UNIVERSIDADE DE FRANCA
Desenvolvimento e validação de método
analítico por CLAE-DAD para avaliação de
extratos padronizados de Mikania glomerata
com atividade antimicrobiana frente a
bactérias cariogênicas
Franca
2017
Monique Rodrigues Moreira
Desenvolvimento e validação de método analítico
por CLAE-DAD para avaliação de extratos
padronizados de Mikania glomerata com atividade
antimicrobiana frente a bactérias cariogênicas
Defesa apresentada à Universidade de Franca como exigência parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Química.
Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
Moreira, Monique Rodrigues
M838d Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-DAD para avaliação de extratos padronizados de Mikania glomerata com atividade antimicrobiana frente a bactérias cariogênicas / Monique Rodrigues Moreira ; orientador: Rodrigo Cassio Sola Veneziani. – 2017
126 f. : 30 cm.
Tese de Doutorado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Doutor em Ciências
1. Mikania glomerata. 2. Antimicrobiana. 3. Validação. 4. Otimização. I. Universidade de Franca. II. Título.
Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais e todas as pessoas que estiveram presente ao meu lado durante toda essa trajetória, me incentivando a perseverar e ter a paciência necessária para alcançar meus objetivos.
AGRADECIMENTOS
Inicio os agradecimentos por meus pais, que sempre primaram pela minha educação. Obrigada Sr. Mauricio e Sra. Elizabeth por, além de me oferecerem a oportunidade de estudar, sempre me incentivaram neste caminho.
Agradeço ao professor e orientador Rodrigo Cassio Sola Veneziani, por me mostrar a nobre função da pesquisa, pelos seus conselhos e seu interesse no meu crescimento e amadurecimento profissional, e também por sua confiança e amizade nesta jornada acadêmica de oito anos.
Venho agradecer os professores Carlos Henrique Gomes Martins, Denise Crispim Tavares, Márcio Luis Andrade e Silva, Ana Helena Januário, pela disponibilidade de seus laboratórios, equipamentos e colaboração no desenvolvimento deste trabalho. Aos alunos envolvidos Sandra Soares, Thaís da Silva Moraes, Natália Helen Ferreira, pela sua prestatividade e colaboração.
Meus respeitosos agradecimentos a banca de qualificação e a banca de defesa pelas contribuições no aprimoramento deste trabalho. E a todos os professores e profissionais da pós-graduação que contribuíram cada qual da sua forma para o meu aprimoramento profissional e pessoal durante esse período.
Agradeço à FAPESP por conceder a bolsa de Iniciação Científica (Nº do processo 2009/17700-0), e também a CAPES pela bolsa de Mestrado e Doutorado, a CNPQ pelo apoio financeiro.
―Grande coisa é haver recebido do céu Uma partícula da sabedoria, o dom de achar as relações das coisas, A faculdade de as comparar e o talento de concluir‖. (Machado de Assis)
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS, CÓDIGOS E ABREVIATURAS... VII LISTA DE FIGURAS... X LISTA DE TABELAS... XII LISTA DE QUADROS... XIII RESUMO... XIV ABSTRACT... XV
1. INTRODUÇÃO... 16
1.1. Fitoterápicos... 17
1.2. Cárie bucal e produtos naturais... 18
1.3. Mikania glomerata e ácido ent – caurenóico frente a patógenos bucais... 19
1.4. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE-DAD... 21
1.5. Metodologias de Superfície de Resposta (MSR) para otimização de processos extrativos... 23
2. OBJETIVO ... 27
2.1. Objetivo Geral... 28
2.2. Objetivos Específico... 28
3. MATERIAL E MÉTODOS... 30
3.1. Aquisição do material vegetal... 31
3.2. Obtenção do extrato enriquecido GDH2 e isolamento do ácido ent-caurenóico... 31
3.3. Avaliação antimicrobiana frente a patógenos bucais... 33
3.3.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima... 33
3.3.2. Determinação da Concentração Bactericida Mínima... 35
3.3.3. Determinação da Cinética Antimicrobiana... 36
3.3.4. Determinação da formação de biofilme... 36
3.4. Avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade... 37
3.5. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE-DAD... 41
3.6. Planejamento experimental para obtenção dos extratos de Mikania glomerata por procedimentos não cromatográficos... 48
3.6.1. Extração por maceração (EMMG) e por ultrassom (EUMG)... 51
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 54
4.1. Isolamento e identificação do marcador químico ácido ent-caurenóico... 55
4.2. Avaliação antimicrobiana... 60
4.3. Avaliação da citotoxicidae e genotoxicidade... 69
4.4. Desenvolvimento de metodologia analitica por CLAE-DAD... 74
4.5. Otimização dos extratos sem etapa cromatográfica... 80
4.5.1. Dados experimentais e modelo de regressão... 81
4.5.2. Coeficientes e variáveis significativas... 85
4.5.3. Análise gráfica das superfícies de respostas... 91
4.5.4. Determinando as condições ótimas... 96
5. CONCLUSÕES... 100
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
AC – ácido ent-caurenóico AcN – Acetonitrila
AcOEt – Acetato de etila ANOVA – Análise de variância
Anvisa – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC – American Type Culture Collection
BHI – Brain heart infusion
RMN de ¹³C – Ressonância Magnética de Carbono Nuclear CBM – Concentração bactericida mínima
CC50 – Concentração citotóxica de 50%
CL50 - Concentração letal de 50%
CCDC – Cromatografia camada delgada comparativa CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
DAD – Detector de arranjo de diodo DP - desvio padrão
DPR%. - desvio padrão relativo
CIM – Concentração inibitória mínima
CIMB50 – Concentração inibitória mínima do biofilme
CLV – Cromatografia líquida a vácuo DMEM – Meio de cultura Dulbecco MEM DMSO – Dimetilsulfóxido
D.O – Densidade óptica
EUMG – Extração por ultrassom
GD – Extrato de guaco em diclorometano
GDH – Extrato de guaco diclorometânico particionado em n-hexano
GDH2 – Extrato de guaco diclorometânico particionado em n-hexano segunda fração CLV
RMN de 1H – Ressonância Magnética de Hidrogênio Nuclear
HAM-F10 - L-glutamina sem NaHCO3
HEPES - ácido N-(2-hidroxietilo)-piperazina-N'-2-etanesulfónico HEX - n-hexano
LAPEMA - Laboratório de pesquisa em microbiologia aplicada LD – Limite de detecção
LQ – Limite de quantificação MeOH - Metanol
M. glomerata – Mikania glomerata MMS – metanossulfonato de metila MN - micronucléos
MNPCEs - eritrócitos policromáticos micronucleados MSR – Metodologia de superfície de resposta
IDN – Indice de divisão nuclear IS – Índice de seletividade PBS – Tampão fosfato
PCN-NCE - eritrócitos normocromático PI – Padrão interno
Rs/s – Variável independente relação volume de solvente por grama de pó vegetal
RE nº 899/2003 – Resolução Anvisa número 899 de 2003 RMN – Ressonância magnética nuclear
RPMI – Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute t – Variável independente tempo
TSB – Caldo triptona soja
UFC – Unidades formadoras de colônias
V79 – Fibroblasto de pulmão de hamster chinês
XTT - 2,3-Bis (2-metoxi- 4- nitro- 5- sulfofenil) - 2 H - tetrazolium- 5- sal interno carboxanilida
δ – Deslocamento químico em ppm σ - Desvio Padrão relativo
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mikania glomerata 20
Figura 2.
