Síntese, caracterização e avaliação antitumoral de novos derivados 3-Benzil-5-(Indol-3-il-Metileno)-Tiazolidina-2,4-Diona

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO ANTITUMORAL DE NOVOS DERIVADOS 3-BENZIL-5(INDOL-3-IL-METILENO)-TIAZOLIDINA-2,4-DIONA. SYBELLE CHRISTIANNE BATISTA DE LACERDA PEDROSA. RECIFE- PE, 2011.

(2) SYBELLE CHRISTIANNE BATISTA DE LACERDA PEDROSA. SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO ANTITUMORAL DE NOVOS DERIVADOS 3-BENZIL-5(INDOL-3-IL-METILENO)-TIAZOLIDINA-2,4-DIONA. Dissertação Apresentada ao Programa de Pós-Graduação. em. Ciências. Farmacêuticas como Parte dos Requisitos para Obtenção do Título de Mestre em Ciências. Farmacêuticas. –. Área. de. Concentração: Síntese e Planejamento de Fármacos.. ORIENTADORA: Profª. Drª. Maria do Carmo Alves de Lima CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Thiago Mendonça de Aquino. RECIFE – PE, 2011.

(3) Pedrosa, Sybelle Christianne Batista de Lacerda Síntese, caracterização e avaliação antitumoral de novos derivados 3-Benzil-5-(Indol-3-il-Metileno)Tiazolidina-2,4-Diona / Sybelle Christianne Batista de Lacerda Pedrosa. – Recife: O Autor, 2011. 89 folhas: il., fig. ; 30 cm. Orientador: Maria do Carmo Alves de Lima. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2011. Inclui bibliografia. 1. Tiazolidinas. 2. Indol. 3. Antitumoral. 4. Química medicinal. I. Lima, Maria do Carmo Alves de. II.Título.. 615.3. CDD (20.ed.). UFPE CCS2011-177.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. REITOR: Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR: Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO: Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado. DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE: Prof. José Thadeu Pinheiro. VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE: Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros. CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Prof. Dalci José Brondanni. SUB-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Prof. Antônio Rodolfo de Faria COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Profa. Nereide Stela Santos Magalhães. VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS: Profa. Ana Cristina Lima Leite.

(6) "Há homens que lutam um dia e são bons. Há outros que lutam um ano e são melhores. Há os que lutam muitos anos e são muito bons. Porém, há os que lutam toda a vida. Esses são os imprescindíveis." Bertolt Brecht.

(7) DEDICATÓRIA. A Deus por me dar força, coragem e iluminar meus passos todos os dias para que eu possa alcançar meus objetivos de cabeça erguida com dignidade. Aos meus Pais, Gilda e Otávio Lacerda pela compreensão nos momentos de estresse e também por me proporcionarem e incentivarem a todo esse tempo a que me dediquei e concluo satisfeita e feliz. E, sobretudo, por terem me ensinado o valor de ser e ter uma família. A minha irmã Isabelle Lacerda pela paciência, compreensão e apoio durante toda minha formação acadêmica. Ao meu esposo, Diogo Pedrosa por toda paciência, companheirismo e palavras de incentivo, carinho e amor..

(8) AGRADECIMENTOS. Em especial à Profa. Dra. Maria do Carmo Alves de Lima, minha orientadora, pela amizade, confiança, por seu exemplo de ser como pessoa, contribuição e incentivo para minha formação acadêmica durante a Iniciação Científica e o Mestrado. Ao Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta por seu exemplo de profissionalismo e competência no desenvolvimento científico nacional. Á Profa. Dra. Suely Lins Galdino por seu exemplo de competência acadêmica e visionarismo político e sócio-econômico. Ao Prof. Dr. Thiago Mendonça de Aquino pela paciência durante a dissertação e o artigo científico e também por seu exemplo de competência científica. Á Profa. Dra. Ivone Antônia Souza por sua colaboração, atenção e por todo apoio e dedicação para conclusão deste trabalho. Á Profª Drª Teresinha Gonçalves da Silva e Profª Drª Gardênia Carmen Gadelha Militão pelo apoio e colaboração para o desenvolvimento do trabalho. Á Margarete Valdevino, pela compreensão, amizade, ajuda e ter sempre uma palavra amiga nos momentos de estresses, durante minhas idas à Secretária da PósGraduação. Ao LPSF/GPIT, Nathalia, Beatriz, Tiago, Anekécia, Willams, Michele, Andreza, Sérgio, Luiz Carlos, Fabiana, Cleiton, Sandra, Sandrinha, Camila, Aracelly, Juliana, Leidiane, Marina, Maíra, Jamerson, Talitha, Nayara, Bárbara e Paula pela colaboração do trabalho. Aos colegas de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pelos momentos compartilhados. À Facepe pelo suporte financeiro. Por fim, a Universidade Federal de Pernambuco, aos professores, funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela oportunidade de conviver e adquirir novos conhecimentos importantes a minha formação acadêmica. A todos, meu muitíssimo obrigada!.

(9) SUMÁRIO RESUMO. XII. ABSTRACT. XIII. LISTA DE ESQUEMAS. XIV. LISTA DE FIGURAS. XV. LISTA DE TABELAS. XVII. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. XVII. INTRODUÇÃO........................................................................................... 20 OBJETIVOS............................................................................................... 23 1. Objetivo geral......................................................................................... 23 2. Objetivos específicos............................................................................. 23 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................... 25. 3. Química Medicinal e Planejamento de Fármacos.................................. 25. 4. Aplicações Biológicas dos Compostos Tiazolidínicos e indólicos.......... 26. 4.1.Atividade Antiiflamatória....................................................................... 27. 4.2. Atividade Hipoglicemiante................................................................... 29. 4.3. Atividade Antibacteriana e Antifúngica................................................ 29. 4.4. Atividade Antitumoral.......................................................................... 30 5. ESTUDO QUÍMICO................................................................................ 36. 5.1. A Química das Tiazolidina-2,4-dionas................................................. 36. 5.2. Reatividade da tiazolidina-2,4-diona................................................... 37 5.2.1. Reações de Oxidação...................................................................... 37. 5.2.2. Tionação........................................................................................... 38. 5.2.3. N-alquilação..................................................................................... 39 5.2.5. Reação de Michael........................................................................... 40.

(10) 40 5.2.6. Condensação de Knoevenagel........................................................ 5.2.7. Reação de Acoplamento Diazo........................................................ 41. 5.2.8. Síntese da tiazolidina-2,4-diona....................................................... 42. 5.2.9. Determinação da Configuração da Dupla Ligação Benzilidênica.... 43 SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E COMPROVAÇÃO ESTRUTURAL....... 46. 6. Material e Métodos................................................................................. 46. 6.1. Mecanismos e rota sintética................................................................ 46. 6.2. Metodologias de síntese..................................................................... 51 6.2.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona....................................................... 51. 6.2.2. Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ)...................... 51 6.2.3. Síntese dos ésteres de Cope (LPSF/IP).......................................... 51 6.2.4. Síntese da 5-(1H-indol-3-il-metileno)3-benzil-tiazolidina-2,4dionas (LPSF/GQ)..................................................................................... 6.3. Resultados e Discussão...................................................................... 52. 6.3.1. Características físico-químicas e resultados espectroscópicos....... 53. 52. 6.3.1.1. 2-ciano-3-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP-19).. 53 6.3.1.2. 2-ciano-3-(5-bromo-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila 53 (LPSF/IP-59).............................................................................................. 6.3.1.3. 3-(3,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-142).......... 53. 6.3.1.4. 3-(3-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-156)............. 54 6.3.1.5. 3-(2,6-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-168).......... 54. 6.3.1.6. 3-(2,6-difluor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-175)........... 55. 6.3.1.7. 3-(2-cloro-4-fluor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-176).... 55 6.3.1.8. 3-(4-metilsulfanil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-365)..... 55. 6.3.1.9. 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,456 diona (LPSF/GQ-199)................................................................................ 6.3.1.10. 3-(2-Cloro-4-fluor-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina2,4-diona (LPSF/GQ-236).......................................................................... 57.

