividade Proteolítica do efluente precondicionado 34
Inativação Térmica do Efluente Coronariano Precondicionado 36
Concentração do Efluente Precondicionado 38
Purificação com Coluna Adsorvente de Fase Reversa C-18 39
Avaliação das Arritmias 42
Protocolos de estudo das vias de sinalização ativadas pelo efluente precondicionado
43
Análise estatística 49
RESULTADOS
50
Efeito cardioprotetor do efluente coronariano precondicionado fresco
50 Conservação do efeito cardioprotetor do efluente precondicionado fresco
por inibidores de proteases
51
Termolabilidade da atividade cardioprotetora do efluente coronariano precondicionado
52
Extrato Concentrado do Efluente Precondicionado 54
Purificação do fator cardioprotetor por cromatografia de fase reversa 55 Efeito do efluente precondicionado sobre as arritmias de reperfusão 56 Efeitos de bloqueadores de canais KATP na cardioproteção induzida por
precondicionamento isquêmico ou tratamento com efluente precondicionado
61
Efeito da cheleritrina na cardioproteção induzida por precondicionamento isquêmico ou tratamento com efluente precondicionado
64 Efeito da indometacina na cardioproteção induzida por precondicionamento
isquêmico ou tratamento com efluente precondicionado
67
DISCUSSÃO 71
CONCLUSÃO 82
BIBLIOGRAFIA 83
A doença cardiovascular é a principal causa de morte nos países ocidentais. Em 2008, estima-se que 770.000 americanos tenham um ataque do coração com um custo na ordem de 448.5 bilhões de dólares (ROSAMOND et al., 2008). No Brasil, entre as causas de morte definidas, as doenças do aparelho circulatório foram a primeira causa de óbito atingindo 285.543 pessoas em 2004, representando 32,5% do total (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Os principais fatores de risco para as doenças coronarianas são a hipercolesterolemia, hipertensão, tabagismo, diabetes mellitus e o aumento dos níveis de homocisteína sérica que através de diferentes mecanismos causam injúria e disfunção endotelial. O infarto do miocárdio ocorre por obstrução da artéria coronária durante o processo de aterosclerose, o que leva a formação de trombos devido à agregação plaquetária, causando uma isquemia com redução ou interrupção do aporte sanguíneo. O aumento gradativo da severidade e duração da isquemia acaba levando a necrose celular (OPIE, 1998).
A interrupção do fluxo sangüíneo para uma região do tecido e conseqüente redução do suprimento de oxigênio e nutrientes, junto com o acúmulo de produtos residuais, inicia uma fase de injúria irreversível. A restauração do fluxo sangüíneo é necessária para salvar o tecido, mas não é inteiramente um procedimento benigno (WILLIAMS, 1996). A rápida reperfusão está associada a uma série de manifestações como arritmias de reperfusão, disfunção contrátil do miocárdio (stunning), geração de radicais livres, aumento da sobrecarga de cálcio e infiltração de neutrófilos que levam a uma exacerbação da injúria tecidual (PARK & LUCCHSI, 1999).
Tal situação leva a uma debilitação da função contrátil do ventrículo e diminuição do débito cardíaco. As arritmias são muito comuns durante o infarto do miocárdio e constituem a principal causa de morte (THÉROUX, 1999).
Identificar técnicas que minimizem os efeitos deletérios da isquemia do miocárdio e diminuam a extensão do infarto depois da oclusão coronariana tem sido o objetivo de muitos pesquisadores. Em 1986, MURRY et al., baseados em estudos sobre as adaptações metabólicas cardíacas depois de repetidos estresses de isquemia (VERDOUW et al., 1979; REIMER et al., 1986), observaram que breves episódios de isquemia e reperfusão, em corações de cães, antes de um período de isquemia sustentada de 40 minutos, protegiam o miocárdio. Essa proteção se dava por uma menor depleção de ATP após o período de isquemia e uma redução da área de infarto de 75% em relação ao grupo controle o qual não era submetido aos ciclos de isquemia e reperfusão (MURRY et al., 1986). Este fenômeno foi chamado de precondicionamento isquêmico.
Os ciclos de isquemia e reperfusão durante o precondicionamento isquêmico não produzem um efeito dose-dependente (LI et al., 1990) e múltiplos ciclos aparentemente promovem perda da eficácia do precondicionamento em coelhos (ILIODROMITIS et al., 1997). Além dos ciclos, a efetividade do precondicionamento é também influenciada pela duração dos períodos, variando de 2 a 15 minutos, sendo efetivo na maioria das espécies com períodos de 5 minutos (DOWNEY et al., 1994).
Existem duas fases de precondicionamento isquêmico. A primeira fase, chamada de clássica ou aguda (“primeira janela de proteção”), tem início logo após o coração ser submetido ao ciclo de precondicionamento isquêmico tendo duração de 30 minutos a 2 horas. A liberação de substâncias cardioprotetoras durante o
precondicionamento isquêmico promove proteção do miocárdio contra lesões de isquemia e reperfusão. Este fenômeno é descrito em várias espécies animais, tais como rato (LIU & DOWNEY, 1992), coelho (LIU et al., 1991), porco (VAHNLHAUS et al., 1998) e no homem (TOMAI et al., 1999).
Em 1993, foi descrito que o precondicionamento isquêmico pode induzir também uma proteção tardia. MARBER et al. (1993) demonstraram que quando corações de coelhos eram submetidos ao ciclo de precondicionamento isquêmico e, somente após 24 horas, era realizada a isquemia global sustentada de 30 minutos, estes animais apresentavam uma redução da área de infarto de 44% em relação aos animais controles. Este fenômeno foi denominado de precondicionamento tardio ou retardado (“segunda janela de proteção”), sendo a duração da proteção de 12 a 72 horas (KOURTHUIS, 1998). Os mecanismos envolvidos nesse tipo de proteção incluem o aparecimento de novas proteínas, alteração da atividade protéica por mecanismos pós-traducionais, síntese de proteínas de choque térmico, e aumento da atividade de enzimas antioxidantes (MILLAR et al., 1996).
A mensuração da área de infarto, expresso como porcentagem da zona de risco, foi originalmente o principal método de evidenciar a proteção do miocárdio pelo precondicionamento clássico (MURRY et al.,1986). Em algumas espécies, o coração tem circulação colateral que, em situações de oclusão da artéria coronária principal, fornece certo nível de irrigação do tecido não permitindo o aparecimento de um infarto tão pronunciado. Essa oposição causa uma relação inversa entre fluxo colateral e área de infarto. Em animais com pré-formação colateral, tal como em cães, esta deve ser calculada (REIMER et al., 1979). O tamanho do infarto é comumente medido por coloração do tecido viável com sais de trifeniltetrazólio. O sal de trifeniltetrazólio reage com NADH e enzimas desidrogenases corando o tecido
(KLEIN et al., 1981). Células mortas perdem enzimas e cofatores devido a rompimento da membrana plasmática e não se coram. Utilizando esse método tem sido demonstrada a limitação da área de infarto pelo precondicionamento clássico em todas as espécies testadas.
