UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Carlos Yure Barbosa de Oliveira
Efeito do modo nutricional e da fonte de carbono no cultivo e na composição bioquímica da microalga Selenastraceae sp. nov.
Florianópolis 2020
Carlos Yure Barbosa de Oliveira
Efeito do modo nutricional e da fonte de carbono no cultivo e na composição bioquímica da microalga Selenastraceae sp. nov.
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Mestre em Aquicultura.
Orientador: Prof. Roberto Bianchini Derner, Dr. Coorientador: Rafael Garcia Lopes, Dr.
Florianópolis 2020
Carlos Yure Barbosa de Oliveira
Efeito do modo nutricional e da fonte de carbono no cultivo e na composição bioquímica da microalga Selenastraceae sp. nov.
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Roberto Bianchini Derner, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Leonardo Rubi Rörig, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Luis Alejandro Vinatea Arana, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado como adequado para obtenção do título de mestre em Aquicultura.
__________________________________
Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Aquicultura
__________________________________ Prof. Roberto Bianchini Derner, Dr.
Orientador
Florianópolis, 2020.
Roberto Bianchini
Derner:53308131
900
Assinado de forma digital por Roberto Bianchini Derner:53308131900 Dados: 2020.03.09 20:38:50 -03'00'
Documento assinado digitalmente Leila Hayashi
Data: 10/03/2020 17:11:38-0300 CPF: 264.594.018-88
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, por toda beleza que é a natureza, por toda forma de amor e por todos bons acontecimentos durante esta jornada.
À minha Família, em especial: aos meus pais, Idílio e Nilzete pela educação, criação e amor incondicional; à minha irmã Amara pelo carinho e palavras de incentivo; aos meus sobrinhos Cauã Luca e Maria Eduarda pelos sorrisos encantadores e motivantes.
Ao orientador, Roberto Derner e ao co-orientador, Rafael Lopes pelas oportunidades, confiança e ensinamentos depositados ao longo do Mestrado.
A Equipe do Laboratório de Cultivo de Algas (LCA) por toda parceria e cumplicidade ao logo dessa caminhada e também pelos momentos descontraídos.
Aos meus amigos, Cicero Diogo Lins de Oliveira, Ayanne Almeida, Matheus Cruz, Laerty Gomes, Camila Nader, Weverson Silva, Raphaella Holovate, Geyse Carvalho e Juliana Favetta que estiveram sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins e que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura, Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Laboratório de Nutrição de Espécies Aquícolas (LABNUTRI) e Laboratório de Produção de Alimento Vivo (LAPAVI) pela infraestrutura e parceria na realização de análises.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil - (CAPES) - Código de Financiamento 001.
RESUMO
As microalgas têm sido amplamente empregadas na Aquicultura, bem como, apresentam um vasto potencial de emprego no tratamento de águas residuais, na produção de compostos de alto valor comercial e na produção de biocombustíveis. Na busca por espécies de microalgas com potencial para a produção de biodiesel, a biomassa da microalga Selenastraceae sp. nov. foi apontada como promissora, devido ao elevado teor lipídico e perfil de ácidos graxos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi investigar os modos nutricionais e seus efeitos no cultivo da microalga Selenastraceae sp. nov. Para isso, foram desenvolvidos cultivos experimentais de Selenastraceae sp. nov. nos modos nutricionais fotoautotrófico, heterotrófico e mixotrófico, com o emprego de glicose, frutose, glicerol ou sacarose – nas condições que utilizam carbono orgânico, utilizando garrafas cilíndricas de vidro de borosilicato com capacidade de 1 litro. Para a determinação da influência do modo nutricional e da fonte de carbono, foram avaliados diariamente os parâmetros de crescimento das culturas. Ademais, o rendimento e o perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos foram determinados por cromatografia gasosa de alta resolução; também foram averiguadas a eficiência de conversão de carbono em biomassa e a análise microbiana. Por fim, uma possível cadeia integrada de produção foi examinada através do emprego da biomassa desengordurada, e integral, de Selenastraceae sp. nov. crescida nos três modos nutricionais, usando glicose, na alimentação do microcrustáceo Daphnia similis. Em relação ao modo nutricional, os resultados demonstraram que a heterotrofia e a mixotrofia, independente da fonte de carbono orgânico utilizada, apresentaram vantagens sobre a fotoautotrofia. Além disso, foi possível inferir que na produção de biomassa o uso de glicose apresentou vantagens frente as demais fontes de carbono orgânico, independente do modo nutricional. Os cultivos com a introdução de CO2
apresentaram menor eficiência de conversão de carbono em biomassa devido, entre outros fatores, ao formato e ao tamanho do fotobiorreator utilizado. Em contraste à produção de biomassa, na condição fotoautotrófica foi reportada a menor carga bacteriana. Ainda, em relação ao rendimento de ésteres metílicos de ácidos graxos, a biomassa das culturas crescidas na presença de luz (fotoautotrofia ou mixotrofia) apresentaram maior rendimento; o perfil de ácidos graxos apresentou relativa similaridade quando Selenastraceae sp. nov. foi cultivada usando glicose ou sacarose (comprovados por análise de componentes principais). Com relação ao crescimento de D. similis, o uso da biomassa integral de Selenastraceae sp. nov. apresentou vantagens na velocidade de crescimento e na população deste microcrustáceo. Apenas a biomassa desengordurada oriunda do crescimento heterotrófico atingiu densidade populacional similar às dietas com biomassas integrais. Provavelmente, este fato pode ser resultado de um maior percentual de carboidratos (fonte energética) presente na biomassa crescida em modo nutricional heterotrófico, uma vez que o teor lipídico deste modo nutricional foi significativamente menor que fotoautotrófico e mixotrófico. Em conclusão, as culturas de Selenastraceae sp. nov. desenvolvidas em modo mixotrófico apresentaram maior biomassa em comparação ao crescimento fotoautotrófico e heterotrófico. O modo nutricional também afetou o rendimento lipídico e de ésteres metílicos de ácidos graxos de Selenastraceae sp. nov. - menores rendimentos foram reportados para o crescimento heterotrófico. Já em relação ao crescimento de D. similis apenas a biomassa residual oriunda do crescimento heterotrófico resultou em desempenho similar às dietas integrais.
Palavras-chave: Aquicultura. Microalgas. Modos nutricionais. Composição bioquímica. Ácidos graxos.
ABSTRACT
Microalgae have been widely used in Aquaculture, as well, they present a vast potential of use in the wastewater treatment, high-value compounds production and biofuels production. In the search for microalgae species with potential for biodiesel production, microalga Selenastraceae sp. nov. biomass was shown to be promising, due to the high lipid content and fatty acid profile. In this sense, the objective of this work was to investigate the nutritional modes and the effects on the cultivation of the green microalga Selenastraceae sp. nov. For that, experimental cultivations of Selenastraceae sp. nov. in photoautotrophic, heterotrophic and mixotrophic nutritional modes, using glucose, fructose, glycerol or sucrose - in conditions that use organic carbon, using cylindrical borosilicate glass bottles with of 1 liter. To determine the influence of the nutritional mode and the carbon source, growth parameters of cultures were evaluated daily. In addition, fatty acid methyl esters yield and profile were determined by high performance gas chromatography; the carbon conversion efficiency into biomass and microbial analysis were also investigated. Finally, a possible integrated production chain was examined using the defatted, and the integral biomass, of Selenastraceae sp. nov. grown in the three nutritional modes, using glucose, in the production of microcrustacean Daphnia similis. Regarding the nutritional mode, the results showed heterotrophy and mixotrophy, regardless of organic carbon source used, presented advantages over photoautotrophy. In addition, it was possible to infer that in the biomass production, glucose use had advantages over other organic carbon sources, regardless of the nutritional mode. Cultivations with the CO2 addition showed less efficiency in converting carbon into
biomass due, among other factors, to photobioreactor shape and size used. In contrast to biomass production, in the photoautotrophic condition, lowest bacterial load was reported. Still, in relation to fatty acid methyl esters yield, the biomass of cultures grown in the light presence (photoautotrophy or mixotrophy) showed higher yield; fatty acid profile showed relative similarity when Selenastraceae sp. nov. was grown using glucose or sucrose (proven by the principal components analysis). In relation to the growth of D. similis, the use of integral biomass of Selenastraceae sp. nov. presented advantages in growth rate and microcrustacean population. Only defatted biomass from heterotrophic growth reached a population density similar to diets with integral biomass. This fact may probably be the result of a carbohydrates higher percentage (energy source) present in biomass grown in heterotrophic nutritional mode, since the lipid content in this mode was significantly lower than photoautotrophic and mixotrophic. In conclusion, cultures of Selenastraceae sp. nov. developed in mixotrophic nutritional mode showed higher biomass compared to photoautotrophic and heterotrophic growth. Nutritional mode also affected the lipid yield and fatty acid methyl esters of the biomass of Selenastraceae sp. nov. - lower yields have been reported for heterotrophic growth. Regarding the growth of D. similis, only residual biomass from heterotrophic growth resulted in performance similar to integral diets.
