Validação analítica do método de dosagem por HPLC de trans-desidrocrotonina aplicado a nanocápsulas convencionais e furtivas

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. HYWRE CESAR DE BRITO PINTO. VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO MÉTODO DE DOSAGEM POR HPLC DE trans-DESIDROCROTONINA APLICADO A NANOCÁPSULAS CONVENCIONAIS E FURTIVAS. RECIFE 2010.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. HYWRE CESAR DE BRITO PINTO. VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO MÉTODO DE DOSAGEM POR HPLC DE transDESIDROCROTONINA APLICADO A NANOCÁPSULAS CONVENCIONAIS E FURTIVAS. Dissertação de Mestrado defendida e aprovada, por decisão unânime, em 26 de fevereiro de 2010 pelo Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na área de concentração: Fármacos e Medicamentos, linha de pesquisa: Produção e Controle de Qualidade de Medicamentos.. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Nereide Stela Santos Magalhães Co-Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida M. Maciel. RECIFE 2010.

(3) Pinto, Hywre Cesar de Brito Validação analítica do método de dosagem por HPLC de trans-desidrocrotonina aplicado a nanocápsulas convencionais e furtivas / Hywre Cesar de Brito Pinto. – Recife: O Autor, 2010. 90 folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.. Inclui bibliografia, apêndice e anexos. 1. Trans-desidrocrotonina. 2. Validação de método analítico. 3. Cromatografia líquida de alta eficiência. 4. Sistemas de liberação de fármacos. I. Título.. 615.15 615.1901. CDU (2.ed.) CDD (20.ed.). UFPE CCS2010-111.

(4)

(5)

(6) Aos meus pais Idalmo e Edileuza e a minha irmã Hyanne, por me ensinarem os valores que carrego. As minhas tias Graça, Nazaré e Terezinha, pelo apoio ímpar em todos os momentos; apoio compartilhado também por todos os demais membros da minha família. E a, minha razão de existir, Olga, por fazer parte de minha vida. Dedico.

(7) AGRADECIMENTOS. Como toda jornada é difícil, a minha não seria diferente. Vim de longe, saí de casa para conquistar um sonho, ser alguém na vida e escrever meu nome nas estrelas. No entanto, não tendo acesso egoísta, não digo que essa conquista é apenas minha, mas ela é parte do trabalho e da dedicação de diferentes pessoas que cruzaram meu caminho nessa minha jornada que só está começando. Sendo assim agradeço a estas várias pessoas tão diferentes e especiais, pois sem elas eu não estaria aqui e não teria cumprido parte da minha missão. Agradeço primeiramente a Deus, pois foi Nele que depositei minha fé e esperança tanto nas horas difíceis quanto nas horas felizes. Agradeço aos meus adorados pais por terem me dado a vida, pela força, pelo carinho e pelo amor que une nossa família, agradeço também a minha irmã por ser minha amiga e a melhor madrinha do mundo. Aos meus avós, por me ensinarem os valores da vida. Aos meus familiares, tios, primos, por terem me dado o alicerce para que eu me tornasse uma pessoa melhor a cada dia. Agradeço, especialmente, a minha querida tia Graça, por ter me iluminado quando eu estava na escuridão, ela foi uma das principais responsáveis por eu estar aqui hoje. Também a tia Nazaré e a tia Terezinha, por me ampararem e me darem conselhos valiosos. Agradeço a minha querida orientadora Prof.ª Dra. Nereide Stela Magalhães, por ter me aberto as portas e por ter me dado a chance da minha vida. E a Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida M. Maciel pela tão valiosa t-DCTN. Também agradeço aos meus queridos e eternos professores da graduação em Farmácia da UFRN, Prof.ª Dina Maria de Araújo e o Prof. Marco Vinícius Monteiro Navarro. Agradeço aos meus ótimos professores do Mestrado da UFPE: A Prof.ª Dra. Beate e seus orientandos Cleiton e Julio Cesar, pelas dicas muito valiosas. Ao Prof. Dr. Pedro Rolim, por ter me dito o não que eu precisava. E ao Prof. Dr. Gildo Lima, por ter me ensinado que a excelência é algo que se aprende duramente. Agradeço, ainda, ao Professor Dr. Haroudo Sátiro Xavier, por ter me mostrado que a vida acadêmica tem seus encantos e que às vezes vale a pena não levá-la tão a sério. E a professora Ivone Batista da disciplina de Oncologia.