Estrutura do ácido ent-caurenóico(metabólito majoritário de M.
glomerata) 21
Figura 3. Fluxograma ilustrativo do preparo da fração rica em AC GDH2 33 Figura 4. Gradiente exploratório proposto por Snyder & Dolan 42 Figura 5. Esquema de diluições de ácido caurenóico para elaboração da
curva de calibração 44
Figura 6. Fluxograma do esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão do método analítico 46 Figura 7. Estrutura do ácido ent – caur – 16 (17) – en – 19 – óico 55 Figura 8. Espectro de RMN 1H do ácido ent – caur – 16 (17) – em – 19 - óico
(CDCl3 /400 MHz) 58
Figura 9. Espectro de RMN 13C do ácido ent – caur – 16 (17) – em – 19 -
óico (CDCl3 /100 MHz 59
Figura 10. Esquema ilustrativo da oxidação da resazurina em resofurina pela
ação das enzimas mitocondriais 60
Figura 11. Representação gráfica da avaliação da cinética bactericida do extrato GDH2 frente ao S. mutans (ATCC 25175). 63 Figura 12. Representação gráfica da avaliação da cinética bactericida do AC
frente ao S. mutans (ATCC 25175). 63
Figura 13. Representação gráfica da avaliação da sensibilidade do biofilme demonstrado pela D.O. e pelo nº de microrganismos (Log10
UFC/mL) do extrato GDH2. 65
Figura 14. Representação gráfica da avaliação da sensibilidade do biofilme demonstrado pela D.O. e pelo nº de microrganismos (Log10 UFC/mL) da clorexidina (controle positivo). 66 Figura 15. Representação gráfica da avaliação da sensibilidade do biofilme
demonstrado pela D.O. e pelo nº de microrganismos (Log10 UFC/mL) da clorexidina (controle positivo). 66 Figura 16 Média das porcentagens de sobrevência celular obtidas após a
exposição das células V79 as concentrações do extrato de M.
glomerata enriquecido com ácido caurenóico (GDH2) em um
intervalo de 0.3 a 160 µg/mL. *Significativamente diferente do
grupo controle (P < 0.05). 70
Figura 17. Cromatograma típico referente a GDH2, obtido nas condições estabelecidas (sistema isocrático de eluição composto de 90 % AcN em água contendo 0,1 % de ácido acético numa vazão de 1,0 mL/min, temperatura da coluna de 40 oC e detecção a 201 nm) 75 Figura 18. Seletividade avaliada pelo método da pureza espectral
comparando o cromatograma e espectro UV do AC obtido na curva de calibração (acima) com o cromatograma e espectro da
amostra GDH2 (abaixo) 76
Figura 19. Comparação teórica entre valores experimentais de predição e valores experimentais obtidos pelos modelos experimentais das
Figura 21. Gráficos de Resíduos quem avaliam as variações nos dados fornecidos pelo teste ANOVA do modelo quadrático de EUMG 91 Figura 22. Gráficos 2D e 3D representativos da equação de regressão da
resposta Y usando A) n-hexano, B) acetato de etila e C) etanol, mostrando como a extração por maceração é afetada pela Rs/s e
pelo t. 93
Figura 23. Gráficos 2D e 3D representativos da equação de regressão da resposta Y usando A) n-hexano, B) acetato de etila e C) etanol, mostrando como a extração por maceração é afetada pela Rs/s e
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Fatores e níveis investigados na robustez, e suas abreviações e
unidades. 47
Tabela 2 Design experimental de Plackett–Burman para sete fatores e oito
experimentos 48
Tabela 3 Código e níveis das variáveis independentes usadas no
planejamento experimental. 49
Tabela 4 Descrição dos 22 experimentos do Design Optimal Custom para
as duas metodologias de extrativas 52
Tabela 5 Dados de RMN 1H do ácido caurenóico (400 MHz, CDCl3,
multiplicidade). 56
Tabela 6 Dados de RMN 13C do ácido caurenóico (100 MHz, CDCl3). 57 Tabela 7 Resultados da atividade antibacteriana in vitro (CIM e CBM) 61 Tabela 8 Porcentagem de inibição da formação biofilme de S. mutans
(ATCC 25175) conforme as concentrações testadas do extrato
GDH2, do AC e da clorexidina 67
Tabela 9 Frequência de micronucléos (MN), indice de divisão nuclear (IDN) e indice de citotoxicidade observadas em culturas célulares V79 tratadas com diferentes concentrações do extrato de M. glomerata enriquecido com ácido caurenóico (GDH2) e seus respectivos
controles 72
Tabela 10 Frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) em medula ossea dos animais tratados com diferentes doses do extrato de M. glomerata enriquecido com ácido caurenóico (GDH2)
e seus respectivos controles. 73
Tabela 11 Parâmetros analíticos de LD, LQ, precisão, exatidão e robustez
obtidos para o método desenvolvido 78
Tabela 12 Descrição da matriz experimental para os dois métodos de extração (EMMG e EUMG), e os resultados e valores de predição de cada experimento das respostas Y (rendimento em massa %). 83 Tabela 13 Análise ANOVA para a Superfície de Resposta para as variáveis e
modelo quadrático quanto ao Rendimento da massa de extrato (%)
de EMMG 87
Tabela 14 Análise ANOVA para a Superfície de Resposta para as variáveis e modelo quadrático quanto ao Rendimento da massa de extrato (%)
de EUMG. 90
Tabela 15 As condições experimentais otimizadas, estabelecidas pela função ―desirability‖, para os dois métodos de extração 97 Tabela 16 Teores de AC nos extratos preparados nas condições proposta
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Equações para predição das condições ótimas para rendimento da
RESUMO
Mikania glomerata pertence à família Asteraceae e no Brasil é
popularmente conhecido como ―Guaco‖. Em termos fitoquímicos, esta planta é caracterizada pela presença de vários diterpenos do tipo caurano em sua composição, sendo o ácido ent-caurenóico (AC) seu metabólito majoritário. Inicialmente, o presente trabalho descreve a obtenção de um extrato padronizado de Mikania glomerata enriquecido em AC. Este extrato apresentou valores de CIM entre 6,25 e 12,50 µg/mL enquanto AC apresentou valores de CIM entre 6,25 e 50,00 µg/mL frente ao painel de bactérias bucais testado. O extrato padronizado e o AC necessitaram 6 horas para exercer seu efeito bactericida ao S. mutans. Estes resultados denotam o potencial de Mikania
glomerata na busca de novos princípios ativos anticariogênicos, principalmente
com relação ao extrato devido apresentar menor valor de CIM do que o AC possivelmente pelo efeito de sinergismo entre os constituintes do extrato. Neste trabalho descreve-se ainda o desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD) para determinação do teor de AC em no extrato padronizado. Os estudos analíticos permitiram estabelecer um método confiável para determinar o teor de AC no extrato padronizado, atendendo às crescentes demandas por qualidade e segurança em produtos fitofarmacêuticos. Os ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade afirmaram a segurança do uso do extrato padronizado. Finalmente, é descrito ainda a utilização de Design experimental para a obtenção de novos extratos a base de Mikania glomerata que dispensem a utilização de etapas
ABSTRACT
Mikania glomerata belongs to Asteraceae family, in Brazil is commonly
named as ―Guaco‖. This plant can be chemically characterized by the presence of several kauran diterpenes in your composition, and ent-kaurenoic acid has been pointed out as its major constituent. Ent-caurenoic enriched Mikania
glomerate extract (standardized extract) presented MIC values between 6.25
and 12.50 µg/mL and its main metabolite (ent-kaurenoic acid) showed MIC values between 6.25 and 50.00 µg/mL. Standardized extract and ent-kaurenoic acid required 6 hours to exert their bactericidal effect. The results describe here in denote the potential of Mikania glomerata as a source of new anticareogenic active principles. This work also describes development and validation of analytical method by high performance liquid chromatography (HPLC-DAD) to determine ent-kaurenoic acid content in standardized extract. Analytical studies allowed establish a reliable method to determine ent-kaurenoic acid content in standardized extract, meeting increasing demands for quality and safety in plant derived products. In addition, cytotoxicity and genotoxicity assays stated the safety standardized extract use. Finally, it is also described the use of experimental design to obtain extracts of Mikania glomerata without the utilization of chromatographic steps.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Fitoterápicos
Agentes fitoterapêuticos (ou fitoterápicos) são preparações padronizadas que consistem numa mistura complexa de uma ou mais plantas que contêm como ingredientes ativos as partes processadas deste material vegetal 1. Mesmo com o advento da biotecnologia e dos modernos métodos da química combinatória e do design racional de fármacos, este tipo de produto natural ainda se mostra como uma importante fonte de produtos farmacêuticos 12. Além do mais, ainda que a importância relativa dos produtos fitofarmacêuticos oscile ao longo do tempo de acordo com as estratégias mercadológicas das grandes companhias farmacêuticas, a tendência atual é largamente favorável ao Brasil devido à sua grande biodiversidade e fronteira agrícola em expansão que disponibiliza o acesso as matérias primas vegetais 1,3. O uso de fitoterápico deve ser estimulado com custo mais acessível à população e aos serviços públicos de saúde, visto que a maior parte da população mundial ocupa os países em desenvolvimento os quais encontram poucos recursos em oferecer atendimento médico e maior necessidade de acesso a medicamen-tos4,5.