Keywords: Aquaculture. Microalgae. Nutritional modes. Biochemical composition. Fatty acids.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fontes, inorgânicas e orgânicas, de carbono empregadas ao cultivo de microalgas ... 15 Figura 2 - Microfotografia das células de Selenastraceae sp. nov. Barra: 10µm. ... 17 Figura 3 - Concentração média de biomassa de culturas fotoautotróficas, heterotróficas e
mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes concentrações de glicose. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3). ... 29 Figura 4 - Consumo de nitrato (A), e de glicose (B) em culturas fotoautotróficas,
heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3). ... 32 Figura 5 - Efeito da concentração de glicose no crescimento heterotrófico e mixotrófico de
Selenastraceae sp. nov. Valores referentes à biomassa máxima de cada uma das réplicas (n = 3). Para a condição heterotrófica sem glicose, a interseção no ponto 0, 0 foi definida uma vez que não foi observado crescimento; enquanto para a condição mixotrófica, o crescimento sem glicose corresponde ao crescimento fotoautotrófico. ... 33 Figura 6 - Concentração média de biomassa de culturas fotoautotróficas, heterotróficas e
mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes fontes de carbono orgânico. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3). ... 34 Figura 7 - Concentração média de teores de clorofila-a (A) e carotenoides totais (B) de
culturas fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes fontes de carbono orgânico. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3). ... 36 Figura 8 - Eficiência média de conversão de carbono (%) em biomassa por Selenastraceae
sp. nov. em diferentes modos nutricionais. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3). FT fotoautotrófico, HT heterotrófico e MT mixotrófico. ... 37 Figura 9 - Quantificação manual de bactérias em culturas fotoautotróficas, heterotróficas e
mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes fontes de carbono orgânico. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3).FT fotoautotrófico, HT heterotrófico e MT mixotrófico. ■ concentração do inóculo e ■ concentração final. ... 39
Figura 10 - Diagrama de ordenação da Análise de Principais Componentes (PCA) categorizada pelo modo nutricional (A) e pela fonte de carbono (B). FT fotoautotrófico, HT heterotrófico e MT mixotrófico. ... 46 Figura 11 - Efeito do modo nutricional na concentração de biomassa e perfil de consumo
de nutrientes. (A) fotoautotrófico, (B) heterotrófico e (C) mixotrófico. Setas brancas e pretas indicam a adição de nitrato e glicose, respectivamente, à cultura. ... 58 Figura 12 - Rendimento lipídico (%) de Selenastraceae sp. nov. cultivada em condições
fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas. Letras diferentes indicam diferença significativa pelo teste post-hoc de Tukey (p <0,05). ... 59 Figura 13 - Curvas de crescimento de culturas de Daphnia similis alimentadas com dietas
integrais (linhas sólidas) e residuais (linhas tracejadas). Valores apresentados em média ± desvio padrão (n = 2). ... 60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Modos nutricionais reportados para o crescimento de microalgas... 13 Tabela 2 - Parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. cultivada em modo
nutricional fotoautotrófico (96 h), heterotrófico (96 h) e mixotrófico (72 h) utilizando glicose como fonte de carbono orgânico. ... 30 Tabela 3 - Parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. cultivada em diferentes
modos nutricionais e fontes de carbono orgânico... 34 Tabela 4 - Produtividade de ésteres metílicos de ácidos graxos obtida de Selenastraceae sp.
nov. crescida sob diferentes modos nutricionais e fontes de carbono. ... 41 Tabela 5 - Perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (%) obtidos de biomassas
Selenastraceae sp. nov. cultivadas em diferentes modos nutricionais e fontes de carbono. ... 43
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
1.1 FONTES DE CARBONO ... 14
1.2 Selenastraceae ... 16
1.3 CADEIA PRODUTIVA INTEGRADA DE MICROALGAS ... 18
1.4 OBJETIVO GERAL... 18
1.4.1 Objetivos Específicos ... 19
2 ARTIGO CIENTÍFICO I ... 20
2.1 INTRODUÇÃO... 20
2.2 MATERIAL E MÉTODOS... 22
2.2.1 Cepa de microalga e meio de cultura... 22
2.2.2 Condições de cultura ... 22 2.2.3 Estudo experimental... 23 2.2.3.1 Experimento I ... 23 2.2.3.2 Experimento II ... 23 2.2.4 Métodos analíticos ... 24 2.2.4.1 Parâmetros de crescimento ... 24 2.2.4.2 Concentração de nitrato ... 24 2.2.4.3 Concentração de glicose ... 25 2.2.4.4 Teor de pigmentos ... 25 2.2.4.4.1 Fluxo de carbono... 25 2.2.4.5 Análise bacteriológica ... 26
2.2.5 Separação e secagem da biomassa ... 26
2.2.6 Transesterificação direta ... 26
2.2.7 Condições de HRGC-FID e HRGC-MS ... 27
2.2.8 Curva de quantificação para teor de FAME ... 28
2.2.9 Análise estatística ... 28 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 28 2.3.1 Experimento I ... 28 2.3.2 Experimento II ... 33 2.3.3 Pigmentos fotossintéticos ... 36 2.3.4 Fluxo de carbono ... 37 2.3.5 Análise bacteriológica ... 38
2.3.6 Produtividade de FAME ... 40
2.3.7 Perfil de FAME ... 42
2.3.8 Comparações por análise multivariada ... 45
2.4 CONCLUSÕES ... 47
2.5 REFERÊNCIAS ... 47
3 ARTIGO CIENTÍFICO II ... 53
3.1 INTRODUÇÃO... 53
3.2 MATERIAL E MÉTODOS... 54
3.2.1 Cepa de microalga e manutenção de inóculo ... 54
3.2.2 Condições de crescimento ... 55 3.2.3 Métodos analíticos ... 55 3.2.3.1 Concentração de biomassa ... 55 3.2.3.2 Concentração de nitrato ... 55 3.2.3.3 Concentração de glicose ... 56 3.2.4 Processamento da biomassa ... 56
3.2.5 Cultivo de Daphnia similis ... 56
3.2.6 Análise estatística ... 57
3.3 RESULTADOS ... 57
3.3.1 Crescimento de Selenastraceae sp. nov. e consumo de nutrientes ... 57
3.3.2 Rendimento lipídico ... 58
3.3.3 Crescimento de Daphnia similis ... 59
3.4 DISCUSSÃO ... 60
3.5 CONCLUSÕES ... 63
3.6 REFERÊNCIAS ... 63
4 CONCLUSÕES GERAIS ... 67
1 INTRODUÇÃO
O interesse por microalgas tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas, principalmente devido ao surgimento de demanda por biomassas e bioprocessos sustentáveis, a exemplo da aquicultura, onde as microalgas desempenham papéis imprescindíveis na criação de moluscos e em fases larvais de crustáceos e peixes (MULLER-FEUGA, 2000; GARRIDO-CARDENAS et al., 2018). Dentre outras aplicações, esses micro-organismos também têm despertado interesses no tratamento de águas residuais, produção de pigmentos de alto valor comercial e na produção de biocombustíveis (DAROCH et al., 2013; SALAMA et al., 2017; GALARZA et al., 2018). Em se tratando do emprego da biomassa de microalgas para a elaboração de biocombustíveis, os carboidratos podem ser fermentados para a produção de bioetanol (JONES; MAYFIELDT, 2012) e os lipídios podem ser transesterificados para produção de biodiesel (DAROCH et al., 2013). Entretanto, apesar de aproximadamente meio século de pesquisas, biocombustíveis derivados de microalgas ainda não se tornaram uma alternativa economicamente viável (GRIFFITHS; HARRISON, 2009).
