UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO
GRANDE DO SUL – UNIJUI
LARISSA VILMA LOHMANN
ESTUDO DE MÉTODO MULTIRRESÍDUO PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUPERFICIAL POR CROMATOGRAFIA EM FASE
GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS GC-MS/MS
Ijuí 2018
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LARISSA VILMA LOHAMNN
ESTUDO DE MÉTODO MULTIRRESÍDUO PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUPERFICIAL POR CROMATOGRAFIA EM FASE
GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS GC-MS/MS
Trabalho de Conclusão de Curso de
Engenharia Química apresentado como
requisito parcial para obtenção do título de
Engenheiro Químico.
Orientador : Prof. Me Alessandro Hermann
Ijuí 2018
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LARISSA VILMA LOHAMNN
ESTUDO DE MÉTODO MULTIRRESÍDUO PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUPERFICIAL POR CROMATOGRAFIA EM FASE
GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS GC-MS/MS
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para a obtenção do título de
ENGENHEIRO QUÍMICO e aprovado em sua forma final pelo professor orientador e pelo
membro da banca examinadora. Ijuí, 27 de Dezembro de 2018
Prof
. Me Alessandro HermannMestre pela Universidade Federal de Santa Maria
Prof. Dra. Fernanda da Cunha Pereira Coordenador do Curso de Engenharia
Química/UNIJUÍ
BANCA EXAMINADORA Prof. Me Joice Viviane de oliveira
Mestre pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, razão da
Lohmann e Adriane Schmidt por sempre me
apoiarem e estarem comigo ao longo desta
caminhada.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, eu te agradeço meu Deus, por mais esta vitória. Tu sempre recompensas àqueles que nunca desistem daquilo que está certo. Confiar na tua força e no teu poder é a melhor decisão que alguém pode tomar.
A minha família: minha mãe Adriane, meu pai Hilário e meu irmão Lásio por todo apoio durante toda a faculdade, incentivo, compreensão, amor, dedicação para comigo.
A minha tia Luciane e minha vó Nelsi, pelo amor, pela força, por estarem sempre na torcida. Ao meu orientador professor Me. Alessandro Hermann pela orientação competente, oportunidade, atenção, amizade e paciência.
A professora Anagilda Bacarin Gobo, pelo auxílio em todos os momentos, pelo incentivo, pelo apoio, pelas trocas durante este tempo, pela paciência, amizade.
A todos os colegas do Laboratório de Cromatografia Gasosa pela amizade, pelo incentivo, principalmente pelas ajudas no laboratório. Um especial agradecimento aos colegas e amigos Arthur e a Liege que deram sua contribuição auxiliando em diversos momentos.
A querida Andreia, por todo auxílio, ajuda, amizade e paciência. Aos amigos da Central Analítica, pela disponibilidade, sempre prontos a ajudar. A minha colega e amiga
Carolina Bragato, por todo exemplo, amizade, incentivo em toda esta caminhada, conversas e apoio.
Aos meus amigos Talia, Taís, Franthiecoli e Bárbara pelo auxílio, disponibilidade suporte e amizade em todas as horas inclusive nas horas de aperto.
Agradeço meus amigos que sempre me incentivaram a continuar e me deram força e palavras de apoio.
A todos os professores que contribuíram durante a minha formação durante a faculdade, principalmente a professora Fernanda, coordenadora e amiga, pelo incentivo, apoio e disponibilidade.
Meus mais sinceros agradecimentos a cada um que esteve comigo nesse período. Obrigada!
O saber a gente aprende com os mestres e com os livros. A
sabedoria se aprende é com a vida e com os humildes.
Cora Carolina
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RESUMO
LOHMANN, L. V. Estudo de método multirresíduo para determinação de agrotóxicos em água superficial por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas GC- MS/MS. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Engenharia Química, Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, Ijuí, 2018.
Por muito tempo a sociedade definiu a agricultura como uma atividade de subsistência, tendo como a produção de alimento o principal objetivo (RANCON, 2011). Ao longo do tempo, devido ao crescimento populacional, o manuseio com a agricultura passou a ser não mais apenas para subsistência humana, mas sim atrelada a ela, uma atividade comercial (MAGALHÃES, 2010), ou seja, um setor de geração de renda e lucro (RANCON, 2011). Objetivava-se então o aumento da produtividade. Por conseguinte, tornou-se necessário o aumento da produção para fins de suprir a demanda por alimentos. Com isso, foram introduzidas novas tecnologias, como por exemplo, o agrotóxico, um composto químico que objetivava minimizar e combater as pragas (MAGALHÃES, 2010). Desse modo, o presente trabalho visa o estudo de método multirresíduo para determinação de agrotóxicos em água superficial utilizando extração por fase sólida e quantificação por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas em série GC-(TQ)-MS/MS. Para otimização do procedimento de extração, foi utilizado planejamento fatorial em estrela, avaliando dois tipos de sorventes, Bond Elut Plexa 200 mg e Bond Elut C18 500 mg, variando proporções de metanol em diclorometano , bem como diferentes valores de pH. O procedimento de extração otimizado consiste em utilização de cartucho SPE com o sorvente Bond Elut C18 500 mg, Condicionamento do cartucho com 3 mL de DCM, 3 mL de MeOH, seguido de 3 mL de água ultrapura em pH ajustado. Percolação de 100 mL de amostra previamente acidificada em pH 8,7. Para eluição foi utilizada 2 mL de 100% de DCM. A avaliação das figuras de mérito para o método proposto foram satisfatórias para 30 compostos analisados, apresentando curvas analíticas lineares com r2superiores a 0,990
respectivamente. Ao avaliar as recuperações foram encontrados valores aceitáveis para 5 dos 30 compostos estudados, com valores de precisão RSD ≤ 20%.A aplicação do método foi realizada em 8 amostras de açudes de diferentes municípios da região Noroeste Colonial do Rio grande do Sul, sendo que não foi detectado resíduos de agrotóxicos em nenhuma delas. O método proposto para os 5 compostos é eficaz, porém é necessário que o método analise e atenda um maior número de resíduos, o que denota, uma análise do processo de extração utilizando sorvente Bond Elut C18 e também as condições de extração de cada analito utilizada.
Palavras-chave: Extração por fase sólida (SPE). Água Superficial. Cromatografia Gasosa.
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ABSTRACT
LOHMANN, L. V. Estudo de método multirresíduo para determinação de agrotóxicos em água superficial por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas GC- MS/MS. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Engenharia Química, Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, Ijuí, 2018.
For a long time society defined agriculture as a subsistence activity, having as food production the main objective (RANCON, 2011). Over time, due to population growth, handling with agriculture has become no longer just for human subsistence, but rather linked to it, a commercial activity (MAGALHÃES, 2010), that is, a sector of income generation and profit (RANCON, 2011). The aim was to increase productivity. It has therefore become necessary to increase production to meet the demand for food. As a result, new technologies were introduced, such as agrochemicals, a chemical that aimed to minimize and combat pests (MAGALHÃES, 2010). Thus, the present work aims at the study of a multi-residue method for the determination of pesticides in surface water using solid phase extraction and quantification by gas chromatography coupled to GC- (TQ) -MS / MS series mass spectrometry. To optimize the extraction procedure, we used star factorial design, evaluating two types of sorbents, Bond Elut Plexa 200 mg and Bond Elut C18 500 mg, varying proportions of methanol in dichloromethane, as well
as different pH values. The optimized extraction procedure consists of using SPE cartridge with Bond Elut C18 500 mg sorbent, Cartridge conditioning with 3 mL of DCM, 3 mL of MeOH, followed by 3 mL of ultrapure water at adjusted pH. Percolation of 100 mL of previously acidified sample at pH 8,7. For elution, 2 mL of 100% DCM was used. The evaluation of the merit figures for the proposed method were satisfactory for 30 compounds analyzed, presenting linear analytical curves with r2 higher than 0.990 in the range of 5 to 200 μg L-1, presenting values of LOD and LOQm of 0.03 and 0, 1 μg L-1, respectively. When evaluating the recoveries, acceptable values were found for 5 of the 30 compounds studied, with RSD accuracy values ≤ 20%. The application of the method was carried out in 8 samples of dams from different municipalities of the Northwest Colonial region of Rio Grande do Sul, and no residues of pesticides were detected in any of them. The proposed method for the 5 compounds is effective, but it is necessary that the method analyzes and attends a greater number of residues, which denotes an analysis of the extraction process using sorbent Bond Elut C18 and also the extraction conditions of each analyte used .
