UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Química
ANA KARINA BRAMBILLA COSTA
ESTUDO DA FERMENTAÇÃO DE HIDROLISADO
LIGNOCELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PELA
LINHAGEM SPATHASPORA PASSALIDARUM UFMG-HMD 14.1
CAMPINAS
2016
ANA KARINA BRAMBILLA COSTA
ESTUDO DA FERMENTAÇÃO DE HIDROLISADO
LIGNOCELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PELA
LINHAGEM SPATHASPORA PASSALIDARUM UFMG-HMD 14.1
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Engenharia Química.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ANA KARINA BRAMBILLA COSTA E ORIENTADA PELO PROF. DR. RUBENS MACIEL FILHO.
CAMPINAS 2016
Dissertação de Mestrado defendida por Ana Karina Brambilla Costa e aprovada no dia 27 de julho de 2016 pela banca examinadora constituída pelos doutores:
Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
Orientador – Faculdade de Engenharia Química/UNICAMP
Prof. Dr. Adriano Pinto Mariano Faculdade de Engenharia Química/UNICAMP
Dr. Daniel Ibraim Pires Atala BP Biocombustíveis
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Irene e José, e à minha irmã Carolina, com todo o amor.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Irene e José, pela dedicação sem limites, por todo o exemplo, todos os ensinamentos, conselhos, broncas e afagos. Agradeço à minha irmã, Carolina pela parceria, compreensão e apoio. Vocês são e sempre serão o meu porto seguro.
A toda minha família, que me proporciona tanto apoio e confiança, mesmo que distante.
Ao meu querido Eduardo, por todo carinho, companheirismo e compreensão. Ao meu orientador, Dr. Rubens Maciel Filho, pela orientação, paciência e conselhos que colaboraram grandemente para este trabalho e para meu desenvolvimento.
Ao prof. Dr. Carlos Rosa e à Dra. Raquel Cadete, pela disponibilização dos microrganismos utilizados neste trabalho.
Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), por me permitir a realização deste trabalho e pelo fornecimento de toda a estrutura necessária para sua realização. Aos colegas Alberto Shintaku e Suleiman Hassuani, agradeço imensamente a confiança em mim depositada nos primeiros passos de minha carreira.
Aos colegas do Fermenteam, Julio Cezar, Luciano, Karen, Alexandra, Carolina, Juliana e Alberto, pelo apoio na realização deste trabalho. Agradeço pelas experiências, discussões, cafés, risadas e pelo crescimento que vocês me proporcionam. À nossa querida estagiária, Karen, pelo auxílio fundamental na fase experimental.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
RESUMO
O aumento do uso de fontes de energia não renováveis, associado a alta emissão de gases do efeito estufa, tem levantado questões pertinentes acerca de sua finitude, bem como de seu impacto ambiental e econômico. Atualmente, diversas políticas públicas de incentivo e subsídio a utilização de combustíveis de fontes renováveis têm sido discutidas e aplicadas a nível mundial, com destaque para a produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica. O reaproveitamento da biomassa gerada no próprio processo produtivo de geração de etanol a partir da cana-de-açúcar pode resultar em um aumento de até 40% na produção. Para isso, a etapa de fermentação deve ser capaz de converter tanto as moléculas de glicose quanto de xilose, liberadas durante o processamento, em etanol. Enquanto uma vasta gama de microrganismos é capaz de converter glicose a etanol, apenas um seleto grupo é capaz de converter xilose a etanol.
O presente trabalho teve por objetivo avaliar a levedura Spathaspora passalidarum HMD14.1, naturalmente consumidora de xilose e recentemente isolada do ecossistema brasileiro, em um processo de produção de etanol a partir de hidrolisado lignocelulósico de bagaço de açúcar. Para tanto, um hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar foi preparado a partir do pré-tratamento por explosão a vapor seguido de hidrólise enzimática. A avaliação da levedura foi realizada em duas etapas: a primeira em meio semissintético, para avaliação da influência dos compostos inibidores no metabolismo celular e a segunda em hidrolisado lignocelulósico, para otimização das condições fermentativas.
A linhagem S. passalidarum HMD 14.1 destacou-se em relação a velocidade máxima de crescimento em meio contendo tanto glicose quanto xilose como fonte de carbono, bem como em hidrolisado lignocelulósico diluído a 10% e 20% m/m, com e sem suplementação nutricional. Em meio YPX, o crescimento celular foi totalmente inibido em 2 g/L de ácido acético e 1,5 g/L de ácido fórmico, e parcialmente inibido em 6 g/L de ácido levulínico, 1 g/L de furfural e 2 g/L de 5-HMF. O efeito dos compostos inibidores, avaliado por meio de um planejamento fatorial fracionado, indicou que apenas os ácidos fórmico e acético apresentam efeitos significativos (p<0,1) no consumo de xilose, rendimento em etanol, rendimento em célula e eficiência fermentativa. Furfural e 5-HMF não apresentaram efeitos significativos para nenhuma das respostas, dentro das faixas avaliadas.
Partindo-se do hidrolisado lignocelulósico produzido, a otimização do pH e porcentagem de hidrolisado lignocelulósico por meio de um delineamento central composto rotacional 2², possibilitou a redução do tempo de fermentação em 24 horas. A condição
otimizada de 94,1% de hidrolisado e pH 6,2 resultou em um rendimento em etanolde 0,41 ± 0,03 g/g, rendimento em xilitol de 0,11 ± 0,01 g/g, rendimento em células de 0,11 ± 0,01 g/g, produtividade em etanol de 0,48 ± 0,02 g/L.h e eficiência fermentativa de 81,78 ± 1,61%. Em fermentações em batelada com reciclo celular e concentração celular inicial de 10g DW/L em condições similares, a linhagem apresentou viabilidade celular próxima a 100% nos três ciclos iniciais. Estes ciclos apresentaram produtividade volumétrica média de 0,45 ± 0,03 g/L.h, e eficiência fermentativa de 81,4 ± 5,2%, em 48 horas de fermentação. A linhagem, no entanto, não foi capaz de suportar um número maior de ciclos.
ABSTRACT
The increasing use of non-renewable energy sources associated with high greenhouse gases (GHG) emission has raised pertinent questions about their finitude, as well theirs environmental and economic impact. Currently, several public policies for encouraging and granting the use of renewable energy sources have been discussed and applied worldwide, especially regarding ethanol production from lignocellulosic biomass. The utilization of biomass generated in the production process for the generation of ethanol from sugarcane may result in production increasing up to 40%. For this, the fermentation process should be able to convert both glucose and xylose molecules, which are released during processing, in ethanol. While a wide range of microorganisms are capable of converting glucose to ethanol, only a select group is capable of converting xylose to ethanol.
This study aimed to evaluate the strain Spathaspora passalidarum HMD14.1, a naturally consuming xylose strain and recently isolated from the Brazilian ecosystem, in a process to produce ethanol from lignocellulosic hydrolysate of sugarcane bagasse. Thus, a lignocellulosic hydrolysate was prepared based on the steam explosion pretreatment, followed by enzymatic hydrolysis. The strain evaluation was carried out in two stages: the first in semisynthetic media, aiming to evaluate the influence of inhibitor compounds on cell metabolism, and the second in lignocellulosic hydrolysate, aiming the optimization of the fermentation conditions.
The strain S. passalidarum HMD 14.1 stood out regarding the maximum growth rate in both in medium containing glucose and xylose as carbon source, as well as lignocellulosic hydrolysate diluted to 10% and 20% w/w with or without nutritional supplementation. In YPX medium, cell growth was completely inhibited by 2 g/L acetic acid and 1.5 g/L formic acid, and partially inhibited by 6 g/L levulinic acid, 1g/L furfural and 2 g/L 5-HMF. The effect of inhibitor compounds, evaluated using a fractional factorial design, indicated that only formic and acetic acids have shown significant effects (p <0.1) in the consumption of xylose, ethanol yield, cell yield and fermentative efficiency. Furfural and 5-HMF have shown no significant effect on any of the evaluated parameters, in the evaluated regions.