Majoritariamente, os cultivos de microalgas, tanto em larga como em pequena escala, são desenvolvidos em modo nutricional fotoautotrófico. No entanto, as microalgas podem apresentar outros tipos de modos nutricionais, desde o fotoautotrófico ao heterotrófico (BRENNAN; OWENDE, 2010) (Tabela 1).
Tabela 1 - Modos nutricionais reportados para o crescimento de microalgas.
Metabolismo Fonte de carbono Fonte energética
Fotoautotrófico Carbono inorgânico Luz
Fotoheterotrófico Carbono orgânico Luz
Heterotrófico Carbono orgânico Carbono orgânico Mixotrófico Carbono orgânico e inorgânico Luz e carbono orgânico
Fonte: Adaptado de Wang et al. (2014).
A condição de cultivo fotoautotrófica é a mais difundida e mais utilizada no desenvolvimento das culturas de microalgas, visto que todas são fotossintéticas. Isso se deve, principalmente, a elevada eficiência na conversão de energia luminosa em energia química, facilidades de manejo e baixo custo (RICHMOND, 2004). Microalgas fotoautotróficas, por meio da fotossíntese, fazem a assimilação e fixação do carbono inorgânico proveniente do ar atmosférico ou da injeção artificial de CO₂, transformando este elemento em compostos orgânicos mais reduzidos, principalmente açúcares (NELSON; COX, 2015; UGGETTI et al.,
2018). No entanto, o principal problema para a maioria dos cultivos fotoautotróficos é a baixa disponibilidade de luz nos tanques profundos em que as culturas são desenvolvidas, onde as células são moduladas não apenas pela irradiância disponível, mas também pelo número de células, turbulência e profundidade da coluna d'água (FALKOWSKI, 2007; LI et al., 2014).
Apesar da preferência pela fotoautotrofia, algumas cepas de microalgas são capazes de crescer em condições heterotróficas, sem a presença de energia luminosa, e assim não realizam a fotossíntese. Neste modo nutricional, são utilizadas fontes orgânicas de carbono para satisfazer as exigências nutricionais e energéticas (MOHAN et al., 2015). Em contraste ao metabolismo fotoautotrófico, onde há uma contínua produção de oxigênio (muito superior à demanda) o consumo exclusivo de oxigênio no modo nutricional heterotrófico está relacionado ao processo de respiração celular, que será regulado pela demanda de energia na forma de adenosina trifosfato e adenina dinucleotídeo fosfato (GEIDER; OSBORNE, 1989; GRIFFITHS et al., 1960).
Por sua vez, o modo nutricional fotoheterotrófico, que requer luz como fonte energética – assim como no fotoautotrófico -, e compostos orgânicos como fonte de carbono, diferindo do modo nutricional mixotrófico pela incapacidade de realizar o crescimento simultâneo usando fontes orgânicas e inorgânicas de carbono (CHEN et al., 2011; WANG et al., 2014). Já em culturas mixotróficas, as células microalgáceas utilizam simultaneamente luz, fontes orgânicas e inorgânicas de carbono para o crescimento. De acordo com Wang et al. (2014), a possibilidade de utilizar carbono orgânico como fonte energética faz do metabolismo mixotrófico uma opção promissora para o desenvolvimento da produção de microalgas. Alguns estudos sugerem que a taxa de crescimento de microalgas em condição mixotrófica seja aproximadamente a soma das produções do modo heterotrófico e fotoautotrófico, desde que estejam sob mesmas condições (e.g. temperatura e meio de cultura) (MARQUEZ et al., 1993). De fato, Li et al. (2014) reportaram produtividades mais elevadas (5,2 vezes maior) de Chlorella sorokiniana quando cultivada sob condições mixotróficas do que em condições fotoautotróficas e heterotróficas.
1.1 FONTES DE CARBONO
Independentemente do modo nutricional, o carbono é o principal macronutriente requerido no cultivo de microalgas, uma vez que corresponde a 50% da biomassa seca (MIRÓN et al., 2003). Em produções intensivas de microalgas, a suplementação de CO2 nas
baixa disponibilidade desse gás na atmosfera (~0,03%) pode ser limitante para que seja alcançada elevada biomassa (HART, 1978; CHISTI, 2007). Na Figura 1 é mostrado as principais fontes inorgânicas e orgânicas de carbono empregadas ao cultivo de microalgas.
Figura 1 - Fontes, inorgânicas e orgânicas, de carbono empregadas ao cultivo de microalgas.
Fonte: Elaborado pelo autor (2019).
Para os modos nutricionais que utilizam carbono orgânico, duas fontes têm sido frequentemente estudadas no cultivo de microalgas: glicose (CHEIRSILP; TORPEE, 2012; MORALES-SÁNCHEZ et al., 2013; WANG et al., 2017); e acetato (JEON et al., 2006; MOON et al., 2013; LIU et al., 2018). O uso de glicose em condição mixotrófica proporcionou rendimentos 3,4 vezes maior em culturas de Nanochloropsis sp. (CHEIRSILP; TORPEE 2012) e 5,2 vezes maior em Chlorella sp. (LI et al., 2014) quando comparado com produções fotoautotróficas. Além disso, a substituição de glicose para o cultivo heterotrófico e mixotrófico por fontes alternativas (e.g. glicerol, frutose, galactose, sacarose, efluentes etc.) tem despertado interesse de modo a otimizar as produções (MONDAL et al., 2017).
O glicerol é um subproduto da produção de fábricas de biodiesel, sabão e ácidos graxos com potenciais aplicações na indústria biotecnológica (ANITHA et al., 2016) e, embora o composto ofereça uma gama de aplicações comerciais, sua produção excessiva por conta da rápida expansão de usinas de biodiesel em todo mundo, ainda representa um gargalo (PAGLIARO; ROSSI, 2010). O cultivo de microalgas usando glicerol tem sido recentemente empregado para diferentes espécies com o objetivo de estimular a produtividade proteica e
lipídica (PARANJAPE et al., 2016; SALATI et al., 2017). Morais et al. (2019) reportaram que o uso do glicerol, além de promover melhor performance de crescimento mixotrófico quando comparado ao fotoautotrófico, causou aumento do teor de proteína e alterações no perfil de ácidos graxos de Arthrospira sp.; enquanto que resultados similares foram reportados para Chlorella pyrenoidosa (YU et al., 2018). O uso de glicerol na produção heterotrófica e mixotrófica de biomassa de microalgas oleaginosas, com potencial aplicação na produção de biodiesel, poderia proporcionar uma integração dessa cadeia produtiva, uma vez que esse composto é um coproduto inevitável na produção de biodiesel (ANITTHA et al., 2016).
Outro composto de interesse é a sacarose, que é um dissacarídeo de origem vegetal e é encontrado, principalmente, na cana-de-açúcar. A sacarose é formada por uma molécula de frutose e uma de glicose. O uso desse composto como substrato para microalgas heterotróficas é questionável devido ao baixo desempenho de crescimento, quando comparado com glicose, e ainda que a maioria das cepas estudadas não conseguiu assimilar esse composto (PEREZ-GARCIA et al., 2011). O uso de dissacarídeos, incluindo sacarose, promoveu incremento na produção de biomassa em culturas heterotróficas de Chlorella pyrenoidosa sem afetar significativamente a composição bioquímica da biomassa (ZHANG et al., 2014; WANG et al., 2018). Até o momento, foi hipotetizado que devido à baixa eficiência de utilização deste substrato no crescimento heterotrófico, as células algáceas não possuem um transportador de sacarose ou não são capazes de hidrolisar extracelularmente a sacarose em monossacarídeos - embora se saiba que em baixas concentrações (< 10% p/v) ela é hidrolisada em glicose e frutose pela invertase (ZHANG et al., 2014; WANG et al., 2016).
1.2 Selenastraceae
Dentre inúmeras espécies de microalgas descritas, em nível mundial a produção de microalgas encontra-se limitada a um pequeno número de espécies (GARRIDO-CARDENAS et al., 2018): Arthrospira (Spirulina) spp. destinada, principalmente, a alimentação e suplementação humana (PAN-UTAI et al., 2018); Chlorella spp. por ser uma potencial produtora de β-1,3-glucano, um imunoestimulador ativo com capacidade antioxidante (CARBALLO et al., 2019); Dunaliella salina, uma das fontes mais promissoras de β-caroteno (BEN-AMOTZ, 2004); e Haematococcus pluvialis, com a produção voltada para a extração de astaxantina (PANIS; CARREON, 2016).
