GENETICA

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GENÉTICA

É a ciência que estuda a

hereditariedade

Estuda os

gens

Estuda como a expressão da informação dentro de um organismo determina as características particulares daquele organismo

Cromossomos são estruturas celulares que transportam fisicamente a informação hereditária, é onde se encontram os genes

Genes são segmentos de DNA

DNA é uma macromolécula composta de unidades repetidas denominadas nucleotídeos

Nucleotídeos consistem de uma base nitrogenada (adenina, timina, citosina ou guanina), uma desoxirribose (1 açúcar pentose) e um grupo fosfato

As duas fitas são mantidas juntas por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.

Os pares de bases são sempre específicos, as fitas de DNA são complementares.

O código genético, determinado por uma seqüência de nucleotídeos, é convertida em uma seqüência de aminoácidos de uma proteína

DNA TRANSCRIÇÃO MRNA

TRADUÇÃO

AMINOÁCIDOS

Pares CG - três pontes de hidrogênio Pares AT - duas pontes de hidrogênio

Uma típica célula animal tem cerca de 3x109 pares de bases - Livro com mais de 500000 páginas!

3 1869 - DNA = Ácido desoxiribonúcleico

DNA - Ácido doxirribonucléico

- Dupla hélice, com as bases no centro da molécula e as unidades de deoxiribose e fosfato no exterior.

- Cadeias complementares - C e T – Pirimidinas (1 anel) - A e G – Purinas (2 aneis)

- DNA tem que permitir a transmissão de informação para as células filhas de forma estável e fiável.

- Tem que ser passível de replicação - Tem que ser capaz de mutar

-1953 - Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin e Maurice Wilkens, Difração de raios X:

5 Replicação do DNA

1. Replicação Conservativa – Produção de molécula de DNA inteiramente nova.

2. Replicação Semiconservativa –uma das cadeias do DNA provem da molécula original e a outra nova. As cadeias originais servem de modelo para a síntese das novas cadeias.

3. Replicação Dispersiva – Envolve a quebra da molécula de DNA original e a reconstrução de novas moléculas a partir destes fragmentos.

Experiência de Meselson-Stahl:

Crescimento de E. coli em meio contendo 15N (a substituir

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N). As bactérias resultantes apresentaram 50% do DNA com

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N e 50% com 14N. A replicação do DNA é semi-conservativa.

Células procariotas - Uma RNA polimerase Céluas eucariotas - Três RNA polimerases

Células procariotas - Uma RNA polimerase Céluas eucariotas - Três RNA polimerases

RNA polimerase I -

Transcreve os rRNA's de elevado peso molecular (18s, 28s e 45s)

RNA polimerase II -

Transcreve os mRNA's

RNA polimerase III -

Transcreve os rRNA's de baixo peso molecular (5S) e tRNA's

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CÓDIGO GENÉTICO

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Porque é que o DNA teria sido selecionado como

material genético?

É mais estável que o RNA

Mais fácil de replicar

Permite a ação de mecanismos de reparação que

usa a cadeia intacta como modelo.

Natureza das mutações Transformação química Erros de replicação Erros na divisão celular

Integração de elementos genéticos móveis.

A taxa de mutação numa célula

Em células eucarióticas - 10-9. Um gene com 103 nucleótidos codificantes sofre uma mutação em cada 106 gerações celulares.

15 Engenharia genética - Capacidade de manipular ácidos nucléicos de forma bem definida e controlada. As ferramentas que o permitem são as enzimas capazes de atuarem sobre ácidos nucléicos.

Enzimas de restrição (endonucleases) - Reconhecem pequenas sequências de DNA e "cortam" DNA de dupla cadeia nos locais ou próximos dos locais de reconhecimento.

Estabelecimento de mapas de restrição

Fragmentação de DNA para posterior análise noutras técnicas

Aplicações Geração de fragmentos passíveis de serem clonados em vetores apropriados

Produção de fragmentos de DNA para serem usados como sondas em diferentes técnicas Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e

metilação. Têm sequências de reconhecimento específicas, mas cortam de forma inespecífica dentro da sequência de reconhecimento.

Enzimas de

restrição

Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilação é feita por proteínas diferentes. Cortam sequências específicas de forma também específica.

Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Cortam sequências específicas de forma também específica.