Based on the lignocellulosic hydrolysate produced, the optimization of pH and percentage of lignocellulosic hydrolysate by a central composite design have reduced fermentation time in 24 hours. The optimized condition of 94.1% hydrolysate and pH 6.2 resulted in ethanol yield of 0.41 ± 0.03 g/g, xylitol yield of 0.11 ± 0.01 g/g, cell yield 0.11 ±
0.01 g/g, volumetric productivity of 0.48 ± 0.02 g/L.h and fermentative efficiency of 81.78 ± 1.61%. In batch fermentation with cell recycle and 10gDW/L initial cell concentration in similar conditions resulted in cell viability around 100% at the three initial cycles. These cycles resulted in average volumetric productivity of 0.45 ± 0.03 g/L.h, and fermentative efficiency of 81.4 ± 5.2%, in a 48 hours fermentation. The strain, however, was not capable to support a higher number of cycles.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Automóvel Ford movido a etanol hidratado 70% durante teste em 1925, no Rio de
Janeiro (MARCOLIN, 2008). ... 25
Figura 2. Processo de fermentação e destilação para produção de etanol de primeira geração (UDOP, 2014). ... 28
Figura 3.Projeção da demanda brasileira de etanol entre 2014-2023 (BRASIL, 2014). ... 29
Figura 4. Projeção de produção e comércio mundial de etanol para 2014-2023. ... 30
Figura 5. Estrutura e composição típica da cana-de-açúcar (BNDES; CGEE, 2008). ... 32
Figura 6.Estrutura da biomassa de cana-de-açúcar (RUBIN, 2008). ... 35
Figura 7. Configurações de processo aplicáveis para produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica. Sacarificação e fermentação separada (SHF), sacarificação e cofermentação separada (SHCF), sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF) e bioprocesso consolidado (CBP). ... 38
Figura 8. Representação esquemática da hidrólise da celulose, pela atuação das principais classes de enzimas: endo-glucanases (EG), exo-glucanases (CBH I e CBH II) e β-glicosidades (BG). (a) celulose contendo regiões amorfas e cristalinas, e atuação das EG na região amorfa; (b) celulose parcialmente hidrolisada, com ação das exo-glucanases nas extremidades livres; (c) atuação de β-glicosidades na clivagem de celobiose; (d) solução final contendo moléculas de glicose (GUSAKOV, 2011). ... 41
Figura 9. Principais compostos inibidores formandos durante a disponibilização dos açúcares e suas rotas de produção. Adaptado de Almeida; Modig; Peterson (2007). ... 44
Figura 10. Representação esquemática do metabolismo de xilose em leveduras. Adaptado de KUHAD et al. (2011). ... 47
Figura 11. Fluxograma descritivo das principais etapas realizadas neste trabalho. ... 51
Figura 12. Experimento de spot plate para avaliação da tolerância aos compostos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico. ... 56
Figura 13. Fluxograma de obtenção do hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, composto por pré-tratamento por explosão a vapor e hidrólise enzimática do material pré-tratado. ... 59
Figura 14. Reator de pré-tratamento por explosão a vapor (ANDRADE, 2014). ... 61
Figura 15. Perfil de crescimento celular (DO600nm) para leveduras (1) S. passalidarum HMD14.1, (2) S. arborariae HMD19.1 e (3) S. stipitis Y-7124 em meio semissintético YPD e YPX. Resultados expressam média de triplicatas. ... 68
Figura 16. Perfil de crescimento celular (DO600nm) para leveduras (1) S. passalidarum
HMD14.1, (2) S. arborariae HMD19.1 e (3) S. stipitis Y-7124 em meio composto por 10% e 20% m/m de hidrolisado lignocelulósico. Concentração final de açúcares fixada em 1% glicose e 1% xilose. Resultados expressam média de triplicatas. ... 69 Figura 17. Perfil de crescimento celular (DO600nm) para linhagens (1) S. passalidarum
HMD14.1, (2) S. arborariae HMD19.1 e (3) S. stipitis Y-7124 em composto por 10% e 20% m/m de hidrolisado lignocelulósico, suplementado com meio rico YP. Concentração final de açúcares fixada em 1% glicose e 1% xilose. Resultados expressam média de triplicatas. ... 69 Figura 18. Curvas de correlação entre concentração celular em massa seca (g DW/L) e densidade ótica a 600nm para as linhagens S. arborariae HMD19.1 (A), S. passalidarum HMD 14.1 (B) e S. stipitis Y-7124 (C). ... 70 Figura 19. Perfil de crescimento celular e consumo de açúcares em meio semissintético YPD, YPX e YPDX, para as leveduras (a) S. arborariae HMD19.1, (b) S. passalidarum HMD14.1 e (c) S. stipitis Y-7124. Resultados expressam média e desvio de duplicatas. ... 72 Figura 20. Meio sólido YPX com adição de ácido fórmico, após 48 horas de incubação em BOD a 30°C. (a) experimento controle, sem adição de ácido fórmico; (b) 0,25g/L de ácido fórmico; (c) 0,50 g/L de ácido fórmico; (d) 0,75 g/L ácido fórmico; (e) 1,0 g/L ácido fórmico. (1) Saccharomyces cerevisiae SA-1; (2) S. stipitis NRRL Y-7124; (3) S. arborariae UFMG HMD19.1 e (4) S. passalidarum UFMG HMD14.1. ... 73 Figura 21. Meio sólido YPX com adição de ácido levulínico, após 48 horas de incubação em BOD a 30°C. (a) experimento controle, sem adição de ácido levulínico; (b) 2,0g/L de ácido levulínico; (c) 4,0 g/L de ácido levulínico; (d) 6,0 g/L ácido levulínico. (1) Saccharomyces cerevisiae SA-1; (2) S. stipitis NRRL Y-7124; (3) S. arborariae UFMG HMD19.1 e (4) S. passalidarum UFMG HMD14.1. ... 73 Figura 22. Meio sólido YPX com adição de ácido acético, após 48 horas de incubação em BOD a 30°C. (a) experimento controle, sem adição de ácido acético; (b) 0,5 g/L de ácido acético; (c) 1,0 g/L de ácido acético; (d) 1,5 g/L ácido acético; (e) 2,0 g/L ácido acético. Os níveis de 3,0 e 4,0 g/L não estão ilustrados, pois não houve crescimento celular significativo. (1) Saccharomyces cerevisiae SA-1; (2) S. stipitis NRRL Y-7124; (3) S. arborariae UFMG HMD19.1 e (4) S. passalidarum UFMG HMD14.1 ... 74 Figura 23. Meio sólido YPX com adição de 5-HMF, após 48 horas de incubação em BOD a 30°C. (a) experimento controle, sem adição de HMF; (b) 0,50 g/L de HMF; (c) 1,00 g/L de HMF; (d) 1,50 g/L HMF; (e) 2,00 g/L HMF. (1) Saccharomyces cerevisiae SA-1; (2) S. stipitis
NRRL Y-7124; (3) S. arborariae UFMG HMD19.1 e (4) S. passalidarum UFMG HMD14.1. ... 74 Figura 24. Meio sólido YPX com adição de furfural, após 48 horas de incubação em BOD a 30°C. (a) experimento controle, sem adição de furfural; (b) 0,2 g/L furfural; (c) 0,6 g/L furfural; (d) 1,0 g/L furfural. (1) Saccharomyces cerevisiae SA-1; (2) S. stipitis NRRL Y-7124; (3) S. arborariae UFMG HMD19.1 e (4) S. passalidarum UFMG HMD14.1. ... 74 Figura 25. Perfil de xilose (azul), etanol (vermelho) e crescimento celular (verde) em 48 horas de fermentação a 30°C e 120 rpm, dos ensaios do planejamento fatorial fracionado 25-1 (%) para a linhagem S. passalidarum HMD14.1. PC: média do ponto central. ... 79 Figura 26. Balanço de massa para recuperação de celulose e hemicelulose do bagaço de cana pré-tratado. SS: Sólidos solúveis. ... 84 Figura 27. Perfil de glicose, xilose e ácido acético em hidrólise enzimática a 15% TS, 20 FPU/g celulose, 50°C e 72 horas. Linhas tracejadas indicam experimento realizado em escala piloto e linhas contínuas, experimento em escala laboratorial. ... 85 Figura 28. Rendimento do processo de obtenção de hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em escalas laboratorial e piloto. ... 87 Figura 29. Perfil de consumo de açúcares, produção de etanol e crescimento celular para fermentações em meio sintético e hidrolisado lignocelulósico (H.L) diluído e suplementado com meio rico YP, pH 5,0, 30°C e 120 rpm. Resultados representam média e desvio padrão de triplicatas. ... 89 Figura 30. Distribuição da eficiência global de fermentação no decorrer de 72 horas. Resultados representam média de triplicatas. ... 91 Figura 31.Perfil de consumo de açúcares e produção de etanol dos experimentos que compõe o planejamento experimental DCCR 2² para os ensaios de 1 a 8 e valores médios do ponto central (PC). ... 94 Figura 32. Superfície de resposta para a eficiência da fermentação, em função do pH e porcentagem de hidrolisado no meio de cultivo suplementado meio rico YP. ... 96 Figura 33. Curvas de contorno para a eficiência da fermentação, em função do pH e porcentagem de hidrolisado no meio de cultivo suplementado meio rico YP. ... 97 Figura 34. Superfície de resposta para o consumo de xilose (em %), em função do pH e porcentagem de hidrolisado no meio de cultivo suplementado com extrato de levedura e peptona. ... 99
Figura 35. Curvas de contorno para o consumo de xilose (em %), em função do pH e porcentagem de hidrolisado no meio de cultivo suplementado com extrato de levedura e peptona. ... 99 Figura 36. Perfil fermentativo de hidrolisado lignocelulósico de cana-de-açúcar suplementado meio rico YP, para as leveduras S. passalidarum UFMG HMD14.1 (a), S. arborariae UFMG HMD19.1 (b) e S. stipitis NRRL Y-7124 (c). Resultados expressam média e desvio padrão de duplicatas. ... 102 Figura 37. Consumo de açúcares, eficiência fermentativa e viabilidade celular no decorrer de cinco fermentações em batelada com reciclo celular, em hidrolisado lignocelulósico diluído a 94,1% e pH 6,2. Resultados representam a média e desvio padrão de duplicatas, em 48 horas de fermentação. ... 104