A família Selenastraceae é composta por algas verdes cocóides, com células com formato variado (geralmente fusiforme ou cilíndrico) e solitárias ou coloniais. A maioria das
espécies de Selenastraceae são descritas como cosmopolitas e podem ser encontradas nas mais diversas regiões climáticas (SILVA et al., 2016). Para a produção de biodiesel, o elevado teor lipídico, o perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos nas células e a alta produtividade de Selenastraceae sp. nov. (Sphaeropleales, Chlorophyceae) (Figura 2) verificada nas culturas despertaram um recente interesse por esta espécie; particularmente considerando a biomassa de Selenastraceae sp. nov. como uma matéria-prima promissora para produção de biodiesel (MENEZES et al., 2016; DA CRUZ LIMA et al., 2018).
A cepa de Selenastraceae utilizada neste estudo foi inicialmente identificada pelo Professor Armando Henriques Vieira, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), como Choricystis minor var. minor e está listada no Centro de Culturas de Microalgas da UFSCar com o código CCMA-UFSCar 265, de acordo com World Data Center for Microorganism e World Federation for Culture Collection. No entanto, com a aplicação da biologia molecular nas inferências filogenéticas percebeu-se que na verdade se trata de um novo gênero ainda não publicado (em processo final de descrição). Por esse motivo, ao longo de todo o texto a nomenclatura Selenastraceae sp. nov. foi adotada para se referir à esta cepa em particular.
Figura 2 - Microfotografia das células de Selenastraceae sp. nov. Barra: 10µm.
1.3 CADEIA PRODUTIVA INTEGRADA DE MICROALGAS
Os estudos visando à cadeia produtiva integrada de microalgas têm evoluído, ainda que de maneira lenta, particularmente aqueles que podem melhorar a sustentabilidade e a economia dos bioprocessos, sobretudo do biodiesel produzido a partir da biomassa algácea (GERARDO et al., 2015). Além da constante preocupação no aprimoramento das técnicas empregadas no cultivo e na separação de biomassa de microalgas, a necessidade de processos que utilizem integradamente essa biomassa tem se tornado cada vez mais presente (LÓPES-RODRÍGUEZ et al., 2019). A extração de vários produtos sintetizados - assim como já ocorre para Arthrospira spp. e Chlorella spp. - poderia melhorar a economia e reduzir os impactos ambientais nos bioprocessos envolvendo microalgas e é considerada uma medida mitigatória extremamente necessária (MOLINA-MIRAS et al., 2018; CHEW et al., 2017).
Selenastraceae sp. nov. além de ter apresentado elevado conteúdo lipídico, possui um elevado teor proteico e de carotenoides com potenciais aplicações biotecnológicas (MENEZES et al., 2016). Entretanto, estudos de Selenastraceae sp. nov. ainda são escassos, principalmente referente aos modos nutricionais de cultivo e ao aproveitamento integrado da biomassa; cultivos heterotróficos e mixotróficos de Selenastraceae sp. nov. poderiam proporcionar produções intensivas em grandes volumes devido a não-dependência da luz; enquanto uma possível utilização da biomassa residual, após a extração dos lipídios, poderia contribuir para que seja alcançada a viabilidade econômica da produção do biodiesel pelo emprego da biomassa de microalgas como matéria-prima (PEREZ-GARCIA et al., 2011).
Diante do apresentado, a presente dissertação foi elaborada visando realizar uma abordagem dos modos nutricionais e seus efeitos nos parâmetros de crescimento, nos pigmentos fotossintéticos e, no rendimento e no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (Artigo científico I). No artigo científico II, foram realizadas culturas de Selenastraceae sp. nov. em batelada alimentada e a viabilidade da biomassa desengordurada foi testada na alimentação do microcustáceo Daphnia similis.
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 Objetivo geral
Determinar o efeito de distintos modos nutricionais e fontes de carbono no cultivo da microalga Selenastraceae sp. nov.
1.4.2 Objetivos Específicos
Comparar os parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. nos modos nutricionais fotoautotrófico, heterotrófico e mixotrófico.
Determinar o efeito do modo nutricional e de fontes de carbono na produção de pigmentos e no perfil de ácidos graxos da biomassa de Selenastraceae sp. nov.
Determinar o efeito do modo nutricional no rendimento lipídico e no uso da biomassa desengordurada de Selenastraceae sp. nov. na alimentação do microcrustáceo Daphnia similis.
2 ARTIGO CIENTÍFICO I
Artigo a ser submetido à Revista Journal of Applied Phycology (ISSN: 0921-8971, Qualis: A2, Área: Zootecnia e Recursos Pesqueiros).
Modo nutricional e fonte de carbono influenciam na produção de biomassa, pigmentos fotossintéticos e ácidos graxos da microalga Selenastraceae sp. nov.
Carlos Yure Barbosa de Oliveira1*, Emmanuel Bezerra D'Alessandro2, Nelson Roberto
Antoniosi Filho2, Rafael Garcia Lopes1 & Roberto Bianchini Derner1
1 Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura, Laboratório de
Cultivo de Algas, Florianópolis, Brasil
2 Universidade Federal de Goiás, Departamento de Quimica, Laboratório de Métodos de
Extração e Separação, Goiânia, Brasil
*Autor correspondente: yureboliveira@gmail.com; ORCID: 0000-0001-9237-1869
2.1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de cadeias de produção de biomassas sustentáveis, para posterior geração de bioprodutos e energias renováveis, pode contribuir com a redução da poluição atmosférica e de efluentes líquidos ricos em nitrogênio e fósforo. Neste segmento, as microalgas são consideradas micro-organismos muito promissores por diversos aspectos: elevada eficiência de conversão de dióxido de carbono (CO2) em biomassa, capacidade de ser
produzida em áreas impróprias para a agricultura, fonte de produtos de alto valor comercial (e.g. ácidos graxos poli-insaturados, carotenoides, aminoácidos essenciais etc.) e lipídios neutros, que podem ser usados para a produção de biodiesel (Mata et al. 2010; Juárez et al. 2018; Dantas et al. 2019; Goh et al. 2019; Liu et al. 2019). A extrapolação de dados de produção em laboratório aponta que a produção de biomassa de microalgas destinada à produção de biodiesel seria capaz de superar em até 20 vezes a produtividade da soja (principal oleaginosa usada neste fim) por unidade de área, no entanto, a produção em larga escala de biodiesel derivado da biomassa de microalgas ainda é uma utopia (Chisti 2008; Menezes et al. 2016).
O modo nutricional mais comum aplicado ao cultivo de microalgas é o fotoautotrófico, visto que todas as microalgas realizam a fotossíntese oxigênica e, também, devido as facilidades de manejo (Chen et al. 2011). No entanto, alguns problemas ainda são
presentes para a maioria dos cultivos em larga escala neste modo nutricional: baixa produtividade em sistemas outdoor com alta profundidade, disponibilidade de luz para todas as células em cultivo, custos elevados com separação da biomassa, devido à baixa concentração celular, etc (Li et al. 2014; Hu et al. 2018; Sun et al. 2019). A abordagem de outros modos nutricionais (principalmente o heterotrófico e o mixotrófico) tem sido uma estratégia interessante para solucionar alguns desses desafios. Microalgas heterotróficas não requerem energia luminosa e por esse fato, maiores produtividades são reportadas quando comparadas ao modo nutricional fotoautotrófico; para o crescimento das culturas neste modo nutricional precisam ser adicionados compostos orgânicos ao meio de cultura para satisfazer os requerimentos de carbono e de energia (Mohan et al. 2015; Mondal et al. 2017). No entanto, culturas mixotróficas têm recebido maior destaque devido ao uso simultâneo de carbono orgânico, carbono inorgânico e luz (Nzayisenga et al. 2018). Em cultivos heterotróficos e mixotróficos a glicose é o composto orgânico mais usado, embora o emprego deste composto possa acarretar gastos elevados (Li et al. 2007; Mondal et al. 2017). Outra fonte orgânica de carbono é o glicerol, que tem sido recentemente empregado para diferentes espécies com o objetivo de aumentar a produtividade (Paranjape et al. 2016; Salati et al. 2017). Menos frequente, o uso de frutose e sacarose tem sido abordado (Mondal et al. 2017), no entanto, nem todas as cepas heterotróficas são capazes de assimilar outras fontes de carbono orgânico que não a glicose (Heredia-Arroyo et al. 2011).
