3. MATERIAL E MÉTODOS
3.4. Avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade
Os ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Mutagênese, na Universidade de Franca, através da colaboração com a Profa. Dra. Denise Tavares Crispim
A linhagem celular utilizada no estudo de citotoxicidade e genotoxicidade foi a V79 (fibroblasto de pulmão de hamster Chinês). Essas células estão estocadas em fracos de cultura monocamadas (25 cm2) em uma solução com de meio de cultura (Ham F10 + DMEM, na proporção 1:1, Sigma-Aldrich), suplementado com 10% de soro bovino fetal (Nutricell), antibióticos (0,01 mg/mL estreptomicina e 0,005 mg/mL de penicilina; Sigma-Aldrich), e 2,38 mg/mL HEPES (Sigma-Aldrich), a 37ºC com 5% CO2. As células V79 foram usadas depois do 4º dia e não mais do que 12º dias. Esta linhagem célular tem um ciclo em uma média de 12 horas nas condições experimentais descritas.
O ensaio de eficiência clonogência foi usado para determinar a citotoxicidade para o extrato de Mikania glomerata enriquecido com ácido caurenóico (GDH2). As células foram tratadas por 3 horas com GDH2 em um intervalo de concentração entre 0,30 – 160,00 µg/mL. Os controles incluídos foram o negativo (não tratado), o solvente (MeOH, 0,4%) e o positivo (metanossulfonato de metila, MMS, 110,00 µg/mL). Logo após, as culturas foram tripsinizadas e as 300 células foram semeadas por frascos de cultura (três frascos por concentração). Os experimentos foram realizados por 10 dias. O meio de cultura foi então removido e as colônias foram lavadas com PBS (salina tamponada fosfatada) e corada com Giemsa (1:20 em tampão fosfato; pH 7,0) por 20 minutos. As colônias foram contadas sob uma lente de aumento
A avaliação da genotoxicidade da fração GDH2 foi realizada pelo teste de micronúcleos de acordo com Resende et al 2010 73. Para os testes, 0,5 x 106 células foram semeadas em frascos de cultura, e incubadas por dois ciclos (24 horas) e completados em 5 mL de meio HAM-F10/DMEM, e lavados com PBS, pH 7,4, e então submetidos ao tratamento em meio sem soro por 3 h com GDH2 (2,50; 5,00; 10,00 e 15,00 µg/mL). Foram incluídos os controles, negativo (não tratados), solvente (MeOH, 0,4%) e positivo (MMS, 44,00 µg/mL). No final deste período, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e adicionado soro fresco suplementado com meio contendo 3,00 µg/mL de citocalasina-B (Sigma-Aldrich), e as células foram incubadas por um adicional de 17 h. Para o resultado, as células foram tripsinizadas (0,025%) e foi adicionada a solução hipotônica de 1% de citrato de sódio a 37ºC. As células foram fixadas em metanol:ácido acético (3:1) e as lâminas foram coradas com Giemsa a 3,00% por 5 minutos. Os critérios estabelecidos por Fenech 74 foram usados para as análises de células micronucleadas e binucleadas. Um total de 3000 células binucleadas foram marcadas por tratamento, correspondendo a 1000 células/tratamento/repetição. Para a avaliação de citotoxicidade do tratamento foram analisadas 1500 células por tratamento, em um total de 500 células por repetição, e calculados o índice de divisão nuclear (IDN). Células com o citoplasma bem preservado contendo 1-4 núcleos foram marcados. O IDN foi calculado de acordo com Eastmond e Tucker 75 usando a formula:
( ) ( ) ( ) (Eq. 1)
Na fórmula M1-M4 é o número de células com 1, 2, 3 e 4 núcleos, respectivamento, e o N é o total numérico de células viáveis.
Adicionalmente, o índice de citotoxicidade (IC) de GDH2 foi calculado como descrito por Kirsch-Volders et al 76:
(
) (Eq. 2)
Em que IDNt é o IDN encontrado para os diferentes tratamentos, e o IDNc é o IDN para o controle negativo.
Sistema de teste in vivo: Para este experimento, foram usados camundongos Swiss machos (7-8 semanas de idade) com aproximadamente 30,00 g (peso corpóreo), obtidos da casa de animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, Campus Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. Os animais foram mantidos em caixas plásticas em uma sala experimental com condições controladas de temperatura (22 ± 2ºC) e humidade (50 ± 10%) no ciclo de 12 horas de luz claro/escura, com ração de rato padronizadas e água disponível ad libitum. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética para Cuidado Animal da Universidade de Franca (Protocolo 0031/10).