A recuperação pós-isquêmica da função contrátil é outra metodologia comumente usada como marcador dos efeitos do precondicionamento isquêmico em corações isolados de mamíferos (CAVE & HEARSE,1992). Contudo, a recuperação da função mecânica depois do insulto isquêmico é influenciada por uma combinação do número de cardiomiócitos sobreviventes e o grau com que eles estão atordoados. Além disso, a recuperação funcional promovida pelo precondicionamento é muito menos pronunciada em algumas espécies que outras. Prova disso, GELPI et al. (2002) propôs que o efeito anti-atordoamento em ratos pode ser resultado da alteração do metabolismo da adenosina. A adenosina liberada durante a isquemia é convertida a inosina e depois em hipoxantina. No início da reperfusão, a hipoxantina é oxidada pela xantina oxidase produzindo radicais livres que levam ao atordoamento (BROWN et al., 1988). GELPI et al. (2002) demonstraram que o alopurinol, inibidor da xantina oxidase, melhora a função pós-isquêmica evidenciando os efeitos do precondicionamento em ratos, o que não acontece em coelhos que naturalmente apresentam uma menor expressão de xantina oxidase.
Tem sido demonstrado, também, que o precondicionamento isquêmico altera a incidência de arritmias induzidas por isquemia e reperfusão em cães (VEGH et al., 1990) e ratos (SHIKI & HEARSE, 1987). A geração de radicais livres tem sido demonstrada como um dos fatores responsáveis pela gênese das arritmias no coração (KUSAMA et al., 1990). DRIAMOV et al. (2004) em um recente estudo mostraram que o precondicionamento isquêmico protege contra as arritmias
ventriculares induzidas por isquemia e reperfusão através da ativação de receptores B2 de bradicinina e subseqüente abertura dos canais de potássio sensíveis a ATP sarcolemais.
Nos últimos anos, um grande número de pesquisadores tem explorado o fenômeno de proteção tecidual pelo precondicionamento isquêmico através da utilização de miméticos farmacológicos, objetivando uma possível utilização no cenário clínico. Até o momento desta revisão, aproximadamente 5.000 artigos tinham sido publicados abordando o tema “precondicionamento isquêmico”.
Principais Ativadores do Precondicionamento Isquêmico
Adenosina
O aumento da formação de adenosina no coração ocorre durante a isquemia devido ao desbalanço entre o suprimento de oxigênio e a sua demanda e a formação de ATP e seu consumo (BARDENHEUER & SCHRADER, 1986). A adenosina interage com receptores de membrana sarcolemais produzindo diferentes efeitos. Existem quatro subtipos de receptores de adenosina: A1, A2A, A2B e A3. Estes receptores foram inicialmente definidos farmacologicamente baseados no efeito (estimulatório ou inibitório) de sua ativação sobre a atividade da adenilato ciclase e de suas interações seletivas com agonistas e antagonistas (MUBAGWA & FLAMENG, 2001).
A adenosina produz inúmeras ações no sistema cardiovascular. Por exemplo, produz vasodilatação por interação com receptor A2A, em células musculares lisas, diminui a freqüência cardíaca por interação com receptores A1 no nodo sino atrial, e causa inotropismo negativo por interação com receptores A1 em cardiomiócitos ventriculares. Todas essas ações da adenosina são benéficas no miocárdio isquêmico por melhorar o desbalanço da demanda e suprimento de oxigênio (FRYER et al., 2002).
Em 1991, foi demonstrada, pela primeira vez, a ação da adenosina induzindo uma resposta adaptativa de cardioproteção. LIU et al. (1991 b) mostraram que a cardioproteção induzida pelo precondicionamento isquêmico pode ser inibida por administração de um antagonista não seletivo do receptor de adenosina, sugerindo que a adenosina produzida durante o precondicionamento atua em receptores de superfície para induzir uma resposta adaptativa. Além disso, estes autores demonstraram que agonistas seletivos do receptor A1 levam a indução de cardioproteção similar ao precondicionamento isquêmico.
Estudos subseqüentes usando agentes farmacológicos seletivos para subtipos de receptores de adenosina vêm demonstrando que os receptores A1 (THORNTON et al., 1992) e A3 (mas não A2) estão envolvidos no processo inicial de sinalização do precondicionamento isquêmico (LIU et al., 1994 a).
Embora adenosina e fármacos agonistas dos receptores de adenosina são os ligantes cardioprotetores mais extensamente estudados, não existe um consenso definido de como os receptores de adenosina e seus subtipos contribuem para a cardioproteção durante as fases de isquemia ou reperfusão. Provavelmente, inúmeros fatores, tais como tipo de espécie, dose, tempo, número de ciclos de precondicionamento e subtipo de receptores ativados por agonistas, contribuem
para as inúmeras variações entre os estudos, pois afetam a quantidade de adenosina liberada na isquemia, a afinidade do receptor ou outro mecanismo ainda não identificado (GROSS & GROSS, 2006).
Apesar do uso da adenosina como agente terapêutico ser capaz de mimetizar os efeitos do precondicionamento, os fármacos agonistas dos receptores de adenosina produzem efeitos hemodinâmicos indesejados, incluindo bradicardia e hipotensão, que limitam o seu uso clínico.
Opióides
Tradicionalmente, a importância dos agonistas dos receptores opióides tem sido focada no tratamento da dor (BARRON, 2000). Contudo, o coração pode ser modulado por opióides em estados fisiológicos e patofisiológicos (PUGSLEY, 2002).
A primeira evidência da importância dos receptores opióides, como um componente da indução do precondicionamento, foi apresentada por SCHULTZ et al. (1995). Estes autores demonstraram que naloxona, um antagonista não específico dos receptores opióides, era capaz de inibir o efeito do precondicionamento isquêmico no coração de rato. Outra evidência foi que infusões de morfina na ausência do precondicionamento isquêmico induzem cardioproteção em corações de ratos in vivo (SCHULTZ et al., 1996).
SCHULTZ et al. (1998) demonstraram que o efeito do precondicionamento isquêmico na diminuição da área de infarto é mediado pelo receptor opióide do tipo d1, mas não por d2, m ou k. O receptor d1 está acoplado à proteína G e sua ativação leva a abertura dos canais de potássio sensíveis a ATP que estão envolvidos no processo de cardioproteção. MIKI et al. (1998) demonstraram que em coelhos os
opióides induzem cardioproteção via ativação da proteína cinase C. A cardioproteção induzida pelos opióides é mediada por mecanismos de ação preferencialmente periféricos (CHIEN et al., 1999; SCHULTZ et al., 1997), e pode estar relacionada à habilidade dos opióides atenuarem a ativação dos neutrófilos (WANG et al., 1998 a) que contribuem para a morte celular após a reperfusão do miocárdio.
FRYER et al. (2000) mostraram que o agonista opióide TAN-67 tem atividade antiarrítmica e inibe completamente a incidência de fibrilação ventricular durante a oclusão coronariana em ratos. Similarmente, PEPE et al. (1997) demonstraram que leucina-encefalina, um agonista de receptor opióide d, inibe a estimulação da adenilato ciclase pelo adrenoreceptor b1 diminuindo os níveis de AMPc que é um dos mediadores das arritmias induzidas em corações de porcos isquêmicos (PODZUWEIT et al.,1981).