Recentemente, microalgas de Selenastraceae emergiram como potenciais candidatos à produção de biodiesel, principalmente Monoraphidium spp. e Ankistrodesmus sp. já foram relatadas como produtoras de alta biomassa e lipídios quando cultivados em condições específicas (Dhup e Dhawan 2014; Yee 2016). Alguns poucos estudos já reportaram o potencial da microalga verde Selenastraceae sp. nov. como uma matéria graxa promissora para a produção de biodiesel; todos reportando o crescimento sob condições fotoautotróficas (Menezes et al. 2016). A biomassa de Selenastraceae sp. nov. contém um teor de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) satisfatório, o biodiesel produzido com a biomassa de Selenastraceae sp. nov., atendeu a quase todos os requisitos exigidos pelas diretrizes da União Europeia para qualidade do biodiesel (Menezes et al. 2016). Em comparação com o cultivo fotoautotrófico, o cultivo heterotrófico poderia otimizar a produção de biomassa e permitir a aplicação de bioreatores independentes de luz (dispensando uma razão superfície/volume alta, um dos principais desafios para cultivos fotoautotróficos intensivos). Entretanto, o cultivo heterotrófico de microalgas requer mais atenção com possíveis contaminações da cultura, principalmente por bactérias e fungos, que podem competir com as microalgas pelos mesmos
substratos (Wu et al. 2014; Di Caprio et al. 2019). Como as bactérias apresentam taxas de crescimento significativamente maiores em comparação às microalgas, a dominância da cultura por bactérias pode ser facilmente alcançada (Deschênes, 2016).
Diante do exposto, este estudo foi executado com o objetivo de determinar a influência dos modos nutricionais, e de diferentes fontes de carbono orgânico, nos parâmetros de crescimento, na contaminação bacteriana, na produção de pigmentos fotossintéticos e no rendimento e no perfil de FAME de uma cepa de Selenastraceae sp. nov.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 Cepa de microalga e meio de cultura
A microalga Selenastraceae sp. nov. foi cedida pelo Centro de Cultura de Microalgas da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Brasil. Selenastraceae sp. nov. foi mantida em meio LCA-AD (pH 7,6) que contém: 1,05 g L-1 NaNO
3; 0,75 g L-1 MgSO4 7H2O; 0,6 g L -1 KH
2PO4; 0,05 g L-1 EDTA-Na2; 0,03 g L-1 KOH; 0,25 g L-1 K2HPO4; 0,25 g L-1 NaCl; 0,25
g L-1 CaCl
2 2H2O; 0,11 g L-1 H3BO3; 0,05 g L-1 FeSO4 7H2O; 0,014 g L-1 MnCl 4H2O; 0,016
g L-1 CuSO
4 5H2O; 0,00071 g L-1 MoO3; 0,0004 g L-1 Co (NO3) 6H2O em câmaras de
germinação com ciclo claro-escuro de 12 h. Para produzir o inóculo, Selenastraceae sp. nov. foi cultivada em modo nutricional fotoautotrófico sob 450 μmol fótons m−2 s−1, em
fotoperíodo contínuo, e homogeneizadas continuamente com ar atmosférico enriquecido com 0,5 % de CO2 (v/v) à 25±0,5 ºC.
2.2.2 Condições de cultura
Para a determinação do efeito do modo nutricional nos parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. foram realizados cultivos fotoautotróficos, mixotróficos e heterotróficos em frascos cilíndricos de vidro de borossilicato de 1 L. Para a condição fotoautotrófica, as culturas foram agitadas por borbulhamento de ar atmosférico enriquecido com 0,5% de CO2 e submetidas a irradiância de 450 μmol fótons m−2 s−1, com fotoperíodo
contínuo, e temperatura de 25 ºC; na condição mixotrófica foram empregadas as mesmas condições do modo nutricional fotoautotrófico, e foi adicionado carbono orgânico da fonte a ser avaliada. Para a condição heterotrófica, os cultivos ocorreram em sala escura e os frascos foram envoltos em papel pardo; nesta condição, também foi acrescido ao meio de cultura a fonte orgânica de carbono e as culturas foram homogeneizadas com o auxílio de uma mesa
agitadora à 120 rpm e ar atmosférico. O oxigênio dissolvido foi mantido acima de 6 mg L-1,
através de alterações no fluxo de ar injetado no bioreator, para satisfazer a de respiração celular.
2.2.3 Estudo experimental 2.2.3.1 Experimento I
Em um experimento prévio (dados não publicados), com Selenastraceae sp. nov. foi comprovada a existência de metabolismo heterotrófico e mixotrófico desta cepa com o emprego de glicose como fonte de carbono orgânico. Assim, um primeiro experimento foi realizado utilizando glicose; no modo nutricional heterotrófico, em quatro concentrações: 0, 3, 6 e 9 g L-1, nomeados de HT0, HT3, HT6 e HT9, respectivamente; enquanto no modo
nutricional mixotrófico, as concentrações 3, 6 e 9 g L-1 corresponderam aos tratamentos MT3,
MT6 e MT9, respectivamente. O crescimento no modo fotoautotrófico foi considerado como controle positivo para ambas as condições.
Uma curva polinomial de regressão foi plotada para os modos heterotrófico e mixotrófico de modo independente, com valores de concentração de glicose (eixo x) e biomassa máxima (eixo y). O ponto máximo positivo da equação foi calculado pela aplicação da primeira derivada da equação igualada a zero:
𝜕
𝜕𝑥 = 𝑎𝑥
2+ 𝑏𝑥 + 𝑐 (1)
para isso, obrigatoriamente foi assumido que a < 0. A concentração de glicose que proporcionaria o melhor desempenho em biomassa máxima foi utilizada como base para as demais fontes de carbono.
2.2.3.2 Experimento II
Com base no resultado da maximização das equações anteriores, as concentrações deste experimento foram definidas a partir da normalização dos tratamentos (glicerol, frutose ou sacarose) pela quantidade de carbono presente em cada composto:
𝐶𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 = 2𝑦 (2) 𝐶𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒 = 𝑦 (3) 𝐶𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑒 =𝑦
onde y é a concentração calculada de glicose que proporcionou o melhor desempenho de biomassa máxima na curva do modo nutricional heterotrófico e mixotrófico.
Os experimentos foram inoculados com aproximadamente 0,8 g L-1 da biomassa de
Selenastraceae sp. nov. e realizados com delineamento inteiramente ao acaso e com três réplicas independentes para cada tratamento. As culturas foram desenvolvidas até a completa exaustão do NaNO3 no meio de cultura.
2.2.4 Métodos analíticos
2.2.4.1 Parâmetros de crescimento
Amostras (30 mL) das culturas de Selenastraceae sp. nov. foram coletadas em intervalos de 24 h. A concentração da biomassa (g L-1, em peso seco) foi estimada pelo
método gravimétrico utilizando microfiltros de fibra de vidro com porosidade de 0,45 µm. Os filtros contendo a biomassa filtrada foram mantidos em estufa a 60 ºC por 24 h. Posteriormente, foram alocados em um dessecador a vácuo por 30 min e então pesados em uma balança analítica. A biomassa foi determinada pela seguinte equação:
𝐵 =𝑝𝑓−𝑝𝑖
𝑣 × 1000 (5)
onde B foi a biomassa seca, pf e pi foram os pesos do filtro após e antes da filtragem, respectivamente e v o volume de amostra filtrado.
A variação na concentração de biomassa foi usada para calcular a produtividade diária (P, g L-1 d-1) durante um período específico:
𝑃 =𝐵1−𝐵0
𝑇1−𝑇0 (6)
onde B1 e B0 foram as concentrações de biomassa obtidas nos dias T1 e T0, respectivamente. A taxa de crescimento específico das células foi calculada usando a equação:
µ =𝑙𝑛(𝐵1−𝐵0)
𝑇1−𝑇0 (7)
Um hemocitômetro com 10µL de amostra foi utilizado para contagem celular usando um microscópio de luz com aumento de 400 ou 1.000x. Adicionalmente, o biovolume celular foi calculado conforme Sun e Liu (2003).