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Potencial de produção de etanol celulósico no Brasil, de acordo com o tipo de investimento. ... 31 Tabela 2. Composição química e poder calorífico do bagaço e palha de cana-de-açúcar. ... 33 Tabela 3. Composição de colmos de cana-de-açúcar, palha de cana-de-açúcar e cana-energia, em % mássica (MILANEZ et al., 2015) ... 34 Tabela 4. Composição média do bagaço de cana-de-açúcar. ... 36 Tabela 5. Comparação das vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento. ... 39 Tabela 6. Principais compostos fenólicos presentes em hidrolisados lignocelulósicos. Adaptado de Klinke, Thomsen e Ahring (2004). ... 46 Tabela 7. Compostos inibidores e respectivas concentrações utilizadas na avaliação de tolerância das leveduras Spathaspora arborariae UFMG-HMD 19.1, Spathaspora passalidarum UFMH-HMD 14.1, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 e Saccharomyces cerevisiae SA-1. ... 56 Tabela 8. Planejamento fatorial fracionado 25-1 para avaliação do efeito dos compostos inibidores no crescimento celular, consumo de xilose e produção de etanol da levedura Spathaspora passalidarum HMD14.1 em meio semissintético YPX4%. Valores codificados e não-codificados (em g/L, entre parênteses). ... 57 Tabela 9. Matriz do delineamento experimental DCCR 2² para avaliação do pH e concentração de hidrolisado lignocelulósico no metabolismo celular da levedura Spathaspora passalidarum HMD14.1. Valores codificados e não codificados (entre parênteses). ... 65 Tabela 10. Velocidade máxima de crescimento (µmax, h-1) das leveduras S. passalidarum
HMD14.1, S. arborariae HMD19.1 e S. stipitis Y-7124 em diferentes meios de cultivo. Resultados apresentam a média e desvio padrão de triplicatas. Para cada meio de cultivo avaliado, letras diferentes representam valores distintos a 95% de significância (p<0.05). .... 71 Tabela 11. Matriz do planejamento fatorial 25-1 com triplicata no ponto central, para avaliação
do efeito das variáveis ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, HMF e furfural no consumo de xilose (%), rendimento em etanol (Yp/s), rendimento celular (Yx/s) e eficiência (%)
(%) para a linhagem S. passalidarum HMD14.1. ... 78 Tabela 12. Estimativa dos efeitos dos fatores sobre o consumo de xilose (%) em 48 horas, teste t de Student e nível de significância para cada fator. ... 80
Tabela 13. Estimativa dos efeitos dos fatores sobre o rendimento em etanol (Yp/s) em 48 horas, teste t de Student e nível de significância para cada fator ... 80 Tabela 14. Estimativa dos efeitos dos fatores sobre o rendimento em células (Yx/s) em 48 horas, teste t de Student e nível de significância para cada fator ... 80 Tabela 15. Estimativa dos efeitos dos fatores sobre a eficiência (%) em 48 horas, teste t de Student e nível de significância para cada fator ... 80 Tabela 16. Composição do bagaço de cana-de-açúcar “in natura” e após pré-tratamento por explosão a vapor. Valores representam a média e o desvio padrão das triplicatas. ... 83 Tabela 17. Composição (em g/L) do hidrolisado lignocelulósico obtido a partir de bagaço de cana-de-açúcar pré tratado por explosão a vapor. Resultados representam média e desvio padrão de triplicata. ... 86 Tabela 18. Parâmetros para fermentações com concentrações crescentes de hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana. Resultados avaliados em 72 horas de fermentação, apresentados como média e desvio padrão de triplicatas. ... 90 Tabela 19. Delineamento Central Composto Rotacional 2², com valores codificados e decodificados (entre parênteses) das variáveis independentes analisadas e as respostas obtidas para consumo de xilose (%) e eficiência (%) em 72 horas de fermentação. ... 92 Tabela 20. Coeficientes de regressão para a eficiência em etanol em 72 horas de fermentação. ... 95 Tabela 21. Análise de variância (ANOVA) para a eficiência obtida em 72 horas de fermentação. ... 95 Tabela 22. Coeficientes de regressão para o consumo de xilose em 72 horas de fermentação. ... 98 Tabela 23. Análise de variância (ANOVA) para o consumo de xilose em 72 horas de fermentação. ... 98 Tabela 24. Comparação dos valores experimentais e preditos pelos modelos gerados para eficiência fermentativa (%) e consumo de xilose (%), em 72 horas de fermentação. ... 100 Tabela 25. Condições de ponto ótimo utilizadas no experimento de validação dos modelos experimentais. Valores entre parênteses representam os níveis codificados de cada variável. ... 101 Tabela 26. Resultados experimentais e preditos para as duas condições utilizadas na validação dos modelos experimentais. ... 101
Tabela 27. Parâmetros obtidos para as linhagens S. arborariae HMD19.1, S passalidarum HMD14.1 e S. stipitis Y-7124, em hidrolisado lignocelulósico com baixa concentração celular (1gDW/L). Resultados indicam a média e desvio padrão de duplicatas. ... 103
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ... 20
1.1. Objetivos ... 22
1.2. Organização do trabalho... 23
1.3. Principais contribuições deste trabalho ... 24
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 25
2.1. A produção industrial de etanol ... 25
2.2. Mercado de etanol e projeções de crescimento ... 28
2.3. A cana-de-açúcar como matéria-prima ... 32
2.3.1 Disponibilidade da biomassa ... 32
2.3.2 Composição Química do Bagaço de Cana-de-Açúcar ... 34
2.4 Produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar ... 37
2.4.1 Pré-tratamento ... 38
2.4.2 Hidrólise Enzimática ... 40
2.4.3 Fermentação de hidrolisados lignocelulósicos ... 42
2.4.3.1 Efeito dos compostos inibidores no metabolismo microbiano... 43
2.4.3.2 Metabolismo de xilose ... 46
2.4.4 Leveduras do gênero Spathaspora ... 47
2.5 Comentários Parciais ... 49
CAPÍTULO 3 – METODOLOGIA EXPERIMENTAL ... 51
3.1. Materiais ... 52
3.1.1. Reagentes ... 52
3.1.2. Equipamentos ... 52
3.1.3. Microrganismos ... 53
3.2. Metodologia Experimental ... 54
3.2.1. Perfil de crescimento e consumo de açúcares em meio semissintético... 54
3.2.2. Avaliação da tolerância aos compostos inibidores: ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, furfural e 5-HMF. ... 55
3.2.3. Planejamento Fatorial Fracionado 25-1para determinação do efeito dos compostos inibidores sobre o metabolismo celular ... 56
3.2.4. Obtenção do hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar ... 58
3.2.4.1. Caracterização química do bagaço de cana-de-açúcar “in natura” ... 59
3.2.4.3. Caracterização química do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ... 61
3.2.4.4. Balanço de Massa do pré-tratamento ... 61
3.2.4.5. Hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ... 63
3.2.5. Fermentação em hidrolisado lignocelulósico ... 64
3.2.6. Avaliação da influência do pH e concentração de compostos inibidores do hidrolisado lignocelulósico ... 64
3.2.7. Fermentações com alta concentração e reciclo celular ... 65
3.2.8. Métodos Analíticos ... 66
3.2.8.1. Concentração celular ... 66
3.2.8.2. Viabilidade celular ... 66
3.2.8.3. Compostos inibidores, açúcares e metabólitos ... 66
3.3. Comentários Parciais ... 67
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 68
4.1. ETAPA 1 – Fermentação em meio semissintético ... 68
4.1.1. Perfil de crescimento e consumo de açúcares ... 68
4.1.2. Avaliação da tolerância aos compostos inibidores do hidrolisado lignocelulósico 73 4.1.3. Planejamento Fatorial Fracionado 25-1 ... 76
4.2. ETAPA 2 – Obtenção do hidrolisado lignocelulósico ... 82
4.2.1. Pré-tratamento por explosão a vapor ... 82
4.2.2. Hidrólise enzimática ... 84
4.3. ETAPA 3 – Fermentações em hidrolisado lignocelulósico ... 87
4.3.1. Avaliação da fermentabilidade do hidrolisado lignocelulósico ... 88
4.3.2. Delineamento Central Composto Rotacional 2² ... 92
4.3.3. Fermentação em alta concentração celular ... 101
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 106 5.1. Sugestões para trabalhos futuros ... 108
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO
Os avanços tecnológicos iniciados com a Revolução Industrial no século XVIII têm causado, historicamente, uma sucessão de impactos ambientais e sociais a nível mundial, como acidificação dos oceanos, aumento da temperatura média do planeta, redução da área de geleiras glaciais e consequente aumento do nível dos oceanos. A emissão de gases do efeito estufa (principalmente CO2) está diretamente relacionado a este desenvolvimento econômico e
tecnológico, sendo que 40% da emissão total entre os anos de 1750 e 2011 refere-se apenas aos últimos quarenta anos do período. Além disso, 78% da emissão de gases do efeito estufa entre 1970 e 2011 refere-se a queima de combustíveis fosseis e a atividades industriais (IPCC, 2014). O aumento do uso de fontes de energia não renováveis (como petróleo e carvão, majoritariamente) no último século tem levantado questões pertinentes acerca da finitude destas fontes, bem como de seu impacto no meio ambiente e na economia. Visando reduzir a dependência aos combustíveis de origem não renováveis, reduzindo assim a susceptibilidade econômica perante flutuações de preço, e substituindo as fontes não renováveis clássicas por combustíveis de origem renovável, muitos países têm dedicado suas agendas à discussão e implantação de combustíveis renováveis. Atualmente, encontram-se diversas políticas públicas de incentivo e subsídios ao uso de combustíveis renováveis ao redor do mundo, com destaque para as políticas aplicadas nos Estados Unidos, Brasil e União Europeia (GUPTA; VERMA, 2015; UNCTAD, 2016).