Enzimas tipo II - As mais utilizadas em biologia molecular.

GGATCC CCTAGG

Corte no eixo de simetria - "blunt ends" Corte "em escada" - "sticky ends"

"Isoschizomers" - Enzimas que reconhecem a mesma

sequência de DNA.

Terminações compatíveis - Terminações idênticas de

DNA produzidas por enzimas diferentes. Fragmentos de DNA com terminações compatíveis podem ser ligados entre si.

Enzimas de restrição - Têm origem em células

procarióticas, onde são usadas para degradar DNA exógeno (especialmente DNA bacteriófago). Os organismos que produzem enzimas de restrição protegem o seu próprio DNA por metilação das sequências de reconhecimento das enzimas.

17 Projeto do Genoma Humano

Objetivo – Clonagem e caracterização molecular de genomas de diferentes espécies seqüência completa do genoma. Tarefa fácil? - Genoma humano – 3x109 bp - Nº de genes estimado – 200 000 Qual o interesse?

1- Os clones e marcadores genéticos obtidos proporcionam excelentes ferramentas de manipulação e diagnóstico genético.

2- O genoma é o cerne de qualquer organismo e contém toda a informação necessária para a sua sobrevivência e organização.

3- O conhecimento da sua estrutura e sequência providenciarão a base do conhecimento para perguntas como: Porque um organismo é diferente de outro?

4- O conhecimento do genoma humano permitirá caracterizar e talvez tratar, extensivamente todas as doenças de origem genética.

1. Classificação do DNA eucariótico.

Ferramentas

1- Mapeamento genético – Permite determinar a localização relativa de marcadores genéticos específicos ao longo de um cromossoma.

2- Mapeamento físico – Permite determinar a localização física de marcadores genéticos no genoma.

19 Biotecnologia

- Mecanismos genéticos básicos - Manipulação enzimática de ácidos nucléicos

- Extração de ácidos nucleícos - Vetores de clonagem

- Técnicas de análise de DNA e RNA - Bibliotecas de DNA

Manipulação de

sequências conhecidas de DNA.

- Mapeamento e sequenciação de genomas de diferentes organismos

Manipulação da

Expressão de genes recombinantes e organismos transgênicos

Expressão de transgenes eucarióticos em bactérias

Produção de factor VII (factor de coagulação do sangue humano) – Hemofilia

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23 Expressão de transgenes em eucariotas

Utilização do plasmídeo Ti em Plantas

Plasmídeo Ti

- Ocorre naturalmente numa bactéria do solo – Agrobacterium tumefaciens

- O T-DNA do plasmídeo Ti é responsável pela doença “Crown gall”

- O plasmídeo Ti aumenta a proliferação das células que infecta (tumor) e utiliza-as para produzir opinas que a bactéria é capaz de metabolizar.

- É o único vector usado rotineiramente para produzir Plantas transgénicas.

25 Características:

- Resistência a herbicidas (sementes de soja). - Resistência a Insetos (milho, algodão e batata). - Agricultura molecular Plantas produtoras de

Produção de Activador de plasminogénio tecidular (anti-coagulante) em Animais – Doenças vasculares.

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Por que exprimir transgenes em sistemas eucariotas?

- Uma grande parte das proteínas eucariotas (especialmente de secreção e membranares) expressas em bactérias adota conformações incorretas e ineficientes para a sua função biológica.

Terapia genética somática

- Retrovírus desativados – Integrados no genoma ao acaso e apenas infectam células com proliferação ativa (Ex: células sanguíneas). Usados com sucesso em alguns tratamentos

- Doença SCID (Severe combined immunodeficiency disease) que resulta da mutação do gene ADA (Adenosina deaminase).

- Mutação do gene LDLR (Low-density-lipoprotein receptor) que aumenta o risco de arteriosclerose e doença coronária.

- Adenovírus – Normalmente infecta epitélio respiratório. Persiste na forma epissomal e também infecta células em G0.

Estão em curso ensaios de tratamento da fibrose cística com este vetor.

- HAC (Human artificial cromossomes) – Construídos através da junção de DNA telomérico, genómico e -satélite). Provavelmente, e após optimização da tecnologia, constituirão os vectores de eleição para terapia genética.

31 Terapia genética