Keywords: Pesticides, solid phase extraction (SPE), surface water, GC-MS/MS
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Ilustração do modo de contaminação e dispersão dos agrotóxicos ... 24 Figura 2- Etapas do processo de extração por Extração em Fase Sólida (SPE). ... 27 Figura 3- Sistema de Extração em Fase Sólida (SPE). ... 34 Figura 4- Cromatograma da amostra "branco" (extrato da matriz). ... 35 Figura 5- Cromatograma de íons totais obtidos a partir do GC-(TQ)-MS/MS gerados pela fortificação da matriz em 100 μg L -1. ... 41 Figura 6 - Superfície de
resposta gerada através do planejamento experimental em estrela, para diferentes valores de pH e percentagens MeOH em DCM para o sorvente Bond Elut C18 500 mg. ... 42 Figura 7- Superfície de resposta gerada através do planejamento experimental em estrela, para diferentes valores de pH e percentagens MeOH em DCM para o sorvente
Bond Elut Plexa PCX 200 mg.
... 42 Figura 8- Estrutura química do sorvente C18. ... 43
Figura 9- Estrutura química do sorvente Plexa PCX.
... 44 Figura 10- Recuperação dos compostos para a melhor condição obtida a partir da superfície de resposta para cada um dos dois sorventes analisados. ... 45 Figura 11- Esquema do Procedimento de Extração para determinação dos agrotóxicos. ... 46
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação toxicológica dos agrotóxicos
... 19 Tabela 2– Ensaios para cada tipo de sorvente utilizado no planejamento experimental ... 33 Tabela 3- Agrotóxicos determinados por GC-(TQ)-MS/MS, utilizando o modo de ionização EI, aquisição de espectro no modo MRM com seus respectivos segmentos de análise, tempos de retenção (t R), íons precursores e produtos para a quantificação e confirmação. ... 37 Tabela 4- Resultados obtidos para as curvas analíticas dos agrotóxicos preparadas no extrato da
matriz, empregando SPE e CG-(TQ)-MS/MS.
... 47 Tabela 5-Valores de LOD e LOQ para o método utilizado. ... 49 Tabela 6- Percentuais de recuperação e RSD% para a precisão (repetitividade) do método analítico em três níveis de fortificação. ... 49 Tabela 7 - Resultado das amostras de água superficial analisadas conforme o método otimizado por SPE e GC-(TQ)-MS/MS. ... 51
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Condições do Cromatógrafo a gás... 32
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LISTA DE SIGLAS
A – Acaricida AGROFIT- Agrotóxicos Fitossanitários ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária C18 – Sílica modificada com hidrocarboneto linear C18,
octadecilsilano CONAMA – Conselho Nacional de Meio Ambiente CONSEMA – Conselho Estadual do Meio Ambiente DCM – Diclorometano DL50 – Dose Letal para 50% dos organismos testes EI – Ionização por Elétrons, do inglês Electron Ionization EM – Espectrômetro de Massas EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária eV – Elétrons Volt F – Fungicida GC – Cromatografia Gasosa, do inglês
Gas Chromatography LMR- Limite Máximo de Resíduos MeOH-Metanol mL - Mililitro
M.M – Massa molar m/z – Razão massa carga MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MS – Ministério da Saúde MS – Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry MS/MS – Espectrometria de Massas em série, do inglês
Mass Spectrometry in tandem OMS – Organização Mundial da Saúde p.a. – Para
análise Pa – Pascal pH – Potencial hidrogeniônico pKa – Constante de dissociação ácida PTFE – Politetrafluoretileno PV – Pressão de Vapor PNCRC- Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes r2 – coeficiente de determinação REC –
Recuperação RSD – Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation SIM – Monitoramento do Íon Selecionado, do inglês Selected Ion Monitoring SPE – Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction SUS- Sistema Único de Saúde TPP – Trifenilfosfato TQ – Triplo quadrupolo tR – tempo de retenção U.S.EPA – Agência Americana de Proteção Ambiental, do inglês United States Environmental
Protection Agency UE – União Européia VMP – Valor Máximo Permitido
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 14 2 OBJETIVOS ... 17 2.1 OBJETIVO GERAL ... 17 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 3 REVISÃO DA LITERATURA ... 18 3.1 ATIVIDADES
AGRÍCOLAS E AGROTÓXICOS ... 18 3.1.1 ATIVIDADES AGRÍCOLAS ... 18 3.1.2 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DOS AGROTÓXICOS
... 18 3.2
CONTROLE DE RESÍDUOS CONTAMINANTES NO BRASIL E SUA FISCALIZAÇÃO ... 21 3.3
AGRICULTURA, AGROTÓXICOS E CONTAMINAÇÃO HUMANA ... 22 3.4 TRANSPORTE DE AGROTÓXICOS NO AMBIENTE ... 23 3.5 PARÂMETROS DA QUALIDADE DAS ÁGUAS E LEGISLAÇÃO ... 24 3.6 PROCEDIMENTOS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS ... 25 3.7 PREPARO DE AMOSTRA POR EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE) ... 26 3.8 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ... 28 3.9 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ... 28 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29 4.1 MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS ... 29 4.2 AGROTÓXICOS ESCOLHIDOS PARA O ESTUDO ... 30 4.3 AMOSTRA BRANCO ... 31 4.4 PREPARO DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS UTILIZADAS ... 31 4.5 OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO ... 32 4.5.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS ... 32 4.5.2 AS CONDIÇÕES DO ESPECTRÔMETRO DE MASSAS ... 32 4.5.3
OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
(SPE)...33 4.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE) ... 35 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 35 5.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA O GC-(TQ)-MS/MS, UTILIZADAS NA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUAS SUPERFICIAIS.
... 35 5.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO DE
EXTRAÇÃO POR FASE SÓLIDA (SPE) ... 41 5.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO EMPREGANDO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
(SPE) E GC-(TQ)-MS/MS ... 46 5.3.1 SELETIVIDADE DO MÉTODO ANALÍTICO ... 46 5.3.2 CURVA ANALÍTICA E LINEARIDADE ... 47 5.3.3 DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE LOD E LOQ DO MÉTODO...
... 48 5.3.4 EXATIDÃO ATRAVÉS DO ENSAIO DE RECUPERAÇÃO E PRECISÃO
(REPETITIVIDADE). ... 49 5.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO ... 51 6
CONCLUSÕES ... 51 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
... 52
13
ANEXO A– COMPOSTOS SELECIONADOS PARA ESTUDO E INFORMAÇÕES FÍSICO-QUÍMICAS ... 62
14
1 INTRODUÇÃO
Desde os primórdios, na constante busca pelo alimento, a sobrevivência advinha de
coletas de frutas, raízes e também através da caça (SANTOS, 2006). Nesse cenário, um dos
momentos mais significativos foi o início da agricultura, ou seja, os homens estabeleceram
um local fixo para suas atividades que girava em torno do plantio (CALEFFI, 2005). Esse por
sua vez, gerou o desenvolvimento de pequenos povoados (SANTOS, 2006).
Com o desenvolvimento dos povoados e por consequência o crescimento populacional,
objetivou-se sanar a demanda por alimentos e aumentar a produtividade no campo e controlar
possíveis pragas (SANTOS, 2006). Dessa forma, a produção agrícola tradicional foi substituída por novas tecnologias, que por sua vez, envolve quase em sua maioria, o uso de
agrotóxicos (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2018). A resposta a esse prognóstico foi
utilização indiscriminada, ocasionou impactos sobre o ambiente e a saúde humana (MIRANDA, A. C, et al. 2007).