(8) por sua disciplina não ter o crédito que me restava, aprendi que há males que vem para o bem. Agradeço a Profª Dra. Maria Nelly Caetano por ter me aceitado na disciplina dela isso fez com que eu me aproximasse do amor da minha vida. Agradeço a Querida Professora Elba Lucia, pelas conversas que tanto clarearam minha vida. A minha querida professora Elizabete Chavez, por ter facilitado tanto minha vida, me ajudando com o HPLC, a Susan por ter me dado as primeiras dicas, ao Professor José Luiz pela autorização. Aos Funcionários do LIKA, Felipe, Rafael Padilha, Maria Helena, Kilma e “Seu” Otaviano pelo auxílio técnico; Agradeço meus colegas de mestrado e a equipe do SLC (Milena Sales, Mariane Lira, Waldenice Morais, Taciana, Islene, Isabela, Rafaela, Catarine, Rosana, Mirela, Marcileide, Jéssica, Rebeca, Larissa, André, Vinícius, Elizângela) e do LIKA (Ricardo, Adriana, Humberto, Natalia, “Mari” Cabrera, Luiza, Amanda, Lúcia, Sinara, Larissa, Camila, Roziana e Vanessa). A Família Ajinomoto por terem trazido o Lamén do Japão para o Brasil, sem o qual não estaria aqui! Agradeço também ao fomento que me foi dado pelo CNPq. Agradeço muitíssimo a Sra. Lúcia e Sr. Paulo Freitas, por me tratarem como um filho. E a Iris por me fazer sentir em casa. Agradeço também a todos aqueles que me ajudaram direta e indiretamente para a conclusão desse trabalho, pois plantei uma pequena semente com a ajuda de um milhão de jardineiros, desejo então que essa planta floresça para que eu possa dar um milhão de flores. E Finalmente e não menos importante, mas muitíssimo importante, agradeço a Olga Paula de Freitas, meu amor que tanto se esforçou e em momentos difíceis abdicou do nosso tempo juntos para que eu pudesse sorver a ciência. Meu muito obrigado!.

(9) "A mente que se abre a uma nova idéia, jamais voltará ao seu tamanho original" Albert Einstein.

(10) RESUMO. A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é um diterpeno presente nas cascas da espécie Croton cajucara. Benth. (Euphorbiaceae). sendo. atribuídas. atividades. hipoglicemiante,. antiinflamatória, antiestrogênica, antiulcerogênica e principalmente antitumoral, a qual demonstrou grande atividade contra Carcinoma de Erlich e Sarcoma 180. Apesar da expressiva atividade da t-DCTN, tem sido descrito o aumento do número de casos de hepatite tóxica relacionadas ao uso da infusão das cascas desta planta em altas concentrações. Os efeitos tóxicos da substância no organismo podem ser evitados pelo uso de formas farmacêuticas de liberação controlada. Nanocápsulas são preparações de diâmetro nanométrico que contêm uma fina camada polimérica envolvendo um núcleo líquido ou semisólido. Esses sistemas têm a capacidade de encapsular diferentes fármacos em seu interior, promovendo uma liberação controlada dentro de uma faixa terapêutica, reduzindo os picos plasmáticos, e, consequentemente, proporcionando uma melhoria de sua biodisponibilidade. Além disso, esses sistemas diminuem a toxicidade dos fármacos encapsulados e ainda, os protegem contra fatores externos melhorando a estabilidade do bioativo. Para caracterizar esses sistemas é de extrema importância quantificar o fármaco e determinar a sua eficiência de encapsulação nas nanopartículas. Desta forma, se faz necessária a utilização de metodologia validada, a fim de se alcançar resultados confiáveis. O objetivo desse trabalho foi preparar e caracterizar nanocápsulas contendo t-DCTN e validar um método de quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A validação do método cromatográfico seguiu os protocolos de validação preconizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e pela International Conference on Harmonisation. A validação da metodologia analítica se mostrou exata, precisa, sensível e reprodutível, sendo possível determinar quantitativamente a t-DCTN em nanocápsulas convencionais e furtivas. Os resultados revelaram que foi possível preparar nanocápsulas contendo 1,0 mg.mL-1 de t-DCTN com uma eficiência de encapsulação superior a 97% em ambos os sistemas poliméricos. Desta forma, foi possível obter nanocápsulas contendo t-DCTN e desenvolver um método analítico validado para quantificação do bioativo em nanocápsulas convencionais e furtivas de modo confiável. Palavras-chave: trans-desidrocrotonina. Validação de método analítico. Cromatografia líquida de alta eficiência. Sistemas de liberação de fármacos. Nanocápsulas. Câncer..