A RDC n° 26/2014 estabeleceu os requisitos mínimos para o registro e renovação de registro de Medicamento fitoterápico-MF (segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas) e para o registro, renovação de registro e notificação de Produto Tradional Fitoterápico-PTF (segurança e efetividade baseadas na literatura técnico-científica) 6. É importante destacar que tanto MF como PTF são considerados medicamentos, possuindo os requisitos similares de fabricação e de qualidade, mais flexíveis para PTF 7.
Geralmente acredita-se que o risco associado ao uso deste tipo de medicamento é pequeno, mas uma série de registros envolvendo graves reações adversas ou ineficácia destes produtos mostra que esta percepção é errônea. Problemas envolvendo contaminação, adulteração e identificação incorreta das espécies vegetais envolvidas no preparo dos produtos fitofarmacêuticos tornam essencial o desenvolvimento de padrões técnicos na manufatura, de avaliações toxicológicas e de métodos analíticos que garantam a qualidade e segurança no uso destes produtos 8,9.
1.2. Cárie bucal e produtos naturais
Segundo dados da Pesquisa Nacional de Saúde Bucal, realizada pelo Ministério da Saúde em 2012, a cárie é a principal patologia que acomete a cavidade bucal, sendo encontrada em 56% da população brasileira 10. Ela tem início quando ocorre um desequilíbrio da microbiota residente na cavidade bucal, com o consequentemente acúmulo de certos microrganismos potencialmente cariogênicos que, somados a uma dieta rica em carboidratos (principalmente sacarose) podem levar à instalação da cárie dental 11,12. Em outros termos, trata-se de uma doença de origem bacteriana, que resulta na dissolução do esmalte dentário devido à ação de ácidos produzidos pelo processo de metabolismo bacteriano sobre os carboidratos fermentáveis da dieta.
Quando não estacionada, a cárie pode levar à desmineralização dos tecidos dentais e consequentemente à perda do dente 13,14. Além disso, as
culminando em doenças como estomatites, gengivites, aftas e ainda outras de maior gravidade, como o câncer bucal 15,16.
A principal estratégia para o controle da cárie é a remoção mecânica dos microrganismos cariogênicos através da escovação e do uso do fio dental, associados ao emprego de dentifrícios e enxaguatórios bucais contendo agentes antimicrobianos. Porém, muitos problemas relacionados à eficácia e segurança dos enxaguatórios têm sido observados, dentre os quais podem ser destacados a resistência microbiana (9,10,13) e os efeitos adversos de seus princípios ativos como pigmentação, alteração de paladar e descamação da mucosa18–20. Com base em tais questões, faz-se premente a necessidade do desenvolvimento de novos ingredientes ativos para incorporação em produtos de higiene bucal.
Neste sentido, nosso grupo de pesquisas vem investigando fitoquimicamente uma série de fontes botânicas e avaliando o potencial antimicrobiano dos constituintes isolados frente a bactérias causadoras de cárie 21–25. Em nossos estudos ao longo dos anos, temos demonstrado que os diterpenos constituem uma classe de metabólitos que tem apresentado resultados muito promissores 19,21. A seguir, será apresentada uma das espécies vegetais e o seu metabólito cujo potencial anticariogênico mereceu destaque durante estes estudos.
1.3. Mikania glomerata e ácido ent – caurenóico frente a patógenos bucais
Figura 1: Mikania glomerata. Fonte:
http://www.ufrgs.br/fitoecologia/florars/open_sp.php?img=11911, Data de acesso: 08-11-2016
Mikania glomerata (Figura 1) é uma espécie vegetal morfológica e
geograficamente bem representativa do gênero Mikania. Pertence à família Asteraceae e no Brasil é popularmente conhecido como ―Guaco‖ 26,27. Em termos fitoquímicos, esta planta é caracterizada pela presença de vários diterpenos do tipo caurano em sua composição, sendo o ácido ent-caurenóico (Figura 2) seu metabólito majoritário 28,29. Esta espécie possui ampla utilização na medicina popular brasileira para o tratamento de afecções do trato respiratório 28,30. sendo, por este motivo, facilmente disponível de forma comercial, já seca e pulverizada e contando com laudos que atestam autenticidade e qualidade.
H COOH
Figura 2: Estrutura do ácido ent-caurenóico (metabólito majoritário de M.
glomerata.).
Entre as atividades biológicas descritas, merece destaque o potencial antimicrobiano deste vegetal e de seu componente majoritário devido ao grande número de citações 22,26,29–35. Em Ambrósio et al (2008) 19 e De Andrade et al (2011) 22, nosso grupo de pesquisas demonstrou que o ácido ent-caurenóico apresentou valores de concentração inibitória mínima da ordem de 10,0 µg/mL para uma série de bactérias relacionadas à cárie (Lactobacillus
casei, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis e Streptococcus sobrinus), o que podem ser considerados como resultados
promissores na busca por novos agentes antimicrobianos 36,37.
1.4. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE-DAD O desenvolvimento de um método analítico envolve o estabelecimento do procedimento de extração ou síntese e das condições cromatográficas e a realização de alguns estudos preliminares quanto à seletividade, sensibilidade, linearidade, parâmetros a serem avaliados, procedimentos utilizados para avaliar parâmetros, critérios de aceitação, resposta do detector e forma de padronização. Segundo Oliveira 29, o desenvolvimento de um método analítico envolve, na verdade, cinco etapas: levantamento bibliográfico, seleção do método, desenvolvimento, otimização e validação.
A validação é um processo que fornece uma evidência documentada de que um método é confiável ao que se aplica. Consiste em uma série de procedimentos que visam assegurar credibilidade às medidas obtidas. É uma ferramenta para demonstrar que a metodologia analítica desenvolvida é capaz analisar a qualidade dos resultados analíticos, e determinar o teor dos ingredientes ativos da amostra em questão, e o resultado analítico sempra incluíra a variabilidade devido ao processo de medidas estar sujeito ao erro 38– 40. Deste modo, a validação é uma etapa muito importante e necessária para que um método analítico possa ser utilizado na rotina analítica. Porém, antes de iniciar o processo de validação, é necessário desenvolver o método a ser validado 41,42.