2.2.4.2 Concentração de nitrato
A determinação de nitrato deu-se por meio do método de espectrofotometria visível com redução de nitrato por cádmio (NitraVer®, Hach Company®, Alemanha). Após a adição
do pó reagente, a amostra foi homogeneizada por 2 min, em seguida foi mantida em repouso por 15 min. Decorrido o tempo de reação, as amostras foram lidas em 410 nm em um espectrofotômetro.
2.2.4.3 Concentração de glicose
Para determinação da concentração de glicose ao longo dos cultivos heterotróficos e mixotróficos do experimento I foi utilizado os métodos de glicose oxidase para análise enzimática em modo cinético usando um kit comercial (Glicose Liquiform, Labtest Diagnóstica S.A., Brasil).
2.2.4.4Teor de pigmentos
Para a determinação de clorofila-a e carotenoides totais, uma alíquota de 15 mL foi centrifugada (3.000 xg por 5 min), a cada 24 h, para separar a biomassa do meio de cultura. Após retirada do sobrenadante e da adição de acetona (90%) as amostras foram armazenadas a 5 ºC por 24 h para completa extração de clorofila-a e dos carotenoides totais. A quantificação foi realizada utilizando um espectrofotômetro nos comprimentos de onda 480, 647 e 664 nm, de acordo com as seguintes equações (Jeffrey e Humphrey 1975):
𝐶𝑎 = 11,93 × 𝐴664− 1,93 × 𝐴647 (8)
onde Ca foram os valores de clorofila-a (mg L-1), respectivamente, A
664 e A647 as
absorbâncias de 664 e 647nm, respectivamente.
𝐶𝑡 = 𝐴480 − 0,0012 × 𝐶𝑎 × 0,0047 × 𝐶𝑏 (9) onde Ct representa a concentração de carotenoides totais (mg L-1) e A
480 a absorbância de 480
nm. Todas as concentrações de pigmentos foram normalizadas como mg g-1 de biomassa seca.
2.2.4.4.1 Fluxo de carbono
Para compreender os fluxos metabólicos nos diferentes modos nutricionais e com as diferentes fontes de carbono orgânico, um balanço de carbono foi realizado para examinar a eficiência de conversão de carbono, orgânico e inorgânico, em biomassa (Subramanian et al. 2016). A eficiência de utilização de carbono foi determinada pela relação entre a quantidade de carbono fixado em biomassa (mc fixado) pela quantidade de carbono total ofertado (mc ofertado):
𝑚𝐶 = m𝐶 𝑓𝑖𝑥𝑎𝑑𝑜 𝑚𝑐 𝑜𝑓𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑𝑜 (10) 𝑚𝑐 𝑓𝑖𝑥𝑎𝑑𝑜 = 0,5 (𝐵1− 𝐵0) (11) 𝑚𝑐𝑜2 𝑜𝑓𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑𝑜 = 𝐹𝐶𝑂2 22,47 × 12 (12)
para isso, foi adotado um teor de carbono na biomassa de 50% (Tang et al. 2011). Para a condição fotoautotrófica o fluxo de CO2 (Fco2; 0,03 L/L/h), correspondente a introdução de
CO2 pela homogeneização do reator (0,6 L/L/h contendo 0,5% de CO2). Para converter litros
de CO2 gasoso em gramas de carbono foi utilizada a Lei de Boyle-Mariotte, onde em
condições de 1 atm e 25 ºC, 22,47 L de CO2 gasoso correspondem a 1 mol de CO2 e para cada
mol de CO2 possui 12 g de carbono.
2.2.4.5 Análise bacteriológica
Foram quantificadas as bactérias presentes nas culturas fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. através do plaqueamento de amostras de 100 µL em diluição seriada em placas contendo meio Tryptone Soya Agar (pH 7.3) que contém: digestivo pancreática de caseína 15 g L-1, digestivo papaico de farelo de soja 5 g L-1,
cloreto de sódio 5 g L-1 e ágar 15 g L-1, preparado em água doce esterilizada. As placas
inoculadas foram incubadas a 28 ºC durante 24 h. As unidades formadoras de colônias (UFC) bacterianas resultantes nas placas foram contadas manualmente.
2.2.5 Separação e secagem da biomassa
Após os cultivos, as biomassas dos diferentes modos nutricionais e utilizando diferentes fontes de carbono orgânico foram imediatamente centrifugadas (a 3.200 ×g por 10 min) e posteriormente secas em um liofilizador (FreeZone 4.5, Labconco, USA) em alto vácuo (150×10-3 mbar) e -50±2 ºC por 48 h (Oliveira et al. 2020). Amostras de 100 mg de
biomassa seca foram utilizadas para transesterificação.
2.2.6 Transesterificação direta
A obtenção de FAME foi executada segundo método modificado de transesterificação direta adaptado para microescala (Hartman e Lago 1973; Menezes et al.
2013). Amostras de 100 mg de biomassa seca foram pesadas em tubos de ensaio de 20 mL. Em seguida, foram adicionados 1,5 mL de solução de hidróxido de sódio 0,5 mol L-1 em
metanol. Os tubos de ensaio foram lacrados com as tampas e aquecidos por 15 min em banho-maria à 90 ºC. Após esse tempo, os tubos de ensaio foram resfriados em banho de gelo e 4,3 mL da mistura esterificante foram adicionados. Os tubos de ensaio foram lacrados e aquecidos novamente por 15 min na mesma temperatura. Os tubos foram agitados manualmente por três vezes no decorrer dos processos de aquecimento. Após esse tempo, os tubos de ensaio foram resfriados em banho de gelo e 5,0 mL de n-heptano foram adicionados em cada amostra. Em seguida os tubos de ensaio foram agitados em um agitador digital (MS3, IKA, China), por 1 min à 3.000 rpm. Foi colocado em repouso por 2h em seguida foram adicionados 9,2 mL de água destilada. Os tubos de ensaio foram novamente agitados por 1 min à 3.000 rpm e deixados de repouso por 24h, até a separação de fases. As fases heptânicas foram coletadas com pipetas tipo Pasteur, inseridas em vials de 1,5 mL e analisadas por cromatografia gasosa. O procedimento de extração foi realizado em triplicata.
2.2.7 Condições de HRGC-FID e HRGC-MS
O perfil de FAME das amostras foi caracterizado usando um cromatógrafo a gás de alta resolução (HRGC) (modelo 7890A, Agilent, Estados Unidos) com detector por ionização em chama (FID). Os FAMEs foram identificados em cromatógrafo a gás (modelo 17A, Shimadzu, Japão) com espectrômetro de massas de alta resolução (HRMS) (modelo QP5050, Shimadzu, Japão). A coluna capilar utilizada foi a DB-WAX (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). A temperatura inicial do forno era de 70 ºC e foi aquecida a uma taxa de 10ºC min -1 até atingir
240 ºC e mantida a essa temperatura por 13 min. Em seguida, foi novamente aquecido a uma taxa de 5 °C min-1 à 250 °C. A temperatura do injetor foi mantida em 310 °C no modo split,
com razão de separação de 10:1 para um volume de injeção de 2 μL. A temperatura do forno foi mantida a 310 °C. O hidrogênio (5,0) foi utilizado como gás carreador a uma velocidade linear de 42 cm s-1, e o nitrogênio foi utilizado como gás auxiliar a uma taxa de 20 mL min-1.
As condições de operação do GC-FID (forno, injetor interface e coluna capilar) foram mantidas para GC-HRMS (D’Alessandro et al. 2018). Cada amostra foi injetada duas vezes, tanto por HRGP-FID quanto por HRGC-MS. Assim, foram obtidos seis resultados para cada tratamento.
2.2.8 Curva de quantificação para teor de FAME
O cálculo do rendimento em ésteres das biomassas foi determinado a partir da normalização das áreas de FAME dos cromatogramas e seus porcentuais calculados em relação a somatória dos picos identificados como ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo de soja (R2 = 0,996), cujo valor foi adotado como 100% de ésteres obtidos. Para a elaboração da curva de quantificação foram selecionados 11 pontos nas seguintes massas 5, 6, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 19 e 19,5 mg. O método de produção de FAME para o óleo de soja foi o mesmo adotado para as biomassas.
2.2.9 Análise estatística
Possíveis diferenças entre as médias (n = 3) dos parâmetros de crescimento, eficiência de conversão de carbono em biomassa e UFCs foram avaliadas por Análise de Variância Unifatorial (one-way ANOVA), e quando comprovadas diferenças significativas, considerando 5% de significância, foi utilizado o teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas entre as médias. Uma análise de componentes principais (PCA) foi realizada para determinar possíveis padrões na presença de ácidos graxos entre os modos nutricionais e/ou fonte de carbono, usando uma correlação para produzir uma matriz de produtos cruzados. Todas as análises foram realizadas no software R Studio ® versão 3.5.1.