(11) 6.3.1.11. 5-(5-Bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2-cloro-4-fluor-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-237)......................................................... 57. 6.3.1.12. 5-(5-Bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2,6-difluoro-benzil)tiazolidina-2,4 diona (LPSF/GQ-238)......................................................... 58 6.3.1.13. 3-(3-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4diona (LPSF/GQ-239) ............................................................................... 59 6.3.1.14. 3-(3-Bromo-benzil)- 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-240) ........................................................ 60. 6.3.1.15. 3-(3,4-Dicloro-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4diona (LPSF/GQ-241) ............................................................................... 60 6.3.1.16. 5-(5-Bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(3,4-dicloro-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-242)........................................................ 61. 6.3.1.17. 3-(2,6-Dicloro)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-346).......................................................................................... 62 6.3.1.18. 5-(5-Bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2,6-dicloro)-tiazolidina2,4-diona (LPSF/GQ-347).......................................................................... 62 6.3.1.19. 5-(5-Bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(4-metilsulfanil-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-368)......................................................... 63. 6.3.1.20. 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-3-(4-metilsulfanil-benzil)-tiazolidina2,4-diona (LPSF/GQ-369).......................................................................... 65 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA.......................................................................... 66 7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA............................................ 66 7.1. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE.................................................. 66 7.1.1. OBJETIVO........................................................................................ 66. 7.1.2. MATERIAL....................................................................................... 66 7.1.3. MÉTODO.......................................................................................... 67. 7.1.4. RESULTADOS................................................................................. 68. 7.2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 69. 7.2.1. Derivado 3-benzil-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona. 69. 7.2.2. Tumor Sólido.................................................................................... 70.

(12) 7.2.3. Animais experimentais..................................................................... 70 7.3. Determinação a atividade antitumoral in vivo...................................... 70. 7.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 72 7.4.1. Atividade Antitumoral....................................................................... 72 7.5. Influência dos Substituintes na Resposta Biológica............................ 74. CONCLUSÕES.......................................................................................... 78. PERSPECTIVAS........................................................................................ 80. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 82.

(13) RESUMO. As tiazolidina-2,4-dionas são uma classe de compostos derivados da tiazolidina. Tratase de um anel de 5 membros, contendo um átomo de enxofre e um átomo de nitrogênio nas posições 1 e 3, respectivamente, e carbonilas na posição 4 e 2. Dados encontrados na literatura demonstram as tiazolidinadionas como ligantes sintéticos dos PPARs e por esta razão desempenham algumas atividades biológicas como: Hipoglicemiante, antimicrobiana, antitumoral e antiinflamatória. Este trabalho teve como objetivos: Sintetizar novos derivados 5-(indol-3-il-metileno)-3-benzil-tiazolidina2,4-dionas, por reações de ciclização, adição de Michael, N-alquilação na posição 3 e condensação de Knoevenagel na posição 5 do anel da tiazolidina-2,4-diona. As moléculas obtidas foram comprovadas através de métodos espectroscópicos de infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas. Verificou-se a citotoxicidade in vitro das novas moléculas sintetizadas em 3 linhagens de células tumorais: HT29 (carcinoma de cólon - humano), HEP (carcinoma de laringe - humano) e NCI H-292 (câncer de pulmão– humano). Essa análise fez parte de um screening inicial para determinação do potencial antitumoral. O 3-(3bromo-benzil)-5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-240) apresentou o melhor resultado para NCI H-292 (câncer de pulmão–humano) 80,2% inibição e HT29 (carcinoma de cólon - humano) 83,1% de inibição. Com isso a atividade antitumoral in vivo foi realizada no modelo Sarcoma-180 onde ficou demonstrado altos valores de inibição do crescimento tumoral em três doses testadas (10, 20 e 40mg/kg) do LPSF/GQ-240 comparadas ao controle negativo. Estes resultados ratificam a importância de derivados 5-(indol-3-il-metileno)-3-benziltiazolodina-2,4-dionas no combate ao câncer.. Palavras-chave: Tiazolidinas; Indol; Antitumoral; Química Medicinal..

(14) ABSTRACT. The thiazolidine-2,4-dione are a class of compounds derived thiazolidine. It is a 5membered ring containing a sulfur atom and a nitrogen atom in positions 1 and 3, respectively, and carbonyl in position 4 and 2. Data in the literature demonstrate the synthetic thiazolidinedione ligands of PPARs as and therefore play some biological activities such as hypoglycemic, antimicrobial, antitumor and anti-inflammatory. This study aimed to: synthesize new derivatives 5 - (indole-3-yl-methylene)-3-benzylthiazolidine-2 ,4-dione, by reactions of cyclization, addition of Michael, N-alkylation at position 3 and in the Knoevenagel condensation at position 5 of ring thiazolidine-2,4dione. The molecules obtained were proved by infrared spectroscopic methods, hydrogen nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. It was found that in vitro cytotoxicity of new molecules synthesized in three tumor cell lines: HT29 (colon carcinoma - human), HEP (laryngeal carcinoma - human) and NCI H-292 (human lung cancer). This analysis was part of an initial screening to determine the antitumor potential. The 3-(3-bromo-benzyl)-5-(5-bromo-1H-indole-3-yl-methylene)-thiazolidine2,4-dione (LPSF/GQ-240) showed the best result for NCI H-292 (human lung cancer) 80.2% of inhibition and HT29 (colon carcinoma - human) 83.1% of inhibition. This antitumor activity in vivo was performed in the model where the Sarcoma-180 which showed high values of inhibition of tumor growth in three doses tested (10, 20 and 40mg/kg) of LPSF/GQ-240 compared to the negative control. These results confirm the importance of derivatives 5-(indole-3-yl-methylene)-3-benzyl-tiazolodina-2,4-dione in the fight against cancer.. Keywords: Thiazolidine; Indole; Antitumor; Medicinal Chemistry..

(15) LISTA DE ESQUEMAS. Esquema 1: Rota sintética do bis-indol substituído. 30. Esquema 2: Reação de oxidação do anel tiazolidínico. 36. Esquema 3: Tionação da tiazolidina-2,4-diona com o Reagente de Lawesson. 36. Esquema 4: Reação de N-alquilação. 37. Esquema 5: Reação de Mannich. Formação de N-metil-N,N-bis(2,4tiazolidinadiona-metil-amina) 38 Esquema 6: Reação de Michael para obtenção das tiazolidinas 5substituídas. 38. Esquema 7: Condensação de Knoevenagel. Métodos: A) Catalisador 39 acetato de sódio e B) Catalisador β-alanina Esquema 8: Reação do anel tiazolidínico com sais diazônio. 39. Esquema 9: Síntese da tiazolidina-2,4-diona. 40. Esquema 10: Síntese de Bohen e Joull. 40. Esquema 11: Síntese de Singh. 40. Esquema 12: Substituição na posição 5 do anel heterocíclico. 41. Esquema 13: Rota sintética dos novos derivados arilideno-tiazolidina2,4-diona. 41. Esquema 14: Diagrama de síntese dos novos derivados TZDs. 45. Esquema 15: Mecanismo para formação do intermediário N-alquilado. 47. Esquema 16: Mecanismo reacional da condensação de Knoevenagel conduzindo aos ésteres cianocinâmicos (LPSF/IP) 47 Esquema 17: Mecanismo reacional da adição de Michael conduzindo aos derivados 5-(1H-indol-3-il-metileno)3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) 48.

(16) LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Derivado da série 5-indol-tioxotiazolidinadionas. 25. Figura 2: Estruturas químicas (A) Indometacina, (B) Rosiglitazona e (C) (5Z,E)-3-[2-(4-clorofenil)-2-oxoetil]-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina- 25 2,4-diona (LPSF/PG15) Figura 3: Derivados indol-tiazolidínicos sintetizados por Singhe cols. (1981). 26. Figura 4: Composto indol-tiazolidínico hipoglicemiante. 27. Figura 5: Derivado tiazolil-tiazolidina-2,4-diona. 28. Figura 6: Derivado TZD contendo o heterociclo benzopirano. 28. Figura 7: Estrutura química da Troglitazona.. 29. Figura 8: Inibidor da iniciação da tradução celular. 30. Figura 9: Estruturas químicas de moléculas contendo o núcleo indol 31 com atividade anticâncer Figura 10: Nova série de análogos indólicos. 32. Figura 11: Estrutura química de CS-7017. CS-7017 pertence aos 32 derivados de TZD na forma de sal dihidrocloreto Figura 12: Derivado TZD com ação antineoplásica. 33. Figura 13: Inibidor dual TZD das vias Raf/MEK/ERK e PIP3k/Akt. 33. Figura 14: Potente agente antitumoral derivado da 5-benzilideno- 34 tiazolidina-2,4-diona Figura 15: Bioisósteros das tiazolidinas. 34. Figura 16: Reatividade da tiazolidina-2,4-diona. 35. Figura 17: Estruturas teóricas dos diastereoisômeros Z e E para as 2,4TZDs 42 Figura 18: Efeitos do LPSF/GQ-240 com sarcoma 180 induzido e cada grupo. 71.