Segundo Ministério da saúde (2018) e pela Lei Federal no 7.802 de 11 de julho de 1989,
define que, os agrotóxicos são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, a serem introduzidos no setor de produção, armazenamento e
beneficiamento de
produtos agrícolas. Sua atuação para com as florestas, recursos hídricos, área industrial e
todo ecossistema são de preservar a flora e a fauna contra ações danosas de seres vivos que
são considerados nocivos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).
Os agrotóxicos são utilizados em grande escala no setor agropecuário, especialmente
nos sistemas de monocultivo em grandes extensões. Conforme estudo desenvolvido pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), ao que se refere ao mercado de agrotóxicos, revela que no Brasil o consumo de agrotóxicos vem se intensificando. Seu crescimento foi aproximadamente de 176% na última década, valor superado quando comparado à média mundial. Este fato é de grande importância e conduz o Brasil a alertar-se
no que confere a potencialização da contaminação ambiental oriunda do uso de agrotóxicos
(ANVISA, 2017). Diante do exposto, não se pode pensar em um processo homogêneo de
modernização da agricultura bem como a utilização de agrotóxicos. A modernização agrícola
no
Norte e Nordeste do país (AGRA, 2001).
Diante da modernização heterogênea, O Rio Grande do Sul (RS) é um Estado que se
destaca pelas atividades agropecuárias onde elas representam importante atividade 15
econômica. Com isso, há a utilização de grandes volumes de agrotóxicos (COSTA E. T., et al,
2016). Segundo Sindag (2008; 2012) os volumes de agrotóxicos que são consumidos
por vários
tipos de culturas, sendo que a soja utilizou 40% do volume total entre inseticidas, herbicidas,
fungicidas, acaricidas e outros (adjuvantes surfactantes e reguladores). Posteriormente o
milho com 15%, a cana e o algodão com 10%, os cítricos com 7%, o café com 3%, o trigo
(3%), o arroz (3%), o feijão (2%), a pastagem (1%), a batata (1%), o tomate (1%), a maçã
(0,5%), a banana (0,2%) (SINDAG, 2018).
Diante da introdução do agrotóxico em diversas culturas, esse apresenta uma complexidade no seu comportamento frente ao meio ambiente (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2018), interferem em mecanismos fisiológicos de sustentação da vida que são
comuns também aos seres humanos, e, portanto estão relacionados a uma extensa sucessão de
possui
grande potencial de atingir o solo e as águas, devido aos ventos e à água das chuvas, que
promovem a lavagem das folhas tratadas, a lixiviação e a erosão. Dessa forma, qualquer que
seja o caminho do agrotóxico no meio ambiente o homem é seu potencial receptor (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2018).
A contaminação humana pode ocorrer por três formas: ocupacional, ambiental e alimentar. A ocupacional se dá por meio do trabalho e manipulação dos agrotóxicos; ambiental por meio da disseminação dos produtos e a contaminação alimentar
decorrente da
ingestão de alimentos e água que podem estar contaminados (SOUZA, 2011). Diante disso, os
agrotóxicos constituem hoje um importante problema de saúde pública, tendo em vista da
grande exposição humana a esses produtos químicos (ROCHA, et al, 2014)
Diante das diferentes formas de contaminação citadas, para determinar a concentração
de agrotóxicos, está intimamente relacionada ao modo de absorção destes compostos. Esta
absorção pode acontecer pelas vias respiratórias, via dérmica ou pelo trato gastrointestinal.
Trata-se da absorção de agentes externos para áreas internas, ou seja, os compostos químicos
são introduzidos no organismo que se encaminham para vias de circulação sistêmica (RUPPENTHAL J. E, 2013).
O transporte do composto químico é realizado pela corrente sanguínea e é transportado
para o resto do organismo, deslocando-se para diversos tecidos e células sofrendo biotransformações e ocasionando diversas doenças (RUPPENTHAL J. E, 2013). Doenças
essas que causam danos ao sistema nervoso central, problemas no sistema reprodutivo e
16
locomotor, deficiências mentais e também diversos tipos de câncer (BARBOSA, 2004). Assim como com relação aos sintomas, cefaleia, náuseas, vertigem, irritação da pele, garganta, morbidade respiratória expressa por tosse, escarro manchado por sangue, entre
outros sintomas (FURLONG et al, 2015).
Segundo INCA (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER) define o câncer como:
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o
crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e órgãos. Dividindo-se
rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores malignos, que podem espalhar-se para outras
regiões do corpo.
Segundo Ministério da saúde (2018), a origem do câncer pode ser de agentes externos
(ambientais) ou endógenos (hereditários), estando ambos inter-relacionados e interagindo de
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018). Ele exige longos períodos de exposição, ou de exposição
repetida ao agente cancerígeno. Conectar a exposição aos agrotóxicos e o desenvolvimento de
câncer nem sempre é possível. Deve ser considerado que, em muitos casos, com o passar do
tempo, a doença pode não ser relacionada ao agente causador no momento do diagnóstico
(INCA, 2005).
Para um estudo de contaminação por agrotóxico é relevante a sua identificação e sua
quantificação no ambiente. Torna-se, assim, necessário, o desenvolvimento de métodos
analíticos que permitam a determinação dos mais diferentes resíduos e contaminantes (HERMANN, 2013).
As técnicas cromatográficas se evidenciam no cenário das determinações de contaminantes, elas permitem determinar de forma simultânea uma grande quantidade de
compostos, além de permitir diferentes sistemas de detecção, sejam eles os eletroquímicos,
fluorescência, espectrometria e massas, dentre outros. Esta variedade no sistema de detecção
permite o desenvolvimento de métodos focados na determinação de um ou dois componentes
que necessitam individualização decorrente de suas características ou no desenvolvimento de
métodos para análise multirresíduo (KURZ, 2013; MARTINI, 2013; WALORCZYK, 2012).
O melhor método para análise de resíduos de agrotóxicos deve apresentar sensibilidade,
seletividade, exatidão, precisão e ser de baixo custo, permitir a aplicabilidade para uma ampla
quantidade de agrotóxicos em diferentes matrizes e capazes de fornecer informações 17
estruturais necessárias e corretas sobre o analito de interesse (MICHEL E BUSZWENSKI,
2004). O presente trabalho visa o estudo de método cromatografia em fase gasosa acoplada à
espectrometria de massas GC-MS/MS que possibilite investigar a presença de resíduos de
agrotóxicos em água superficial. Com isso, faz-se estudo através de amostras de água superficial de diferentes regiões coloniais do noroeste do estado do Rio Grande do Sul. Trazer
à visibilidade o tema concentração de agrotóxico e o potencial causador do câncer, bem como
servir de alerta ao uso sem proteção e indiscriminado desses agrotóxicos.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver método analítico para determinar resíduos agrotóxicos em água superficial,
utilizando a técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliara o melhor método de extração;
• Aperfeiçoar as condições de limpeza da matriz e remoção de interferentes a partir de planejamento
experimental;
• Realizar estudo de validação da metodologia analítica;
• Aplicação do método validado em amostras reais de águas superficiais;
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3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 ATIVIDADES AGRÍCOLAS E AGROTÓXICOS
3.1.1 ATIVIDADES AGRÍCOLAS
A Revolução Verde demostrou mudanças significativas quanto à agricultura mundial. Iniciada no final da Segunda Guerra Mundial, as mudanças foram constantes e
exacerbadas na
década de 1990 pela globalização econômica e introdução de tecnologias agrícolas. A técnica
de modernização da agricultura, aumento da produtividade, desenvolvimento da população
agricultura mundial (NUNES, 2007).
Ao tratar-se da agricultura brasileira, obteve-se um grande impulso nos anos de 1960 e
1980, através das inúmeras tecnologias que vinham sendo aprimoradas em prol da agricultura.