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 2.3.1 Experimento I
O experimento I foi conduzido para investigar o efeito do emprego de glicose sobre os parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. na presença (mixotrofia) ou ausência (heterotrofia) de luz. O crescimento de Selenastraceae sp. nov. sob os modos nutricionais fotoautotrófico e, heterotrófico e mixotrófico, com o uso de glicose, é mostrado na Figura 3. Em HT0, a concentração de biomassa não aumentou e a concentração final de biomassa foi menor que a do inóculo inicial devido a morte de algumas células. Nas primeiras 48 h de cultivo, o crescimento das culturas submetidas a condições heterotróficas, independente da concentração de glicose, apresentaram biomassa semelhante (p = 0,32); com valores significativamente (p < 0,01) superiores aos tratamentos fotoautotrófico e HT0 (Tabela 2). Diferenças na biomassa seca em HT3 quando comparado com HT6 e HT9 foram notadas em
72 (p = 0,04) e 96 h (p < 0,01). Já em condições mixotróficas, a partir das primeiras 24 h de cultivo, independente da concentração de glicose, foi observado diferença (p < 0,01) em relação ao cultivo fotoautotrófico. Vale ressaltar que MT3 apresentou concentração de biomassa inferior (p < 0,01) às demais concentrações (MT6 e MT9) após as primeiras 24 h de cultivo. Assim, o menor crescimento em MT3, quando comparado com MT6 e MT9, pode ser atribuído à alternância do metabolismo mixotrófico para fotoautotrófico, uma vez que apenas o CO2 estava disponível. Embora a condição fotoautotrófica tenha causado uma densidade
celular superior (p < 0,01) nas culturas em condições heterotróficas e mixotróficas, as células crescidas na ausência de glicose apresentaram biovolume até quatro vezes inferior às células crescidas na presença deste açúcar.
Figura 3 - Concentração média de biomassa de culturas fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes
concentrações de glicose. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3).
Tabela 2 - Parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. cultivada em modo nutricional fotoautotrófico (96 h), heterotrófico (96 h) e mixotrófico (72 h) utilizando glicose como fonte de
carbono orgânico. Modo nutricional Concentração de
glicose (g L-1) alcançada (g LBiomassa máx. -1) Densidade celular (×108 cel mL-1) Biovolume (µm3) (g L-1 P dia-1)
Fotoautotrófico - 1,67±0,16c 39,87±1,97a 11,66±4,74b 0,26±0,04c Heterotrófico 0 0,73±0,09d 8,13±0,46e 10,34±3,94b * 3 1,89±0,30c 16,20±1,40d 37,69±7,61a 0,31±0,08c 6 4,43±0,46a 33,60±2,80b 33,24±11,92a 0,95±0,12ab 9 3,95±0,19a 30,00±3,20b 32,66±5,4a 0,82±0,05b Mixotrófico 3 2,83±0,15b 29,35±0,17b 39,07±9,17a 0,70±0,04b 6 4,14±0,17a 18,77±0,51c 46,57±16,78a 1,12±0,09a 9 4,25±0,24a 20,85±1,18c 41,46±11,91a 1,15±0,10a
Dados representam a média ± desvio padrão de três réplicas independentes para cada condição. Letras diferentes na mesma linha indica diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05). * valor
negativo devido à redução de biomassa.
Valores de biomassa significativamente maiores quando em condições heterotróficas e mixotróficas do que quando em condições fotoautotróficas, são achados consistentes com a maioria dos estudos comparativos de modos nutricionais (Li et al. 2014; Paranjape et al. 2016; He et al. 2019). No entanto, é importante ressaltar que na condição fotoautotrófica 96 h de cultivo foram insuficientes para alcançar valores expressivos de biomassa, uma vez que, neste modo nutricional as culturas apresentam taxas de crescimento específico significativamente inferiores aos demais modos nutricionais (Shen et al. 2018). Assim, a presença de glicose no meio deve ter conferido energia instantânea às células de modo a acelerar significativamente o crescimento, e isto se deve ao fato de que a assimilação de carbono orgânico é energeticamente mais eficiente para a célula algácea, do que assimilação através da fotossíntese (Ciclo de Calvin-Benson).
Heredia-Arroyo et al. (2010) estudaram o crescimento de Chlorella protothecoides sob condições heterotróficas e mixotróficas usando glicose e fotoautotróficas, sendo que obtiveram concentrações de biomassa significativamente superior nas duas primeiras condições. Shen et al. (2018) reportaram uma produtividade cerca de três vezes inferior (0,366 g L-1 dia-1), quando comparada à maior produtividade obtida no presente estudo (1,15 g
L-1 dia-1), de Scenedesmus obliquus sob modo nutricional mixotrófico. Este fato pode ser
associado a uma menor concentração do inóculo inicial (~0,25 g L-1 em peso seco) que
também foi aproximadamente três vezes inferior quando comparada ao presente estudo. Destacadamente, as diferenças verificadas no biovolume celular de Selenastraceae sp. nov. nas culturas com os distintos modos nutricionais foram achados interessantes no presente estudo. O aumento do biovolume celular na transição do crescimento exponencial
para a fase estacionária já foi documentado (Vanucci et al. 2012). No entanto, outros fatores no cultivo já foram correlacionados ao aumento do biovolume das células. Conforme Campos et al. (2014), diferentes concentrações de nitrogênio influenciaram no biovolume celular de Nannochloropsis salina. Além disso, Vanucci et al. (2012) mostraram que a deficiência de nitrogênio provocou um aumento do biovolume em Ostreopsis cf. ovata. Os estágios do ciclo de vida (cenóbios, células individuais, células filhas, esporos etc) para outros gêneros de Selenastraceae, como Raphidocelis, Ankistrodesmus e Kirchneriella já foram estudados (Kobayashi 1974; Kobayashi e Ito 1977; Yamagishi et al. 2017). Para Raphidocelis subcapitata o contato com dicromato de potássio (0,3 mg L-1) resultou na formação de até
oito núcleos, implicando diretamente em tamanhos celulares muito maiores que as células com dois ou quatro núcleos (Yamagishi et al. 2017). Desta forma, a alternância quase que instantânea do metabolismo fotoautotrófico (inóculo) para o heterotrófico e o mixotrófico (condições experimentais) pode ser uma justificativa plausível para explicar o aumento do biovolume ainda em fase de crescimento exponencial de Seleastraceae sp. nov. na presença de glicose.
Aparentemente, este é um dos poucos relatos da influência do modo nutricional no biovolume celular de uma espécie de microalga. No geral, é possível afirmar que a diferença no biovolume celular foi provocada de fato pela adição de glicose no meio, uma vez que essa característica já foi observada nas primeiras 24 h após o início do cultivo (início da fase exponencial). Desta forma, uma estratégia interessante para promover um incremento quase que instantâneo na biomassa de Selenastraceae sp. nov., seria promover um cultivo fotoautotrófico (para gerar uma elevada densidade celular) e em seguida adicionar glicose ao meio (para promover um aumento do biovolume e por consequência, da biomassa). Se este comportamento também for observado para outras espécies, essa estratégia poderia ser um passo interessante para o aumento da produtividade da biomassa em culturas de microalgas.
Para as culturas heterotróficas, a completa exaustão de nitrato do meio de cultura ocorreu após 96 h de cultivo, enquanto para condição mixotrófica em 72 h (Figura 4A). Claramente, antes do crescimento de Selenastraceae sp. nov. ser limitado pela ausência de nitrogênio, a limitação de glicose a partir das primeiras 72 h em HT3 parece ser a melhor justificativa para a ocorrência do menor crescimento quando comparado com HT6 e HT9. Um comportamento similar foi observado em MT3 a partir das 48 h, já que neste momento, provavelmente ocorreu uma alternância do modo nutricional mixotrófico para fotoautotrófico – uma vez que ainda restava NaNO3 no meio de cultura e estavam na presença de energia
não foram completamente consumidos durante o período experimental. A presença de glicose no meio acelera o processo de conversão de nitrato (NO3−) em amônio (NH
4
+) por dispensar a
necessidade de energia oriunda da fotossíntese e, portanto, as menores taxas de absorção foram observadas no modo nutricional fotoautotrófico (Ahmad e Hellebust 1984).