(17) Figura 19: Os valores representam a média dos pesos dos tumores. P<0.05 comparando os grupos tratados com o controle que recebeu 71 apenas solução salina 0.9%. Teste “t” de student (n = 6/grupo) Figura 20: Estrutura química do LPSF/GQ-240 com a tiazolidina-2,4diona substituído com 5-Br-indol e 3-Br-benzil. 73.

(18) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Citotoxicidade em células tumorais pelo método do MTT após 72 h de incubação. 67. Tabela 2: Efeito do LPSF/GQ-240 no crescimento do sarcoma-180 (média ± erro padrão, n = 6) 70 Tabela 3: Avaliação da inibição do crescimento da massa tumoral do composto LPSF/GQ-240 com em camundongos Swiss com Sarcoma 180 induzido 72.

(19) LISTA DE ABREVIATURAS. d. Dubleto. DMAD. Acetileno dicarboilato de metila. dd. Duplo dubleto. DMEN. Meio Dulbecco’s Eagle’s Modificado. DMSO. Dimetilsulfóxido. DMSO-d 6. Dimetilsulfóxido deuterado. e.p.m. Erro padrão. GPIT. Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica. IV. Infravermelho. J. Constante de acoplamento. MDR. Resistência a múltiplas drogas. MS. Espectrometria de massas. MTT. 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium. LPSF. Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos. m. Multipleto. NCI. National Cancer Institute. PPARs. Receptor proliferador ativador de peroxissomos. Rf. Razão de frente. RMN 13C. Ressonância magnética nuclear de carbono 13. RMN1H. Ressonância magnética nuclear de hidrogênio. s. Singleto. S-180. S-180. SAR. Estudos de relação estrutura-atividade. t. Tripleto. TZDs. Tiazolidinadionas.

(20) 19. INTRODUÇÃO.

(21) 20. INTRODUÇÃO O câncer continua a ser um grave problema de saúde nos países em desenvolvimento bem como nos desenvolvidos (ECKHARDT, 2002). De acordo com um relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC)/Organização Mundial de Saúde (OMS) [World Cancer Report 2008], mais de 7 milhões de pessoas morrem de câncer e cerca de 12 milhões de casos são diagnosticados a cada ano no mundo. Apesar dos grandes avanços realizados na administração dos quimioterápicos, o compromisso contínuo para a árdua tarefa de descobrir novos agentes anticancerígenos mantém-se criticamente importante. Assim, devido à importância epidemiológica dos processos neoplásicos, inúmeras abordagens terapêuticas têm surgido. O tratamento básico das neoplasias se limita a: cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Esta última apresenta-se desfavorável devido a inespecificidade do medicamento e a dificuldade de estabelecer a dose efetiva para destruir o máximo de células tumorais com o mínimo de efeitos adversos a células normais (SANTOS, 2003). Um dos maiores obstáculos para o sucesso da quimioterapia no tratamento de alguns tipos de câncer é o desenvolvimento por parte das células tumorais, pelo fenômeno da resistência aos fármacos utilizados, não ocorrendo resposta do tratamento. A resistência a múltiplas drogas (MDR) é um caso de resistência adquirida, observada em células tumorais, in vivo e in vitro, que consiste na ausência de resposta aos quimioterápicos, tanto àquele que foi utilizado inicialmente, quanto a outros empregados como alternativa terapêutica (HUBER et al., 2010). O termo MDR é usado para descrever o fenômeno caracterizado pela capacidade das células tumorais possuírem uma resistência simultânea a diferentes agentes quimioterápicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados (WAGNER et al., 2003). A incapacidade dos antineoplásicos atuarem de forma efetiva após a recidiva do tumor deve-se a múltiplos fatores de resistência. Os mecanismos de resistência representam várias formas de proteção da célula e do organismo.

(22) 21. e estão presentes na maioria das células normais. Em geral, a resposta celular tumoral com tratamento farmacológico pode ser definida por um vasto número de mecanismos moleculares operando em diferentes estágios: alteração no transporte do fármaco através da membrana plasmática, alteração de enzimasalvo, alteração do metabolismo da droga, aumento da reparação do DNA e incapacidade de sofrer apoptose (STAVROVSKAYA & STROMSKAYA, 2008; HUBER et al., 2010). Assim, com a finalidade de diminuir e, até mesmo, erradicar a resistência dos agentes quimioterápicos, além de amplificar sua ação terapêutica de forma mais específica reduzindo as manifestações indesejáveis, o papel fisiológico das tiazolidinas-2,4-dionas (TZDs) tem se destacado em estudos que mostram a sua participação no controle do ciclo celular, especialmente na modulação de ciclinas que são reguladores do ciclo celular e inibem especificamente as quinases dependentes de ciclina (CDKs) que são necessárias para transição da fase G1 para fase S da mitose (CHEN et al., 2005; SERRANO et al., 1993). O anel indol também representa uma das subunidades estruturais importantes para a descoberta de novos fármacos. A demonstração de que muitos alcalóides contêm o núcleo indol e o reconhecimento da importância do aminoácido essencial triptofano como sendo componente estrutural de muitas proteínas inclusive precursor biossintético do neurotransmissor serotonina, serviram para corroborar as pesquisas cientificas sobre a química do indol. (SMITH et al., 1998). Onde diversos trabalhos tem sido focado no desenvolvimento de fármacos anticancerígenos que contêm o indol como principal estrutura (WENG et al., 2008). Desse. modo,. aliando. os. estudos. sobre. esses. dois. núcleos. farmacologicamente ativos, este trabalho buscou sintetizar novos derivados estruturais indol-tiazolidínicos com possível ação antitumoral. Com base nos dados acima foi proposta pelo Grupo de Pesquisa em Inovação. Terapêutica. (LPSF/GPIT/UFPE),. sintetizar,. caracterizar. estruturalmente e avaliar a atividade antitumoral das novas moléculas 5-(1Hindol-3-il-metileno)-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas substituídos..

(23) 22. OBJETIVOS.

(24) 23. OBJETIVOS. 1. Objetivo Geral: • Planejar as estruturas baseadas no princípio de modificação molecular. Sendo feita a junção do núcleo heterocíclico indol com o anel tiazolidina-2,4-diona substituído, a fim de se obter a atividade antitumoral desejada.. 2. Objetivos Específicos: • Sintetizar novas moléculas. 5-(1H-indol-3-il-metileno)-3-benzil-. tiazolidina-2,4-dionas substituídas por meio de reações de Nalquilação e Adição de Michael utilizando haletos de benzila e 2ciano-5-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP); •. Caracterizar estruturalmente as novas moléculas 5-(1H-indol-3-ilmetileno)-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas. substituídas. sintetizadas. pelos métodos espectroscópicos de infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas;. •. Verificar a citoxicidade in vitro das novas moléculas 5-(1H-indol-3-ilmetileno)-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas substituídas em 3 linhagens de células tumorais, HT29 (carcinoma de cólon - humano), HEP (carcinoma de laringe - humano) e NCI H-292 (câncer de pulmão– humano), para determinação do potencial antitumoral dos derivados;. •. Avaliar a atividade antitumoral in vivo das novas moléculas 5-(1Hindol-3-il-metileno)-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas substituídas frente ao tumor sólido Sarcoma 180..

(25) 24. REVISÃO DA LITERATURA.

(26) 25. REVISÃO DA LITERATURA. 3. Química Medicinal e Planejamento de Fármacos A simplificação molecular representa a estratégia de desenhar novos fármacos diminuindo a sua rota sintética, mantendo ou melhorando a atividade biológica de qualquer composto protótipo seja ele natural ou sintético. Inicialmente, este conceito foi aplicado empiricamente aos produtos naturais com estruturas complexas para a obtenção de derivados ativos em processo simplificado molecular. Exemplos clássicos de simplificação molecular são os alcalóides morfina natural e quinina o que levou a vários fármacos utilizados na terapêutica (GARCÍA et al., 2010). Entretanto, o bioisosterismo planeja racionalmente novos compostos bioativos, aplicados a um protótipo conhecido. A estrutura química e mecanismo de ação devem ser. bem conhecidos, se possível ao nível da. interação com o receptor topográfico, incluindo o conhecimento de todos os seus grupos farmacofóricos. Além disso, as vias de inativação metabólica, bem como os principais fatores estruturais determinantes das propriedades físicoquímicas que regulam a biodisponibilidade e os efeitos colaterais devem ser conhecidos a fim de permitir uma previsão ampla da relação bioisostérica a ser utilizada (MOREIRA, 2005). O uso correto do bioisosterismo demanda parâmetros conformacionais eletrônicos, físicos e químicos envolvidos na prevista substituição. Assim, a substituição deve ser rigorosamente precedida por uma análise cuidadosa dos seguintes parâmetros (BARREIRO, 1991):. a) Tamanho, volume e distribuição eletrônica dos átomos ou considerações sobre o grau de hibridação, polarizabilidade, ângulos de ligação e efeitos indutivo e mesoméricos quando cabíveis;. b) O grau de solubilidade, de modo a permitir a previsão de alteração das propriedades físico-químicas, tais como logP e pKa;.