Dentre os combustíveis renováveis, o etanol tem papel de destaque, principalmente no Brasil. Impulsionado pela crise do petróleo na década de setenta, foi criado um programa nacional (Proálcool) para diminuição da dependência de combustíveis fosseis por meio da produção de etanol. Por muitas décadas, o Brasil ocupou o papel de maior produtor e exportador de etanol, sendo recentemente superado pelos Estados Unidos. Contudo, o Brasil ainda se mantém como o maior produtor mundial de etanol a partir de cana-de-açúcar, uma vez que os Estados Unidos o fazem a partir de milho. A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar, entretanto, é mais vantajosa do ponto de vista ambiental, apresentando balanço energético superior ao processo envolvendo milho. Enquanto de 8,2 a 10,5 unidades energéticas são produzidas na forma de etanol a partir da cana-de-açúcar para cada unidade de energia fóssil utilizada, no processo utilizando milho este valor reduz-se para 1,1 a 1,4 (BASSO et al., 2008; LEITE; CORTEZ, 2008).
O aumento da demanda de etanol a níveis nacional e mundial impulsiona a busca por alternativas para maximizar a produção deste bicombustível. No Brasil, estima-se que até 2023 sejam necessários investimentos da ordem de 145 bilhões de reais para suprir o crescimento da demanda de etanol (BRASIL, 2014). A utilização de novas matérias primas para produção, como o reaproveitamento da biomassa gerada no próprio processo produtivo (bagaço e palha de cana-de-açúcar) para geração de etanol pode resultar em um aumento de até 40% na produção, sem a necessidade da carga de investimentos supracitados, principalmente da área plantada. Além disso, a integração entre o processo convencional de produção de etanol a partir de caldo e melaço de cana-de-açúcar (primeira geração) e o processo com aproveitamento da biomassa (segunda geração) ocasionaria redução nos custos fixos de produção, justamente pelas operações unitárias comuns a ambos os processos. Com isso, o desenvolvimento da tecnologia de produção de etanol de segunda geração, ou etanol celulósico, torna-se econômica e estrategicamente atrativa (DIAS et al., 2013).
A biomassa vegetal é majoritariamente composta por celulose, hemicelulose e lignina. A produção de etanol a partir da biomassa compreende as etapas de pré tratamento para exposição das cadeias de celulose e solubilização das cadeias de hemicelulose; hidrólise para liberação dos açúcares monoméricos; fermentação e recuperação do etanol (CANILHA et al., 2012; UNIÃO DA INDUSTRIA DE CANA-DE-AÇÚCAR, 2014). Dentre os principais desafios relacionados ao desenvolvimento da tecnologia de produção de etanol celulósico, destacam-se os relacionados à fermentação do hidrolisado lignocelulósico obtido após a hidrólise, tanto devido a presença de compostos inibidores ao metabolismo microbiano, quanto pela presença de um açúcar não-convencional – a xilose – fermentada apenas por um pequeno grupo de microrganismos (ALMEIDA; MODIG; PETERSSON, 2007).
A viabilização desta tecnologia está diretamente relacionada ao aproveitamento total dos açúcares gerados, isto é, glicose e xilose. A levedura Saccharomyces cerevisiae, extensivamente utilizada no atual processo de primeira geração, apresenta uma alta tolerância às condições industriais, sendo reaproveitada durante toda a safra em fermentações com reciclo celular. No entanto, ela é incapaz de fermentar xilose a etanol (HAHN-HÄGERDAL et al., 2007; BASSO et al., 2008). Dentre as leveduras sabidamente fermentadoras de xilose, os gêneros Candida sp., Scheffersomyces sp. e Pachysolen sp. têm sido exaustivamente estudadas. Contudo, todas apresentam fatores limitantes à aplicação industrial, devido à necessidade de microaerofilia, baixa tolerância a inibidores e ao próprio etanol produzido, além de pronunciada diauxia, com preferência pelo consumo de glicose ao de xilose (KUHAD et al., 2011).
Um novo gênero de levedura naturalmente consumidora de xilose, isolada recentemente de insetos relacionados a decomposição de madeira, tem se mostrado promissora. Dentre as vantagens de linhagens do gênero Spathaspora sp., destacam-se a capacidade de consumo concomitante de glicose e xilose; fermentação etanólica em anaerobiose; produção de xilanases e consumo de celobiose (NGUYEN et al., 2006; CADETE et al., 2009; HOU, 2011). No entanto, poucos são os trabalhos visando um maior entendimento de sua tolerância frente à hidrolisados lignocelulósicos, especialmente hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (DA CUNHA-PEREIRA et al., 2011; CADETE et al., 2012).
Além da maior viabilidade econômica, devido ao aproveitamento total dos açúcares, a utilização de microrganismos naturalmente consumidores de xilose no processo garantiria uma redução de custos fixos de produção quando comparado com um processo utilizando microrganismos geneticamente modificados, pois diminuiria a necessidade de sistemas fechados e assépticos, além de não ser necessária regulamentações especiais para sua utilização. Desta forma, torna-se importante a investigação detalhada do comportamento de leveduras do gênero Spathaspora sp. quando submetidas ao hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, afim de verificar sua robustez ao processo, bem como determinar seus limites de trabalho e sua potencial aplicabilidade industrial.
1.1.Objetivos
Este trabalho visa, de uma maneira global, avaliar o comportamento da levedura Spathaspora passalidarum HMD14.1, naturalmente consumidora de xilose e recentemente isolada do ecossistema brasileiro, em hidrolisado lignocelulósico de cana-de-açúcar obtido por meio de pré-tratamento por explosão a vapor seguido de hidrólise enzimática.
Para tanto, a avaliação foi dividida em três etapas principais, as quais têm os seguintes objetivos específicos:
Avaliar os níveis de tolerância dos compostos inibidores: ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, furfural e 5-hidroximetilfurfural isoladamente, em meio semissintético;
Avaliar estatisticamente o poder inibitório do ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, furfural e 5-hidroximetilfurfural no crescimento e consumo de açúcares, em meio semissintético;
Obter um hidrolisado lignocelulósico a partir do pré-tratamento por explosão a vapor e da hidrólise enzimática do material recuperado no pré-tratamento, sem que haja divisão de correntes, eliminação ou redução dos compostos inibidores presentes;
Avaliar o desempenho da levedura frente ao hidrolisado lignocelulósico, explorando a influência do pH e concentração de hidrolisado no meio de cultivo; Avaliar a resistência da levedura quando submetida às condições semelhantes ao
processo fermentativo comumente utilizado nas unidades industriais produtoras de açúcar e etanol, com alta concentração celular e reciclo celular.