PEART & GROSS (2004 a) encontraram que a indução de cardioproteção com morfina em camundongos era devido ao aumento da liberação de substância P endógena, calcitonina e adenosina. Estimulação de receptores de opióides tipo d1 induz cardioproteção tardia possivelmente através da ativação de canais mitocondriais de K sensíveis a ATP (SCHULTZ & GROSS, 2001). Tem sido demonstrado que o anestésico propofol age como cardioprotetor contra o estresse oxidativo e as injúrias de reperfusão (KO et al., 1997). JAVADOV et al. (2000) mostraram que esta droga confere uma significante proteção contra a isquemia global normotérmica e durante a cardioplegia por frio, através de uma diminuição da atividade do poro de permeabilidade transitória da mitocôndria.
A ação dos opióides na cardioproteção tem sido investigada em humanos. TOMAI et al. (1999) observaram que repetidas insuflações do balão durante a
angioplastia conferem cardioproteção com melhora das funções cardiovasculares e que a infusão de naloxona, um inibidor dos receptores opióides, é capaz de inibir a proteção. Apesar disso, o uso clínico dos opióides é limitado pois eles têm um alto potencial de causar dependência, abuso e depressão respiratória.
Bradicinina
As cininas participam do processo de regulação humoral do fluxo sanguíneo no sistema circulatório. São pequenos polipeptídios que se originam da clivagem das alfa2-globulinas do sangue e dos líquidos orgânicos. Tipos diferentes de enzimas proteolíticas podem clivar globulinas originando as cininas. Uma dessas enzimas, de particular importância, é a calicreína, presente no sangue e nos líquidos orgânicos em forma inativa. Conforme a calicreína é ativada, passa a imediatamente atuar sobre a alfa2-globulina para liberar uma cinina, chamada de calidina, que é, então, convertida em bradicinina. Uma vez formada, a bradicinina, persiste por alguns minutos na circulação, promovendo vasodilatação e regulando assim o fluxo sanguíneo. A degradação e inativação da bradicinina são realizadas pela enzima conversora de angiotensina (ECA). Esta enzima realiza assim dois importantes papéis: regula a elevação da pressão arterial pela conversão de angiotensina I em angiotensina II promovendo vasoconstrição e inativa a bradicinina evitando vasodilatação (WIRTH et al., 1997).
Várias evidências sugerem que as cininas, por exemplo, calidina e bradicinina têm efeitos cardioprotetores, como por exemplo, na redução do remodelamento do ventrículo esquerdo após o infarto do miocárdio com redução da fibrose intersticial (WOLLERT et al., 1997).
O nível de bradicinina é elevado durante e depois do insulto isquêmico (PAN et al., 2000). Existem dois tipos de receptores nos cardiomiócitos, um constitutivo, receptor B2 e outro que é induzido por estresse, receptor B1 (MARCEAU et al.,1998). A indução de cardioproteção por precondicionamento isquêmico foi abolida em camundongo “knockout” para receptores B2 (YANG et al., 1997). Ratos “knockout” para os receptores B1 não tiveram efeito sobre o remodelamento depois do infarto do miocárdio, contudo seu papel na cardioproteção é ainda desconhecido (XU et al., 2005).
WALL et al. (1994), pela primeira vez, demonstraram em coelhos que HOE 140, um antagonista do receptor B2 de bradicinina, era capaz de abolir o efeito do precondicionamento isquêmico e que infusões de bradicinina antes do período de isquemia e reperfusão reduziam a área de infarto na ausência do precondicionamento isquêmico, um efeito que pode ser bloqueado pelo pré-tratamento com HOE 140. GOTO et al. (1995) demonstraram em preparações de coelhos, que HOE 140 era capaz de abolir a cardioproteção induzida pelo precondicionamento isquêmico quando administrado antes de um ciclo de estímulo do precondicionamento, contudo múltiplos ciclos de precondicionamento eram capazes de sobrepujar o efeito do HOE 140.
A administração de bradicinina exógena além de promover diminuição da área de infarto é capaz de aumentar a pressão desenvolvida, a dP/dt e a redução da pressão diastólica final do ventrículo esquerdo depois do período de isquemia e reperfusão (BREW et al., 1995).
Durante o estímulo do precondicionamento ocorre liberação de bradicinina no tecido isquêmico ocasionando um aumento da resistência contra a isquemia prolongada que foi positivamente associado com o aumento da concentração
intersticial de bradicinina determinada por microdiálise e radioimunoensaio (SCHULZ et al., 1998).
Utilizando o agente anti-hipertensivo losartan, antagonista de receptores AT1 para angiotensina II, SATO et al. (2000) demonstraram que o bloqueio de AT1 induz a cardioproteção reduzindo a extensão do infarto e a apoptose em miócitos, melhorando assim a função cardíaca. Outro medicamento utilizado, o captopril, um inibidor da ECA, também promoveu cardioproteção antes da isquemia. De fato, tem sido descrito que inibidores de ECA podem preservar os níveis de bradicinina e potencializar os efeitos do precondicionamento isquêmico via ativação dos receptores B2 de bradicinina (MIKI et al., 1996).
Apesar destes resultados encorajadores todos estes estudos têm sido realizados em modelos de infarto em animais de experimentação. Entretanto, LEESAR et al. (1999) realizaram um estudo clínico com infusões intracoronarianas de bradicinina, durante uma angioplastia coronariana, precondicionando corações humanos tão efetivamente quanto os ciclos de isquemia do precondicionamento isquêmico por insuflação do balão. Os efeitos benéficos foram verificados por ausência de mudanças hemodinâmicas, o que sugere que a bradicinina pode ser usada profilaticamente para mimetizar o precondicionamento isquêmico em humanos.
Oxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é considerado uma molécula chave em vários processos fisiológicos e patofisiológicos. Na fisiologia vascular normal o NO participa da regulação da pressão arterial, mantém o tônus vasodilatador, impede a formação de
trombos na superfície endotelial, previne a agregação plaquetária, previne a aderência dos neutrófilos no endotélio vascular, inibe a proliferação de células da musculatura lisa vascular e é um neurotransmissor do sistema nervoso central (LEPORE, 2000).
O NO é sintetizado por três isoformas de óxido nítrico sintases (NOS) que catalisam a oxidação de L-arginina para formar L-citrulina e NO. As três formas humanas da NOS identificadas foram: eNOS (endotelial constitutiva), nNOS (neuronal) e iNOS (induzida).
As isoformas eNOS e nNOS são reguladas por concentrações citosólicas de cálcio e pela presença de cofatores tais como tetrahidrobiopterium (BH4), magnésio e NADPH (ANDREW & MAYER,1999). A isoforma iNOS (induzida) é expressa em macrófagos, não necessita de cálcio para sua regulação, produz grande quantidade de NO que tem efeito citostático via inibição de enzimas férricas causando fragmentação do DNA.
A indução da iNOS está envolvida na fisiopatologia das doenças auto-imunes e no choque séptico. Sua expressão é marcadamente induzida por estresse isquêmico através de cascatas de sinalização de fatores transcricionais tais como NF-kB (BELL et al., 2002).