Além da necessidade de garantir a autenticidade e a qualidade de matérias primas vegetais ou de fitofarmacêuticos, existem razões legais que justificam a validação de métodos analíticos. No Brasil, a principal agência governamental que verifica a competência de laboratórios de ensaios é a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Para isso, ela disponibiliza um verdadeiro guia para o procedimento de validação de métodos analíticos 43. Segundo a RE n° 27/2012 ―Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos‖ da ANVISA 44, os métodos analíticos para testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas não descritas em farmacopéias ou formulários oficiais, será validada, desde que sejam avaliados os seguintes parâmetros:
detector, assegurando-se que o sinal medido não é influenciado por substâncias interferentes 41,42,44–46.
Linearidade: é a capacidade de um método analítico de gerar resultados proporcionais à concentração do composto em questão, dentro de uma faixa analítica especificada (Intervalo Dinâmico), sendo possível relacionar a resposta do detector à concentração 41,42,44,47.
Exatidão: é a relação entre o valor encontrado pelo método e o valor aceito como verdadeiro ou de referência. A exatidão é normalmente determinada por intermédio de, no mínimo, análises em três pontos: mais diluído da curva analítica, outra em média 40 a 60% do ponto mais concentrado e uma alta 75 a 95% do ponto mais concentrado 41,42,45,46. Outra forma de investigação consiste em comparar a média dos resultados obtidos com a média obtida do programa interlaboratorial, ou ainda por meio de estudos de recuperação de quantidades conhecidas do analito adicionado na matriz limpa da amostra ou ainda na matriz da amostra 47,48.
Precisão: consiste na habilidade do método de repetir o mesmo resultado obtendo a concordância entre os resultados, embora não neces-sariamente o correto, sempre que o procedimento é executado 41,42,45,46.
Robustez: é a habilidade do método em fornecer resultados inalterados quando sujeitos a pequenas mudanças como diferentes analistas, variações no pH e/ou concentração da fase móvel, alterações na performance da coluna, temperatura do ambiente etc 41,42,45,46.
1.5. Metodologias de Superfície de Resposta (MSR) para otimização de processos extrativos.
Otimizar significa melhorar a performance de um processo no sentido de se obter o máximo benefício a partir dele 49. Isto pode ser conseguido através da execução de uma série de experimentos cuidadosamente planejados para combinar alterações em variáveis independentes (variáveis de entrada) relacionadas ao processo a ser otimizado e utilizar uma série de ferramentas matemáticas e estatísticas, conhecidas como metodologia de superfície de resposta (MSR), para gerar um modelo empírico que permita identificar e quantificar o efeito das variáveis independentes em uma ou mais respostas (variáveis dependentes) 49,50. O termo ―metodologia de superfície de resposta‖ remete à forma dos gráficos gerados após a adequação dos dados obtidos ao modelo matemático empírico.
A MSR vem sendo amplamente utilizada com o intuito de analisar e otimizar as variáveis independentes que influenciam no rendimento de processos extrativos e no perfil de componentes bioativos (respostas; variáveis dependentes) presentes nos extratos de plantas medicinais e outros produtos naturais 51. Por exemplo, Wang et al (2013) e Anastácio et al (2013) utilizaram a MSR para otimizar os parâmetros de extração e as condições de enriquecimento para compostos fenólicos encontrados respectivamente em
Punica granatum e em cascas de batata doce 51,52. As condições de extração
de flavonoides e terpenos a partir de Gingko biloba foram objeto de estudo de Zhu et al (2011) 53, que realizaram um estudo também baseado em MSR para otimizar o processo mecânico-químico de extração destes metabólitos 53.
rendimento dos processos extrativos, no sentido de obter a maior massa de extrato em relação à massa de material vegetal de partida.
Experimentos planejados com esta finalidade são geralmente empregados sequencialmente. O primeiro experimento costuma ter muitas variáveis controláveis e é denomidado experimento exploratório (screening
experiment). Ele é projetado para determinar quais variáveis são mais
importantes e qual a direção do ajuste nesses fatores, logo os experimentos subsequentes são usados para refinar essa informação (experimento de otimização) e determinar quais ajustes são requeridos nessas variáveis de modo a encontrar a região que leva a resposta ótima 54,55.
Existem muitos tipos diferentes de design, que podem ser distinguidos pelo modelo de que são derivados: linear ou quadrático (com ou sem interações) ou ortogonais, que variam os fatores independentemente uns dos outros o que elimina as correlações entre os fatores 56.
A metodologia proposta pelo design experimental D-optimal custom é um design de otimização que segue a estratégia de combinação multivariada de fatores e requer um mínimo de dois fatores, podendo-se inserir variáveis qualitativas/categóricas. É possível também estudar vários fatores com um reduzido número de experimentos e mistura de níveis dos fatores qualitativos (até sete níveis). Ainda, disponibiliza a adaptação do design para cada problema analítico escolhendo os níveis requiridos para cada fator bem como as interações necessárias 57. Este design foi construído para minimizar a variação generalizada na estimativa dos coeficientes de regressão, se baseia no D-critério, que é a maximização da matriz determinante (M) da informação M=(X’X)/N, o X é o modelo da matriz e N é o número de experimentos do
design 58, o D-critério leva a um máximo de propagação dos experimentos da região de domínio, de modo que um volume máximo é ocupado e o domínio experimental é explorado, é útil quando a região experimental de interesse é irregular ou quando um design simétrico propõe um número muito grande de experimentos 59–61.
O D-optimal custom usa um modelo de regressão polinomial, os modelos de regressão polinomiais são amplamente usados nos casos em que a resposta é curvilínea, pois relações complexas não lineares podem ser adequadamente modelada por polinômios 55,62. O modelo de regressão polinomial se mostrou eficiente quando empregado em trabalhos em que o objetivo é aumentar o rendimento do conteúdo extraído ou na extração de metabólitos secundários como terpenos e flavonóides 63–66.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
2.1.1. Obter, avaliar o potencial antimicrobiano (frente a patógenos bucais) e caracterizar quimicamente um extrato de M. glomerata enriquecido em ácido ent-caurenóico e obtido a partir de fracionamento cromatográfico (GDH2);
2.1.2. Otimizar duas metodologias de obtenção de extratos de Mikania
glomerata, retirando a etapa cromatográfica procedimento no qual aumenta o
custo da produção de extrato, bem como, retirar o uso de diclorometano que se trata de um solvente agressivo ao meio ambiente desta forma de difícil descarte.
2.2. Objetivos Específicos
Com relação ao primeiro objetivo geral (item 2.1.1.):
Obter extrato com potencial anticariogênico, visando maximizar tanto o rendimento do processo extrativo quanto o teor do metabólito mais ativo para Mikania glomerata.
Desenvolver e validar método analítico por CLAE-DAD para identificar e quantificar o metabólito nos extratos vegetais.
Avaliar o potencial antimicrobiano in vitro dos extratos de maior rendimento e maior teor do metabólito ativo frente as principais bactérias cariogênicas.
Com relação ao segundo objetivo geral (2.1.2.):
Otimizar o processo extrativo no sentido de aumentar o rendimento em massa de extrato, retirando a etapa cromatográfica e o uso de diclorometano na obtenção do extrato. Definir as variáveis do processo extrativo possivelmente mais
significativas e estipular seus níveis para desenvolver o planejamento experimental usando a versão trial do Software Design Expert®
Confeccionar os extratos nas condições do planejamento experimental e análise dos teores pelo método analítico por CLAE-DAD.
Realizar estatística descritiva dos dados experimentais, tais como Média, Desvio padrão e aplicar a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) verificando o ajuste do modelo experimental, as variáveis significativas; avaliar a confiança da previsão de resultados, pelo teste estatístico ANOVA e Gráficos de diagnósticos e de superfície de respostas.