1.2.Organização do trabalho
Este trabalho é estruturado na forma de cinco capítulos: “Introdução”, “Revisão Bibliográfica”, “Metodologia Experimental”, “Resultados e Discussões” e “ Conclusões e Sugestões para Trabalhos Futuros”.
O Capítulo 2, “Revisão Bibliográfica”, aborda os principais conceitos envolvidos no processo convencional de produção de etanol a partir da cana-de-açúcar. Além disso, partindo-se da composição química da cana-de-açúcar e seu potencial energético, uma breve revisão sobre os principais métodos de pré-tratamento e hidrólise da biomassa de cana-de-açúcar são apresentados. Em seguida, é apresentada a problemática da fermentação de cana-de-açúcares não convencionais, como a xilose, e as alternativas para mitigar este gargalo de processo. Neste momento, as leveduras naturalmente consumidoras de xilose são descritas em detalhes, com foco no gênero Spathaspora.
No Capítulo 3, “Metodologia Experimental”, os procedimentos aplicados no desenvolvimento dos experimentos são descritos detalhadamente, englobando os cálculos realizados e o ferramental utilizado na análise dos dados.
O Capítulo 4, “Resultados e Discussões”, compreende uma discussão aprofundada dos resultados obtidos, baseando-se nas análises estatísticas realizadas e de resultados previamente descritos em literatura.
Por fim, o Capítulo 5, “Conclusões e Sugestões para Trabalhos Futuros”, sumariza os principais resultados e conclusões deste trabalho, bem como elenca sugestões para trabalhos futuros, baseadas no conhecimento adquirido durante a realização deste trabalho.
1.3.Principais contribuições deste trabalho
Diante da perspectiva de utilização de biomassas lignocelulósicas para produção de etanol de segunda geração, o aproveitamento total dos açúcares gerados no processo, isto é, glicose e xilose, são importantes para a viabilização desta tecnologia. Neste contexto, pode-se destacar como principais contribuições deste trabalho:
As leveduras consumidoras de xilose S. passalidarum HMD14.1, S. arborariae HMD19.1 e S. stipitis NRRL Y-7124 foram inibidas completamente em 2 g/L de ácido acético e 1,5 g/L de ácido fórmico, isoladamente; e inibidas parcialmente em 6 g/L de ácido levulínico, 1 g/L de furfural e 2 g/L de 5-HMF, isoladamente. Apenas os ácidos orgânicos afetaram significantemente (p<0,1) o metabolismo
celular da linhagem S. passalidarum HMD14.1, em fermentações em meio semissintético com 40g/L de xilose e sem controle de pH.
Produção de hidrolisado lignocelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com rendimento global 82% em escala laboratorial e 55% em escala piloto, resultando em corrente com 5,35g/L ácido acético, 0,56g/L ácido fórmico 32,5 g/L glicose e 33,1 g/L xilose.
A linhagem S. passalidarum foi capaz de fermentar o hidrolisado lignocelulósico diluído a 90% (m/m) e suplementado com meio rico YP, pH 5,0, em 72 horas, com consumo de 63,68 ± 1,40% dos açúcares, eficiência fermentativa 52,5 ± 2,1%, rendimento em etanol de 0,42 ± 0,02 e produtividade volumétrica de 0,24 ± 0,01 g/L.h.
O planejamento experimental (DCCR 2²) realizado proporcionou uma redução de 24 horas no tempo de fermentação. A fermentação de hidrolisado diluído a 94,1% (m/m) e pH 6,2 apresentou rendimento em etanol de 0,41 ± 0,03 g/g, rendimento em xilitol de 0,11 ± 0,01 g/g, rendimento em células de 0,11 ± 0,01 g/g, produtividade volumétrica de 0,48 ± 0,02 g/L.h e eficiência fermentativa de 81,78 ± 1,61%
A linhagem S. passalidarum HMD14.1 suportou três ciclos fermentativos com alta concentração celular, com viabilidade celular próxima a 100%, produtividade volumétrica média de 0,45 ± 0,03 g/L.h, e eficiência fermentativa de 81,4 ± 5,2%, em 48 horas de fermentação.
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo é apresentada uma revisão bibliográfica envolvendo a produção de etanol a partir de caldo (primeira geração) e biomassa (segunda geração) de cana-de-açúcar. Inicialmente, o processo de produção de etanol a partir do caldo e/ou melaço de cana-de-açúcar é descrito, incluindo dados de mercado e perspectivas de crescimento do setor.
Em seguida, o conceito de etanol de segunda geração, ou etanol celulósico, é apresentado e discute-se, a partir da composição da biomassa de cana-de-açúcar, as etapas de processamento e seu impacto na fermentação. Ainda nesta seção, são apresentados os diferentes arranjos de processo pesquisados atualmente.
Por fim, os desafios da fermentação são apresentados, com foco na fermentação de xilose. Neste âmbito, as leveduras comumente estudadas, bem como as leveduras nativas recentemente isoladas do ecossistema brasileiro, são descritas e comparadas.
2.1.A produção industrial de etanol
Os primeiros relatos de produção de etanol no Brasil datam do início do século XX, com objetivo de minimizar as crises do setor açucareiro e a dependência das importações de combustíveis fosseis. Em 1925, o primeiro carro movido à etanol (Figura 1) foi testado no Rio de Janeiro, utilizando etanol hidratado 70% como combustível, com um consumo de 20 litros por 100km rodados (MARCOLIN, 2008).
Figura 1. Automóvel Ford movido a etanol hidratado 70% durante teste em 1925, no Rio de Janeiro (MARCOLIN, 2008).
No entanto, a consolidação do etanol como biocombustível deu-se somente após meio século, com a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) em 1975, o qual visava
a redução da dependência de combustíveis fósseis (LEITE; CORTEZ, 2008). Como resultado, a produção nacional de etanol saltou de 0,6 bilhões de litros em 1973, para 21,3 bilhões em 2014 (AMORIM et al., 2011; UNIÃO DA INDUSTRIA DE CANA-DE-AÇÚCAR, 2014).
A indústria sucroalcooleira é sazonal e limitada pelo período da safra de cana-de-açúcar, variando de abril a novembro para a região Centro-Sul e de setembro a março, para região Nordeste do Brasil. O plantio de cana-de-açúcar é distribuído de forma que sua colheita seja realizada durante todo o período de safra, no ponto de máxima acumulação de sacarose no colmo. A deterioração da cana-de-açúcar inicia-se imediatamente após a colheita, caracterizando-se por perda de água, conversão da sacarose em açúcares redutores pela ação da enzima invertase e produção de gomas e ácidos devido à contaminação microbiana. Por essa razão, após a colheita, a cana-de-açúcar e transportada para a indústria, analisada e processada no menor tempo possível (BNDES; CGEE, 2008; AMORIM et al., 2011; FERREIRA, 2012).
Após a recepção, a cana-de-açúcar passa por uma etapa de preparação e extração da fração líquida (caldo). Na etapa de preparo, a cana-de-açúcar passa por uma sequência de facas rotativas e martelos desfibradores, os quais pulverizam os colmos da cana, expondo as células vegetais contendo sacarose e outros açúcar e, assim, facilitando o processo de extração dos açucares. Denomina-se cana desfibrada o material obtido após a seção de preparo. A extração do caldo é feita convencionalmente por meio de um sistema de quatro a sete conjuntos de três rolos de moenda, cada qual denominado “terno”. Após o preparo, a cana-de-açúcar desfibrada passa sequencialmente pelos ternos. Água ou o próprio caldo obtido podem ser alimentado em contracorrente para maximizar a eficiência de extração da sacarose. Alternativamente, a extração por difusores tem sido adotada em algumas usinas nos últimos anos, apresentando algumas vantagens em relação à demanda energética e eficiência na extração de sacarose. Neste processo, a cana de açúcar desfibrada é lavada repetidamente com água quente, de forma que a sacarose adsorvida na fração sólida seja diluída e lixiviada na fração líquida. Em ambos os processos de extração, o bagaço obtido após a extração do caldo é direcionado para estocagem e/ou queima em caldeira (BNDES; CGEE, 2008; FERREIRA, 2012; HUGOT, 2014).
