TÍTULO: AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE ESPÉCIES DE CANDIDA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): BRENDA LORENA BALBINO AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): REGINA HELENA PIRES, REGINALDO DOS SANTOS PEDROSO, GÉSSICA ANDRADE
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): MAYKER LAZARO DANTAS MIRANDA COLABORADOR(ES):
1. Resumo
Candida é levedura associada às infecções superficiais ou sistêmicas. Tem se tornado um problema de saúde pública diante do aumento da frequência de quadros de candidíase, especialmente em indivíduos imunocomprometidos, e a emergência de resistência aos antimicrobianos, especialmente aos azóis, que são as drogas de eleição para o tratamento. Dentre as fontes potenciais para novos antifúngicos, destacam-se as propriedades antimicrobianas dos óleos essenciais, evidenciando as interações dinâmicas entre as populações humanas e plantas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica de 11 óleos essenciais frente a cinco espécies de Candida. Os isolados testados foram: Candida albicans ATCC 5314, Candida glabrata ATCC 2001, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida krusei ATCC 6258 e Candida tropicalis ATCC 13803. Os óleos essenciais utilizados foram: de Piper aduncun (amostras 1, 2 e 3),Citrus nobilis, Citrus reticulata, Citrus reticulata Blanco, Citrus cinensis L, Psidium cattleyanum. A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizada pelo método da microdiluição em caldo com revelação pela rezasurina. A CIM encontrada com o óleo de casca de mexerica cheirosinha e de casca de mexerica poncã foram, respectivamente, 250 µg/mL e 500 µg/mL para C. krusei. Os demais óleos apresentaram altos valores de CIM com intervalos de 1000 a <4.000 µg/mL. Conclui-se que dois óleos testados apresentaram moderada atividade antimicrobiana contra uma das espécies de Candida. Os resultados são importantes nas análises de possíveis fitoterápicos, visto que a não efetividade dos óleos testados, influenciam nos futuros estudos em etnobotânica e fitoterapia.
2. Introdução
Candidiase é a denominação para infecções causadas por fungos do gênero Candida, sendo uma doença com manifestações clínicas variadas e de ocorrência universal. As infecções ocorrem em diferentes órgãos e sistemas e as lesões ocorrem comumente na boca, faringe, pele, unhas, sistema bronco pulmonar, intestinal e perianal, além de outros.
Além disso, os fungos desse gênero, são os principais agentes etiológicos de infecções hospitalares e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com
doenças graves e aqueles em período pós-operatório. As formas graves ocorrem em decorrência de fatores predisponentes, em geral relacionados ao imunocomprometimento do indivíduo, tais como: desnutrição, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia prolongada, quimioterapia e uso de corticosteroides, manipulação endovenosa inadequada, neoplasias e outras doenças debilitantes (ANVISA, 2004).
A infecção por Candida acomete preferencialmente as crianças e as pessoas idosas, numa frequência de 5% dos recém-nascidos, 5% de pessoas com doenças neoplásicas e 10% dos pacientes idosos com saúde precária; portanto a candidíase é mais frequente em pessoas nos extremos da idade (PEIXOTO et al., 2014). Infecções fúngicas invasivas causadas por espécies de Candida têm sido cada vez mais relatadas entre as infecções relacionadas à assistência à saúde.
Das quase 200 espécies já descritas, aproximadamente 10% são agentes etiológicos de infecções em humanos, sendo que as principais espécies de interesse clínico são C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae (BARBEDO et al., 2010)
Os fármacos mais utilizados para o tratamento da candidíase são os derivados azólicos (fluconazol, miconazol e itraconazol) e os poliênicos (anfotericina B e nistatina), atuando de forma tópica ou sistêmica. Algumas espécies de Candida apresentam resistência a alguns desses medicamentos, principalmente aquelas isoladas de pacientes HIV positivos. Diante ao relato cada vez mais frequente de isolados de Candida resistentes aos antifúngicos, observa-se um aumento na procura por novas drogas, principalmente entre os produtos vegetais, na tentativa de se obter melhor desempenho sobre tais micro-organismos (ALMEIDA et al., 2012).
Os óleos essenciais podem ser sintetizados por todos os órgãos das plantas: flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutas, raízes, madeira e cascas da árvore e dos frutos (denominados cítricos), sendo compostos voláteis com baixo peso molecular, produzidos principalmente para a sobrevivência das mesmas, exercendo papel fundamental na defesa contra micro-organismos predadores (SAITO; SCRAMIN, 2000; WOLFFENBÜTTEL, 2007). Estudo de Maia et al. (2015) relata que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas.
Além disso, o vasto potencial terapêutico das plantas, para tratamento de varias doenças, ficou evidenciado com a publicação em 2009, da Relação Nacional
de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS), que importantemente tem alavancado as pesquisas de atividade antimicrobiana de produtos extraídos de plantas (BRASIL, 2009).
3. OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi determinar a concentração inibitória mínima de 11 óleos essenciais contra cinco espécies de Candida.
4. METODOLOGIA
Foram testados óleos essenciais de Piper aduncun (pimenta-de-macaco (amostras 1, 2 e 3), Citrus nobilis (mexerica Bahia- cascas), Citrus reticulata (mexerica cheirosinha- cascas), Citrus reticulata (var. cravo mexerica fuxiqueira- cascas), Citrus reticulata Blanco (mexerica poncã- folhas secas, folhas frescas e casca), Citrus cinensis L. (laranja pera do rio-cascas), Psidium cattleyanum (araçá- folhas frescas), gentilmente cedidos pelo Dr. Mayker Dantas, docente do Instituto Federal do sul de Minas Gerais.
Para a validação da técnica foi utilizado o antifúngico anfotericina B (Sigma Inc, São Paulo, Brasil) como droga padrão. A partir de uma solução estoque da droga a 1600 µg/mL, diluída em DMSO (Synth, São Paulo, Brazil), mantida em tubos Eppendorf a -80°C, foram realizadas diluições em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Sigma), tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico (Sigma) a pH 7,0 e suplementado com 2% de glicose. Dessa maneira foi possível avaliar a anfotericina B no intervalo de concentrações compreendido entre 0,015 a 8 μg/mL.
Os micro-organismos utilizados nesse estudo foram as cepas-padrão de C. albicans ATCC 5314, C. glabrata ATCC 2001, C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258 e C. tropicalis ATCC 13803.
Inicialmente, as cepas foram semeadas em ágar cromogênico Candida (CHROMagar, Difco, Detroit, MI, USA) e em Sabouraud dextrose agar (SDA) (Difco) a 30 °C em condições aeróbias, incubados por 48 horas para assegurar a pureza e a viabilidade dos organismos. A seguir, as leveduras foram suspensas em meio RPMI, sendo que a turbidez do inóculo foi ajustada ao padrão 0,5 da escala de McFarland, correspondendo à concentração de 1,0 a 2,5 x 106 unidades formadoras de colônias
por mL (UFC/mL). A seguir, as suspensões celulares foram diluídas em RPMI de modo a atingirem uma concentração final de 0,5 a 2,5×103 UFC/mL.
Para os ensaios com os óleos essenciais, seguiram-se os protocolos publicados por Santos et al. (2008), Punithavathy et al. (2012), e nos documentos M27-A3 e M27-S4 (2012) publicados pelo Clinical Laboratory Standards (CLSI). Os óleos essenciais foram dissolvidos em DMSO a 2% (v/v) e diluídos em RPMI. As concentrações testadas variaram de 4000 µg/mL a 0,18 µg/mL. Cada uma das suspensões de leveduras foi inoculada nas microplacas previamente preparadas com as diluições dos óleos essenciais e incubadas a 37ºC por 48h. Os poços com apenas inóculo e meio de cultura foram considerados como 100% de viabilidade dos organismos. Controle de esterilidade do DMSO a 2% (v/v) e o meio de cultura sem o inóculo, acrescido dos óleos vegetais ou da droga controle também foram testados em placa separada concomitante ao ensaio. C. krusei ATCC 6258 e C. parapsilosis ATCC 22019 e o antifúngico anfotericina B foram usados como controle e para validação dos testes. A adição de solução aquosa de rezasurina a 0,001% (GOUGHENOUR et al., 2015), e incubação adicional por 3h a 37ºC foi utilizada para visualização da viabilidade das leveduras. A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor concentração do agente antifúngico que manteve a coloração azul no meio sobrenadante. Os ensaios foram realizados em triplicata e o valor médio obtido foi utilizado para descrever a concentração inibitória mínima.
Para avaliação dos resultados de CIM obtidos adotou-se os critérios de Holetz (2002), os quais consideram que valores de CIM inferiores a 100 µg/mL indicam que a substância vegetal testada possui boa atividade antimicrobiana, valores entre 100 e 500µg/mL indicam atividade antimicrobiana moderada e valores de CIM superiores a 500 µg/mL indicam que a substância testada é inativa contra o micro-organismo a que foi submetido.
5. DESENVOLVIMENTO
Nos últimos anos, a etnobotânica tem contribuído para o desenvolvimento tecnológico e farmacêutico de biomoléculas de origem vegetal para a produção de novos fármacos. Os óleos essenciais têm-se mostrado efetivos contra uma variedade de organismos, entretanto, fatores como a metodologia de extração dos
óleos, volatilidade e dificuldade de solubilização dificultam a comparação de resultados de testes antimicrobianos (NASCIMENTO, 2007).
No presente estudo, a maioria dos óleos não apresentaram atividade antifúngica. Somente foi observada atividade para Citrus reticulata Blanco (mexerica poncã) e Citrus reticulata (mexerica cheirosinha). Esta informação não foi encontrada na literatura até o momento, de acordo com os levantamentos realizados. Ademais, este achado é curioso porque a atividade antifúngica foi evidenciada contra somente uma das espécies, C. krusei, que apresenta resistência intrínseca a um dos antifúngicos mais utilizados na prática clínica, o fluconazol.