Isso proporcionou o domínio de regiões antes consideradas inadequadas para o cultivo. Consequentemente, surgiu um grande número de produtos e também ofertas
(CONCEIÇÃO, 2014).
O Rio Grande do Sul, conhecido como “Celeiro do Brasil”, demostrou grande importância
para a oferta nacional de alimentos, historicamente reconhecido. Seu reconhecimento se deu
através da sua expressiva contribuição para a produção agropecuária nacional, destinada ao
mercado interno e à exportação (FEIX, 2017). O Estado ocupa posição estratégica para a
oferta nacional de diversos produtos agrícolas como o arroz, trigo, aveia, dentre outros. Está
entre os principais exportadores de fumo e arroz. Porém, destaca-se como o principal produtor
de soja (FUNDAÇÃO DE ECONOMIA E ESTATÍSTICA, 2018).
3.1.2 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DOS AGROTÓXICOS
Para adquirir o registro no Brasil, até 1989, os agrotóxicos eram submetidos apenas às avaliações toxicológicas e de eficácia agronômica. Após a regulamentação da Lei no 7.802, de
ambiental
também passaram a ser exigidas (DUBOIS, 2003).
19
Diante disso, conforme o Decreto No 6.913 DE 23 de julho de 2009, a classificação leva em consideração tudo que dispõem de pesquisa, experimentação, produção, embalagem e
rotulagem, o transporte, o armazenamento, a comercialização, a propaganda comercial, a
utilização, a importação, a exportação, o destino final dos resíduos e embalagens, o registro, o
controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos e seus componentes (DUBOIS, 2003).
Os agrotóxicos se enquadram em diversas classificações dentre elas (seu emprego, as vias de acesso, persistência no solo, arrasto ou lixiviação, toxicidade e propriedades físico-
químicas) (SAÚDE SÃO PAULO, 2018). Quanto ao seu emprego, são utilizados para fins de
combater insetos (inseticidas), bactérias (bactericidas), fungos (fungicidas), folhas indesejadas
(desfolhantes), roedores (raticidas), moluscos (moluscocidas), entre outros (BCPC, 2013).
No entanto, faz-se necessário, também, o conhecimento das propriedades físico- químicas e toxicológicas dos agrotóxicos, justamente por servirem de base para qualquer
alteração, restrição ou irregularidade de registro (DUBOIS, 2003).
Ao considerar os efeitos à saúde, ou seja, sua ação tóxica (ingrediente ativo e sua formulação) os agrotóxicos são classificados em termos de valor de dose letal 50% ou DL50, esse representado por (miligramas do produto tóxico/ quilograma do peso
corpóreo)
(PASCHOARELLI et al, 2009). A DL50 é a dose administrada ou ingerida, pela mesma via que provoca a morte de 50% da população em estudo (ANVISA, 2017).
O Ministério da Saúde classifica os agrotóxicos em quatro classes toxicológicas, na qual, cada classe é representada por uma cor, toxicidade e DL50 (JARDIN, I. C. S. F; ANDRADE, J. A: QUIROZ, S. C. N, 2009). A Tabela 1 apresenta de forma resumida a classificação dos agrotóxicos quando relacionados aos efeitos da saúde humana.
Tabela 1 - Classificação toxicológica dos agrotóxicos
Classe toxicológica Toxicidade DL50 (mg Kg-1) Cor I Extremamente
Perigoso >5000 Vermelha I Altamente Perigoso 500 a 5000 Amarela II Moderadamente Perigoso 5 a 500 Azul III Ligeiramente
Perigoso 5 a 50 Verde IV - < 5 -
Fonte: Adaptado de RODRIGUES, 2012. Outra classificação importante é quanto a sua natureza, ou seja, quimicamente, os
agrotóxicos são classificados como compostos orgânicos ou inorgânicos. Os inorgânicos são
20
os produtos que tem na composição, bário, boro, flúor, chumbo, cádmio, mercúrio, óleos
minerais entre outros. Sua desvantagem se dá pelas propriedades acumulativas e persistência
no ambiente, apresenta também toxicidade significativa (SAÚDE SÃO PAULO, 2018).
Os orgânicos, com a presença do átomo de carbono, podem ser sintéticos (produzidos
artificialmente pelo homem) e naturais (SAÚDE SÃO PAULO, 2018), os que estão nos principais grupos químicos são os organoclorados, organofosforados, Carbamatos, triazinas,
piretroides, dentre outros (BCPC, 2013).
Segundo Neves, em 2017, os Organofosforados foram os mais empregados em todo o
mundo, tanto no meio ocupacional como doméstico. Ao tratar-se de suas características, não
apresentam evidências da capacidade de persistência no ambiente, como os organoclorados.
Alguns exemplos de organofosforados são: Malathion, Diazinon, Nuvacrom, Parathion (Folidol, Rhodiatox), Diclorvós (DDVP), Metamidofós (Tamaron), Monocrotophós (Azodrin), Fentrothion, Coumaphós e outros (NEVES,
2017).
Neves, em 2017, abordou que os Carbamatos apresentam ações semelhantes às dos
organofosforados, que foram muito empregados em ambiente domiciliar. Como exemplo:
Aldicarb, Carbaril, Carbofuram, Metomil, Propoxur e outros (NEVES, 2017).
A utilização dos Organoclorados são de forma restrita ou, muitas vezes, proibida,
embora presentes e empregados no meio ambiente, eles apresentam ação principalmente
inseticida, sendo o principal representante o DDT (dicloro-difenil-tricloroetano), e demais
exemplos como: Aldrin, Endrin, BHC, Endossulfan, Heptacloro, Lindane, Mirex, Dicofol, Clordane e outros (NEVES, 2017). Aborda ainda, que os Piretroides estão presentes em
ambientes domiciliares, e são muito usados como repelentes de insetos, na lavoura, para
combater vetores de doenças. Seus exemplos são: Aletrina, Cipermetrina, Piretrinas, Tetrametrina e outros (NEVES,
2017).
Neves, em 2017, abordou também os Fungicidas que estão nos principais grupos
(Manzate), Zineb, Thiram); Trifenil estânico (Duter, Brestan, Mertin); Captan (Orthocide e
Merpan); Hexaclorobenzeno (NEVES, 2017).
As propriedades físico-químicas auxiliam na avaliação e caracterização dos diferentes
tipos de compostos. A solubilidade em água atua no comportamento, condução e destino
desses compostos, indicando a tendência do agrotóxico se solubilizarem e serem carregados
juntamente com as águas de escoamento superficiais e assim atingir os rios ou mesmo percolando pela coluna do solo e contaminando as águas
subterrâneas.
21
Por outro lado, o coeficiente de adsorção normalizado pelo carbono orgânico (Koc),
mede a tendência que um composto químico tem de sofrer partição entre a fase sólida e a
solução do solo no sistema solo-água. Além disso, a constante de dissociação ácida do composto (pKa) juntamente com o pH do solo, fornecem informações sobre a forma predominante (ionizável ou molecular) de um agrotóxico na água (BARCELÓ;
HENNION,
2003; CALDAS; ZANELLA; PRIMEL, 2001).
A Pressão de Vapor (PV) e constante de Henry (KH) são medidas de volatilidade de
um agente químico na forma pura. Determinam a velocidade de volatilização para o ar desde
2003;
CALDAS, S, S;ZANELLA, R; PRIMEL, E, G, 2001). O coeficiente de partição octanol-água
(Kow ou Log Kow ou Log P) relaciona as propriedades hidrofílicas e lipofílicas,
demonstrando a tendência à bioconcentração de uma substância química, sendo usado na
identificação dos agrotóxicos que podem ser transportados via cadeia alimentar (ISQ, 2018).
E o tempo de meia vida (t1/2) de um composto fornece informações sobre a
possibilidade de persistência do mesmo nos diferentes compartimentos, seja no solo ou na água ((BARCELÓ;
HENNION, 2003; CALDAS; ZANELLA; PRIMEL, 2001).