Devido à presença de impurezas, partículas coloidais e resquícios de bagaço e bagaçilhos, o caldo bruto extraído deve passar por uma etapa de tratamento, visando sua purificação. O tratamento do caldo é realizado independente de seu direcionamento para produção de açúcar ou etanol, e compõe-se pelas etapas de peneiramento, calagem, decantação e resfriamento. O caldo destinado a produção de açúcar pode passar, ainda, por uma etapa de
sulfitação, dependendo do tipo de açúcar a ser produzido, e segue para evaporação e cristalização. Após a cristalização e centrifugação dos cristais de sacarose, a fração líquida não cristalizada (denominada mel ou melaço) contém minerais, nutrientes e açúcares que podem ser direcionados para a produção de etanol. (FERREIRA, 2012).
A fermentação industrial é realizada pelo processo Melle-Boinot (batelada alimentada) em 85% das usinas do país. São utilizados tanques de 0,5 a 3 milhões de litros e alta concentração celular (10 a 15% m/v), o que resulta em um processo de 6 a 12 horas. Após este período, o mosto fermentado apresenta cerca de 7 a 11%v/v de etanol e residual de açúcares inferior a 0,1%. O processo é flexível, podendo-se utilizar caldo, melaço diluído com água ou melaço diluído com o próprio caldo de cana-de-açúcar como mosto de fermentação. A levedura utilizada no processo é recuperada por centrifugação e sofre um tratamento ácido para reduzir a contaminação bacteriana presente. Para tanto, ácido sulfúrico é adicionado ao creme de leveduras obtido após a centrifugação, até que se atinja pH 2,5, e o tanque é mantido sob agitação por cerca de 2 a 3 horas. Após o tratamento, a levedura é novamente enviada para a dorna de fermentação. (AMORIM et al., 2011).
A fração leve obtida após a centrifugação, denominada vinho delevedurado ou vinho turbinado é, então, destilado para recuperação do etanol. Na destilação, inicialmente recupera-se o etanol hidratado com aproximadamente 96ºGL, gerando como resíduos a vinhaça, álcoois de segunda e óleo fúsel. O etanol hidratado pode seguir para colunas de desidratação, das quais obtém-se etanol anidro, com aproximadamente 99,7ºGL (CGEE, 2009).
As etapas de fermentação e destilação, envolvidas no processo de produção de etanol de primeira geração, estão esquematizadas na Figura 2.
Figura 2. Processo de fermentação e destilação para produção de etanol de primeira geração (UDOP, 2014).
2.2.Mercado de etanol e projeções de crescimento
No ano de 2014, a área colhida de cana-de-açúcar atingiu 9,9 milhões de hectares, correspondente a 13,5% da área total destinada ao plantio agrícola no Brasil. A Safra 2013/2014, com 653,5 milhões de toneladas de cana-de-açúcar colhida, resultou na produção de 37,7 milhões de toneladas de açúcar e 21,3 bilhões de litros de etanol (UNIÃO DA INDUSTRIA DE CANA-DE-AÇÚCAR, 2014; IBGE, 2015).
O Ministério das Minas e Energia, por meio do Plano Decenal de Expansão de Energia de 2023, estima um aumento na demanda de 7,6% ao ano para o etanol hidratado e 3,4% ao ano para o etanol anidro – considerando o teor fixo de 25% adicionado à gasolina A.
Com isso, a demanda interna deste biocombustível daria um salto dos atuais 23,9 bilhões de litros para 42,8 bilhões de litros em 2023 (Figura 3). Quanto à exportação de etanol, estima-se um mercado modesto de 3,2 bilhões de litros, atendendo basicamente os contratos de exportação preestabelecidos. A demanda total de etanol é projetada para 47,8 bilhões de litros em 2023, referente a um aumento de 124% em relação à produção de 2014 (BRASIL, 2014).
Figura 3.Projeção da demanda brasileira de etanol entre 2014-2023 (BRASIL, 2014).
Para suprir a demanda, seria necessário um esforço conjunto para construção de novas unidades, uso da capacidade total das usinas já existentes e expansão de área colhida em 1,9% ao ano (totalizando 10,6 milhões de hectares e 897 milhões de toneladas de cana-de-açúcar em 2023). Para o sucesso desse esforço, considera-se ainda que haverá uma importação de cerca de 500 milhões de litros de etanol, aumento na produtividade e qualidade da cana-de-açúcar no decênio. Este esforço conjunto reflete-se financeiramente em investimentos da ordem de 145 bilhões de reais nos próximos 10 anos, relacionados a construção de 13 novas usinas e 5 novas destilarias; expansão, renovação e tratamento dos canaviais (BRASIL, 2014).
O país conta, atualmente, com 379 usinas cadastradas no Ministério da Agricultura para produção de etanol e/ou açúcar. A associação entre questões político-econômicas no setor, necessidades de novos investimentos devido ao aumento da mecanização da colheita e condições climáticas desfavoráveis encontradas nos últimos anos fez com que o número de usinas em operação fosse reduzido. A partir de 2008, houve somente o projeto de implantação de quatro novas usinas no país, previstas para 2014. Neste mesmo período, 43 usinas foram
desativadas, criando assim um desafio ainda maior ao suprimento da demanda crescente de etanol (REHDER, 2013).
A nível mundial, no entanto, os Estados Unidos apresentam-se como o maior produtor de etanol. Projeções da FAO para o período de 2014-2023 (Figura 4) indicam que a produção mundial de etanol atingirá 158 bilhões de litros em 2023, suportada pelas produções dos Estados Unidos, Brasil e União Europeia. Espera-se que os países emergentes, neste cenário representado majoritariamente pelo Brasil, tenham um aumento de 45 bilhões de litros (em 2013) para 71 bilhões de litros (em 2023). Este aumento relaciona-se, principalmente, à mistura de 25% de etanol na gasolina, ao desenvolvimento da indústria “flex-fuel” e da necessidade de importação de etanol de milho dos Estados Unidos. Já nos Estados Unidos e União Europeia, a produção de etanol é limitada pelas regulamentações ambientais, envolvendo redução de emissão de gases do efeito estufa e limites máximos de mistura de etanol à gasolina. A mistura máxima de etanol à gasolina nos Estados Unidos permitida atualmente é de 15% (E15), para carros produzidos a partir de 2001 (OECD; FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, 2014).
Figura 4. Projeção de produção e comércio mundial de etanol para 2014-2023.
A projeção de produção de etanol para países da América do Norte e Europa já engloba novas alternativas de produção, como o etanol obtido a partir da matriz lignocelulósica. Por definição, o termo lignocelulósico compreende o grupo de plantas que contém, além de celulose, quantidades variáveis de lignina em sua estrutura, englobando resíduos florestais, agrícolas, e resíduos urbanos e industriais (BRASIL, 2010; EBPT, 2016).
A matriz lignocelulósica mais indicada para cada processamento depende de fatores relacionados a origem da matéria-prima, disponibilidade de terras e práticas de produção, logística no recolhimento, transporte e armazenamento da biomassa e valor direto do processo, o qual envolve o custo da biomassa, requerimento de água e energia, dentre outros (BALAT, 2011). A escolha por uma biomassa de elevada disponibilidade e baixo custo acarreta redução direta nos custos de processo, justificando seu uso para produção de uma commodity tal qual o etanol (CARDONA; QUINTERO; PAZ, 2010).
No caso do Brasil, o aproveitamento de materiais lignocelulósicos gerados no processamento da cana-de-açúcar (ponteiras, palha e bagaço) como substrato para produção de etanol possibilitaria um incremento substancial da produção, sem a necessidade de ampliação da área plantada ou construção de novas unidades. O processo utilizando materiais lignocelulósicos (segunda geração) pode, ainda, ser integrado ao processo convencional (primeira geração), visto que as etapas de concentração de açúcares, fermentação e destilação são semelhantes e, com isso, os investimentos são minimizados e a atratividade da tecnologia é ampliada (DIAS et al., 2013). O Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) possui a patente brasileira de integração dos processos de primeira e segunda geração, incluindo o aproveitamento de matérias-primas, vapor, energia elétrica e água tratada em ambos os processos (PINTO et al., 2013).
A partir da consideração de manutenção do preço do barril do petróleo em US$60 e da aplicação de políticas públicas de incentivo à produção de etanol celulósico, estima-se que até 2025 o Brasil contará com capacidade produtiva de 10 bilhões de litros de etanol celulósico, por meio de três formas de investimento distintas, conforme apresentado na Tabela 1 (UNCTAD, 2016).
Tabela 1. Potencial de produção de etanol celulósico no Brasil, de acordo com o tipo de investimento.