O papel do NO no precondicionamento isquêmico parece não estar completamente esclarecido. Embora o NO não seja o ativador e nem o mediador da fase aguda do precondicionamento isquêmico em coelhos (NAKANO et al., 2000) e suínos (POST et al., 2000), em outras espécies, alguns trabalhos mostram a sua participação na fase aguda do precondicionamento isquêmico. Por exemplo, o bloqueio da enzima NOS atenua a recuperação pós-isquêmica da pressão induzida pelo precondicionamento isquêmico em ratos (LOCHNER et al., 2000); as arritmias
provocadas por eletroestimulação em cães são atenuadas pelo precondicionamento isquêmico, e este efeito antiarrítmico é completamente abolido por inibição da via do NO por L-NAME (Ng-nitro-arginina metil Ester) (VEGH et al., 1992).
Além disso, doadores de NO como GT (gliceril trinitrato) e SIN-1 (3-morpholinosydnonimine-hydrochloride) mostraram-se capazes de mimetizar os efeitos do precondicionamento isquêmico agudo e aboliram as arritmias ventriculares provocadas por reperfusão em corações isolados de ratos (BILINSKA et al., 1996).
O NO também participa na indução do precondicionamento isquêmico tardio. BOLLI et al. (1997a) mostraram que em coelhos conscientes submetidos a ciclos breves de isquemia e reperfusão durante três dias, a administração, no primeiro dia, de inibidor não-seletivo da NOS (L-NA) bloqueou o desenvolvimento do precondicionamento isquêmico tardio. Em um estudo subseqüente, quando usado um inibidor seletivo (aminoguanidina ou S-methyl-isothiourea) da iNOS no mesmo modelo verificou-se a inibição do precondicionamento isquêmico (BOLLI et al., 1997b). Assim, tem sido sugerido que o precondicionamento isquêmico tardio pode ser iniciado pela produção de NO pela isoforma eNOS (QUI et al., 1997) e pode ser mediado por iNOS (TAKANO et al., 1998).
A contribuição do óxido nítrico na proteção cardíaca é dependente do modelo experimental, por outro lado, é fácil demonstrar que o óxido nítrico exógeno pode ativar a cardioproteção em corações isolados (QIN et al., 2004) ou mesmo em modelos cardíacos in vivo (COHEN et al., 2006).
Radicais Livres
A respiração mitocondrial e a fosforilação oxidativa são gradualmente desacopladas durante a hipóxia e isquemia/reperfusão (FERRARI, 1996). Uma conseqüência imediata da diminuição da respiração celular é um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e radicais livres na mitocôndria (VANDEN HOEK et al., 1998). Em altas concentrações os radicais livres podem induzir a peroxidação de lipídeos de membrana, alterando a sua integridade, fluidez e permeabilidade. Os radicais livres podem ainda atacar proteínas de membrana envolvidas na homeostase iônica celular (LUCCHESI, 1998).
Radicais livres não somente causam dano aos miócitos cardíacos, mas também podem atuar como ativadores do precondicionamento isquêmico. Infusões de N-2-mercaptopropionil glicina (BAINES et al., 1997), um antioxidante difusível, ou dimetiltiouréia, um captador de radicais livres (DAS et al., 1999), bloqueiam a proteção do precondicionamento isquêmico. O mecanismo pelo qual estes radicais oxigenados precondicionam o coração ainda não está bem esclarecida, mas sabe-se que os radicais livres podem ativar proteínas G (NISHIDA et al., 2000), proteínas cinases (DAS et al., 1999) e canais de potássio sensíveis a ATP (TOKUBE et al., 1996) e com isso induzir o precondicionamento.
Prostaglandinas
Alguns estudos têm focado na via das prostaglandinas como indutora de cardioproteção. MURPHY et al. (1995) encontraram que a preservação da função pós-isquêmica induzida pelo precondicionamento isquêmico em ratos podia ser
bloqueada por um inibidor da 12-lipooxigenase. Outro estudo (GRES et al., 2002), mostrou que a indometacina, um bloqueador da ciclooxigenase, pode abolir, em porcos, a proteção induzida por um estímulo fraco de precondicionamento (3 min de isquemia e 15 min de reperfusão), contudo, quando utilizado um protocolo precondicionante de maior intensidade (10 min de isquemia e 15 min de reperfusão) o efeito inibitório da indometacina não se mostrou eficiente.
Ainda é bem pouco investigado como as prostaglandinas atuam no sistema cardiovascular para promover a cardioproteção. LIU et al. (1992 a) observaram que dois inibidores da via das ciclooxigenases, meclofenamato e aspirina, quando testados in situ e perfundidos em corações isolados de ratos não foram capazes de inibir o precondicionamento isquêmico em coelhos.
Contudo, o precondicionamento isquêmico tardio está envolvido em um complexo processo de mecanismos regulatórios de sinalização celular e expressão gênica. Várias evidências indicam que a ciclooxigenase (COX)-2 é mediadora da cardioproteção induzida por precondicionamento em coelhos (WANG et al., 2004) e camundongos (GUO et al., 2000) através do aumento da produção de prostanóides citoprotetores tais como (PG)E2 e PGI2. A via da COX-2 é também essencial para conferir a cardioproteção tardia através da indução por estresse térmico (ARNAUD et al., 2003), anestésicos voláteis (TANAKA et al., 2004) e agonistas de receptores d-opióides em ratos (PATEL et al., 2004). Contudo, estímulos diferentes conferem efeitos cardioprotetores similares em diferentes espécies. Também, têm sido encontrado que a cardioproteção induzida por ativação de receptores A1 e A3 de adenosina é independente da COX-2 (KODANI et al., 2001). Ciclooxigenase-1, outra isoforma da COX, é constitutivamente expressa em muitos tecidos, incluindo o coração, e tem sido encontrada em efeitos gastroprotetores induzidas por
precondicionamento (BRZOZOWSKI et al., 2004). Contudo, o papel da COX-1 na cardioproteção ainda é pouco estudado. Bloqueio por inibidores ou mesmo deleção do gene da COX-1 aumentam as injúrias de isquemia/reperfusão no coração de camundongos (CAMITTA et al., 2001), contudo COX-1 não participa da cardioproteção tardia induzida por receptores d-opióides em ratos (SHINMURA et al., 2002)
Mediadores do Precondicionamento Isquêmico
Receptores acoplados a Proteína G
Receptores acoplados a proteínas heterotriméricas ligadoras de GTP (proteínas G) são proteínas integrais de membrana envolvidos na transmissão de sinais extracelulares para o citoplasma. Os receptores acoplados a proteína G compreendem mais de 1000 membros ativados por diferentes estímulos como neurotransmissores, odores, hormônios, fosfolipídios, fótons e fatores de crescimento. A ligação ao receptor inicia a resposta sinalizadora intracelular por ativar ou inibir moléculas efetoras tais como adenilato ciclases, fosfolipases, canais iônicos ou cascatas de cinases (GUTKIND, 1998).