3.2 CONTROLE DE RESÍDUOS CONTAMINANTES NO BRASIL E SUA FISCALIZAÇÃO
A Constituição Federal Brasileira impôs ao Poder Público o comprometimento de controlar as substâncias que admitam risco à vida, à qualidade de vida e ao meio
ambiente, no
que se inclui o controle dos produtos fitossanitários. Dentre estas previsões constitucionais
encontra-se o Artigo 225, § 1o, inciso V estabelecendo que:
Todos têm direito ao meio ambiente ecologicamente equilibrado, bem de uso comum do povo e essencial à sadia qualidade de vida, impondo-se ao Poder Público
e à coletividade o dever de defendê-lo e preservá-lo para o presente e futuras gerações. §”1o incumbe ao Poder Público: controlar a produção, a
o emprego de técnicas, métodos e substâncias que comportem risco para a vida, a
qualidade de vida e meio ambiente”. e o Artigo 196, que determina: “A saúde é Direito de todos e dever do Estado, garantindo mediante políticas sociais e econômicas que visem a redução do risco de doença e de outros agravos e ao acesso
universal igualitário às ações e serviços para sua promoção, proteção e recuperação.
22
Conforme dados da AGROFIT , em 2018, dentro da classificação no Brasil, o estado do
Rio Grande do Sul situa-se como o sexto estado brasileiro que mais consome agrotóxico,
empregando aproximadamente 99 milhões/kg de ingrediente. Esses compostos químicos são
largamente utilizados nos setores agropecuários e em monocultivo de grandes extensões.
Ainda no estado, mesmo com o diagnóstico da evolução da área de produção agrícola juntamente com o consumo de agrotóxicos e também dos casos de intoxicações, no mesmo
momento, revelou um pequeno aumento na área de plantio e um aumento em torno de três
vezes no percentual de consumo de agrotóxicos (AGROFIT, 2018).
Frente à recomendação 028/2016 aprovada em Reunião Plenária do Conselho Nacional de Segurança Alimentar e Nutricional – CONSEA, a fim da ANVISA revisar o relatório do Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos – PARA de 2013
crônica (comparecimento de agrotóxicos acima do limite permitido e/ou vetados para a cultura), tendo em vista o comparativo a anos anteriores, assim como redução da exposição
aos agrotóxicos e sanar qualquer dúvida a exposição ocupacional frente aos brasileiros (ANVISA, 2017).
Cabe ao Ministério da Saúde (MS) controlar os diferentes resíduos, assim como a
normatização para o Limite Máximo de Resíduo (LMR) em produtos advindos de animais ou
vegetais no Brasil, já a ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária é responsável por
coordenar as ações na área toxicológica, com o objetivo de controlar, regulamentar e fiscalizar
todos os produtos e serviços que envolvam algum tipo de risco a saúde (MAPA, 2018).
Cabe ao Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) monitorar e coordenar a presença de resíduos de agrotóxicos, contaminantes ambientais e
medicamentos
veterinários em produtos de origem animal e vegetal, para isso, utilizam do Plano Nacional de
Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC). O plano tem como objetivo direcionar inspeção e fiscalizar os alimentos, baseado em análise de risco, que visa constatar o comparecimento de resíduos de substâncias químicas potencialmente prejudiciais à saúde do
consumidor (MAPA, 2018).
3.3 AGRICULTURA, AGROTÓXICOS E CONTAMINAÇÃO HUMANA Por muito tempo a sociedade definiu a agricultura como uma atividade de subsistência,
tendo como a produção de alimento o principal objetivo. Ao longo do tempo, devido ao crescimento populacional, o manuseio com a agricultura passou a ser não mais apenas para
23
subsistência humana, mas sim atrelada a ela, uma atividade comercial (MAGALHÃES, 2010), ou seja, um setor de geração de renda e lucro (RONCON, 2011). Objetivava-se então o
aumento da produtividade. Por conseguinte, tornou-se necessário o aumento da produção para
fins de suprir a demanda por alimentos. Com isso, foram introduzidas novas tecnologias,
como por exemplo, o agrotóxico, um composto químico que objetivava minimizar e combater
as pragas (MAGALHÃES, 2010).
Se de uma forma a utilização dos agrotóxicos favoreceu a intensificação da produção
de alimentos, de outra foi o surgimento dos efeitos na saúde humana e no meio ambiente
(RANGEL; ROSA; SARCINELLI, 2011). Isso justifica pela administração dos agrotóxicos
em diversas áreas da agricultura e através dos mecanismos físicos e biológicos que permitem
a disseminação dos resíduos no ecossistema (FAY et al, 2004), a transferência dessas substâncias potencialmente tóxicas depende da natureza química e da estrutura dos compostos
(NEILSON, 2000). O que detona, por consequência, a contaminação dos alimentos, do solo,
podem
estar expostas a níveis excessivos de agrotóxicos durante o trabalho ou através do consumo de
água e alimentos contaminados (RANGEL; ROSA; SARCINELLI, 2001). Porém, é importante mencionar que tudo depende da quantidade ingerida ou absorvida, do tempo de
exposição e das condições gerais de saúde do próprio indivíduo contaminado (VEIGA, 2007).
Com a utilização indiscriminada dos agrotóxicos, fortalece-se a atenção voltada para
esse aspecto. O Brasil está entre os principais usuários mundiais de agrotóxicos. Segundo
Londres (2011) o Brasil foi o país que mais consumiu agrotóxico no mundo na última década.
A exposição humana aos agrotóxicos constitui um problema de saúde pública. Em 2005,
5.577 casos de intoxicação por agrotóxicos de uso agrícola foram notificados no Brasil (RECENA, M. C. P; CALDAS, E. D, 2008).
Conforme publicações da Organização Internacional do Trabalho/Organização Mundial da Saúde (OIT/OMS), os agrotóxicos são os responsáveis por causar, por ano, 70 mil
intoxicações agudas e crônicas que podem chegar a óbito e aproximadamente 7 milhões de
doenças agudas e crônicas não fatais, ocasionando implicações rigorosas para a saúde humana
(FARIA N. M. X; FASSA, A. G; FACCHINI, L. A, 2007).
3.4 TRANSPORTE DE AGROTÓXICOS NO AMBIENTE
50% do total de agrotóxicos administrados não alcançam seu propósito, dissipando-se para
demais locais do ambiente como solo, atmosfera, sobretudo a água (GAVRILESCU, 2005).
24
Quando o agrotóxico é aplicado no solo, inúmeros processos físicos, químicos e biológicos definem seu comportamento. O transporte (deriva, volatilização, lixiviação, carreamento superficial), a retenção (sorção), e algumas transformações (fotólise, hidrólise,
oxidação-redução e degradação biológica) que ocorrem são processos essencialmente influenciados pelo processo de adsorção, o qual é responsável pela ligação dos
analitos às
partículas do solo (EVANGELOU, V.P, 1998; HARPER, 1994; SPADOTTO et al. 2010).
Analisando os processos de transporte em diferentes pontos do ambiente, a percolação e
o escoamento superficial são de extrema importância. De modo que o primeiro resulta em
contaminação das águas subterrâneas, de maneira que as substâncias químicas são juntamente
carreadas atingindo os aquíferos. E o segundo favorece a contaminação das águas superficiais,
através do transporte do agrotóxico adsorvido às partículas do solo erodido ou dissolvido em
água (SPADOTTO et al., 2004) a Figura 1 demonstra como os agrotóxicos podem se dispersar
no ambiente causando contaminação em diferentes pontos.
agrotóxicos
Fonte: Adaptado de LAVORENTI et al, 2003.