Confeccionar os extratos nas condições ótimas prevista para confirmar a previsão dada pelo modelo.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Aquisição do material vegetal
As partes aéreas de Mikania glomerata foram adquiridas junto a ―Nutriervas‖ (localizado em São Paulo, na Rua do Bucolismo nº.144 – Brás, CEP: 03008-040) na forma de droga seca e com certificação de autenticidade provida pelo fornecedor. O material foi pulverizado em moinho de facas e tamizado para padronização do tamanho das partículas (partículas ≤ 10 Mesh; 2.00 mm).
3.2. Obtenção do extrato enriquecido GDH2 e isolamento do ácido
ent-caurenóico.
Para a preparação do extrato bruto, 1000,00 g de M. glomerata. seca e pulverizada foram distribuídas em 4 erlenmeyers (250,00 g em cada) extraídas com 875 mL em cada erlenmeyer (3500 mL total) de diclorometano por 15 min. O procedimento extrativo foi repetido duas vezes e, após isso, o material resultante foi filtrado em papel de filtro. O sólido retido no papel foi descartado e o filtrado foi concentrado em rotaevaporador, originando 42,40 g do extrato bruto diclorometânico de Mikania glomerata (GD).
Para a partição do extrato bruto, tomou-se 42,00 g de extrato GD e solubilizou-se em 300 mL de uma solução metanol/H2O 9:1 (v/v). Em seguida, o material obtido foi filtrado em papel de filtro e o resíduo foi descartado. O filtrado consistiu em uma fração hidroalcoólica solúvel que foi submetida a partição em n-hexano (300 mL) com auxílio de funil de separação, sendo o procedimento repetido por outras três vezes. Após concentração em
rotaevaporador obteve-se a fração hexânica do extrato diclorometânico de M.
glomerata (GDH).
GDH (18,00 g) foi submetida a Cromatografia Líquida a Vácuo (CLV) utilizando-se 700,00 g de uma mistura de 1:1 de sílica gel 60 e sílica gel 60H como fase estacionária e, como fases móveis, misturas de n-hexano e acetato de etila em gradiente crescente de polaridade como descrito em Moreira et al (2016) 25.
A detecção da fração rica em (AC) ácido ent-caurenóico (GDH2) foi realizada através de Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada a detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD) utilizando padrão de comparação.
A Figura 3 apresenta o fluxograma com os procedimentos executados para a obtenção do extrato de Mikania glomerata rico em AC (GDH2).
Mikania glomerata (1000 g)
Concentrar em rotaevaporador Extrato diclorometano
Extrato diclorometano concentrado (GD) m = 42,40 g
Mikania glomerata
Partes aéreas extraídas com diclorometano
Desprezar resíduo - Ultrassom por 15 minutos com 3500 mL de diclorometano (3X) - Filtrar
- Solubilizar em 300 mL Metanol / H2O 9:1 (v/v) - Filtrar em papel de Filtro
Parte insolúvel Parte hidroalcoólica solúvel Hexano (4X 300 mL cada)
Fração obtida por partição em Hexano Concentrar em rotaevaporador
(GDH) m = 18,00 g
CLV
(GDH2) m = 4,30 g
Hexano (2000 mL) - Hexano / AcOEt 8:2 (400 mL)
- Concentrar em rotaevaporador
(GDH1) m = 2,40 g
Figura 3: Fluxograma ilustrativo do preparo da fração rica em AC GDH2.
O AC foi purificado após a lavagem dos cristais presentes na fração rica em AC de M. glomerata (GDH2) com MeOH resfriado, obtendo 800,00 mg de AC. Após este procedimento, o sólido branco resultante foi submetido a análises espectroscópicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C, permitindo confirmar a sua respectiva estrutura química (item 4.1).
3.3. Avaliação antimicrobiana frente a patógenos bucais
Os ensaios antimicrobianos foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada (LAPEMA), na Universidade de Franca, através da colaboração com o Prof. Dr. Carlos Henrique Martins.
Todas as bactérias utilizadas no estudo são gram-positivas e prove-nientes da American Type Culture Collection (ATCC). São elas: Streptococcus
sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mitis ATCC 49456, Lactobacillus casei
ATCC 11578, Streptococcus mutans ATCC 25275, Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC 10556, Enterococcus faecalis ATCC 4082.
A determinação da CIM (Concentração inibitória mínima) para cada microrganismo foi realizada em triplicata utilizando-se o método de microdiluição em microplacas 67. Um miligrama de GDH2 foi dissolvido em 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e será adicionado 1900 μL de Caldo Triptona Soja (TSB). A concentração final de DMSO não foi superior a 4% e a solução de DMSO nesta concentração foi utilizada como controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, culturas de 24 horas dos microrganismos foram transferidas para tubos contendo 10 mL de solução salina esterilizada. A suspensão foi padronizada comparando-a com o tubo 0,5 da escala de McFarland (0,1 mL de uma solução 1% de BaCl2 em 9,9 mL de uma solução 1% de H2SO4). Em seguida, foram realizadas diluições sucessivas em solução salina e por fim no Caldo Triptona Soja, de modo a fornecer um inóculo de 5 x 105 UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônias/mL).
diluído até a menor concentração de 0,195 µg/mL e a clorexidina testada na concentração de 59-0,115 µg/mL, permitindo determinar a concentração necessária para inibir o crescimento dos microrganismos a serem testados.
Em um dos orifícios de cada placa foi feito o controle da cultura, a qual deve apresentar crescimento bacteriano devido à ausência de agentes antimicrobianos. Em outro orifício foi feito o controle de esterilidade do Caldo Triptona Soja e em outro o controle do solvente (DMSO) utilizado para a solubilização do extrato. Como controle positivo foi utilizado o cloridrato de clorexidina, por se tratar de um agente anticariogênico muito utilizado como componente ativo de enxaguatórios bucais 19.
As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Posteriormente foram adicionados, em cada orifício, 30 μL de uma solução aquosa 0,02% de resazurina, sendo as placas reincubadas por 3 horas. A presença da coloração azul (coloração da solução de resazurina) foi interpretada como ausência de crescimento bacteriano.
3.3.2. Determinação da Concentração Bactericida Mínima As soluções para determinar o valor de Concentração Inibitória Mínima bacteriano (CIM) foram avaliadas também quanto à sua capacidade de causar a morte (concentração bactericida mínima, CBM) frente ao painel de microorganismos avaliados na (CIM) 18,68. Assim, uma solução contendo extrato em sua CIM foi inoculada juntamente com as bactérias selecionadas anteriormente (Item 3.3.1) em um novo meio de cultura esterilizado e apropriado para o crescimento do microrganismo em questão. O meio foi incubado a 37°C por 24 horas. O crescimento do microrganismo indicou que o
extrato na CIM é bacteriostático, enquanto que a ausência de crescimento em determinada concentração correspondeu ao seu valor de CBM 18,68.
3.3.3. Determinação da cinética antimicrobiana
A cinética da atividade bactericida (tempo de morte) foi avaliada pela determinação do tempo de morte do extrato frente a S. mutans. Para isto, culturas frescas do microrganismo foram diluídas até uma concentração de 1,0 X 105 UFC/mL e ressuspendidas em salina com tampão fosfato (PBS). Após a adição dos extratos em suas respectivas CBM, foram retiradas alíquotas em diversos tempos (inicialmente 0, 6, 12 minutos e 6, 12 e 24 horas) e colocadas em placas contendo meio BHI (Brain heart infusion) para contagem de colônias. Todo o procedimento foi realizado em triplicata e submetido à análise estatística 18,69.