(11) ABSTRACT. Trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a diterpene current in the bark of Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) species, and assigned activities as hypoglycemic, anti-inflammatory, antiestrogenic, anti-ulcer and antitumor mainly, which showed high activity against Ehrlich carcinoma and Sarcoma 180. Despite the substantial activity of t-DCTN diterpene, has been described to increase the cases of toxic hepatitis related to the use of bark’s infusion of this plant in high concentrations. The toxic effects of the substance in the body can be avoided by using of controlled release dosage forms. Nanocapsules are formulations nanometric that contains a thin polymer layer surrounding a liquid core or semi-solid. These systems have presented the ability to encapsulate different drugs, promoting a controlled release within a therapeutic range, reducing the peak plasma levels, and thus providing an improved bioavailability. Moreover, these systems reduce the toxicity of encapsulated drugs and also protect them against external factors improving the stability of the bioactive. To characterize these systems, it is extremely important to quantify the drug and determine its nanoparticles encapsulation efficiency. Thus, it is necessary to use validated methodology, in order to achieve reliable results. The aim of this work was to prepare and characterize nanocapsules containing t-DCTN and validate a quantification method by high performance liquid chromatography (HPLC). The validation of chromatographic method followed the validation protocols recommended by the National Agency of Sanitary Surveillance and the International Conference on Harmonization. The validation of analytical methodology proved to be accurate, precise, sensitive and reproducible; it is possible to quantify the t-DCTN in conventional and stealth nanocapsules. The results showed that it was possible to prepare nanocapsules containing 1.0 mg.mL-1 t-DCTN with encapsulation efficiency above 97% in both polymer systems. Thus, it was possible to obtain nanocapsules containing t-DCTN and develop a validated analytical method to quantify the bioactive in conventional and stealth nanocapsules reliably. Keywords: trans-dehydrocrotonin. Analytical Method validation. High performance liquid chromatography. Drug delivery systems. Nanocapsules. Cancer..

(12) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1. Padrões de distribuição de Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) no Brasil.........21 Figura 2. Metabólitos secundários encontrados nas folhas e caule do Croton cajucara Benth.........................................................................................................................................23 Figura 3. Estrutura química (A) e estrutura tridimensional (B) da trans-desidrocrotonina. A barra mostra a escala em Angstrom..........................................................................................24 Figura 4. Perfil farmacocinético de formas farmacêuticas de liberação controlada (A) e convencionais (B).....................................................................................................................26 Figura 5. Fórmula estrutural do ácido polilático e do ácido poliglicólico................................29 Figura 6. Esquema de preparação de nanocápsulas por nanoprecipitação (A), emulsificação – difusão (B), emulsificação – coarcervação (C), emulsão múltipla (D), revestimento polimérico (E) e camada por camada (F)....................................................................................................31 Figura 7. Esquema mostrando as forças envolvidas na fase de formação das emulsões (A) e a acomodação do sistema durante a formação das nanocápsulas pela remoção do solvente (B).............................................................................................................................................32 Figura 8. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo positivo (na fração do tempo de retenção = 18 – 20 min.).......................................................................................73 Figura 9. Espectro de massa da t-DCTN (Peso molecular = 314) no modo negativo (na fração do tempo de retenção = 18 – 20 min.).......................................................................................73 .