3.5 PARÂMETROS DA QUALIDADE DAS ÁGUAS E LEGISLAÇÃO
Em 1997 implantou-se o sistema de Política Nacional de Recursos Hídricos, bem como
o Sistema Nacional de Gerenciamento de Recursos Hídricos, através da Lei Federal No 9.433
25
de 8 de janeiro de 1997, tendo como base que a água é um bem de domínio público, bem
como recurso natural limitado, dotado de valor econômico (BRASIL, 1997), sendo que a gestão dos recursos hídricos deve sempre proporcionar o uso múltiplo das águas,
objetivando
aos
respectivos usos, visando uma utilização racional e integrada dos recursos hídricos, com
vistas ao desenvolvimento sustentável, além da prevenção e a defesa contra eventos hidrológicos críticos de origem natural ou decorrentes do uso inadequado dos recursos naturais (BRASIL, 1997).
Conforme a Portaria no 2.914 de 12 de Dezembro de 2011 do Ministério da Saúde,
estabelece os procedimentos e responsabilidades inerentes ao controle e à vigilância da
qualidade da água para consumo humano, estabelece seu padrão de potabilidade e demais
providências (BRASIL, 2011) e ainda revoga a Portaria 518 de 25 de Março de 2004 que
regulamentava 54 substâncias químicas que representavam riscos à saúde humana (BRASIL,
2004, 2011; NETO apud HELLER et al, 2009).
Através do conselho Estadual do Meio Ambiente do Rio Grande do Sul (CONSEMA), é
publicada a Resolução CONSEMA no 355/2017, que dispõe sobre os critérios e padrões de
emissão de efluentes líquidos para as fontes geradoras que lancem seus efluentes em águas
superficiais no Estado do Rio Grande do Sul, esta resolução é mais restritiva para alguns
parâmetros ambientais do que demais resoluções anteriormente criadas, inclusive medidas que
proíbem o lançamento de um grupo de agrotóxicos persistentes no meio ambiente (RIO GRANDE DO SUL, 2017).
Internacionalmente a Comunidade Europeia estabeleceu o valor máximo permitido para
qualquer agrotóxico em 0,1 μg L-1, sendo que o somatório total de resíduos não pode
passar de 0,5
μg L-1, em águas destinadas ao consumo humano, através do COUNCIL DIRECTIVE
(1980). A
Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA, do inglês Environmental Protection
Agency) e a Organização Mundial da Saúde, estabelecem limites máximos individuais para cada
agrotóxico.
3.6 PROCEDIMENTOS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS
Dentre as inúmeras técnicas para determinar agrotóxicos, destacam-se as cromatográficas, pois, possuem alto grau de separação de analitos, alta sensibilidade, alta
detectabilidade, repetitividade, reprodutibilidade e seletividade, o que permite fazer análises
de um número variado de resíduos através de sistemas de detecção por espectrometria de
massas sequenciais ou simples, permitindo determinar traços e ultratraços de compostos,
26
atendendo aos os limites máximos permitidos (LMRs) que representam na maioria das vezes a
necessidade de quantificação de concentrações extremamente baixas de diversos compostos
3.7 PREPARO DE AMOSTRA POR EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
A extração em fase sólida (SPE) é uma das técnicas de extração mais utilizadas. Consiste na extração dos analitos contidos numa matriz aquosa, juntamente com os compostos interferentes, após passarem por um cartucho contendo sorvente. Um solvente
orgânico seletivo é geralmente utilizado para remover os interferentes (clean-up) e então,
outro solvente é usado para eluir os analitos de interesse (BARRIONUEVO; LANÇAS, 1999).
Os principais objetivos da extração utilizando sorventes são a remoção de interferentes
da matriz, a concentração e o isolamento dos analitos. O fator de concentração é obtido pela
razão entre o volume inicial de amostra percolado no cartucho e o volume final de solução
concentrada do solvente de eluição. A concentração pode ser aumentada por um fator de 100
a 5000, tornando possível a análise qualitativa e quantitativa a nível de traços (JARDIM, 2010).
Um cartucho característico para a extração é formado por um tubo de polipropileno
contendo aproximadamente uma faixa de 50 a 500 mg de sorvente, com 40 a 60 μm de tamanho de partícula, suspenso no tubo por meio de dois filtros de tamanho de poros de 20
μm. A amostra (matriz), contendo o analito de interesse, é colocada no topo do cartucho e
ar, de
forma a penetrar no cartucho ( JARDIM, 2010).
A Figura 2 representa as etapas envolvidas de extração por fase sólida. A primeira
etapa envolve o condicionamento do cartucho, que tem como finalidade ativar o sorvente do
cartucho a ser utilizado e também eluir algumas impurezas que possam estar contidos no
cartucho. O tipo de sorvente tem reflexo direto no solvente a ser utilizado (CALDAS et al.,
2011).
27
Figura 2- Etapas do processo de extração por Extração em Fase Sólida (SPE).
Fonte: CALDAS et al., 2011.
retenção do
analito e às vezes de alguns interferentes no sorvente; A concentração dos analitos tem como
objetivo principal reter o analito no sorvente através da passagem de grande volume de amostra, deixando passar os interferentes. O pH da amostra pode ser crítico para
obtenção de
uma retenção adequada dos agrotóxicos no sorvente. Por isso, em alguns casos, o ajuste do
pH da amostra é necessário para estabilizar os agrotóxicos e aumentar sua retenção na fase
sólida (TRAN et al., 2007). A velocidade ou fluxo da percolação da amostra é importante e
pode ser ajustada, controlando-se o vácuo ou a pressão aplicada no processo. Para pequenos
volumes de amostra, esta etapa pode ser realizada somente com o auxílio da gravidade (FRITZ, J. S.; MACKA, M, 2000).
Para a limpeza do cartucho e para fins de retirar os interferentes menos retidos que o
analito, etapa esta conhecida como lavagem com solvente ou clean-up; é fundamental para
eliminar compostos provenientes da matriz, que podem interferir no método analítico. Pode-se
utilizar solventes com força de eluição intermediária para eluição de impurezas antes do analito de interesse ser eluído. Esses solventes são denominados “solventes de
lavagem”
(wash solvent) e são utilizados solventes que não possuam força suficiente para remover do
sorvente o analito de interesse. Diversos solventes de lavagem podem ser usados, mas quando
28
ultrapura, ou uma mistura de uma pequena porcentagem de metanol com água ultrapura
(SHOMAR et al., 2006; GATIDOU et al., 2005).
Uma vez que os agrotóxicos são retidos nos cartuchos são, então, eluídos com um
pequeno volume de solvente adequado para a análise (FRITZ; MACKA; 2000). É importante
a escolha do eluente, pois ele deve eluir os analitos e minimizar a eluição de interferentes que
não tenham sido eliminados na etapa anterior, por estarem muito retidos no sorvente (LANÇAS, 2004). A escolha do solvente de eluição é um parâmetro importante e está diretamente relacionada com a polaridade do agrotóxico e o sorvente usado na
Extração em
Fase Sólida (SPE).
3.8 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Existem inúmeras situações em que precisa-se estudar várias propriedades ao mesmo
tempo, problemas esses, que são afetados por um grande número de fatores experimentais.
Devido a estas situações aparecem questões que abrangem a necessidade de estudar os efeitos
de distintos fatores sobre as propriedades gerais dos sistemas, fatores que se distinguidos,
podem reduzir o trabalho realizado, bem como o custo dos experimentos, ou até mesmo da
2010).
O planejamento experimental também intitulado delineamento experimental, corresponde
a um conjunto de ensaios estabelecidos com critérios estatísticos e científicos, com a finalidade de determinar a influência de inúmeras variáveis nos resultados de um dado sistema
ou processo. Este objetivo principal pode gerar outros objetivos de acordo com o propósito
dos ensaios, como por exemplo, definir quais as variáveis são mais atuantes nos resultados,
atribuir valores às variáveis atuantes de modo a otimizar os resultados; buscando minimizar a
variabilidade e a influência de variáveis incontroláveis (BUTTON, 2012).