3.3.4. Determinação da formação de biofilme
O ensaio de formação do biofilme foi realizado para verificar a capacidade de formação de biofilme do S. mutans, além de estabelecer a concentração do inóculo necessária e o período requerido para essa formação. O ensaio foi adaptado da técnica padronizada segundo Stepanovic et al. 70, a
qual propõe a formação do biofilme, por microdiluição, em microplacas esterilizadas de 96 poços, de fundo chato.
A padronização da formação do biofilme foi testada com inóculos bacterianos preparados nas concentrações de 109, 108, 107 e 106 UFC/mL,
Após a padronização da formação de biofilme avaliou-se a inibição da formação do biofilme formado pelo S. mutans pelo extrato GDH2, AC e cloridrato de clorexidina (controle positivo). Foi inicialmente avaliada a Concentração Inibitória Mínima do Biofilme (CIMB50), que é determinada pela menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir a formação do modo biofilme em 50%. O método utilizado foi similar ao realizado para a determinação da CIM em células planctônicas 71, com algumas modificações. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Preparadas as amostras e clorexidina, bem como, o inóculo (concentração de inóculo para 1,0 X 106 UFC/mL), procedeu-se o método da microdiluição em caldo para determinar a CIMB50.
Em microplacas esterilizadas de 96 poços foram adicionados a cada poço o caldo BHI, soluções do extrato GDH2, do AC e da clorexidina e a suspensão de S. mutans, obtendo-se um volume final de 100 µL por poço e atingindo as concentrações finais de 0,195 µg/mL a 400,00 µg/mL para o extrato GDH2 e AC e de 0,115 a 59,00 µg/mL para a clorexidina.
Foram também realizados os controles de esterilidade do caldo, do DMSO e das soluções-mãe do extrato GDH2, do AC e da clorexidina, bem como, o controle de crescimento do biofilme. As microplacas foram incubadas em microaerofilia, a 37 °C por 24 h. O ensaio foi realizado em triplicata.
A avaliação da inibição da formação dos biofilmes foi interpretada por duas metodologias: leitura por Densidade Óptica (D.O.) e contagem de microrganismos em UFC/mL.
Os ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Mutagênese, na Universidade de Franca, através da colaboração com a Profa. Dra. Denise Tavares Crispim
A linhagem celular utilizada no estudo de citotoxicidade e genotoxicidade foi a V79 (fibroblasto de pulmão de hamster Chinês). Essas células estão estocadas em fracos de cultura monocamadas (25 cm2) em uma solução com de meio de cultura (Ham F10 + DMEM, na proporção 1:1, Sigma-Aldrich), suplementado com 10% de soro bovino fetal (Nutricell), antibióticos (0,01 mg/mL estreptomicina e 0,005 mg/mL de penicilina; Sigma-Aldrich), e 2,38 mg/mL HEPES (Sigma-Aldrich), a 37ºC com 5% CO2. As células V79 foram usadas depois do 4º dia e não mais do que 12º dias. Esta linhagem célular tem um ciclo em uma média de 12 horas nas condições experimentais descritas.
O ensaio de eficiência clonogência foi usado para determinar a citotoxicidade para o extrato de Mikania glomerata enriquecido com ácido caurenóico (GDH2). As células foram tratadas por 3 horas com GDH2 em um intervalo de concentração entre 0,30 – 160,00 µg/mL. Os controles incluídos foram o negativo (não tratado), o solvente (MeOH, 0,4%) e o positivo (metanossulfonato de metila, MMS, 110,00 µg/mL). Logo após, as culturas foram tripsinizadas e as 300 células foram semeadas por frascos de cultura (três frascos por concentração). Os experimentos foram realizados por 10 dias. O meio de cultura foi então removido e as colônias foram lavadas com PBS (salina tamponada fosfatada) e corada com Giemsa (1:20 em tampão fosfato; pH 7,0) por 20 minutos. As colônias foram contadas sob uma lente de aumento
A avaliação da genotoxicidade da fração GDH2 foi realizada pelo teste de micronúcleos de acordo com Resende et al 2010 73. Para os testes, 0,5 x 106 células foram semeadas em frascos de cultura, e incubadas por dois ciclos (24 horas) e completados em 5 mL de meio HAM-F10/DMEM, e lavados com PBS, pH 7,4, e então submetidos ao tratamento em meio sem soro por 3 h com GDH2 (2,50; 5,00; 10,00 e 15,00 µg/mL). Foram incluídos os controles, negativo (não tratados), solvente (MeOH, 0,4%) e positivo (MMS, 44,00 µg/mL). No final deste período, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e adicionado soro fresco suplementado com meio contendo 3,00 µg/mL de citocalasina-B (Sigma-Aldrich), e as células foram incubadas por um adicional de 17 h. Para o resultado, as células foram tripsinizadas (0,025%) e foi adicionada a solução hipotônica de 1% de citrato de sódio a 37ºC. As células foram fixadas em metanol:ácido acético (3:1) e as lâminas foram coradas com Giemsa a 3,00% por 5 minutos. Os critérios estabelecidos por Fenech 74 foram usados para as análises de células micronucleadas e binucleadas. Um total de 3000 células binucleadas foram marcadas por tratamento, correspondendo a 1000 células/tratamento/repetição. Para a avaliação de citotoxicidade do tratamento foram analisadas 1500 células por tratamento, em um total de 500 células por repetição, e calculados o índice de divisão nuclear (IDN). Células com o citoplasma bem preservado contendo 1-4 núcleos foram marcados. O IDN foi calculado de acordo com Eastmond e Tucker 75 usando a formula:
( ) ( ) ( ) (Eq. 1)
Na fórmula M1-M4 é o número de células com 1, 2, 3 e 4 núcleos, respectivamento, e o N é o total numérico de células viáveis.
Adicionalmente, o índice de citotoxicidade (IC) de GDH2 foi calculado como descrito por Kirsch-Volders et al 76:
(
) (Eq. 2)
Em que IDNt é o IDN encontrado para os diferentes tratamentos, e o IDNc é o IDN para o controle negativo.
Sistema de teste in vivo: Para este experimento, foram usados camundongos Swiss machos (7-8 semanas de idade) com aproximadamente 30,00 g (peso corpóreo), obtidos da casa de animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, Campus Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. Os animais foram mantidos em caixas plásticas em uma sala experimental com condições controladas de temperatura (22 ± 2ºC) e humidade (50 ± 10%) no ciclo de 12 horas de luz claro/escura, com ração de rato padronizadas e água disponível ad libitum. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética para Cuidado Animal da Universidade de Franca (Protocolo 0031/10).
Os animais foram divididos dentre diferentes grupos experimentais de seis animais cada. Preliminarmente os estudos foram conduzidos para doses seletivas de GDH2 usando os critérios de citotoxicidade por Hayashi et al 77. Os sinais clínicos de toxicidade foram verificados em doses superiores a 1500 mg/kg p.c. As doses de GDH2 selecionadas para o ensaio de micronúcleos foram 250,00; 500,00; 1000,00 e 1500,00 mg/kg p.c. Os controles incluídos foram negativo (água), solvente (DMSO 1%) e positivo (40,00 mg/kg p.c, MMS, injeção intraperitoneal). As diferentes doses de GDH2 foram diluídos em DMSO
medula óssea foi realizado de acordo com o protocolo descrito por MacGregor
et al 1984 78. Um total de 2000 eritrócitos policromático (EPC) foram analisados
por animal para determinar a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN).O A relação de EPC:ENC (eritrócitos normocromático) foi calculado pela análise de 400 eritrócitos no sentido de determinar a citotoxicidade do tratamento 79. Lâminas foram coradas usando uma luz microscópica com uma imersão objetiva de 100X.