(27) 26. c) Reatividade química dos grupos funcionais ou subunidades estruturais bioisostéricas, principalmente para prever alterações significativas nos processos de biotransformação, inclusive no perfil de toxicidade em relação ao principal metabólito;. d) Fatores conformacionais, incluindo a capacidade de ligações de hidrogênio inter ou intramolecular. Em todos os processos de planejamento racional de novos bioligantes ou compostos-protótipos, devem-se considerar as eventuais contribuições toxicofóricas das subunidades estruturais, principalmente ao nível do retículo microssomal hepático, responsável por oxidações dependentes do CYP450, essenciais à biotransformação de substâncias endógenas e ao correto funcionamento de funções fisiológicas vitais (BARREIRO et al., 2002). A presença de grupos funcionais eletrofílicos como aceptores de Michael, epóxidos e subunidades estruturais extensamente co-planares devem ser consideradas como atributo de potencial hepato e citotoxicidade, respectivamente, devendo ser, portanto, evitadas (BARREIRO, 2002).. 4. Aplicações Biológicas dos Compostos Tiazolidínicos e indólicos. As Tiazolidinadionas (TZDs) têm sido objetivo de extensa pesquisa por seu envolvimento na regulação de diferentes processos fisiológicos. As TZDs, como Rosiglitazona e Pioglitazona, diminuem o nível plasmático da glicose através. da. ligação. aos. PPARs. (Receptor. proliferador. ativador. de. peroxissomos). Além disso, esta classe de compostos possui outros efeitos benéficos potenciais, incluindo a melhora no perfil lipídico, redução da pressão arterial e efeitos antiinflamatórios (KALAITZIDIS et al., 2009). Vale ressaltar a diversidade de trabalhos contendo o anel TZD relatando sua atividade como potente agente antitumoral, atuando no impedindo da progressão do ciclo celular por inibição de proteínas específicas ou através da interação com PPARs (MALIK et al., 2011)..

(28) 27. 4.1. Atividade Antiiflamatória Além das TZDs, outros agonistas sintéticos PPARγ tem sido identificados. Os AINES como a Indometacina e Ibuprofeno foram mostrados ativarem PPARγ em concentrações micromolares (LEHMANN et al., 1997). A identificação dos novos ligantes como a série de 2,3-dissubstituídos-5-indolácido acético se ligam seletivamente ao PPARγ. A substituição do grupo ácido carboxílico na posição 5 do anel indólico com a TZD resultou em perda considerável da atividade. Isso não é surpreendente, pois os relatos na literatura sugerem que a substituição do grupo TZD com o ácido carboxílico parece exigir uma unidade adicional de metileno para otimizar a atividade (HENKE et al., 1999). Com isso novos derivados da série 5-indol-tioxotiazolidinadionas (Figura 1) foram sintetizados e exibiram atividade antiinflamatória (SANTOS et al., 2005). Além da atividade antiinflamatórias por via COX, algumas TZDs têm sido descritas como ligantes de PPAR, capazes de suprimir o processo inflamatório (CHO et al., 2005).. S Cl. N S. O. N H. Figura 1: Derivado da série 5-indol-tioxotiazolidinadionas. A substituição 5-indol do anel central tiazolidínico e a ausência do grupamento sulfonila são as duas características estruturais da série química obtidas por Uchoa e colaboradores (2008) no Laboratório de Síntese e Planejamento de Fármacos (LPSF), quimicamente relacionados com a Indometacina,. bem como com as TZDs anti-diabéticas, a Roziglitazona.. Estudos anteriores de docking realizados pelo LPSF mostraram as indoltiazolidinadionas como ligantes da COX-2 (LEITE et al., 2005)..

(29) 28. Estes resultados foram confirmados por inibição in vitro de COX-1 e COX-2 medida por ensaio colorimétrico. Um dos compostos da presente série, o candidato a farmáco (5Z,E)-3-[2-(4-clorofenil)-2-oxoetil]-5-(1H-indol-3-ilmetileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/PG15) (Figura 2) demostrou importante atividade na migração de leucócitos avaliados por inflamação induzida por carragenina (UCHOA et al., 2008).. O. S CH3. O. CH3. N. N. O. H. O. OH CH3. O. B. N O. A S Cl. O N. O. O N H. C. Cl. Figura 2: Estruturas químicas (A) Indometacina, (B) Rosiglitazona e (C) (5Z,E)3-[2-(4-clorofenil)-2-oxoetil]-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/PG15) A atividade antiinflamatória de derivados indol-tiazolidínicos foi medida em ratos por Singh e cols. (1981). Destacam-se, entre os compostos sintetizados,. o. ona. composto. e. o. 2-(1H-indol-3il)-3-fenil-5-(2-hidroxi-fenil-metileno)-tiazolidin-42-(1H-indol-3-il)-3-fenil-5-(4-hidroxi-2,5-dimetil-fenil-. metileno)-tiazolidin-4-ona (Figura 3) por obterem atividade antiinflamatória de 34% e 45% na dose de 50mg/Kg.. OH. O. N. CH3O. H HC. S. OH. N. N H. HC. CH3. H. O. S N. CH3. H. Figura 3: Derivados indol-tiazolidínicos sintetizados por Singh e cols. (1981).

(30) 29. 4.2. Atividade Hipoglicemiante. Devido à eficácia insatisfatória e baixo perfil de segurança em testes préclínicos da classe das tiazolidinadionas de agentes hipoglicemiantes, vários análogos não-tiazolidínicos foram testados em atividades sensibilizadoras de insulina (HULIN et al., 1996). Alguns dos derivados do triptofano foram relatados reduzirem a glicose sanguínea após uma dose única em camundongos (dose: 50 mg/kg). O triptofano sendo um aminoácido comumente presente nos seres humanos pode mostrar um melhor perfil toxicológico (MACLEOD et al., 1996). Assim, Lohray e cols. em 1997 sintetizaram as tiazolidinadionas contendo os grupamentos triptofano e indol e testaram suas atividades antidiabéticas em camundongos comparando ao controle Troglitazona. Resultando no composto abaixo (Figura 4) apresentando 60-70% a redução do nível sanguineo de glicose após 3 dias de tratamento na dose de 50mg/kg e a mesma molécula também demonstrou considerável diminuição no nível de colesterol em relação ao controle Troglitazona.. O N. H N. O S. O. Figura 4: Composto indol-tiazolidínico hipoglicemiante. 4.3. Atividade Antibacteriana e Antifúngica. As 2,4-TZDs possuem amplo espectro de atividade em quantidade considerável de trabalhos onde demonstraram o núcleo pentamérico como potente agente antibacteriano e antifúngico. Com isso Bozdag-Dundar e cols. (2007) obtiveram uma série de novos derivados tiazolil-tiazolidina-2,4-diona ligados ao benzil através da ponte acetil ou metilênica testados em Staphylococcus aureus, S. aureus resistentes a Meticillina, Escherichia coli e Candida albicans. Todos os compostos mostraram-se ativos em todas as cepas. No mesmo trabalho, estudos de SAR.

(31) 30. revelaram que a atribuição de um grupo retirador de elétrons como o halogênio ou nitro na posição R do benzil ligado ao anel TZD por uma ponte metilênica ao invés de acetil desempenhou papel muito importante para o aumento da atividade (Figura 5). O. O Cl. N. S S. N. R. CH2 C R1. O. Cl R=H, F, Cl, Br, NO2. R1= H, Cl. Figura 5: Derivado tiazolil-tiazolidina-2,4-diona. Em outro estudo, Mulwald e cols. (2009) desenvolveram a síntese do derivado 3-(2-oxo-2H-benzopirano-6-il)-tiazolidina-2,4-diona (Figura 6) a partir da condensação da imino tiazolidinona com aldeídos aromáticos substituídos com posterior hidrólise em HCl 2%. O produto final teve a avaliação de sua atividade antibacteriana contra Bacillus subtilis, Escherichia coli e atividade antifúngica contra Candida albicans e Aspergillus niger exibindo resultados significantes contra todas as cepas.. O. O. O N S. O. Figura 6: Derivado TZD contendo o heterociclo benzopirano. 4.4. Atividade Antitumoral Diversos relatos na literatura apontam os derivados tiazolidínicos serem bioativos frente a várias linhagens celulares cancerígenas. A forma mais conhecida de suprimir a proliferação celular consiste na parada do ciclo celular. As ciclinas são reguladores do ciclo celular e especificamente elas inibem as quinases dependentes de ciclina (CDKs) que são necessárias para transição.