Os animais foram divididos dentre diferentes grupos experimentais de seis animais cada. Preliminarmente os estudos foram conduzidos para doses seletivas de GDH2 usando os critérios de citotoxicidade por Hayashi et al 77. Os sinais clínicos de toxicidade foram verificados em doses superiores a 1500 mg/kg p.c. As doses de GDH2 selecionadas para o ensaio de micronúcleos foram 250,00; 500,00; 1000,00 e 1500,00 mg/kg p.c. Os controles incluídos foram negativo (água), solvente (DMSO 1%) e positivo (40,00 mg/kg p.c, MMS, injeção intraperitoneal). As diferentes doses de GDH2 foram diluídos em DMSO
medula óssea foi realizado de acordo com o protocolo descrito por MacGregor
et al 1984 78. Um total de 2000 eritrócitos policromático (EPC) foram analisados
por animal para determinar a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN).O A relação de EPC:ENC (eritrócitos normocromático) foi calculado pela análise de 400 eritrócitos no sentido de determinar a citotoxicidade do tratamento 79. Lâminas foram coradas usando uma luz microscópica com uma imersão objetiva de 100X.
Os resultados para os ensaios de micronúcleos e cometa foram analisados estatisticamente por análise de variância por experimentos completamente randomizados, calculando os valores de significância estatísticas para F e p. Neste caso em que p < 0,05, as médias dos tratamentos foram comparados pelo teste Tukey e uma diferença mínima significativa foi calculado para α=0,05.
3.5. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE-DAD
O extrato anticariogênico GDH2 utilizado para o desenvolvimento e validação da metodologia analítica foi o extrato preparado conforme o item 3.2 de ―Materiais e Métodos‖.
Para essa etapa do trabalho, foi utilizado um sistema de CLAE (Shimadzu) com duas bombas modelo LC-20A Prominence composto de um injetor automático SIL-20A, forno para coluna CTO-20A, módulo de controle CBM-20A, degaseificador DGU-20A3 e detector de fotoarranjo de diodos SPD-M20A. O processamento dos dados foi realizado com o programa LC solution® versão 1.25 e as análises foram realizadas numa coluna Shim-pack CLC-ODS (25 cm X 4.6 mm de d.i.; 5 µm; Shimadzu).
Visando o desenvolvimento do método analítico, foram realizados experimentos preliminares baseados no gradiente exploratório descrito por Snyder & Dolan 80 para estimar as melhores condições. Para isto, 0,00208 g de GDH2 e 0,00075 g de manool (GlycoSyn®, Manool CAS:596-85, Número do produto: FC-019) (PI; respectivamente 416,00 µg/mL e 150,00 µg/mL) foram solubilizados e completados em até 5 mL de acetonitrila num balão volumétrico e filtradas em um filtro do tipo seringa UNIFLO 25/02 PTFE (Whatman/Schleicher & Schuell, Maidstone, UK). Em seguida, 20 µL desta solução foi injetada no cromatógrafo utilizando um sistema gradiente de eluição conforme o gráfico da Figura 4, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da coluna de 40 ºC e detecção em 201 nm. 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 t (min) % A cN
Figura 4: Gradiente exploratório proposto por Snyder & Dolan 80.
Após ajustes posteriores, foi estabelecido a utilização de um sistema isocrático de eluição com 90% de AcN em água contendo 0,1% de ácido acético a uma vazão 1,0 mL/min. Utilizou-se temperatura de 40 ºC para a
A seletividade do método foi atestada através da pureza espectral dos picos de AC em todas as amostras. Esta pureza foi determinada pelos dados espectrais do detector de fotoarranjo de diodos coletados nas regiões ascendente, superior e descendente dos picos e comparando-se com as respectivas regiões nos picos de AC obtidos na curva de calibração (padrão). Os espectros combinaram-se exatamente, demonstrando que não foram encontradas outras substâncias co-eluindo com o AC.
Para confecção da curva de calibração, foi confeccionado a solução-mãe (SM) na concentração de 500,00 µg/mL pesando 0,025 g de AC em um balão volumétrico de 50 mL sendo o volume completado com AcN. Partindo desta solução foram retirados os volumes de 4-1 mL e transferidos a outros quatro balões volumétricos de 5 mL e o volume completado até o menisco gerando as concentrações de 400,00; 300,00; 200,00 e 100,00 µg/mL, por fim as amostras nas concentrações de 80,00; 40,00 e 20,00 µg/mL foram preparadas retirando volume de 1 mL das amostras de 400,00; 200,00 e 100,00 µg/mL em seguida transferidos para outros três balões volumétricos de 5 mL e o volume completado até o menisco, conforme o esquema de diluições demonstrado na Figura 5.
500,00 mg/mL Solução-mãe (SM) 400,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 300,00 mg/mL 200,00 mg/mL 100,00 mg/mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 80,00 mg/mL 40,00 mg/mL 20,00 mg/mL 0,025 g de AC
q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN
q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN q.s.p 5 mL AcN
q.s.p 50 mL AcN
Figura 5: Esquema de diluições de ácido caurenóico para elaboração da curva de calibração
Posteriormente, alíquotas de 20 µL destas soluções foram injetadas em triplicata no equipamento. Os dados obtidos foram utilizados para construir a curva de calibração em relação à concentração de AC. O coeficiente de correlação linear foi calculado utilizando-se o programa Microsoft Excel®.