Figura 4 - Consumo de nitrato (A), e de glicose (B) em culturas fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3).
As quatro concentrações de glicose resultaram em distintas relações carbono-nitrogênio de aproximadamente 13:1, 26:1 e 39:1 para 3, 6 e 9 g L-1 de glicose,
respectivamente, uma vez que a concentração de nitrogênio do meio de cultura foi a mesma para todos os tratamentos. Assim, através da derivada da curva de regressão polinomial de segunda ordem foi possível inferir a concentração de glicose que maximizaria a produção de biomassa usando 1.000 mg L-1 de NaNO
3. Na Figura 5 é possível observar claramente a
relação positiva entre a concentração de glicose e a biomassa que cresce até o ponto máximo da curva (8,29; 4,16 e 8,56; 4,33 para as curvas de crescimento heterotrófico e mixotrófico, respectivamente) e posteriormente estabiliza. A partir dos pontos máximos das curvas, pode-se inferir que a relação carbono-nitrogênio calculada que proporcionaria maior crescimento no modo nutricional heterotrófico e mixotrófico são 36,27:1 e 37,45:1, respectivamente. Provavelmente, se concentrações mais altas de glicose tivessem sido testadas poderia ter sido observada uma diminuição na produção de biomassa, devido à inibição do substrato, e desta forma, o excesso de glicose competiria com as moléculas de glicose na permease ligada à membrana celular (Gim et al. 2016).
Figura 5 - Efeito da concentração de glicose no crescimento heterotrófico e mixotrófico de Selenastraceae sp. nov. Valores referentes à biomassa máxima de cada uma das réplicas (n = 3). Para a
condição heterotrófica sem glicose, a interseção no ponto 0, 0 foi definida uma vez que não foi observado crescimento; enquanto para a condição mixotrófica, o crescimento sem glicose corresponde
ao crescimento fotoautotrófico.
2.3.2 Experimento II
Para fins de comparação entre as fontes de carbono orgânico testadas no experimento II, a concentração de 9 g L-1 de glicose, para ambos modos nutricionais, foi utilizada por estar
mais próxima das concentrações máximas calculadas. No entanto, o experimento II foi conduzido utilizando a concentração que maximizaria a produção de biomassa de Selenastraceae sp. nov. utilizando glicose (8,29 e 8,56 g L-1 para os modos nutricionais
heterotrófico e mixotrófico, respectivamente). As curvas de crescimento em biomassa no cultivo heterotrófico e mixotrófico em biomassa utilizando diferentes fontes de carbono orgânico é mostrado na Figura 6. Selenastraceae sp. nov. apresentou crescimento em todas as fontes de carbono testadas, no entanto, culturas crescidas com glicose apresentaram desempenho quase duas vezes superior (p < 0,01) quando comparadas com aquelas com glicerol, frutose ou sacarose, independente de modo nutricional. Não foi observado diferença significativa entre o crescimento heterotrófico utilizando glicerol, frutose ou sacarose (p = 0,05) com biomassa máxima de aproximadamente 2,5 g L-1. Comparado ao crescimento
fotoautotrófico, o emprego de todas as fontes de carbono orgânico também apresentou vantagens em ambos os modos nutricionais, embora o uso de sacarose tenha expressado um ligeiro aumento de biomassa, apresentou o menor aumento de biomassa versus as demais fontes, nos respectivos modos nutricionais. Curiosamente, as culturas mixotróficas com
glicerol, frutose ou sacarose, apresentaram biomassa máxima similar ao crescimento heterotrófico utilizando os mesmos compostos (Tabela 3).
Figura 6 - Concentração média de biomassa de culturas fotoautotróficas, heterotróficas e mixotróficas de Selenastraceae sp. nov. utilizando diferentes fontes de carbono
orgânico. Barras de erro indicam o desvio padrão da média (n = 3).
Tabela 3 - Parâmetros de crescimento de Selenastraceae sp. nov. cultivada em diferentes modos nutricionais e fontes de carbono orgânico.
Modo nutricional
Biomassa
(g L-1) Densidade celular (108 cel mL-1) (diaµ -1) Produtividade (g L-1 dia-1)
Fotoautotrófico 1,67±0,16d 39,87±1,97a 0,45±0,07f 0,26± 0,04d Heterotrófico Glicose1 3,95±0,19a 20,85±1,18c 1,48±0,05a 0,82±0,04b Glicerol2 2,79±0,40b 12,94±1,27e 1,09±0,17b 0,42±0,10d Frutose3 2,78±0,17b 12,13±2,09e 1,06±0,06bc 0,40±0,04d Sacarose4 2,15±0,13c 10,09±1,94e 0,85±0,06cde 0,30±0,02d Mixotrófico Glicose1 4,25±0,24a 30,00±3,20b 1,52±0,08a 1,15±0,10a Glicerol5 2,07±0,07c 15,74±1,27cd 0,81±0,07de 0,43±0,05cd Frutose6 2,72±0,21bc 19,63±2,91c 1,04±0,08bcd 0,61±0,08c Sacarose7 1,74±0,16c 14,27±1,07d 0,71±0,05e 0,36±0,05d
Dados representam a média ± desvio padrão de três réplicas independentes para cada condição. Letras diferentes na mesma coluna indica diferença significativa pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1 valores
referentes a concentração de 9 g L-1. 2 valores referentes a concentração de 16,58 g L-1. 3 valores
referentes a concentração de 8,29 g L-1. 4 valores referentes a concentração de 4,14 g L-1. 5 valores
referentes a concentração de 17,12 g L-1. 6 valores referentes a concentração de 8,56 g L-1. 7 valores
Entre os vários nutrientes requeridos para o crescimento de microalgas, o carbono representa aproximadamente metade da biomassa das células e, independentemente do modo nutricional, seja heterotrófico ou fotoautotrófico, a ausência desse composto acarreta diretamente uma limitação no crescimento e na multiplicação celular. O uso de glicose sob condição heterotrófica e mixotrófica é conhecido por causar um incremento nos parâmetros crescimento de algas verdes como Chlorella pyrenoidosa (Zhang et al. 2014), Scenedesmus obliquus (Shen et al. 2018), Chlorella kessleri (Deng et al. 2019) e também Selenastraceae sp. nov. Vários outros estudos também afirmaram que a glicose é a melhor fonte de carbono para o crescimento de microalgas, seja em metabolismo heterotrófico ou mixotrófico (Liu et al. 2010; Yeh et al. 2010; Gim et al. 2016; He et al. 2019). Isso se deve, principalmente, porque a suplementação de glicose no meio de cultura induz o transporte passivo do meio para a célula e aumenta, assim, a taxa de crescimento (Tanner 1969; Haass e Tanner 1973). Além disso, grande parte do metabolismo de glicose nas células das algas são se dá através da via glicolítica e a das pentoses-fosfato, mesmo sob metabolismo fotoautotrófico (Gim et al. 2016). Ainda é válido ressaltar que o crescimento mixotrófico com glicerol e com sacarose ocasionou rendimento inferior ao crescimento heterotrófico com estas fontes de carbono orgânico. Esse fato pode ser justificado devido a uma possível preferência de utilizar a fotossíntese como fonte energética e o substrato orgânico somente como fonte de carbono (fotoheterotrofia). No entanto, para concluir tal investigação com maior clareza, seria necessário um estudo detalhado dos genes e das enzimas necessárias nas vias metabólicas para utilizar glicerol e sacarose, como fonte energética, na presença e ausência de luz. Grama et al. (2016) reportaram que a suplementação de glicerol pode reduzir a eficiência da fotossíntese, diminuindo o teor de clorofila-a, porém aumentando o rendimento de biomassa via crescimento foto-heterotrófico.
Destacadamente, o uso de sacarose por Selenastraceae sp. nov. foi um achado interessante, visto que, para a maioria das clorofíceas estudadas, o mecanismo de assimilação de dissacarídeos ainda permanece desconhecido, uma vez que a presença de invertase foi reportada quase que exclusivamente em leveduras (Potrich e Amaral 2018). Conforme Wang et al. (2016) o uso de sacarose por Chlorella pyrenoidosa só foi possível através de uma co-cultura com Rhodotorula glutinis (Fungi: Sporidiobolales).