Os resultados para os ensaios de micronúcleos e cometa foram analisados estatisticamente por análise de variância por experimentos completamente randomizados, calculando os valores de significância estatísticas para F e p. Neste caso em que p < 0,05, as médias dos tratamentos foram comparados pelo teste Tukey e uma diferença mínima significativa foi calculado para α=0,05.
3.5. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE-DAD
O extrato anticariogênico GDH2 utilizado para o desenvolvimento e validação da metodologia analítica foi o extrato preparado conforme o item 3.2 de ―Materiais e Métodos‖.
Para essa etapa do trabalho, foi utilizado um sistema de CLAE (Shimadzu) com duas bombas modelo LC-20A Prominence composto de um injetor automático SIL-20A, forno para coluna CTO-20A, módulo de controle CBM-20A, degaseificador DGU-20A3 e detector de fotoarranjo de diodos SPD-M20A. O processamento dos dados foi realizado com o programa LC solution® versão 1.25 e as análises foram realizadas numa coluna Shim-pack CLC-ODS (25 cm X 4.6 mm de d.i.; 5 µm; Shimadzu).
Visando o desenvolvimento do método analítico, foram realizados experimentos preliminares baseados no gradiente exploratório descrito por Snyder & Dolan 80 para estimar as melhores condições. Para isto, 0,00208 g de GDH2 e 0,00075 g de manool (GlycoSyn®, Manool CAS:596-85, Número do produto: FC-019) (PI; respectivamente 416,00 µg/mL e 150,00 µg/mL) foram solubilizados e completados em até 5 mL de acetonitrila num balão volumétrico e filtradas em um filtro do tipo seringa UNIFLO 25/02 PTFE (Whatman/Schleicher & Schuell, Maidstone, UK). Em seguida, 20 µL desta solução foi injetada no cromatógrafo utilizando um sistema gradiente de eluição conforme o gráfico da Figura 4, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da coluna de 40 ºC e detecção em 201 nm. 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 t (min) % A cN
Figura 4: Gradiente exploratório proposto por Snyder & Dolan 80.
Após ajustes posteriores, foi estabelecido a utilização de um sistema isocrático de eluição com 90% de AcN em água contendo 0,1% de ácido acético a uma vazão 1,0 mL/min. Utilizou-se temperatura de 40 ºC para a
A seletividade do método foi atestada através da pureza espectral dos picos de AC em todas as amostras. Esta pureza foi determinada pelos dados espectrais do detector de fotoarranjo de diodos coletados nas regiões ascendente, superior e descendente dos picos e comparando-se com as respectivas regiões nos picos de AC obtidos na curva de calibração (padrão). Os espectros combinaram-se exatamente, demonstrando que não foram encontradas outras substâncias co-eluindo com o AC.
Para confecção da curva de calibração, foi confeccionado a solução-mãe (SM) na concentração de 500,00 µg/mL pesando 0,025 g de AC em um balão volumétrico de 50 mL sendo o volume completado com AcN. Partindo desta solução foram retirados os volumes de 4-1 mL e transferidos a outros quatro balões volumétricos de 5 mL e o volume completado até o menisco gerando as concentrações de 400,00; 300,00; 200,00 e 100,00 µg/mL, por fim as amostras nas concentrações de 80,00; 40,00 e 20,00 µg/mL foram preparadas retirando volume de 1 mL das amostras de 400,00; 200,00 e 100,00 µg/mL em seguida transferidos para outros três balões volumétricos de 5 mL e o volume completado até o menisco, conforme o esquema de diluições demonstrado na Figura 5.
500,00 mg/mL Solução-mãe (SM) 400,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 300,00 mg/mL 200,00 mg/mL 100,00 mg/mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 80,00 mg/mL 40,00 mg/mL 20,00 mg/mL 0,025 g de AC
q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN
q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN
q.s.p 50 mL AcN
Figura 5: Esquema de diluições de ácido caurenóico para elaboração da curva de calibração
Posteriormente, alíquotas de 20 µL destas soluções foram injetadas em triplicata no equipamento. Os dados obtidos foram utilizados para construir a curva de calibração em relação à concentração de AC. O coeficiente de correlação linear foi calculado utilizando-se o programa Microsoft Excel®.
Para os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) não utilizou-se o método pela RDC nº 27 de 2012 44, foram determinados seguindo as fórmulas matemáticas propostas por Kruve et al 2015, Li D. et al 2012 e Taverniers et al 2004 81–83, optando pelas fórmulas pois estas fornecem os valores das concentrações de LD e LQ, qu e consideram o desvio padrão
LQ = 10 σ/S (Eq.4)
A precisão intra-dia foi determinada através da análise de seis amostras e a precisão inter-dias foi analisada em dois dias consecutivos. A partir destas análises foram calculadas a concentração de AC em GDH2 e o respectivo desvio padrão relativo (DPR%). Para verificação da precisão inter-dias, as médias das concentrações de AC entre os dois dias foram comparadas através de teste t (p < 0,05) utilizando-se o programa GraphPad Prism®.
Para determinar a exatidão do método, amostras foram preparadas a partir da adição de AC em GDH2 em três níveis (baixo, médio e alto) de concentrações conhecidas, respectivamente 25,00; 50,00 e 100,00% da concentração determinada para GDH2 no ensaio de precisão intra-dia e então analisadas. A Figura 6, a seguir, apresenta o esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão do método analítico.
Precisão e exatidão 416,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 0,00208 g de GDH2 + 0,00075 g de manool Amostra 500 mL amostra 500 mL amostra+ q.s.p 300 mL AcN 500 mL amostra + q.s.p 450 mL AcN Alta concentração (100% de ácido caurenóico) 500,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 0,0025 g de ácido caurenóico Padrão 1000 mL padrão 700 mL padrão Precisão Intra-dia: Injetar 20mL da amostra 18 vezes Inter-dias: Injetar 20mL da amostra 18 vezes após finalizar exatidão
Exatidão
Injetar cada concentração (alta, média e baixa) em triplicata
Média concentração
(50% de ácido caurenóico) (25% de ácido caurenóico)Baixa concentração 550 mL padrão
Figura 6: Fluxograma do esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão do método analítico
A robustez do método cromatográfico foi determinada segundo o design experimental de Plackett-Burman descrito por Heyden et al 84. Para isso, foram selecionados aleatoriamente fatores operacionais relacionados ao método cromatográfico, tais como: vazão da fase móvel, temperatura da coluna, porcentagem do solvente orgânico na fase móvel (% B), comprimento de onda do detector e volume da amostra injetada (Tabela 1).
Tabela 1: Fatores e níveis investigados na robustez, e suas abreviações e unidades.
Fatores Abreviação Unidades Limites Nível (-1)
Nível
(+1) Nominal Vazão da fase móvel Vel. mL/min ± 0,1 0,9 1,1 1,0 Temperatura da coluna Temp. oC ± 5 35 45 40 Porcentagem de solvente orgânico na fase móvel (%B) %B % ± 1 89 91 90 Comprimento de onda do detector λ nm ± 5 196 206 201 Volume de amostra injetado Inj. µL ± 1 19 21 20
Foram estabelecidos então níveis de variação para cada um desses fatores a partir do método desenvolvido. Estes níveis foram representados como (-1) e (+1), quando relativos respectivamente a variações abaixo e acima dos valores nominais (Tabela 1) e foram divididos em oito experimentos, conforme estipulado pelo design experimental de Plackett-Burman 84. Deve ser mencionado que dois fatores fictícios foram adicionados de modo a atingir a saturação do design experimental. Cada experimento foi conduzido conforme as variações pré-definidas para os limites de variação −1 e +1 de cada fator e uma resposta y foi obtida ao fim de cada um destes experimentos (Tabela 2).