(13) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Comparação entre os sistemas de liberação controlada de fármacos........................27.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AAA – Ácido acetil aleuritólico ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária CLAE/HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência DL50 – Dose letal que mata 50% dos indivíduos FDA – Food and Drug Administration ICH - International Conference on Harmonization LLOD – Limite de detecção / Lower limit of detection LLOQ – Limite de Quantificação / Lower limit of quantification NC – Nanocápsulas PEG – Polietilenoglicol PGA – Polímero de ácido glicólico pH – Potencial hidrogeniônico PLA – Polímero de ácido láctico PLGA – Copolímero de ácido láctico e glicólico SFM – Sistema fagocitário mononuclear t-CTN – trans-crotonina t-DCTN – trans-desidrocrotonina TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa UFPA – Universidade Federal do Pará UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro UV – Espectrofotometria em ultravioleta.

(15) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 15. 2. OBJETIVOS.............................................................................................................. 19. 2.1. GERAIS........................................................................................................................ 19. 2.2. ESPECÍFICOS................................................................................................................ 19. 3. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................21. 3.1. TRANS-DESIDROCROTONINA......................................................................................... 3.1.1. Fitoquímica................................................................................................................ 21. 3.1.2. Química...................................................................................................................... 23. 3.2. NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA............................................................................ 25. 3.2.1. Sistemas Nanoparticulados Poliméricos....................................................................27. 21. 3.2.1.1 Nanocápsulas..............................................................................................................30 3.2.1.2 Métodos de preparação.............................................................................................. 30 3.2.1.3 Métodos de caracterização......................................................................................... 33 3.3. VALIDAÇÃO ANALÍTICA............................................................................................... 34. 4. CONCLUSÕES..........................................................................................................38. 5. PERSPECTIVAS....................................................................................................... 40. REFERÊNCIAS....................................................................................................................... 42 APÊNDICE A – ARTIGO....................................................................................................... 51 ANEXO A – ESPECTRO DE MASSA DA t-DCTN.............................................................. 73 ANEXO B – GUIA PARA AUTORES................................................................................... 74.

(16) 14. INTRODUÇÃO.

(17) 15. 1 INTRODUÇÃO. O gênero Croton é o segundo maior da família das Euforbiáceas. Dentre as espécies desse gênero se destaca a Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecida por “Sacaca”. Essa espécie é originária da região amazônica, porém não é exclusiva do território brasileiro. A infusão das cascas do caule da C. cajucara é amplamente utilizada na medicina popular, principalmente no estado do Pará, contra diversas afecções como, diarréia, malária, febre, problemas estomacais, inflamações do fígado, rins, vesícula, no controle do diabetes e de índices elevados de colesterol. Por outro lado, as folhas são utilizadas para auxílio da digestão (CAMPOS et al., 2002; MACIEL et al., 2002), onde são preparadas infusões, decoctos ou cápsulas a partir das cascas do caule da planta. A triagem dos compostos dessa planta atenta para a classe dos diterpenos do grupo dos clerodanos, além de flavonóides e esteróides (MACIEL et al., 2000). Dentre os vários compostos da classe dos diterpenos pertencentes à espécie C. cajucara destacam-se como o composto mais ativo a trans-desidrocrotonina (t-DCTN). A tDCTN apresenta atividades hipoglicemiante, hipolipidêmica e antiinflamatória (SILVA et al., 2001), antiestrogênica, antiulcerogênica (MELO et al., 2003) e principalmente antitumoral (GRYNBERG et al., 1999), o que demonstra um interesse maior de estudo dessa substância. Na atividade antitumoral, a t-DCTN demonstra grande atividade contra Carcinoma de Erlich e Sarcoma 180 nas doses de 80 e 120 mg/kg (CARVALHO et al., 1996; GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et al., 2000). A citotoxicidade contra o Carcinoma de Erlich é de 16 mM para t-DCTN, bem eficiente quando comparado a outros metabólitos que tem sua atividade antitumoral já conhecida, como é o caso do flavonóide Quercetina, que tem citotoxicidade de 44 mM, todos em 48 horas de cultura celular (MACIEL et al., 2000). Uma atividade significante de TNF-α foi detectada sugerindo assim uma ação de aumento na função imune (GRYNBERG et al., 1999). Apesar da expressiva atividade da t-DCTN, tem sido descrito o aumento do número de casos de usuários do Norte-Nordeste que desenvolveram hepatite tóxica pelo uso de folhas em concentrações elevadas por longos períodos de tempo (MACIEL et al., 2002; VEIGA JR; PINTO; MACIEL, 2005). Os efeitos tóxicos induzidos pela t-DCTN podem ser evitados pelo uso de formas farmacêuticas de liberação controlada que permitem a manutenção da concentração.