Os receptores de adenosina, opióides e bradicinina, os principais ativadores do precondicionamento isquêmico estão acoplados a proteína G inibitória (Gi). O tratamento crônico com a toxina pertussis que bloqueia a proteína G inibitória inibe o efeito protetor do precondicionamento isquêmico em coelhos (THORNTON et al., 1993).
O receptor de adenosina está acoplado através da proteína Gi, entre outras, a fosfolipase C (PLC) e fosfolipase D (PLD). A Fosfolipase C, principalmente o subtipo gama (PLC-g), quando ativada, hidrolisa o fosfatidilinositol em moléculas de segundo mensageiros como o diacilglicerol (DAG) e o inositol-trifosfato (IP3). O diacilglicerol, devido à sua estrutura lipofílica, permanece ligado à membrana onde irá ativar a proteína cinase C (PKC) que fosforila uma série de proteínas (mudando sua estrutura e função), promovendo assim ativação de vários processos intracelulares, inclusive a transcrição do DNA. O inositol trifosfato, que é hidrófilo, difunde-se no citoplasma e, ligando-se ao retículo endoplasmático, libera cálcio, um importante mensageiro de processos intraneuronais. O inositol trifosfato pode ainda ser reciclado por defosforilação, catalisada por inositol fosfatases, para inositol livre, que será reincorporado à membrana (STOOLL et al., 1999).
A fosfolipase D age sobre a fosfatidilcolina, liberando ácido fosfatídico que pode ser convertido para diacilglicerol por ação de fosfoesterases. O ácido fosfatídico é também metabolizado mais adiante por fosfohidrolases a DAG (ESKILDSEN-HELMOND et al., 1996). DAG estimula a translocação e ativação de proteínas cinase C (PKC). Já foi observado um aumento da atividade da PLD durante o precondicionamento isquêmico e o bloqueio da PLD com altas doses de propanolol atenua a proteção (COHEN et al., 1996). ZHOU et al. (1994) observaram em células endoteliais que a ativação da PKC pelo precondicionamento isquêmico pode ser bloqueada por um inibidor da PLC, sugerindo um acoplamento entre PLC e PKC.
Sobre a ativação da proteína Gi por agentes endógenos, podemos ainda distinguir uma subdivisão entre subunidades Gα e Gβg. A ativação da subunidade Gβg da proteína Gi é um componente crítico do precondicionamento isquêmico. A
inibição por toxina pertussis e a inibição da superexpressão transgênica de Gβg reduzem a recuperação pós-isquêmica da pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo, induzida pelo precondicionamento isquêmico, além de aumentar a necrose cardíaca (TONG et al., 2004).
Proteína Cinase C
A proteína cinase C (PKC) catalisa a transferência do fosfato g-terminal do ATP ao grupo hidroxil de resíduos de serina e/ou treonina em várias proteínas, e isso é considerado fundamental no mecanismo regulatório envolvido no crescimento celular, diferenciação e regulação imediata de funções efetoras, sendo um dos mais importantes papéis da PKC a ativação da transcrição (NEWTON, 2003).
A família da PKC consiste de 12 isoformas, classificadas em três distintas subfamílias. A subfamília clássica das isoformas de PKC inclui as isoformas de PKC a, b1, b2, e g, que requerem para sua ativação íons cálcio e lipídios [fosfatidilserina, PMA (phorbol myristate acetate) e/ou diacilglicerol]. A subfamília convencional de PKC das isoformas d, e, h, q e m não requer cálcio para sua ativação, somente lipídios. Finalmente, a subfamília de PKC atípicas inclui as isoformas que necessitam somente de fosfatidilserina para sua ativação (z), e as que não requerem nem cálcio nem PMA e/ou diacilglicerol para ativação (i e l) (SIMKHOVICH, 1998).
Em cardiomiócitos, o envolvimento direto da PKC no processo de transcrição foi confirmado pela expressão de genes da cadeia leve da miosina cardíaca, do fator natriurético atrial, e de isoformas da Ca2+-ATPase de retículo sarcoplasmático (CLERK et al., 1995) . A PKC ainda está envolvida na regulação imediata da função de proteínas cardíacas via fosforilação direta, como por exemplo, na fosforilação das
subunidades de troponinas I e T no complexo de troponinas cardíacas (JIDEAMA et al., 1996). Vários estudos indicam que a PKC pode modular correntes iônicas em cardiomiócitos. Um exemplo disto é que já foi descrito que PKC ativa o canal de K+ sensível a ATP (HU et al., 1996).
Apesar de existirem vários estudos que têm sugerido a participação de PKC no processo de precondicionamento isquêmico, este tema ainda é controverso na literatura. Foi sugerido que as isoformas da PKC, chamadas de a, d e e, podem estar envolvidas no precondicionamento (YOSHIDA et al., 1997). Usando corações de coelhos, tem sido demonstrado que o precondicionamento pode ser induzido por estimulação de receptores b-adrenérgicos, que levam a mudanças na distribuição celular de PKC sugerindo uma translocação de PKC d (YABE et al., 1998).
A ativação da PKC com PMA (phorbol myristate acetate), um ativador não específico, foi efetiva na indução do precondicionamento em corações isolados de coelhos (YTREHAS et al., 1994). Além do mais, miméticos análogos (PMA) ao diacilglicerol simulam o precondicionamento e protegem o miocárdio dos efeitos deletérios da isquemia e reperfusão (LIU et al., 1994 b). Talvez, a evidência mais importante para o papel da PKC no precondicionamento seja a dos estudos usando inibidores da enzima. Por exemplo, inibição da PKC com estaurosporina, polimixina B, ou queleritrina durante uma isquemia prolongada, aboliram o efeito protetor do precondicionamento isquêmico em ratos (MITCHELL et al., 1995).
Duas das mais estudadas isoformas da PKC, PKCe e PKCd, parecem apresentar funções opostas no miocárdio. A PKCe age inibindo o poro de permeabilidade transitória da mitocôndria, preservando o miocárdio das injúrias quando ativada antes da isquemia e a PKCd está envolvida na geração de espécies
reativas de oxigênio deletérias e sua inibição durante a reperfusão leva a cardioproteção (INAGAKI, 2006).
Tirosina Cinase
Tirosina cinases são um conjunto de enzimas que transferem um grupo fosfato do ATP para resíduos de tirosina em proteínas. A fosfrilação de proteínas por cinases é um importante mecanismo de transdução de sinal na regulação da atiidade enzimática. MAULIK et al. (1996) demonstraram pela primeira vez em corações de ratos precondicionados que a isoflavona genisteína, um inibidor seletivo de tirosina cinase, bloqueava a recuperação funcional após a isquemia. BAINES et al. (1998) demonstraram que ambos genisteína e lavendustin A, inibidores competitivo e não-competitivo, respectivamente, da ligação da enzima ao sítio de ATP, inibiram o efeito protetor do precondicionamento isquêmico em coelhos.
A ativação da tirosina cinase parece estar acoplada a ativação da PKC, sendo associada em série em coelhos, enquanto que em outras espécies, como suínos, a ativação da tirosina cinase independe da ativação da PKC, sugerindo uma via alternativa de ativação. Isto pode explicar porque somente a associação de inibidores de tirosina cinases e da PKC são capazes de inibir o efeito protetor do precondicionamento em algumas espécies (VALHAUS et al., 1998).