Tipo de investimento
Potencial de produção (Bilhões de litros)
2016-2020 2021-2025 Total
Retrofit de usinas existentes com inserção de etanol 2G 2,50 2,50 5,00 Expansão de usinas com inserção de etanol 2G 0,70 0,75 1,45
Novas usinas de etanol 2G 0,00 3,50 3,50
Total 3,25 6,75 10,00
2.3.A cana-de-açúcar como matéria-prima 2.3.1 Disponibilidade da biomassa
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) é composta pelos colmos (nos quais acumula-se a sacarose), pelas pontas e folhas (as quais compõe a palha de cana) e pelas raízes (dispostas no subsolo) (SEABRA, 2008). A estrutura típica da cana-de-açúcar, bem como a composição média dos colmos, é apresentada na Figura 5.
Figura 5. Estrutura e composição típica da cana-de-açúcar (BNDES; CGEE, 2008).
No sistema agroindustrial brasileiro, a cultura de cana-de-açúcar representa 75% da produção nacional agrícola (em toneladas), seguido da soja e milho, representando 10% e 8%, respectivamente. Na Safra de 2015, o Brasil colheu um total de 755 milhões de toneladas de cana-de-açúcar e estima-se que em 2016 a produção reduza em 4,4%, atingindo 721,4 milhões de toneladas (IBGE, 2016).
Em média, cada tonelada de cana-de-açúcar gera cerca de 250 kg de bagaço com 50% de umidade e 165 kg de palha, com 15% de umidade (ANDREOLI, 2008; DANTAS, 2010). Com a aprovação da lei nº 11.241, em 2002, a qual prevê a eliminação fracionada da queimada de cana-de-açúcar, haverá maior disponibilidade de palha e ponteiras – as quais, anteriormente, eram queimadas no início da colheita. Uma parcela da palha deve ser mantida no campo como proteção, ocasionando maior aeração, infiltração e retenção da água no solo.
Contudo, estudos mostram que uma remoção de até 50% da palha do solo não traria problemas à cultura de cana-de-açúcar (LEAL et al., 2013; MALUF, 2014).
Considerando o cenário onde não mais haja queima da cana-de-açúcar e 50% da palha produzida seja recolhida do campo e direcionada à indústria, um total de 188,7 milhões de toneladas de bagaço (50% de umidade) e 124,6 milhões de toneladas de palha (15% de umidade) estariam disponíveis na Safra 2015, os quais podem ser destinados para produção tanto de energia quanto de biocombustíveis.
Um ponto importante a ser considerado é o balanço entre a cogeração e a produção de etanol celulósico, visto que ambos competem pela utilização do bagaço de cana-de-açúcar. A inclusão da palha de cana-de-açúcar, neste cenário, torna o processo ainda mais atrativo, pois pode substituir o bagaço de cana-de-açúcar tanto na queima para geração de energia, quanto como biomassa para produção de etanol celulósico, garantindo flexibilidade para a unidade industrial (LEAL et al., 2013). Valores utilizados como base no trabalho de Seabra (2008) indicam que o poder calorífico do bagaço de cana-de-açúcar se assemelha ao da palha, conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2. Composição química e poder calorífico do bagaço e palha de cana-de-açúcar.
% Massa seca Bagaço de cana Palha de cana
Umidade 50,2 29,4
Cinzas 2,2 3,9
Voláteis 79,9 83,3
Carbono Fixo 18,0 12,8
Poder calorífico superior - PCS (MJ/kg) 18,1 17,4
Poder calorífico inferior - PCI (MJ/kg) 14,4 15,6
Fonte: (SEABRA, 2008, apud LINERO;LAMONICA, 2005).
Neste cenário, o bagaço de cana-de-açúcar poderia ser direcionado para a produção de etanol de segunda geração, enquanto que a celulignina gerada (uma forma de densificação energética) poderia ser direcionada juntamente com a palha de cana-de-açúcar para produção energética, por queima em caldeira (SEABRA, 2008; LEAL et al., 2013). Deve-se destacar, no entanto, que a utilização de palha-de-cana traz novos desafios associados, principalmente relacionados ao impacto as impurezas minerais no desempenho dos geradores de vapor. Outros arranjamentos são possíveis dependendo do pré-tratamento do bagaço da cana de açúcar.
A utilização de biomassa para produção de etanol expandiu o horizonte tecnológico também do desenvolvimento de biomassas mais produtivas, como é o caso da cana-energia. Esta nova variedade de cana-de-açúcar, com maior produtividade por hectare e maior conteúdo
de material celulósico proporcionalmente à sacarose, que vem sendo desenvolvida por diversos centros de pesquisa e empresas (GranBio, Vignis, CTC, IAC e Monsanto, entre outros) tem como objetivo maximizar a oferta de biomassa para venda e produção de bioeletricidade, por seu maior teor de fibras. Conforme apresentado na Tabela 3, a cana-energia apresenta menor concentração de açúcares no colmo, se comparada a cana convencional. No entanto, sua elevada produtividade, de cerca de 1,8 a 2,2 vezes superior a cana convencional, faz com que a quantidade total de açúcar (kg/hectare) seja também superior. O teor de fibras da cana-energia pode atingir valores de 30%, sendo uma promissora fonte de biomassa, mas apresentando desafios para o processamento, considerando que as moendas atuais não são capazes de processar tal material (MARIANO, 2015; TOLEDO, 2015; MARINHO, 2016).
Tabela 3. Composição de colmos de cana-de-açúcar, palha de cana-de-açúcar e cana-energia, em % mássica (MILANEZ et al., 2015)
Componente Colmos de cana-de-açúcar Palha de cana-de-açúcar Cana-energia Água 70,3 15,0 66,8 Sacarose 14,0 4,3 8,1 Açúcares redutores 0,6 0,2 2,5 Fibras 12,7 77,9 21,3 Outros 2,4 2,6 1,3
2.3.2 Composição Química do Bagaço de Cana-de-Açúcar
A cana-de-açúcar, enquanto biomassa lignocelulósica, é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, além de outros componentes presentes em pequenas quantidades (RUBIN, 2008). A estrutura básica da cana-de-açúcar, indicando o arranjo destas cadeias na parede celular é indicada na Figura 6. Nota-se que o arranjo das cadeias é tal que a celulose e hemicelulose sejam fixadas pela lignina. As cadeias de celulose mantêm-se unidas através de ligações de hidrogênio, conferindo rigidez a planta. A lignina periférica age não só como elemento de fixação da celulose e hemicelulose, mas também como uma barreira física contra o ataque de microrganismos e a perda de água. A hemicelulose, por fim, atua como elo entre as cadeias de celulose e lignina, formando a rede fibrosa da planta (RABELO, 2010).
Figura 6.Estrutura da biomassa de cana-de-açúcar (RUBIN, 2008).
O bagaço de cana-de-açúcar corresponde à fração da biomassa obtida após a recepção, preparo e extração do caldo de cana-de-açúcar, conforme descrito no item 2.1. Apresenta-se como um material heterogêneo no que diz respeito a sua morfologia e tamanho de partículas, sendo composto pelas frações de casca, fibra e medula. A fração da casca compõe-se por células de tamanho superior às demais frações, com perfil de lâminas groscompõe-seiramente retangulares. A fibra, por outro lado, apresenta-se como um conjunto de células cilíndricas de elevada esbeltez, enquanto que fração de medula é formada por partículas esponjosas com forma regular e aproximadamente esféricas, cuja principal função é o acúmulo dos açúcares na planta (CGEE, 2009; RABELO, 2010; ANDRADE, 2014).
A composição do bagaço de cana-de-açúcar varia de acordo com os procedimentos agrícolas e industriais aplicados, como tipo de solo, realização ou não de queimada, procedimentos de colheita e transporte e procedimentos de limpeza e preparo da cana-de-açúcar na indústria. Estes fatores afetam principalmente a fração de cinzas presente, visto que se relacionam diretamente com o arraste de impurezas minerais (areia, terra, etc.) para o processo. A fração mineral (cinzas) do bagaço varia entre 1,6 e 5,0% (CGEE, 2009). A composição média do bagaço de cana-de-açúcar, em relação aos principais componentes, é apresentada na Tabela 4.
Tabela 4. Composição média do bagaço de cana-de-açúcar.
Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas Referência
34,8 28,96 22,62 4,17 (QUINTERO; MONCADA; CARDONA, 2013)
41,95 21,7 23,61 - (GAO et al., 2013)
34,1 - 40,7 23,0 - 29,9 14,4 - 22,3 - (BENJAMIN; GARCÍA-APARICIO; GÖRGENS, 2014) * 43,95 ± 1,85 25,09 ± 0,91 27,82 ± 0,71 0,99 ± 0,05 (DE BARROS et al., 2013) *Faixa obtida no comparativo entre variedades de cana-de-açúcar e diferentes safras.