(32) 31. da fase G1 para fase S da mitose. As ciclinas são portanto oncogenes e no fato da superexpressão da ciclina D1, promove a progressão celular descontrolada e a transformação para um fenótipo neoplásico (MUSGROVE et al., 1994; CHEN & HARRISON, 2005). A exposição celular por TZD no período de 24 horas provoca a parada da fase G0/G1 do ciclo celular. E as TZDs não só diminuem os níveis de proteína ciclina D1, mas também reduzem a proliferação do antígeno nuclear e aumentam a expressão dos inibidores da quinase dependente de ciclina (p21 e p27) de forma tempo-dependente (KAWAKAMI et al., 2002; YANG et al., 2005). Como p21 e p27 inibem CDKs, isso resulta em parada do ciclo celular. Palarkurthi e cols. (2001) reportaram os efeitos antitumorais da Troglitazona. (Figura 7) mediados pelo esgotamento parcial de cálcio. intracelular levando à inibição da iniciação da tradução. A Troglitazona libera cálcio do retículo endoplasmático e ao mesmo tempo, inibe operação dos canais bloqueando assim o influxo do íon através da membrana plasmática causando um esgotamento parcial intracelular. O esgotamento de cálcio intracelular ativa quinases eIF2α, resultando na fosforilação de eIF2α em Ser51 e sua inativação que concomitante limita a disponibilidade do complexo ativador da tradução (FAN et al., 2004). A inibição da disponibilidade do complexo é limitante na etapa de iniciação da tradução. A fosforilação da eIF2α leva a diminuição preferencial de ciclinas G1 e outras proteínas oncogênicas e assim a parada da fase G1 do ciclo celular (SUDHAKAR et al., 2000). O. H N S. O. O. O. HO. Figura 7: Estrutura química da Troglitazona. Baseado nesses estudos, Chen e cols. (2004) identificaram novos derivados tiazolidínicos (Figura 8) com atividade antineoplásica através do impedimento da iniciação da tradução por depleção dos canais de cálcio..

(33) 32. Estudos de relação estrutura-atividade (SAR) dos substituintes na posição C-5 do benzilideno ou benzila demonstraram o importante papel desta substituição para atividade dos compostos. A ausência de substituição no C-5 resultou em análogos menos potentes.. O. O. H N O. S. CH3. C. CH3. CH3. Figura 8: Inibidor da iniciação da tradução celular Baseado nesses conhecimentos, Niemyjska e cols. (2008) descreveram a citotoxicidade de compostos estruturalmente relacionados ao DIM, entretanto, possuindo a ponte dissulfeto em vez da metilênica, sendo denominados dissulfeto di-indol-3-il substituídos (Esquema 1). Os substituintes Flúor e Iodo exibiram. serem. bastante. potentes. contra. câncer. renal. e. pulmonar,. respectivamente. X X. S C. X NH2. NH2, I2. EtOH/H2O, NaOH. N. S. H. N. S. N H. H X= H, F, I, OCH3. Esquema 1: Rota sintética do bis-indol substituído Diversos trabalhos tem sido focado no desenvolvimento de fármacos anticancerosos que contêm o indol como principal estrutura (WENG et al., 2008). Relatos recentes apontam uma série de análogos indólicos do ácido barbitúrico (Figura 9. Estrutura A) e afins com ação anticâncer..

(34) 33. Li e cols. (2003) sintetizaram uma série de produtos estruturalmente relacionados com N-heterocíclicos glioxilamidas indol (Figura 9. Estrutura B), e descobriram que essas moléculas possuem ação contra o várias neoplásias, incluindo a resistência a múltiplas drogas. As estruturas N-benzilindol e indolizina glioxilamidas (Figura 9. Estrutura C) também mostraram atividade antiproliferativa in vitro em várias linhagens celulares, incluindo leucemia, mama, cólon, e útero (JAMES et al., 2008).. H O. N. NHR1. O O N. NHR1 O O. O H. O N. N. N. A. Cl. Het. CN. B. C. Figura 9: Estruturas químicas de moléculas contendo o núcleo indol com atividade anticâncer.. Com base nas informações acima, Penthala e cols. (2011) planejaram as novas séries de (Z)-5-((1-benzil-1H-indol-3-il)metileno)-2-imino-tiazolidina-4onas e (Z)-5-((1-benzil-1H-indol-3-il)metileno)-imidazolidina-2,4-dionas (Figura 10) através de radiação microondas e testaram a citotoxicidade em 60 tipos de células cancerosas. O screen realizado exibiu o composto A sendo o melhor da série, inibindo mais de 60% do crescimento celular em 14 das 60 linhagens testadas. A segunda molécula mais ativa, B, apresentou boa inibição da proliferação em 98% das células avaliadas. Foi observado também, o análogo C ativo contra melanoma..

(35) 34 H. H. H O. O. N. O. N. NH. O. NH. S. N. S. Br. H. Cl. N. O N. CH3. O. N. N. C. F. CN. F. A. C. B. Figura 10: Nova série de análogos indólicos A atividade antitumoral da classe das tiazolidinadionas agonistas PPAR- γ foi investigada por Shimazaki e cols (2008). A molécula CS-7017 (Figura 11) apresentou ser seletiva para PPAR-γ entre outras subfamílias de PPAR e inibiu a proliferação de linhagens de células tumorais humanas anaplásicas da tireóide e pancreáticas. Em estudos xenográficos, CS-7017 inibiu o crescimento de células tumorais humanas coloretais na dose de 1mg/kg. Além disso, nessa mesma dose aumentou o nível de adiponectina (SHIMAZAKI et al., 2008), uma citocina produzida no tecido adiposo durante a ativação dos PPAR-γ e que evidências sugerem ter relação próxima com o grau de resistência a insulina (WEYER et al., 2001). O. H N. CH3. H3C. O. N. H. S. O. 2HCl. H2O. O N. H2N CH3. Figura 11: Estrutura química de CS-7017. CS-7017 pertence aos derivados de TZD na forma de sal dihidrocloreto Kaminskyy & Lesyk. (2010) propuseram avaliar a atividade antitumoral de 25 compostos contendo o núcleo imidazolidínico ou tiazolidínico (Figura 12) em 60 linhagens de células cancerígenas. Todas as moléculas apresentaram alta sensibilidade na linhagem celular de leucemia. Os autores concluíram também a importância do grupamento metileno na posição 5 do anel para atividade anticâncer e a substituição do átomo enxofre por nitrogênio.

(36) 35. (tiazolidina. para. imidazolidina). contribuiu. para. o. O. H. CH2 C. N. aumento. da. ação. antineoplásica e da seletividade.. O N. F. Me O. S. Figura 12: Derivado TZD com ação antineoplásica. Li e cols. (2010) relataram a síntese e os efeitos anticancerígenos de novos derivados 2,4-TZD (Figura 13) como inibidores duais da cascata Raf/MEK regulada por ERK e da cascata fosfatidilinositol 3-quinase (PIP3k) regulada por Akt. Ambas são proteínas quinases fosforiladas e ativadas que executam. papel. importante. na. proliferação. e. apoptose. de. células. hematopoiéticas (STEELMAN et al., 2008).. O NH2. N S. O. Figura 13: Inibidor dual TZD das vias Raf/MEK/ERK e PIP3k/Akt. A nova molécula descoberta inibiu a progressão celular, indução precoce da apoptose, e parada celular na fase G0/G1 em células leucêmicas humana. Estes resultados indicam o potencial do novo composto líder em desenvolver ação sinérgica nas duas vias de sinalização, atuando como alternativa terapêutica para o tratamento do câncer (Li et al., 2010). Em 2010, Patil e cols. realizaram testes de citotoxicidade em 10 novos derivados 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-diona. Os efeitos citotóxicos foram testados em sete linhagens de células cancerígenas (pulmão, mama, próstata, hepatoma, leucemia, oral e nasofaringe). A porcentagem do crescimento foi avaliada espectrofotometricamente versus controle negativo, ou seja, sem.