MAP Cinases
As MAPKs (proteínas cinases ativadas por mitógenos) são uma família de proteínas serina-treonina cinases ativadas em resposta a uma variedade de
estímulos, tais como fatores de crescimento e estresse celular (WASKIEWICZ & COOPER, 1995).
Alguns trabalhos têm demonstrado o envolvimento das subfamílias das MAPKs, ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) e p38 no processo de cardioproteção celular mediada pelo precondicionamento isquêmico (TAKEISHI et al., 2001).
Em corações isolados de coelhos o aumento da atividade de ERK1 durante o precondicionamento isquêmico (KIM et al., 1999) ativa MAPKAP (MAP kinase-activate protein) a e b, que inicia a fosforilação de pequenas proteínas de choque térmico (CHEVALIER et al., 2001). Infusões intramiocárdicas de anisomicina, um ativador de MAP cinases, reduz o tamanho da área de infarto em coelhos (BAINES et al., 1999) e porcos (BARANSIK et al., 1999) e está associada à ativação de JNK. Mais atenção tem sido focada na função da MAPK p38. Existem cinco isoformas identificadas, contudo somente a p38 a e b são expressas no coração, sendo a p38 a mediadora de apoptose celular enquanto que a p38 b apresenta função anti-apoptótica (WANG et al., 1998 b). Durante o precondicionamento isquêmico ocorre inibição da ativação de p38 a e ativação da p38 b (SAURIN et al., 2000). A ativação da MAPK p38 pode ainda iniciar a fosforilação de proteínas de choque térmico como a Hsp25/27 e aumentar assim a capacidade cardioprotetora do precondicionamento isquêmico (SUGDEN & CLERK, 1998).
A regulação das MAPKs durante o precondicionamento isquêmico e sua conseqüente ativação e inibição no coração ainda não está claramente descrita variando enormemente de acordo com o modelo e a espécie utilizada.
Efetores Finais do Precondicionamento Isquêmico
Proteínas de Choque Térmico
Evidências suficientes têm correlacionado o aumento da expressão de proteínas de choque térmico (HSPs) ao precondicionamento isquêmico. As HSPs aB-crystallin e Hsp27 participam da “primeira linha de defesa” contra estresses não letais através da estabilização mecânica do citoesqueleto durante a fase aguda do precondicionamento isquêmico, promovendo diminuição das injúrias induzidas pela isquemia (EATON et al., 2000).
Muitos estudos, contudo, têm focado na participação efetiva das HSPs na fase tardia do precondicionamento isquêmico, que ocorre após as 24 horas iniciais do estímulo. Em cardiomiócitos, o precondicionamento tardio foi associado com o aumento da expressão de Hsp 90 e Hsp 70, mas não de Hsp 27 (NAYEEM et al., 1997). O aumento da expressão de Hsp 70 promove uma menor ocorrência de arritmias e fibrilação ventricular, melhora a função contrátil, diminui o “stunning”, e aumenta a atividade de enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase (SNOECKX et al., 2001).
Canal de Potássio Sensível a ATP (KATP)
Em cardiomiócitos existem duas populações distintas de canais KATP, uma sarcolemal e a outra mitocondrial. Drogas que ativam estes canais tendem a mimetizar os efeitos do precondicionamento isquêmico, enquanto que drogas que bloqueiam estes canais tendem a abolir o efeito protetor (O’ROURKE, 2000).
O papel dos canais KATP sarcolemais no mecanismo protetor do precondicionamento isquêmico foi sugerido inicialmente pelas observações de sua inibição através da utilização do bloqueador glibenclamida (KANE et al., 2005). Um dos mecanismos propostos para explicar o processo de proteção celular pelo canal KATP sarcolemal é que, com sua abertura durante o precondicionamento isquêmico, ocorreria uma diminuição da duração do potencial de ação, com menor contratilidade miocárdica, diminuição da corrente de cálcio e menor sobrecarga de cálcio intracelular, reduzindo assim os efeitos deletérios da isquemia (NICHOLS et al., 1991). Mais recentemente, uma forte evidência do papel dos canais KATP sarcolemais foi obtida em camundongos “knockout”. Estes animais exibiram uma grande sobrecarga de cálcio e as injúrias de isquemia/reperfusão foram maiores do que em animais controle (GUMINA et al., 2007).
A abertura do canal KATP mitocondrial permite a entrada de íons potássio na mitocôndria, favorecendo o gradiente eletroquímico. O trocador potássio-hidrogênio no interior da membrana mitocondrial permite que o potássio intra-mitocondrial seja permutado com o H+ extra-mitocondrial. A entrada de H+ causa desacoplamento da mitocôndria, com diminuição da passagem destes prótons pela F0F1-ATPase, o que acarreta uma menor produção de ATP, favorecendo um mecanismo poupador e cardioprotetor (GARLID, 2000).
Muitos estudos implicam os canais KATP mitocondriais como mediadores obrigatórios da via de transdução de sinal recrutada durante o precondicionamento isquêmico (GARLID et al., 1997). Foi recentemente demonstrado que a administração do inibidor de canais KATP mitocondriais HD (ácido 5-hidroxidecanóico), especificamente durante a reperfusão, aboliu a redução da área de infarto em corações de ratos precondicionados (HAUSENLOY & YELLOW, 2007).
Isto sugeriu que a abertura dos canais KATP mitocondriais pode contribuir para a cardioproteção induzida pelo precondicionamento isquêmico. Recente estudo tem relacionado a ativação de PKG e PKCe com a abertura dos canais KATP mitocondriais (COSTA et al., 2005). Além disso, com a abertura desses canais ocorre geração de peróxido de hidrogênio que inibe a abertura do poro de permeabilidade transitória da mitocôndria (COSTA et al., 2006).
Poro de Transição da Permeabilidade da Mitocôndria (PTPm)
O PTPm é um poro que abre sob certas condições, principalmente elevada concentração de Ca2+ na matriz e estresse oxidativo, tornando a membrana mitocondrial interna permeável a moléculas < 1,5 kDa, com isso dissipa o potencial de membrana mitocondrial e desacopla a fosforilação oxidativa, resultando em depleção de ATP, aumento do volume mitocondrial e morte celular (HAUSENLOY et al., 2003). Este papel, como mediador crítico para a morte celular após as injúrias de isquemia e reperfusão, é suportado por estudos que demonstram que a abertura do PTPm é dependente de algumas condições, como acumulação de cálcio mitocondrial, estresse oxidativo, restauração do pH neutro, níveis relativamente baixos de ATP, e altos níveis de fosfato (CROMPTON et al., 1987; HAUSENLOY et al., 2003). Tem sido demonstrado que a abertura do PTPm ocorre durante a reperfusão miocárdica (KIM et al., 2006), e a sua inibição por ciclosporina-A e sangliferina-A tem ação cardioprotetora (ARGAUD et al., 2005).