As respostas selecionadas para o estudo de robustez foram a área do pico e o tempo de retenção relativo (trr) do AC, foram escolhidas por serem os critérios de maior relevância em se tratando dos aspectos cromatográficos. Entre as oito respostas obtidas, o efeito estimado foi calculado para cada fator levando-se em conta as respostas selecionadas conforme a seguinte equação:
2
/
)
(
2
/
)
(
E
xN
y
N
y
(Eq. 5)Na fórmula E é o efeito estimado para a resposta selecionada x; x é a área do pico ou o trr para o AC; ∑y(+) é a somatória das respostas em nível positivo; ∑y(−) é a soma das respostas em nível negativo e N é o número de experimentos. Para melhorar a interpretação dos resultados para os estudos de robustez, o efeito estimado Ex foi convertido utilizando-se a equação DPR% = (S/X) 100 no qual DPR% é o desvio padrão relativo, S é o valor de Ex e X representa as médias das respostas y, considerando-se diferentes respostas e fatores.
Tabela 2: Design experimental de Plackett–Burman para sete fatores e oito experimentos [17] Experimento no. Fatores Resposta A B C D E F G
Vel. Temp. Fictício 1 %B λ Inj. Fictício 2
1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 y1 2 -1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 y2 3 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 y3 4 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 y4 5 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 y5 6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 y6 7 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 y7 8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 y8
3.6. Planejamento experimental para obtenção dos extratos de
Mikania glomerata por procedimentos não cromatográficos.
possibilita analisar a relação entre as respostas mensurada com os fatores envolvidos para entender o comportamento do processo experimental e dessa maneira otimizar as relações entre os fatores melhorando a resposta.
Esta etapa do trabalho teve como objetivo elaborar um novo processo extrativo para a obtenção de extrato ativo à base de Mikania glomerata visando eliminar a etapa cromatográfica. Para este fim, foram elaborados dois métodos extrativos, um por maceração e outro por ultrassom.
Para planejar os procedimentos extrativos utilizou-se o desenho experimental D-Optimal custom do programa Design Expert® 7.0 (versão 7, Stat-Ease, INc.,MN). Para tal, foram considerandos três níveis (-1, 0, +1) entre as três variáveis envolvidas no processo extrativo, respectivamente a Relação solvente por sólido (grama de pó vegetal) - X1, Tempo de extração - X2 em dias ou minutos e a variável qualitativa ou categórica Tipo de solvente -X3 (n-hexano, acetato de etila, álcool etílico). Na otimização objetivou-se aumentar o rendimento de massa de extrato (%), resposta Y, como descrito em detalhes na Tabela 3 a seguir.
Tabela 3: Código e níveis das variáveis independentes usadas no planejamento experimental.
Variáveis independentes Código Unidade Níveis
-1 0 1
Rs/s – Solvente / sólido X1 mL/g 10 20 30
t - Tempo extração X2 Minutos (EUMG) Dias (EMMG) 30 3 60 6 90 9 *Solvente-Hex, AcOEt, EtOH X3 - Hex AcOEt EtOH
A equação matemática que descreve a resposta de interesse é dada pelo programa. Nesta abordagem, a resposta Y (Rendimento em Massa %) é representada pela equação polinomial:
(Eq.6)
Na fórmula Y é a resposta medida associada com a combinação entre cada nível dos fatores, b0 é a média das respostas mensuradas, e X1, X2 e X3
são as variáveis independentes, e b1, b2 e b3 são os coeficientes de regressão para as variáveis independentes X1, X2, X3..., X1X2, enquanto são os
termos quadráticos da equação. Os experimentos foram realizados em uma ordem aleatória (randomizada) para minimizar os efeitos inesperados da variabilidade na resposta observada devido a fatores desconhecidos.
A significância estatística de cada coeficiente de regressão para Y foram determinadas usando análises de variância (ANOVA). Os critérios usados na seleção de um modelo apropriado é considerando um valor de p para o modelo <0,05, para a falta de ajuste >0,05 e coeficiente de determinação (R2) >0,8 49,63,85,87. Um valor de p para o modelo <0.05 demonstra que a probabilidade de o modelo estar incorreto é menor que 5%, mas o modelo ser significativo não necessariamente significa que explica corretamente a variação nos dados 88,89. Neste sentido, o coeficiente de determinação R2, e o valor correspondente ajustado serão usados para avaliar o ajuste adequado do modelo de regressão 90,91. O coeficiente de determinação da predição, também são aplicados indicando a habilidade de prever do modelo de regressão.
versus Fatores) foram confeccionados para validar a ANOVA. Para estimar as condições ótimas os coeficientes foram utilizados juntamente com gráficos de superfície de resposta (de contorno e gráfico 3D).
Primeiramente pesou-se 3,00 g de pó vegetal (< 48 Mesh), adicionava-se acetato de etila na proporção 20,00 ml/g de pó vegetal, e este material foi então submetido a maceração por 6 dias ou no caso do ultrasom por 60 minutos, logo após o material foi filtrado usando funil de Buchner e transferido a um recipiente rotulado e tarado.
A seguir, são apresentadas as etapas de otimização, tais como foram concebidas pelo planejamento experimental descrito.
3.6.1. Extração por maceração (EMMG) e por ultrassom (EUMG).
Os extratos (EMMG 1-22 experimentos) foram obtidos por maceração do pó de Mikania glomerata seguindo a Relação solvente por sólido (Rs/s, respectivo X1), Tempo de extração (t, respectivo X2) e tipo do solvente como descrito na Tabela 4, todos os experimentos foram mantidos em temperatura controlada a 25 ºC em incubadora MA 415 (Marconi). Depois foram filtrados usando um funil de Buchner conectado a um frasco kitasato acoplado a uma bomba de vácuo, e filtrados em papel circular de 7.0 cm, Whatman Nº 41. Os líquidos filtrados foram transferidos a béqueres codificados (EMMG 1 – EMMG 22).
Já os extratos (EUMG 1-22 experimentos) foram obtidos por sonificação do pó de M. glomerata em Ultrassom (UNIQUE), model Ultracleaner 1400 (USC-1400), frequência US: 40 KHZ, consumo 80 VA, também seguindo as
condições experimentais previamente determinados na Tabela 4. Em seguida foram filtrados pelo funil de Buchner e transferidos béqueres codificados.
Tabela 4: As condições proposta pelo D-Optimal custom estão descritas nos 22 experimentos para as duas metodologias de extrativas.
EXP EMMG EUMG Rs/s (ml.g-1) t (dias) Solvente* Rs/s (ml.g-1) t (min) Solvente* 1 10 3 Hex 10 90 Hex 2 20 3 Hex 20 30 Hex 3 30 3 Hex 30 30 Hex 4 20 6 Hex 20 60 Hex 5 20 6 Hex 20 60 Hex 6 20 6 Hex 20 60 Hex 7 10 9 Hex 30 60 Hex 8 20 9 Hex 10 90 Hex 9 30 9 Hex 30 90 Hex 10 10 3 AcOet 10 30 AcOet 11 20 3 AcOet 20 30 AcOet 12 30 3 AcOet 10 60 AcOet 13 10 6 AcOet 20 60 AcOet 14 10 9 AcOet 30 60 AcOet 15 30 9 AcOet 20 90 AcOet 16 20 3 EtOH 20 90 AcOet 17 20 3 EtOH 10 30 EtOH 18 10 6 EtOH 20 30 EtOH 19 10 6 EtOH 20 30 EtOH 20 30 6 EtOH 10 90 EtOH 21 30 6 EtOH 30 90 EtOH 22 20 9 EtOH 30 90 EtOH