Dados relativos à atividade antifúngica de óleos essenciais de frutas cítricas, mostrou um estudo de avaliação de sensibilidade com metodologia por disco-difusão, da fração diclorometano de Citrus cinesis (laranja pera) frente a cepa de C. albicans o qual se mostrou efetivo (RODRIGUES; SILVA, 2018). Esse dado é contrastante ao nosso uma vez que o óleo proveniente da casca de Citrus cinesis não apresentou atividade antifúngica sobre as cepas de Candida testadas. No entanto, Tao et al. (2014), sugeriram que o óleo essencial de C. reticulata Blanco produziu efeito citotóxico nas células de Penicillium italicum e P. digitatum ao romper a integridade da membrana celular e consequente perda de componentes celulares. Além disso, Akpomie (2010), relatou que o óleo das sementes de C. sinensis nas concentrações de 2,0; 3,0 e 3,0%, exibiram atividade antifúngica contra os fungos Paecilomyces sp., Penicillium sp. e Rhizopus nigricans, respectivamente.
Menezes et al. (2009), avaliando o óleo essencial de Piper aduncun (pimenta-de-macaco) não encontrou atividade fungicida contra C. albicans em metodologia de disco-difusão. No presente estudo, em que se utilizou a metodologia de microdiluição em caldo, os resultados foram similares, visto que as três amostras do óleo essencial testadas não mostraram atividade antimicrobiana contra as espécies de Candida testadas, mostrando CIM variando de 2000 a >4000 µg/mL.
No conjunto, as discrepâncias encontradas poderiam ser consequentes da composição do óleo essencial empregado, que pode variar conforme o clima, a região de coleta, o teor de minerais do solo, a temperatura e o tempo de secagem do material vegetal (LEAL et al., 2001), a técnica utilizada na extração e conservação dos mesmos, e ainda a metodologia utilizada para triagem e pesquisa da atividade antimicrobiana in vitro.
6. RESULTADOS
A maioria dos óleos testados apresentaram CIM maiores ou iguais a 2.000 µg/mL, e de acordo com os critérios de interpretação adotados, indicam ausência de atividade antifúngica (Quadro 1).
Os melhores resultados foram obtidos com os óleos de cascas de Citrus reticulata (mexerica cheirosinha) e de Citrus reticulata Blanco (mexerica poncã), que apresentaram CIM de 250 µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente, para a cepa de C. krusei testada, indicando atividade antifúngica moderada (Quadro 1).
Quadro 1. Concentrações inibitórias mínimas (CIM) obtidas com óleos essenciais testados contra as espécies de Candida.
Plantas (nome popular – parte utilizada)
Espécies de Candida (CIM µg/mL)
Candida albicans ATCC 5314 Candida tropicalis ATCC 13803 Candida krusei ATCC 6258 Candida glabrata ATCC 2001 Candida parapsilosis ATCC 22019
Citrus nobilis (mexerica Bahia -
cascas)
2.000 4.000 4.000 2.000 4.000
Citrus reticulata (mexerica
cheirosinha - cascas)
2.000 1.000 250 1.000 1.000
Citrus reticulata Blanco
(mexerica poncã - cascas)
1.000 2.000 500 1.000 1.000
Citrus reticulata Blanco
(mexerica poncã - folhas frescas)
2.000 2.000 4.000 4.000 4.000
Citrus reticulata Blanco
(mexerica poncã - folhas secas)
4.000 4.000 4.000 2.000 2.000
Citrus reticulata (var. cravo mexerica fuxiqueira - cascas)
4.000 4.000 4.000 2.000 4.000
Citrus sinensis L (laranja pera do
rio - cascas)
4.000 4.000 4.000 4.000 4.000
Piper aduncun L.
(Pimenta-de-macaco – Amostra 1) 4.000 4.000 4.000 4.000 4.000
Piper aduncun L.
(Pimenta-de-macaco – amostra 2)
4.000 4.000 4.000 2.000 4.000
Piper aduncun L.
(Pimenta-de-macaco – Amostra 3 )
2.000 4.000 4.000 2.000 2.000
Psidium cattleyanum (Araçá
-folhas frescas)
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os óleos essenciais de Citrus reticulata (mexerica cheirosinha) e de Citrus reticulata Blanco (mexerica poncã) podem ser considerados, no âmbito farmacológico, como promissores para estudos de desenvolvimento de novas drogas com atividade antifúngica. O presente trabalho colabora com as possibilidades de tratamentos alternativos acessíveis e efetivos para infecções causadas por leveduras do gênero Candida, e aponta para a continuidade dos estudos, inclusive com outras espécies e outros gêneros fúngicos que apresentam resistência intrínseca ou adquirida aos fármacos comumente utilizados.
8.FONTES CONSULTADAS
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