Para os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) não utilizou-se o método pela RDC nº 27 de 2012 44, foram determinados seguindo as fórmulas matemáticas propostas por Kruve et al 2015, Li D. et al 2012 e Taverniers et al 2004 81–83, optando pelas fórmulas pois estas fornecem os valores das concentrações de LD e LQ, qu e consideram o desvio padrão
LQ = 10 σ/S (Eq.4)
A precisão intra-dia foi determinada através da análise de seis amostras e a precisão inter-dias foi analisada em dois dias consecutivos. A partir destas análises foram calculadas a concentração de AC em GDH2 e o respectivo desvio padrão relativo (DPR%). Para verificação da precisão inter-dias, as médias das concentrações de AC entre os dois dias foram comparadas através de teste t (p < 0,05) utilizando-se o programa GraphPad Prism®.
Para determinar a exatidão do método, amostras foram preparadas a partir da adição de AC em GDH2 em três níveis (baixo, médio e alto) de concentrações conhecidas, respectivamente 25,00; 50,00 e 100,00% da concentração determinada para GDH2 no ensaio de precisão intra-dia e então analisadas. A Figura 6, a seguir, apresenta o esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão do método analítico.
Precisão e exatidão 416,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 0,00208 g de GDH2 + 0,00075 g de manool Amostra 500 mL amostra 500 mL amostra+ q.s.p 300 mL AcN 500 mL amostra + q.s.p 450 mL AcN Alta concentração (100% de ácido caurenóico) 500,00 mg/mL q.s.p 5 mL AcN 0,0025 g de ácido caurenóico Padrão 1000 mL padrão 700 mL padrão Precisão Intra-dia: Injetar 20mL da amostra 18 vezes Inter-dias: Injetar 20mL da amostra 18 vezes após finalizar exatidão
Exatidão
Injetar cada concentração (alta, média e baixa) em triplicata
Média concentração
(50% de ácido caurenóico) (25% de ácido caurenóico)Baixa concentração 550 mL padrão
Figura 6: Fluxograma do esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão do método analítico
A robustez do método cromatográfico foi determinada segundo o design experimental de Plackett-Burman descrito por Heyden et al 84. Para isso, foram selecionados aleatoriamente fatores operacionais relacionados ao método cromatográfico, tais como: vazão da fase móvel, temperatura da coluna, porcentagem do solvente orgânico na fase móvel (% B), comprimento de onda do detector e volume da amostra injetada (Tabela 1).
Tabela 1: Fatores e níveis investigados na robustez, e suas abreviações e unidades.
Fatores Abreviação Unidades Limites Nível (-1)
Nível
(+1) Nominal Vazão da fase móvel Vel. mL/min ± 0,1 0,9 1,1 1,0 Temperatura da coluna Temp. oC ± 5 35 45 40 Porcentagem de solvente orgânico na fase móvel (%B) %B % ± 1 89 91 90 Comprimento de onda do detector λ nm ± 5 196 206 201 Volume de amostra injetado Inj. µL ± 1 19 21 20
Foram estabelecidos então níveis de variação para cada um desses fatores a partir do método desenvolvido. Estes níveis foram representados como (-1) e (+1), quando relativos respectivamente a variações abaixo e acima dos valores nominais (Tabela 1) e foram divididos em oito experimentos, conforme estipulado pelo design experimental de Plackett-Burman 84. Deve ser mencionado que dois fatores fictícios foram adicionados de modo a atingir a saturação do design experimental. Cada experimento foi conduzido conforme as variações pré-definidas para os limites de variação −1 e +1 de cada fator e uma resposta y foi obtida ao fim de cada um destes experimentos (Tabela 2).
As respostas selecionadas para o estudo de robustez foram a área do pico e o tempo de retenção relativo (trr) do AC, foram escolhidas por serem os critérios de maior relevância em se tratando dos aspectos cromatográficos. Entre as oito respostas obtidas, o efeito estimado foi calculado para cada fator levando-se em conta as respostas selecionadas conforme a seguinte equação:
2
/
)
(
2
/
)
(
E
xN
y
N
y
(Eq. 5)Na fórmula E é o efeito estimado para a resposta selecionada x; x é a área do pico ou o trr para o AC; ∑y(+) é a somatória das respostas em nível positivo; ∑y(−) é a soma das respostas em nível negativo e N é o número de experimentos. Para melhorar a interpretação dos resultados para os estudos de robustez, o efeito estimado Ex foi convertido utilizando-se a equação DPR% = (S/X) 100 no qual DPR% é o desvio padrão relativo, S é o valor de Ex e X representa as médias das respostas y, considerando-se diferentes respostas e fatores.
Tabela 2: Design experimental de Plackett–Burman para sete fatores e oito experimentos [17] Experimento no. Fatores Resposta A B C D E F G
Vel. Temp. Fictício 1 %B λ Inj. Fictício 2
1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 y1 2 -1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 y2 3 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 y3 4 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 y4 5 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 y5 6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 y6 7 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 y7 8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 y8