O planejamento fatorial oferece vantagens em relação a investigações preliminares, quando se deseja avaliar a influência de determinados fatores sobre uma resposta, de modo
geral, analisar melhores recuperações. Para efetuá-lo é necessário definir os fatores de interesse e os níveis (geralmente dois) em que cada fator será variado (NETO;
SCARMINIO; BRUNS, 2002).
3.9 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a validação de métodos
deve garantir, através de análises experimentais, que o método utilizado para determinada
análise atenda às exigências das aplicações analíticas, garantindo a confiabilidade dos resultados. É imprescindível a validação apresentar linearidade, especificidade,
precisão,
intervalo, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequada à análise (BRASIL,
2003). Para um domínio eficaz dos resultados e também a fim de garantir a correta interpretação
e confiabilidade dos mesmos, o método analítico é submetido a uma sucessão de etapas de
avaliação, que asseguram a sua validação. Segundo a norma ISO/IEC 17025 – Requerimentos
gerais de competência para Laboratórios de Ensaio e Calibração, a validação de um método
analítico consiste na “comprovação, através de evidências objetivas, de que o método cumpriu
os requisitos para uma aplicação ou uso específico pretendido” (IPAC, 2018).
Dessa forma, a validação do método objetiva fundamentalmente ratificar que as caraterísticas do método atendem as especificações determinadas para os resultados analíticos,
da mesma maneira que estabelecer limites de controle a aplicar no trabalho de rotina (COELHO, 2010).
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho consistiu no estudo de método analítico para a determinação de multiresíduo de
visando à
otimização das condições experimentais e validação de método empregando extração em fase
sólida (SPE) para agrotóxicos comumente utilizados na região Noroeste do Rio Grande do Sul. A
verificação do desempenho do método de extração foi realizada por GC-(TQ)-MS/MS.
Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de cromatografia do Departamento de Ciência
da Vida da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJÚI).
4.1 MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS
A instrumentação utilizada para o desenvolvimento deste trabalho segue descrita abaixo:
• Micropipetador automático com volume variável (20 μL, 100μL e 1000μL) (Transferpette® S)
• Sistema de purificação de água Milli-Q (Direct®-3UV) • Bomba de vácuo (Pro-tools, modelo 131)
• Sistema de manifold SPE (SUPELCO VISIPREPTM24) • pHmetro (OHAUS)
30
• Sistema GC-TQ-MS/MS: cromatógrafo a gás
• Gás de arraste: Hélio 99,999% de pureza (White Martins e Air Products, Brasil);
• Gás argônio 6.0 usado como gás de colisão no GCMS/MS, pureza 99,9992% (White
Martins e Air Products, Brasil);
• Diclorometano, grau HPLC (Vetec- Química Fina, Brasil);
• Acetonitrila, grau HPLC (LiChrosolv®);
• Hexano grau HPLC (Honeywell- Riedel-de Haen®);
• Padrões dos agrotóxicos sólidos em estudo (SIGMA-ALDRICH);
• Ácido Fosfórico p.a. 85%;
• Metanol grau HPLC (Vetec- Química Fina, Brasil);
• Filtros de nylon de 47 mm e porosidade de 0,22 μm (Vertical Chromatography, Tailândia);
• Sistema de Filtração para sólidos suspensos (Millipore, Bedford, MA, EUA);
• Água ultrapura, purificada em sistema Milli-Q Direct UV3® (resistividade de 18,2 MΩ cm);
• Frascos de vidro (vial), capacidade de 2 mL (Agilent Technologies);
• Cartuchos para SPE (Bond Elut Plexa PCX 200 mg, 3mL, 50/Pk e Bond Elut C18 500
mg,3mL, 50/Pk) Agilent Technologies;
• Vidraria comum ao laboratório;
• Detergente neutro Extran® (Merck, Brasil); • Inserts de 200 μL para vials;
4.2 AGROTÓXICOS ESCOLHIDOS PARA O ESTUDO
Primeiramente foram realizadas revisões bibliográficas para potencial utilização dos
agrotóxicos, foram avaliados e selecionados a partir do Sistema de Agrotóxicos
Fitossanitários (AGROFIT) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, com base nos principais agrotóxicos permitidos e não permitidos nos cultivos convencionais para o
trigo, milho e soja, amplamente cultivados na região noroeste do estado do RS, bem como
31
para as culturas avaliadas (abóbora, vagem, cenoura, batata-doce, milho, salsinha, cebola e
cebolinha), sobre a validação das condições cromatográficas, validação e otimização do método de
extração “SPE”, utilizando normas do INMETRO e do Mistério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) e estão listados em ANEXO A, juntamente com o grau de pureza,
classe, grupo químico e informações físico-químicas.
4.3 AMOSTRA BRANCO
Na etapa de validação do método analítico, necessita-se de amostras isentas de agrotóxicos, para avaliação de interferentes que possam causar efeito matriz no
processo de
quantificação. A utilização de amostras que atendem estas características são denominadas
amostras “branco”.
Para as amostras consideradas branco, foi utilizada a água de um açude localizado no
município de Ijuí, zona urbana, situado na Universidade Regional do Noroeste do Estado do
Rio Grande do Sul (UNIJUÍ), protegido por mata ciliar, e sem lavouras em seu entorno.
4.4 PREPARO DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS UTILIZADAS
Padrões de agrotóxicos, foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich, com pureza acima de 98%, a partir destes, soluções estoque foram preparadas na concentração de 1000 mg L-1 em
acetonitrila grau HPLC. Com base nas soluções estoque individuais de cada composto, foi efetuado uma posterior diluição à concentração de 100 mg L -1 também em acetonitrila. A partir das soluções de 100 mg L -1, foram preparadas soluções individuais na concentração de 10 mg.L-1 em viais de 1 mL para injeção em sistema cromatográfico.
Posteriormente foi preparado uma mistura de todos os agrotóxicos avaliados denominado (MIX), na concentração 10 mg L-1também em acetonitrila grau HPLC. A solução MIX foi utilizada para preparar a solução de trabalho na concentração de 1 mgL-1, ela
foi utilizada para a fortificação nos ensaios do planejamento experimental, para o preparo da curva no extrato da matriz com concentrações de 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; e 200,0 μg L-1
permitindo avaliar a linearidade do método e a quantificação dos analitos. A solução de 1 mg L-1 foi preparada sempre que efetuado os testes, não sendo reaproveitada.
32
4.5.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
O estudo foi desenvolvido por cromatografia em fase gasosa acoplada a um espectrômetro de massas em série com analisador tipo triploquadropolo
(GC-(TQ)-MS/MS)
Agilent Technologies 7890B/7000C, com amostrador automático modelo 7693.
Os componentes foram separados em coluna capilar de sílica fundida HP-5MS com
30m de comprimento e diâmetro interno de 0,25 mm, bem como a espessura do filme de 0,25
μm, consistindo de fase estacionária de 95% dimetilsiloxano e 5% fenil.
Quadro 1- Condições do Cromatógrafo a gás
Temperatura do injetor: 280°C; Volume de injeção: 1,0 μL; Modo de injeção: splitless;
Programação da temperatura do forno da coluna: temperatura inicial de 80 °C (manutenção da temperatura em 1min), com taxa de aquecimento de 25 °C min- 1 até 160°C; a partir desta temperatura, a taxa de aquecimento passa a ser de 8 °C min-1até 270 °C ( com manutenção desta temperatura por 11 min);
Gás de arraste: Hélio com vazão constante de 1 mL min-1; Tempo total de corrida: 28,95min.
4.5.2 AS CONDIÇÕES DO ESPECTRÔMETRO DE MASSAS
As condições de operação do espectrômetro de massas para a obtenção dos espectros característicos de cada analito, foi obtido a partir da injeção de 1 μL de uma solução 10 mgL-1
de cada composto individual, no modo full scan (íons totais), possibilitando a identificação e
avaliação do espectro de massas para cada composto a fim de permitir a escolha dos íons a
serem utilizados. As condições do espectrômetro de massas foram: Temperatura da transferline: 280 °C; Temperatura da fonte de ionização: 230 °C; Fonte de ionização por impacto de elétrons (70 eV); Gás de colisão: Nitrogênio com fluxo de 1,5 cm3 min-1.