A celulose constitui-se como uma grande e estável cadeia, com massa molecular próxima a 100 mil U e composta principalmente por unidades 1-4, D-glucopiranose conectadas entre si por ligações do tipo β-1,4 (ANWAR; GULFRAZ; IRSHAD, 2014). As cadeias se compactam em microfibrilas por meio de ligações de hidrogênio, formando fibrilas. As fibrilas são unidas, por sua vez, pela ligação com as cadeias de hemicelulose e demais polímeros (MENON; RAO, 2012). O difícil acesso aos açúcares presentes na celulose deve-se à presença de regiões amorfas e cristalinas na cadeia de celulose. O grau de cristalinidade da molécula está diretamente relacionado a tais ligações de hidrogênio (PARK et al., 2010).
A hemicelulose é uma cadeia amorfa, ramificada e heterogênea, com peso molecular inferior a 30 mil U. Sua composição contempla pentoses (D-xilose e L-arabinose) e hexoses (galactose, manose e glicose), além de grupos acetil e uranil (ácidos D-glucorônico, D-galacturônico, etc.). As unidades de D-xilose encontram-se na forma de xilopiranoses, conectadas entre si por ligações da forma β-1,4, representando 80% do total de açúcares da hemicelulose. A hemicelulose pode ser definida em termos da composição da cadeia de polissacarídeos. Homopolímeros, formados apenas por moléculas de xilose, são denominados xilanas, enquanto que heteropolímero são denominados glucomananas. Em folhosas e gramíneas, a principal cadeia constituinte é a xilana, enquanto que para coníferas, é a glucomanana (FENGEL; WEGENER, 1989; CANILHA et al., 2013).
A lignina é o terceiro componente mais abundante da biomassa lignocelulósica. Apresenta-se como um heteropolímero polifenólico amorfo, composto por unidades de fenilpropanos (álcool p-cumarílico, álcool coferílico e álcool sinapílico) ligados entre si por diferentes tipos de ligações. A estrutura da lignina não é homogênea, possuindo regiões amorfas e estruturas globulares. Sua função na planta é estrutural, garantindo a impermeabilidade e resistência frente a ataques microbianos e estresse oxidativo (CARNEIRO, 2011).
2.4 Produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar
Devido à complexidade estrutural dos materiais lignocelulósicos, o processo de obtenção de etanol a partir destas matrizes deve incluir as operações base de: (1) pré-tratamento da biomassa, para solubilização da lignina e hemicelulose e exposição das cadeias de celulose; (2) hidrólise enzimática do material pré-tratado, liberando monossacarídeos; (3) fermentação dos açúcares monoméricos disponibilizados e (4) recuperação do etanol produzido (CARDONA; QUINTERO; PAZ, 2010).
A partir destas etapas básicas, diversas proposições de processo têm sido estudadas, variando entre si de acordo com a forma de obtenção de enzimas, o foco de recuperação e utilização dos açúcares hexoses (glicose) e pentoses (xilose, majoritariamente) e a integração entre cada etapa. Cinco principais configurações de processo podem ser citadas: sacarificação e fermentação separada (SHF), sacarificação e cofermentação separada (SHCF), sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF) e, por fim, o bioprocesso consolidado (CBP) (GÍRIO et al., 2010; DA SILVA; CHANDEL, 2013). A descrição das etapas de processo envolvidas em cada configuração é ilustrada na Figura 7.
As configurações que envolvem hidrólise e fermentação simultâneas (SSF e SSCF) apresentam como principais vantagens o menor tempo de processamento e complexidade de processo inferior às demais configurações. No entanto, deve-se levar em conta que os parâmetros ótimos para a hidrólise e a fermentação diferem, principalmente no que diz respeito à temperatura. Enquanto a hidrólise enzimática é realizada na faixa de 50°C, a fermentação tem temperatura ótima na faixa de 30-32°C (DA SILVA; CHANDEL, 2013).
Atualmente, a maior parte das unidades de produção de etanol lignocelulósico em escala de demonstração ou escala industrial utilizam-se da estratégia de hidrólise e fermentação em separado, a qual poderia ser mais facilmente integrada ao processo convencional de produção de etanol de primeira geração. Neste cenário, no entanto, a implantação de um processo que envolva a cofermentação dos açúcares disponíveis (glicose e xilose) torna-se economicamente vantajoso, devido a redução dos custos capitais envolvidos na fermentação (GUPTA; TUOHY, 2014).
Figura 7. Configurações de processo aplicáveis para produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica. Sacarificação e fermentação separada (SHF), sacarificação e cofermentação separada (SHCF), sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF) e bioprocesso consolidado (CBP).
No presente trabalho será abordado a estratégia de SHCF, na qual o material obtido no pré-tratamento é diretamente destinado à hidrólise enzimática, sem que haja qualquer separação entre as frações líquidas e sólidas obtidas. Além disso, a fermentação do hidrolisado lignocelulósico obtido será realizada por um microrganismo capaz de converter glicose e xilose simultaneamente a etanol.
2.4.1 Pré-tratamento
O pré-tratamento da biomassa tem como objetivo a solubilização, exposição ou separação dos principais constituintes da biomassa: celulose, hemicelulose e lignina, aumentando a digestibilidade da matriz lignocelulósica para as etapas subsequentes de seu processamento (RABELO, 2010).
A escolha do pré-tratamento deve considerar diversos fatores, pois é uma etapa de alto custo e, a depender dos compostos gerados, pode afetar negativamente as etapas de hidrólise e fermentação. Um pré-tratamento desejável deve evitar a redução de tamanho das partículas, preservar as frações de hemicelulose, limitar a formação de produtos de degradação
que atuam como compostos inibidores e ter baixo requerimento energético, dentre outros fatores (MENON; RAO, 2012).
Os métodos de pré-tratamento podem basear-se em processos químicos (hidrólise ácida, ozonólise, etc.), físicos (moagem, etc.), físico-químicos (explosão a vapor, hidrotérmico, etc.) ou biológicos (microrganismos, enzimas, etc.), podendo haver a combinação destes processos (VARGAS BETANCUR; PEREIRA JR., 2010). Um comparativo das principais vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento atualmente empregados é apresentado na Tabela 5.
Tabela 5. Comparação das vantagens e desvantagens dos principais métodos de pré-tratamento.
Características Desejável Pré-tratamento
AC AD AL OR EV AH
Solubilização da hemicelulose Alta ++ ++ + + ++ ++
Produção de monossacarídeos da hemicelulose Alta ++ ++ -/0 -/0 0 -
Produção de oligossacarídeos Baixa + + -/0 -/0 0 -
Recuperação de celulose Alta ++ ++ + - ++ ++
Digestibilidade da celulose Alta ++ ++ ++ - + +
Formação de compostos inibidores Baixa - - + + 0 0
Problemas associados à corrosão Baixa - - - - 0 0
Necessidade de produtos químicos Baixa - - -/0 - 0 ++
Capacidade de reciclagem de químicos Alta - - -/0/+ - 0 i.r. Requerimentos para neutralização de compostos Baixa - - -/0 + 0 i.r.
Investimento (custo capital) Baixa + + 0/+ 0 - +
Custos operacionais Baixa - 0 -/0 - ++ +
Demanda energética Baixa 0 - + 0 0 0
AC: Ácido concentrado; AD: Ácido diluído; AL: Alcalino; OR: Organosolv; EV: Explosão a vapor; AH: Auto hidrólise. Leia-se +: Vantajoso; -, Desvantajoso; 0: Neutro; i.r.: Irrelevante. Fonte: (CARVALHEIRO; DUARTE; GÍRIO, 2008).
No Brasil, os modelos mais estudados e aplicados por empresas desenvolvedoras de tecnologia são os pré-tratamento ácido diluído e explosão a vapor. O pré-tratamento por explosão a vapor apresenta como vantagens baixa formação de inibidores, recuperação de hemicelulose na fração líquida entre 45 -65% (podendo atingir 80-90% quando realizado na presença de catalisadores ácidos) e manutenção de mais de 90% da celulose na fração sólida. A deslignificação parcial e a remoção da hemicelulose contribuem à exposição das cadeias de celulose, para a posterior hidrólise desta fração (CARVALHEIRO; DUARTE; GÍRIO, 2008; GÍRIO et al., 2010).
O processo utiliza alta temperatura (190 a 270°C) combinada com tempo predefinido. A temperatura é alcançada devido ao aumento de pressão pela inserção de vapor