Precondicionamento Remoto ou “à Distância”
Um pequeno número de trabalhos tem expandido o conceito de precondicionamento isquêmico e demonstrado que o precondicionamento de uma região do tecido ou órgão não somente provoca um efeito protetor local, mas também pode proteger outra região ou um coração aceptor de efluente precondicionado de uma isquemia prolongada. Este fenômeno de precondicionamento remoto ou “à distância” pode ser iniciado por eventos curtos de isquemia em um leito vascular coronariano remoto (PRZYKLENK et al., 1993), ou em tecidos não cardíacos, como rim (PELL et al., 1998), mesentério (GHO et al., 1996) e músculo esquelético (BIRNBAUM et al., 1997).
O precondicionamento à distância tem sido mostrado em várias espécies incluindo ratos, coelhos e cães, e é comparável ao precondicionamento isquêmico clássico. Uma evidência de precondicionamento isquêmico remoto em humanos foi obtida por GUNAYDIN et al. (2000), onde durante uma cirurgia de revascularização da coronária esquerda, breves períodos de isquemia e reperfusão, da coronária direita, produziram uma atenuação do aumento de lactato desidrogenase na célula cardíaca reduzindo a injúria tecidual. Estas observações mostram a relevância clínica e terapêutica do precondicionamento remoto.
As vias de sinalização do precondicionamento remoto parecem ser similares ao precondicionamento isquêmico clássico. No precondicionamento remoto, receptores de adenosina (PELL et al., 1998), a1-adrenérgicos (OXMAN et al., 1997), bradicinina (SCHOEMAKER & VAN HEIJNINGEN, 2000) e opióides (DICKSON et al., 2001) parecem estar envolvidas no efeito de limitação da área de infarto, pois seus antagonistas inibem a cardioproteção. Mas, pouco se conhece sobre a cascata
de transdução de sinais gerada pela ativação destes receptores durante o precondicionamento à distância.
A cardioproteção pelo precondicionamento isquêmico pode ser transferida via transfusão completa de sangue em coelhos (DICKSON et al., 1999 a) ou por transfusão do efluente coronariano em corações isolados de coelhos (DICKSON et al., 1999b; 2000) e de ratos (TAVARES et al., 2001). Estes trabalhos iniciais tentaram mostrar que o precondicionamento isquêmico remoto é mediado por um fator humoral liberado na circulação e que a transferência deste fator precondicionante pode proteger corações aceptores virgens dos efeitos da isquemia sustentada.
Assim, o isolamento deste fator precondicionante seria o primeiro passo na descoberta do verdadeiro ativador do processo de precondicionamento isquêmico. Em 2001, DICKSON et al. mostraram que o fator ativador liberado no precondicionamento poderia ser adsorvido e recuperado em uma coluna de fase reversa C-18 e que o fator eluído da coluna protegia corações aceptores e era bloqueado por naloxona, um inibidor dos receptores de opióides. Em 2002, DICKSON et al. mostraram que o fator precondicionante eluído da coluna era capaz de precondicionar tecidos não cardíacos como o mesentério, melhorando o tônus contrátil após a isquemia, e que sua atividade cardioprotetora era bloqueada pelo naloxona e por glibenclamida, um inibidor dos canais KATP.
Contudo, o fator precondicionante presente no efluente coronariano ainda não foi identificado, nada se sabe sobre sua estrutura química, conformacional ou estabilidade, assim como, sua modulação e interação com possíveis receptores de membrana. Desta forma, os objetivos do presente trabalho são os seguintes:
OBJETIVOS
1) Caracterizar o fator cardioprotetor presente no efluente precondicionado de ratos
quanto à estabilidade térmica e proteolítica;
2) Purificar o fator cardioprotetor através de cromatografia de fase reversa.
3) Avaliar o efeito do efluente precondicionado pré-purificado sobre a área de
infarto, recuperação da função contrátil e arritmias de reperfusão de corações de ratos submetidos à isquemia-reperfusão.
4) Investigar a participação da proteína cinase C e dos canais de potássio sensíveis
a ATP na indução de cardioproteção promovida pelas amostras purificadas do efluente precondicionado
5) Investigar a participação das ciclooxigenases na cardioproteção induzida pelas
amostras purificadas do efluente precondicionado utilizando cromatografia de alta eficiência (HPLC)
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparação do Coração Isolado
O estudo foi realizado em corações isolados de ratos Wistar machos (peso corporal 200-250g). Os animais foram heparinizados (200 IU), anestesiados por inalação de dietil éter e sacrificados por deslocamento cervical. Após toracotomia, os corações foram removidos e submersos em solução salina fisiológica [Krebs-Henseleit (KHB), em mM: NaCl (118), KCl (4,7), NaHCO3- (25), KH2PO4 (1,2), MgSO4 (1,2), glicose (11), e CaCl2 (1,25)]. Imediatamente os corações foram canulados através da artéria aorta em um aparato de Langendorff modificado (Figura 1) e perfundidos com solução KHB a fluxo constante de 10 mL/min, mantido por uma bomba peristáltica (Gilson Minipuls 3, Villiers le Bel, France). A solução de perfusão foi mantida a temperatura de 37 °C por um banho de circulação com termostato (Haake). A solução foi borbulhada continuamente, com mistura gasosa carbogênica (95% O2 / 5% CO2), para oxigenação e manutenção do seu pH em 7,4. Após canulação, os corações foram mantidos imersos em solução KHB no interior de um recipiente de parede dupla com circulação de água aquecida para conservar a temperatura em 37°C.
Figura 1. Montagem do coração isolado (Preparação de Langendorff modificada).
(1) solução de Krebs; (2) bomba peristáltica; (3) interface analógica/digital; (4) aquisição e análise dos dados no computador; (5) sistema de controle da temperatura (37 °C); (6) amplificador diferencial; (7) eletrodos. Figura extraída e adaptada de TAVARES, 2001.
Eletrocardiograma
Os eletrocardiogramas (ECGs) dos corações isolados foram registrados por meio de dois eletródios de prata cloretados em contato com a superfície epicárdica, aos níveis do ápice ventricular esquerdo (elétrodo positivo) e átrio direito (elétrodo negativo). Os sinais do ECG foram amplificados em amplificador diferencial TEKTRONIX (modelo 3A9), digitalizados (interface A/D TL-4, Axon Instruments) e armazenados em computador para análise off-line pelo programa AxoScope 7.
1 2 3 5 6 7 4 -0 2 4 16 14 Tim (
Determinação do Tamanho da Área de Infarto
Após o protocolo experimental, os corações foram retirados imediatamente da montagem de Langendorff, sendo removidos os átrios e a base da aorta. A porção ventricular foi fatiada transversalmente em 4 ou 5 fatias (± 2 mm cada), e incubadas por 5 minutos a 37 oC em solução de TTC (cloridrato de trifeneiltetrazólio) a 1%, sendo o tecido viável corado em vermelho e a área necrótica em branco (CHOPRA & SABHERWAL, 1988). Após fixação em formol a 10% durante 12 horas, os cortes foram digitalizados em um scanner (HP Scanjet 5370C) e posteriormente analisados em um programa de análise de imagens (ImageJ, NIH, Baltimore, USA), para determinação da área de infarto.