(37) 36. tratamento. e. o. controle. positivo. tratado. com. Doxorrubicina,. agente. antineoplásico usado na terapêutica. Entre as moléculas testadas, o composto 2-[4-[(2,4-Dioxotiazolidin-5ilideno) metil] fenoxi]-N-[3-(triflurometil) fenil] acetamida (Figura 14) mostrou resultados mais promissores na atividade antiproliferativa, apresentando potente citotoxicidade contra cinco das sete linhagens de células avaliadas (mama, oral, próstata, nasofaringe e leucemia) e possuindo atividade 10 vezes maior que o controle positivo (PATIL et al., 2010). O. H N. H O. S. N O O F3C. Figura 14: Potente agente antitumoral derivado da 5-benzilideno-tiazolidina-2,4diona 5. ESTUDO QUÍMICO 5.1. A Química das Tiazolidina-2,4-dionas As TZDs são bioisósteros das imidazolidinonas e das oxazolidinonas que pertencem a um importante grupo de heterocíclicos com grupo carbonil nas posições 2, 4 ou 5 do anel pentamérico (Figura 15) (SINGH et al., 1981). Um estudo de Lima e colaboradores (2007) demonstram ainda atividade antitumoral para análogos da tiazolidina, tendo os compostos sintetizados se mostrando mais potentes e seletivos que medicamentos existentes no mercado.. H O. N. O. S. O. O N. N H. Imidazolidinadiona. O. O. O N. H Tiazolidinadiona. H Oxazolidinadiona. Figura 15: Bioisósteros das tiazolidinas.

(38) 37. Lima, em 1998, discute aspectos importantes da química da tiazolidinadiona, abordando principalmente os métodos de obtenção e as propriedades físico-químicas e biológicas de TZDs dissubstituídas. Conforme descrito, o núcleo da tiazolidina-2,4-diona permite algumas reações, tais como: •. Em posição 1: reações de oxidação;. •. Em posição 3: reações de substituição nucleofílica de segunda ordem (SN2 – reações de N-alquilação) e reação de Mannich;. •. Em posição 4: reações de tionação;. •. Em posição 5: reações de condensação com aldeídos, cetonas e aromáticos (reações de Knoevenagel), reações de adição de Michael e reações com sais de diazônio (acoplamento diazo) (Figura 16). N-alquilção Reação de Mannich. H O. N O S. Condensação de Knoevenagel Reação de Michael Reação de Acoplamento Diazo. Tionação. Reações de Oxidação. Figura 16: Reatividade da tiazolidina-2,4-diona. 5.2. Reatividade da tiazolidina-2,4-diona 5.2.1. Reações de Oxidação. Taxak e cols. (2011) com a análise da Química Quântica executaram o metabolismo da classe de fármacos Glitazona através do processo de oxidação do átomo de enxofre do anel tiazolidínico com diferentes oxidantes: H 2 O 2 , HOONO e C4a-hidroperoxiflavina. A oxidação ocorre pela formação da ligação.

(39) 38. O-O entre oxidantes e a gradual formação da ligação S-O. Este estudo é útil para a compreensão da geração de metabólitos devido ao processo de oxidação do átomo de enxofre da série Glitazona de medicamentos antidiabéticos em condições fisiológicas (Esquema 2). S. O H. H. H2O2. N. S. N. S. O. O. Esquema 2: Reação de oxidação do anel tiazolidínico. 5.2.2. Tionação. Modificações na posição 4 podem ser realizadas através de reações de tionação, ou seja, a conversão do grupo carbonila ao correspondente grupo tiocarbonila (Esquema 3). A tiocarbonila pode ser obtida através da reação da carbonila com sulfetos de fósforo, como decassulfeto de tetrafósforo (P 4 S 10 ) e pentassulfeto de fósforo (P 2 S 5 ) (CAVA & LEVINSON, 1985). O reagente mais empregado para tionação é o reagente de Lawesson (2,4-bis(4-metóxifenil)1,3-ditio-2,4-fosfetano-2,4-dissulfeto) que possui o mecanismo similar ao da reação de Witting (CAREY & SUNDBERG, 1990). No entanto, dois fatores limitam a utilização do reagente de Lawesson: o alto custo e a grande quantidade de sub-produtos originados do reagente que acompanham suas reações e apenas são removidos através de processos cromatográficos (CURPHEY, 2002). O. H N S. O. Reagente de Lawesson. S. H N. Dioxano Anidro. S. Reagente de Lawesson:. CH 3O. O. S. P S. S P. OCH 3. S. Esquema 3: Tionação da tiazolidina-2,4-diona com o Reagente de Lawesson.

(40) 39. 5.2.3. N-alquilação. A substituição na posição 3 da tiazolidina-2,4-diona baseia-se na utilização da N-alquilação com haletos de alquila. Em 1985, Omar e cols. realizaram a benzilação com cloreto de benzila em meio básico para obter a TZD 3-substituída. O mecanismo reacional consiste na retirada do hidrogênio ligado ao nitrogênio na posição 3, gerando uma carga negativa. Assim, a carga negativa irá atacar o carbono α-halogenado que devido ao efeito indutivo apresenta a carga parcialmente positiva, formando o composto N-alquilado (Esquema 4). O. O. H. O. Base. N. N. O. S. N. X. MeOH O. S. O. S. X= F,Cl, Br. Esquema 4: Reação de N-alquilação. 5.2.4. Reação de Mannich. A reação de Mannich envolve a condensação de compostos contendo um grupo ácido com formaldeído e uma amina, na presença de um ácido forte, para formar uma base de Mannich (FERRAZ & PEREIRA, 2004). As TZDs por possuírem propriedades ácidas e formar sais básicos, a reação Mannich se processa facilmente a 0°C com morfolina, piperidina e dimetilamina. Com isso, Bombardieri e Taurins em 1955, reagiram a metilamina com duas moléculas de tiazolidina-2,4-diona resultando no composto N-metilN,N-bis(2,4-tiazolidinadiona-metil-amina) (Esquema 5) (BOMBARDIERI & TAURINS, 1955). O. H N S. H. O. H. Esquema 5: Reação de tiazolidinadiona-metil-amina). O. H. O H. N. CH 3. EtOH. Mannich.. O. CH3 N. N O. S. Formação. de. N O. S. N-metil-N,N-bis(2,4-.

(41) 40. 5.2.5. Reação de Michael. A reação de adição do tipo Michael consiste na inserção do grupo benzilideno na posição 5 da TZD. São utilizados os ciano-acrilatos de etila formados a partir de benzaldeídos substituídos (SILVA et al., 2001). Os ciano-acrilatos de etila, em proporções equimolares podem ser inseridos na posição 5 do anel TZD. Na reação utiliza-se piperidina ou morfolina como catalisador e etanol absoluto como solvente com aquecimento de até 60-70°C. O produto final é retirado por filtração e purificado com etanol absoluto (Esquema 6) (PEREIRA, 2003).. O. R2 N. O. R1. O H3C. N H. N. R2 O. S. R1 N S. O. O. Esquema 6: Reação de Michael para obtenção das tiazolidinas 5-substituídas. 5.2.6. Condensação de Knoevenagel. A inserção de substituintes na posição 5 do anel TZD é relatado por Unagst e cols. (1994) por duas metodologias distintas, ambas através da Condensação de Knoevenagel (Esquema 7). O primeiro método utiliza-se aldeído em pequeno excesso em relação a TZD, em meio de acido acético e acetato de sódio como catalisador básico em proporção 3,5 vezes maior. O meio reacional ocorre em refluxo por 48 horas e o produto final é obtido após sua precipitação em água destilada por filtração. O segundo método utiliza proporções equimolares dos aldeídos e da TZD em meio de acido acético e como catalisador básico o aminoácido betaalanina em proporção molar 1,5 vezes menor que os demais reagentes. O meio reacional ocorre em refluxo de 24 horas e após resfriada adiciona-se a água destilada e agita-se por mais de 1 hora. O produto final é obtido através de filtração e recristalizado a partir de cianeto de metila..