33
4.5.3 OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE) Para encontrar as melhores condições para extração dos agrotóxicos em água humano, foi desenvolvido planejamento fatorial 22 em estrela para cada tipo de sorvente: Bond Elut
Plexa 200 mg e Bond Elut C18 500 mg, sendo que o mesmo consistiu na variação de dois
fatores: O sistema de eluição, que avaliou o intercruzamento de dois solventes com polaridades diferentes, sendo utilizado metanol e diclorometano, também foi avaliado a influência do pH no processo de sorção. As condições geradas para o planejamento experimental se deram através do uso do programa Statistica 12®. A Tabela 2 representa os
testes gerados a partir do planejamento experimental.
Tabela 2– Ensaios para cada tipo de sorvente utilizado no planejamento experimental
Ensaio % MeOH* em DCM** pH*** E 01 15,0 3,0 E 02 85,0 3,0 E 03 15,0 7,5 E 04 85,0 7,5 E 05 50,0 2,3 E 06 50,0 8,7 E 07 0,5 5,5 E 08 99,5 5,5 E 09 50,0 5,5 E 10 50,0 5,5 E 11 50,0 5,5
*MeOH = Metanol; **DCM = Diclorometano; ***pH = potencial hidrogeniônico Fonte: LOHMANN, L. V, 2018.
Após a realização dos diferentes ensaios para cada tipo de sorvente, a condição ótima
apresentada pela superfície de resposta foi testada, a fim de confirmar experimentalmente os
resultados obtidos através do planejamento experimental.
A extração e pré-concentração de compostos em amostras de água superficial por SPE,
faz uso de um dispositivo tipo manifold conforme demostrado na figura 3, que compreende
uma caixa mantida a vácuo durante a operação e um suporte que fornece condições de adaptar
até 24 cartuchos de extração simultaneamente. As amostras de água são filtradas e um sistema de filtração a vácuo utilizando filtro de membrana de nylon de 0,22 μm de
diâmetro
de poro, para que consiga remover grande parte dos sólidos suspensos na água, posteriormente, as amostras de água previamente limpas foram dispostas em balões de 100
mL e transferidas para os cartuchos de SPE. A vazão com que o líquido é percolado pelo
cartucho é controlada através das torneiras do sistema e válvulas da bomba. Com objetivo de
melhoras a eficiência por parte do sistema de extração foi adotado vazão na faixa de 2,0 a 4,0
mL min-1.
Figura 3- Sistema de Extração em Fase Sólida (SPE).
Fonte: LOHMANN, L. V, 2018.
35
4.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
A validação do método analítico, neste trabalho, envolveu a verificação das seguintes
figuras de mérito: linearidade, curva analítica, seletividade, Limites de Detecção (LOD) e
Quantificação (LOQ) e exatidão a partir do ensaio da precisão (repetitividade), recuperação e
aplicação do Método Analítico em amostras reais de águas superficiais.
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA O GC-(TQ)-MS/MS,
UTILIZADAS NA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUAS SUPERFICIAIS.
Com o objetivo de avaliara a presença dos compostos em estudo na amostra “branco”, ela
foi preparada conforme o método otimizado e exatamente nas mesmas condições de análise e
injetada no sistema cromatográfico, a Figura 4 demonstra o resultado observado para
cromatograma obtido para a amostra “branco” (matriz).
Figura 4- Cromatograma da amostra "branco" (extrato da matriz).
Fonte: LOHMANN, L. V, 2018.
Dessa forma, pode-se observar que a amostra de água de açude não há a presença dos
agrotóxicos avaliados, essa sendo, então, utilizada como amostra “branco”.
modo de ionização por impacto de elétrons (do inglês Electron impact - EI), e aquisição dos
espectros de massas no modo de monitoramento de reações múltiplas - MRM, com seus
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respectivos tempos de retenção, segmentos de análise, íons precursores e produtos e a energia
de colisão das transições monitoradas. Para cada composto foram selecionadas duas transições características, a transição mais intensa foi utilizada para a quantificação e a segunda transição mais intensa para a confirmação dos
mesmos.
Para a operação do espectrômetro no modo de Monitoramento de Reações Múltiplas
(MRM), Foi indispensável realizar a seleção/avaliação de íons precursores obtidos no modo
full scan (íons totais), para cada agrotóxico estudado neste trabalho. Para efetuar a escolha dos
íons a serem utilizados deu-se a partir de suas intensidades de sinal, igualmente para a ausência do padrão de fragmentação do íon para qualquer composto no mesmo
segmento de análise.
Os íons selecionados para cada composto foram separados de todos os demais íons
produzidos a partir da fragmentação completa do analito em estudo, utilizando o modo
SIM
(do inglês Select Ion Monitoring), desta forma cada íon precursor individual foi separado no
do
quadrupolo 2 (Q2), com a finalidade de proporcionar um novo padrão de fragmentação do íon
precursor já selecionado previamente, influencia diretamente na intensidade e no tipo da nova
fragmentação observada. Neste sentido, para cada analito o(s) íon(s) já selecionado(s) através
de monitoramento de íon seletivo no primeiro quadrupolo (Q1) foi novamente fragmentado
através de diferentes energias de colisão no segundo quadrupolo, na faixa de 5 a 45 Volts,
obtendo desta forma espectros de íons totais na ordem de 50 a 500 m/z de razão massa carga
no terceiro quadrupolo (Q3).
Os dados obtidos permitiram avaliar a melhor energia para a escolha da transição de
quantificação entre íon precursor e produto, com maior sensibilidade e detectabilidade (a
partir da intensidade do sinal – Transição de quantificação), bem como outra transição entre
íon precursor e íon produto utilizada para qualificação, confirmação do analito a ser determinado (a partir da intensidade do sinal – Transição de
qualificação). 37
Tabela 3- Agrotóxicos determinados por GC-(TQ)-MS/MS, utilizando o modo de ionização EI, aquisição de espectro no modo MRM com seus respectivos segmentos de
Nome do Composto Segmento tR (min) Íon Precursor (m/z) Energia Íon Produto Íon Produto Íon Produto de de de de (m/z) Colisão Colisão Colisão (eV) Íon Íon Íon Íon Íon Precursor Precursor Precursor Precursor Precursor Precursor (m/z) (m/z) (m/z) (m/z) Íon Íon Íon Íon Íon Íon Produto Produto Produto Produto Produto Produto Produto (m/z) (m/z) (m/z) (m/z) (m/z) Energia de Energia de Energia de Energia de Energia de Energia de Energia de Energia de Energia de Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV) Colisão (eV)
Carbofurano 1 5,106 164 131 20 164 103 20 Indoxacarb 1 5,556 203 134 20 203 134 20 Metamidofos 1 5,877 141 64 25 141 79 25 Carbaril 1 6,29 144 115 15 144 115 15 Paraquat 1 7,754 156 128 30 156 128 30 Trifluralina 2 8,237 306 206 20 306 264 20 Pencicurom 2 8,354 180 125 35 180 125 35 Clomazone 3 9,089 204 78 30 204 77 30 Terbufos 3 9,332 231 175 15 231 175 15 Pirimetanil 3 9,493 198 183 25 198 118 25 Quintozeno 3 9,744 295 265 10 295 265 10 Clorotalonil 4 10,155 266 133 30 266 170 30 Fenitrotion 4 11,158 260 125 10 277 109 10 38 (Continuação) Pirimifos metilico 4 11,196 290 125 20 276 125 20 Malationa 4 11,381 173 99 5 173 127 5 Fentiona 4 11,577 278 245 5 278 169 5 Tetraconazol 5 11,914 336 204 30 336 204 30 Clorpirifos Etilico 5 11,921 314 258 10 314 258 10