Medida da Pressão Desenvolvida pelo Ventrículo Esquerdo
Para o registro contínuo da pressão do ventrículo esquerdo foi realizada uma incisão no átrio esquerdo e introduzido um balão de látex, através do orifício mitral, no interior da cavidade do ventrículo esquerdo. O balão foi preenchido com água destilada e conectado a um transdutor de pressão (MLT 0380 BP Transducer, ADInstruments Inc). O sinal de pressão foi amplificado por um amplificador (ML110, ADInstruments Inc) e digitalizado (Powerlab/400, ADInstruments Inc) para análises off-line usando o software de aquisição e análise de dados Chart 4.0.1 (ADInstruments Inc).
O volume inicial do balão foi ajustado para a obtenção de uma pressão diastólica final (PDFVE) basal de 10 mmHg. A pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (PDVE) foi calculada como a diferença entre o pico da pressão sistólica e a pressão diastólica final. Os valores basais de PDFVE e PDVE foram medidos ao final de um período de 20 minutos de estabilização e 1 minuto antes da isquemia global. Corações que não apresentavam PDVE superior a 80 mmHg foram excluídos dos experimentos.
Protocolo Experimental de Isquemia/Reperfusão
Todos os corações foram submetidos a um protocolo de isquemia/reperfusão (I/R), que consistiu de 30 minutos de isquemia global normotérmica, seguida de 60 minutos de reperfusão. A isquemia global foi iniciada pela interrupção da perfusão coronariana por desligamento da bomba peristáltica, e a reperfusão pelo religamento da bomba com restabelecimento do fluxo coronariano.
Protocolo Experimental de Precondicionamento Isquêmico
O protocolo do precondicionamento consistiu de 3 ciclos de 5 minutos de isquemia seguidos de 5 minutos de reperfusão. Esse protocolo sempre era realizado antes do período de 30 minutos de isquemia global.
Coleta e transferência do efluente coronariano
A coleta de efluente coronariano (150 mL) foi efetuada durante os 15 minutos finais do período basal, imediatamente antes da aplicação do protocolo de isquemia/reperfusão (efluente controle) ou durante os 3 períodos de 5 minutos de reperfusão do protocolo de precondicionamento isquêmico (efluente
precondicionado). Para a coleta do efluente, o recipiente de imersão do coração
era esvaziado através de um dreno e, em seguida, um becher posicionado sob o dreno para a coleta durante o período pré-estabelecido.
A transferência do efluente para outro coração ocorria através da perfusão deste imediatamente antes da aplicação do protocolo de isquemia/reperfusão. O efluente era previamente filtrado (filtro de papel 80), aquecido a 37 °C e saturado com mistura carbogênica. Para evitar a degradação das propriedades do efluente coronariano fresco, este era transferido para outro coração em no máximo 2 horas após a coleta.
Grupos experimentais
Os corações foram divididos em 4 grupos experimentais:
Grupo doador controle (DC, n=5): os corações foram submetidos apenas ao protocolo de isquemia/reperfusão. O efluente coronariano foi coletado durante 15 minutos (150 mL) antes do período de 30 minutos de isquemia global (efluente controle).
Grupo doador precondicionado (DPC, n=5): os corações foram submetidos ao protocolo de precondicionamento isquêmico (IPC), seguido do protocolo de isquemia/reperfusão. O efluente coronariano foi coletado durante o precondicionamento isquêmico (efluente precondicionado).
Grupo receptor controle (RC, n=5): O efluente controle coletado dos corações do grupo DC (150 mL) foi perfundido em corações receptores durante 15 minutos, seguido da aplicação do protocolo de isquemia/reperfusão.
Grupo receptor precondicionado (RPC, n=5): O efluente precondicionado, coletado dos corações doadores do grupo DPC (150mL), foi perfundido em corações receptores durante 15 minutos, seguido da aplicação do protocolo de isquemia/reperfusão.
Figura 3. Transferência do efluente a fresco. Grupos experimentais: Doador controle
(DC, n=5), doador precondicionado (DPC, n=5), receptor controle (RC, n=5) e receptor precondicionado (RPC, n=5).
Atividade Proteolítica do efluente precondicionado
A atividade cardioprotetora do efluente precondicionado degradava-se quando este era mantido a temperatura ambiente por períodos maiores que 2 horas pós-coleta. Para testar a hipótese de que os fatores cardioprotetores presentes no efluente precondicionado sejam de natureza protéica, sujeitos a ação proteolítica de
proteases liberadas no efluente coronariano, foram realizados os seguintes grupos de experimentos.
O efluente precondicionado (150 mL) foi coletado e armazenado na presença (+PI, n=4) e na ausência de inibidores de proteases (-PI, n=4) e mantido inicialmente em temperatura ambiente (durante o dia de coleta por aproximadamente 6 horas) e posteriormente acondicionado sob refrigeração para teste após 24 horas. As concentrações de inibidores de protease foram 1 mmol/L de PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride – serina protease); 1 mmol/L de EDTA (metaloprotease); 1mg/mL de pepstatina A (protease ácida) e 1mg/mL de Leupeptina (tiol protease). Após 24 horas, os efluentes tratados e não tratados foram testados para verificar sua capacidade cardioprotetora. Um grupo de experimentos (PIC, n=4) foi realizado apenas com os inibidores de proteases ressuspendido no efluente controle para verificar se a cardioproteção poderia ser devido ao efeito direto desses inibidores.
Figura 4. Protocolos experimentais para teste da atividade proteolítica do efluente
precondicionado. Grupos experimentais: Efluente precondicionado na ausência de inibidores de protease (-PI, n=4); na presença de inibidores de proteases (+PI, n=4) e inibidores de proteases ressuspendido em efluente controle (PIC, n=4).
Inativação Térmica do Efluente Coronariano Precondicionado
A fim de verificar se os fatores protetores são de natureza protéica, nós determinamos sua sensibilidade ao calor. Para testar a termolabilidade da atividade cardioprotetora presente no efluente precondicionado coronariano, corações foram perfundidos com 150 mL de efluente precondicionado aquecido a 37 oC (PCE30, n=5), 70 oC (PCE70, n=5) e 100 oC (PCE100, n=5) por 5 minutos. Para evitar o efeito de precipitação do conteúdo de íons provocado pela ebulição da solução de Krebs, o efluente precondicionado foi liofilizado e dialisado (3.500 Da de cut off) contra água destilada antes do aquecimento a 70 oC e 100 oC. Depois disso, foram
reconstituídos em solução de Krebs, filtrados em papel de filtro qualitativo (Klabin 80 g/m2, Maringa, PR, Brasil), gaseificados com 95% de O2 e 5% de CO2 (pH 7.4 a 37 o
C) e perfundido retrogradamente antes do período de 30 minutos de isquemia e 60 minutos de reperfusão para verificar sua capacidade cardioprotetora.
Figura 5. Protocolos experimentais para teste da termolabilidade do efluente
precondicionado. Grupos experimentais: O efluente coronariano precondicionado foi aquecido em diferentes temperaturas 37 oC (PCE30, n=5), 70 oC (PCE70, n=5) e 100 o