(42) 41. O R. O. A) NaOAc. O. H. HOAc. N. H. R. B) b-alanina S. O. H N O. S. HOAc. Esquema 7: Condensação de Knoevenagel. Métodos: A) Catalisador acetato de sódio e B) Catalisador β-alanina Ambos os métodos também são executados com ligeiras modificações em relação ao tempo reacional e a purificação do produto final (MURATA et al., 1999).. 5.2.7. Reação de Acoplamento Diazo. As tiazolidinas-2,4-diona podem realizar reações de acoplamento com sais de diazônio. Estas reações, assim como as reações de condensação aldólica são realizadas via formação de enolato (Esquema 8) (LIESEN et al., 2008). O. R. O. N N S. N. Ar. N. N. Ar. O. R. NH4OH(aq). N Ar. N. N. S. O. R= Aril, aquil ou Heterociclo. Esquema 8: Reação do anel tiazolidínico com sais diazônio 5.2.8. Síntese da tiazolidina-2,4-diona Obteve-se a tiazolidina-2,4-diona primeiramente a partir de uma reação de ciclização utilizando ácido monocloroacético e a tiouréia em meio aquoso (Esquema 9) (LIBERMAN, 1948 apud LIMA, 1998; HEINTZ, 1865 apud ELDERFIELD, 1957)..

(43) 42. Cl. NH2 C. CH2 C. H. O. S. O. N. NH2. O. OH. S. Esquema 9: Síntese da tiazolidina-2,4-diona. E posteriormente a mesma molécula obtida por Bohen e Joull em 1973 a partir da reação de isocianatos com dióxido de tio-ceteno. Ambos radicais, aril e alquil isocianatos, demonstraram baixa reatividade, porém o p-tolilsulfonil demonstrou altamente reativo resultando na formação da TZD (Esquema 10). O O. C p. CH3 C6H4SO2N. C. O. N. SO2C6H4CH3. CH2. O. S. SO2. Esquema 10: Síntese de Bohen e Joull. Em 1981 foi proposta por Singh e cols. uma nova metodologia onde a tiazolidina-2,4-diona é formada através da reação de dimetil-acetilenodicarboxilato (DMAD) com metilamônio e N-metil-tiocarbamato, (Esquema 11) usando como solvente metanol a temperatura ambiente. R. O H3CO2 C. C. CO2CH3. RHN. C. SH. N O. H2NR. O. S. H3CO2CHCH2. R=CH3 ou C6H5CH2. Esquema 11: Síntese de Singh. Um método de obtenção de derivados tiazolidínicos condensados na posição 5 do anel consiste em reagir a tiazolidina-2,4-diona com aldeídos aromáticos substituídos, utilizando ácido acético e acetato de sódio fundido (Esquema 12) (JOHNSON e SCOTT, 1915; LO, 1953). O O N S. N. H CHO O. R. CH 3COOH HC CH 3COONa. R. S. H O. 10. R = H, 2-Cl, 3-NO2, 2-CH3O, C6H 5, 3,4-(OCH2O). Esquema 12: Substituição na posição 5 do anel heterocíclico. H 2O.

(44) 43. Em 2010, Barros e cols. sintetizaram novos derivados arilidenotiazolidina-2,4-diona (Esquema 13) a partir da reação de N-alquilação ao anel tiazolidínico e posterior adição nucleófila de Michael do 3-benzil-tiazolidina-2,4diona aos respectivos aril-substituídos 2-ciano-3-fenil-etil-acrilato também na posição 5 do núcleo pentamérico.. O H. O. O. N. Haletos de benzil O. S. NaOH EtOH. N. R2CH R1. O S. (CN)COOEt. N R1. O. H. S. Piperidina EtOH R2. Esquema 13: Rota sintética dos novos derivados arilideno-tiazolidina-2,4-diona. 5.2.9. Determinação da Configuração da Dupla Exocíclica. As Tiazolidinas-2,4-dionas podem sofrer condensação com aldeídos aromáticos substituídos e reação de adição com ciano acrilatos de etila substituídos, conduzindo a formação de derivados α,β – insaturados. Estes derivados, teoricamente, podem existir nas configurações diastereoisoméricas Z e E (Figura 17). O. O. CH2 N. H S. R1. CH2 N. R2 S. O. R1 O. H. Z. E. Figura 17: Estruturas teóricas dos diastereoisômeros Z e E para as 2,4-TZDs Diversos autores confirmaram a configuração Z ou E da dupla ligação em. várias. moléculas. contendo. os. anéis. tiazolidina-2,4-diona,. imidazolidinadiona e rodanina, bem como derivados de hidantoinas e tiohidantoinas (MENEZES et al., 1992; LIMA et al., 1992)..

(45) 44. Por exemplo, Bruno e cols. (2002) determinaram a configuração da dupla ligação exocíclica em derivados 5-arilideno-tiazolidina-2,4-diona. Apenas para um das moléculas da série sintetizada, esta configuração foi determinada por estudos de difração de Raio-X, sendo identificada como Z apresentando deslocamentos químicos na faixa de 7,72-7,97 ppm. Nos espectros de RMN 13. C, os sinais do C-H arilideno apareceram na faixa de 130,1-132,8 ppm. Este fato deve-se a maior desblindagem por parte do grupo carbonila. (C=O) adjacente (posição 4), em comparação ao mesmo efeito observado pelo átomo de enxofre (S-1)..

(46) 45. SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E COMPROVAÇÃO ESTRUTURAL.

(47) 46. SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E COMPROVAÇÃO ESTRUTURAL. 6. Material e Métodos Os reagentes utilizados foram: etanol, morfolina, piperidina, tiouréia, ácido monocloroacético, acetato de etila, n-hexano, cianoacetato de etila, cloretos de benzila substituídos; aldeídos substituídos e hidróxido de potássio. Os reagentes e solventes utilizados na síntese dos compostos e suas análises pertencem às marcas Sigma, Aldrich, Acros, Merck, Vetec ou Quimis. Na cromatografia em camada delgada foi utilizada placa de sílica gel 60 Merck F254, de 0,25 mm de espessura reveladas em luz ultravioleta (254 ou 366 nm) ou através de vapores de iodo. A caracterização estrutural foi realizada através de espectrofotometria de absorção no infravermelho (IV) em espectrofotômetro FTIR Bruker, Modelo IFS 66, pastilhas de KBr. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) foram efetuados em espectrofotômetros Varian Modelo Plus 300-400 MHz e utilizado como solvente DMSO-d 6 . As multiplicidades dos sinais são indicadas pelas abreviações: singleto (s), dubleto (d), duplo dubleto (dd), tripleto (t), quadrupleto (q), multipleto (m). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hz (Hertz). Os espectros de massa foram registrados sobre impacto eletrônico a 70eV em espectrômetro R1010C Delsi-Nermag, acoplada a CPG. HP5890. Para. determinação do ponto de fusão foi utilizado aparelho Quimis, Modelo 340.27.. 6.1. Mecanismos e rota sintética. Para obtenção das novas moléculas 5-(1H-indol-3-il-metileno)-3-benziltiazolidina-2,4-dionas substituídas foi realizada a seguinte rota sintética (Esquema 14)..

(48) 47. O. H N O. O S. N. MeOH NaOH. R1. O S. Cl. CH2 R1. EtOH Morfolina. R2 CH. C. COCH2CH3. CN N H. S. R2. O N N. O. H. R1. R1 = 3-Br; 2-Cl-4-F;2,4-dicloro;3-4-dicloro;2,6-difluoro;4-SCH3 (LPSF/IP-19): R2 = H (LPSF/IP-59): R2 = 5-Br. Esquema 14: Diagrama de síntese dos novos derivados ATZDs. Iniciam-se com a síntese da tiazolidina-2,4-diona, que foi realizada através da reação de ácido monocloroacético com a tiouréia em meio aquoso. Nesta reação ocorre um processo de ciclização que forma a tiazolidina-2,4diona (LIBERMAN, 1947 apud LIMA, 1998). Em uma segunda etapa temos a síntese dos derivados 3-benziltiazolidina-2,4-dionas, através de reações de N-alquilação da ATZD com haletos de alquila substituídos, na presença de base em solvente metanol, que levou inicialmente a formação de um sal, e posterior adição do haleto de benzila com a formação final do produto intermediário. Tal metodologia é consolidada na literatura por diversos autores, tendo como diferença o meio básico utilizado (DAVIS E DAINS, 1935; LO, SHROPSHIRE, CROXALL, 1953). O mecanismo é concertado e SN 2 (Esquema 15), ou seja, no mesmo momento que o nucleófilo ataca o carbono positivo o halogênio por ser um bom grupo de partida sai da molécula e se forma o produto final da reação..

(49) O N. Cl CH2 R. S. N. B O. O. O N O. B. S. -BH. O. CH2 N. Cl CH2 S. 48. O. H. H. R. R. -HCl S. O. Esquema 15: Mecanismo para formação do intermediário N-alquilado. Em paralelo foi realizado a síntese dos ésteres cianocinâmicos (LPSF/IP), que se processou a partir da condensação de Knoevenagel com 5bromo-indol-3-carboxialdeído ou indol-3-carboxaldeído e cianoacetato de etila, em benzeno e na presença de morfolina. O mecanismo reacional de formação dos ésteres cianocinâmicos (Esquema 16) inicia-se pela retirada do hidrogênio metilênico do cianoacetato de etila através da morfolina. A seguir, o carbânio formado, estabilizado através do equilíbrio ataca o carbono α-carbonila que tem sobre si uma carga parcial positiva resultante do efeito indutivo provocado pelo átomo de oxigênio formando o 2-ciano-3-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (CAREY & SUNDBERG, 1990)..

(50) 49 O. N. CN. CN. H. H2C C. HC. H+ OCH2CH3. C. OCH2CH3. O. O. O. R. C. H. N H. R. OH. CN. CH. C. R C. OCH2CH3. O N. N. H. H. OH. CN. CH. C. C. H. O. OCH2CH3. O N H CN. R CH. C. C. OCH2CH3. O. R= 5-Br; H. N H. Esquema 16: Mecanismo reacional da condensação de Knoevenagel conduzindo aos ésteres cianocinâmicos (LPSF/IP). Estes intermediários foram utilizados para obtenção dos substituintes benzilidênicos, na posição cinco do anel TZD formando os produtos finais TZDs através do mecanismo reacional abaixo (Esquema 17)..

(51) 50. O. O. CH2. CH2. R1. R1. N. N H H. O. S. H. O. S. O. N H. BH. CN. R2. O. R1. CH2 N. CH. C. C. O. CH2CH3. O H. N. O. S. H. O O. CH2. R1. N. R2. H2C(CN)CO2Et. H. N. S. H. C N. O. S. C. -. CH. R1. CH2 N. H. R2. O. CO2Et. H. CN. O. H N H. R1 = 3-Br; 2-Cl-4-F;2,4-dicloro;3-4-dicloro;2,6-difluoro;4-SCH3 (LPSF/IP-19): R2 = H (LPSF/IP-59): R2 = 5-Br. Esquema 17: Mecanismo reacional da adição de Michael conduzindo aos derivados 5-(1H-indol-3-il-metileno)3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) A formação da dupla exocíclica na posição cinco da TZD ocorreu devida a desprotonação pela ação da morfolina, que conduz a formação de um carbânion, que leva a um ataque do carbono β do 2-ciano-3-(1H-indol-3-ilmetileno)-acrilato de etila (LPSF/IP), conduzindo aos novos derivados TZDs (LPSF/GQ) (SANTOS et al., 2005; MOURÃO et al., 2005). A. posição. 5. do. anel. tiazolidínico. apresenta. uma. reatividade. característica frente a vários reagentes. O carbono metilênico comporta-se como um nucleófilo e as reações ocorrem normalmente em presença de uma base, a tiazolidina-2,4-diona reage como um ânion. A formação deste ânion é facilitada pela presença dos grupamentos carbonílicos nas posições 2 e 4, e são dependentes do efeito indutivo negativo do heteroátomo, obedecendo a seguinte ordem: S > NH > NCH 3 > O (BARONOV e KOMARISTA, 1965)..

(52) 51. 6.2. Metodologias de síntese. 6.2.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona Em um balão de fundo redondo adicionou-se tiouréia (5g – 0,0658mols) e ácido monocloroacético (6,35g – 0,00673) previamente dissolvido em água. Aqueceu-se a mistura a uma temperatura de 96°C por 18 horas. Em seguida, deixou-se o produto obtido em repouso por 24 horas na geladeira. Formaramse cristais brancos correspondentes a tiazolidina-2,4-diona, cuja purificação foi realizada através de cristalizações sucessivas em água destilada. A tiazolidina-2,4-diona, de fórmula molecular C 3 H 3 NO 2 S (MM = 117), após purificação apresenta-se na forma de cristais brancos. Este composto foi obtido com rendimento de 84%, apresentando uma faixa de fusão 121-122°C [ponto. de. fusão. na. literatura. 122°C. (KOCHKANYAN;. ISRAELYAN;. ZARITOUSKII, 1978) e Rf = 0,51, em sistema de eluição CHCl 3 /CH 3 OH 96:4. RMN1H (δ, ppm) – DMSO – d6: 4.11 ppm (CH 2 , s, 2H); 12.00 ppm (NH, s ,1H) IV (cm-1): 3115 (NH), 1670 e 1735 (C=O). 6.2.2. Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) Em um balão de fundo redondo foram adicionados 3 g (0,025 mols) da tiazolidina-2,4-diona. Na mesma razão molar foram adicionados o haleto de benzila e o hidróxido de sódio, em meio metanólico. A mistura reacional foi aquecida a 65°C, por 18 horas levando a formação da 3-(3,4-dicloro-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-142), 3-(3-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-156), 3-(2,6-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-168), 3(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona. (LPSF/GQ-175),. 3-(2-cloro-4-flúor-. benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-176) e 3-(4-metiltio-benzil)-tiazolidina2,4-diona (LPSF/GQ-365). Estes intermediários foram purificados através de cromatografia em coluna sob pressão. 6.2.3. Síntese dos ésteres de Cope (LPSF/IP) Em um balão de fundo redondo foram adicionados o 5-Br-indol-3carboxialdeído ou 1H-indol-3-carboxaldeído e cianoacetado de etila em quantidades equimolares, na presença de morfolina como catalisador e benzeno como solvente. A mistura reacional foi aquecida a uma temperatura de 110°C, durante 4 horas. O produto foi mantido na geladeira por 12 horas. Os.

(53) 52. 2-ciano-3-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP) foram purificados através de cristalizações sucessivas em etanol absoluto (COUTO, 2006).. 6.2.4. Síntese da 5-(1H-indol-3-il-metileno)3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) Quantidades equimolares da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e dos 2-ciano-3-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP) dissolvidos em etanol, na presença de 500 μl de morfolina como catalisador, foram aquecidas sob refluxo durante 3 dias. Após resfriamento, ocorreu a cristalização das novas. moléculas. 5-(1H-indol-3-il-metileno)3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas. (LPSF/GQ) que foram purificados através de sucessivas lavagens com álcool etílico absoluto.. 6.3. Resultados e Discussão A análise dos resultados obtidos na síntese dos novos derivados tiazolidínicos: 3-(4-metiltiobenzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-365), 3-(2,6diflúor-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-199), 3(2-Cloro-4-flúor-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-236),. 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2-cloro-4-flúor-benzil)-. tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-237), 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2,6diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4 diona (LPSF/GQ-238), 3-(3-bromo-benzil)-5-(1Hindol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-239), 3-(3-bromo-benzil)-5(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-240), 3-(3,4dicloro-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(3,4-dicloro-benzil)-. (LPSF/GQ-241),. tiazolidina-2,4-diona. (LPSF/GQ-242),. 3-(2,6-dicloro)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona. (LPSF/GQ-346),. 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(2,6-dicloro)-tiazolidina-. 2,4-diona. (LPSF/GQ-347),. benzil)-tiazolidina-2,4-diona. 5-(5-bromo-1H-indol-3-il-metileno)-3-(4-metiltio(LPSF/GQ-368),. metiltio-benzil)-tiazolidina-2,4-diona sintéticas mencionadas.. 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-3-(4-. (LPSF/GQ-369),. a. partir. das. rotas.

(54) 53. 6.3.1. Características físico-químicas e resultados espectroscópicos:. 6.3.1.1. 2-ciano-3-(1H-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP-19). H. N CN. O H3C. O. Fórmula Molecular: C 14 H 12 N 2 O. Massa Molecular: 224.258g/mol. •. Rendimento:. 84%.. Ponto. de. Fusão:. 162-165°C.. Rf:. 0.71. (benzeno:acetato de etila, 6:4) (UCHOA, 2004).. 6.3.1.2. 2-ciano-3-(5-bromo-indol-3-il-metileno)-acrilato de etila (LPSF/IP59). Br. H. N CN. O H3C. O. Fórmula Molecular: C 14 H 11 BrN 2 O. Massa Molecular: 303.154g/mol. •. Rendimento: 87%. Ponto de Fusão: 201-204°C. Razão de Frente: (nhexano:acetato de etila, 7:3).. 6.3.1.3. 3-(3,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-142).