(18) 16. plasmática na faixa terapêutica, alterando sua biodisponibilidade (BRANNON-PEPPAS; BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003). A nanotecnologia farmacêutica tem como um dos objetivos desenvolver sistemas coloidais de liberação controlada para a veiculação de agentes ativos e vacinas na forma de nanodispositivos, que podem oferecer entre outras vantagens um melhor controle da administração de fármacos, atribuída pelo aumento da eficácia terapêutica; liberação progressiva e controlada do fármaco; manutenção de níveis plasmáticos do fármaco no sítio de ação em concentrações terapêuticas; diminuição da instabilidade e decomposição dos fármacos sensíveis; redução da flutuação da concentração plasmática ou picos plasmáticos com expressiva diminuição da toxicidade ou efeitos adversos; possibilidade de direcionamento a alvos específicos como, por exemplo, tumores ou tecidos; possibilidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos diversos sistemas; menor necessidade de administrações e quantidade de fármaco por administração; otimização do uso do fármaco culminando em uma maior conveniência para o paciente, aumento da adesão do paciente ao tratamento e redução global dos custos à saúde (BRANNON-PEPPAS; BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003). Dentre os sistemas de liberação controlada, encontram-se as nanocápsulas. Trata-se de sistemas que possuem uma fina camada polimérica envolvendo um núcleo líquido ou semi-sólido. Esse núcleo pode ser de natureza oleosa ou aquosa, dependendo das características que se quer proporcionar ao núcleo para uma melhor solubilização de fármacos lipofílicos ou hidrofílicos, respectivamente. As nanocápsulas se destacam por serem formas farmacêuticas versáteis, possuindo diversas vantagens sobre outros sistemas de liberação como: alta eficiência de encapsulação, isso advindo da alta solubilidade do fármaco no núcleo delineado; baixo conteúdo polimérico, diminuindo com isso os custos ao se utilizar os polímeros; maior proteção do fármaco, devido à degradação do polímero ocorrer apenas por via hidrofílica e do núcleo ser protegido do conteúdo externo por essa camada polimérica é que o fármaco se torna mais protegido de fatores externos como luz (fotólise), pH, enzimas, agentes oxidantes e outros agentes agressivos ao princípio ativo; redução da irritação tecidual, devido ao uso de polímeros biocompatíveis (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009). Entre as técnicas de preparação das nanocápsulas, a desenvolvida por Fessi (FESSI et al., 1989) difere das demais técnicas por possuir um procedimento muito simples de preparação, ausência de reações químicas durante a formação, reprodutível, adequação do.

(19) 17. método aos diversos tipos de polímeros, rápido, econômico e facilmente transposto para escala industrial, sendo uma técnica importante para indústria farmacêutica, sendo possível encontrar produtos comerciais contendo nanocápsulas na indústria nacional. O método baseiase na emulsificação espontânea de uma solução orgânica contendo solvente orgânico, polímeros pré-formados, o óleo e a substância ativa que será vertida cuidadosamente numa fase aquosa constituída de tampão fosfato. A escolha do solvente orgânico se dá pela miscibilidade em água e a facilidade de remoção por evaporação (LEGRAND et al., 2007). O uso de surfactantes ou copolímeros com características anfifílicas permite uma melhor estabilidade física das suspensões formadas quando estocadas por longos períodos de tempo, evitando a agregação (MOSQUEIRA et al., 2001). As nanopartículas, com diâmetro médio entre 150 a 250 nm, formam-se imediatamente quando se verte a fase orgânica na fase aquosa; isso se deve a rápida difusão do solvente na água (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008). Caracterizações físico-químicas nos sistemas desenvolvidos são fatores importantes para a melhoria das características dessas formulações farmacêuticas. Dentre os parâmetros físico-químicos utilizados para caracterização, estão o doseamento e a eficiência de encapsulação, ambos por meio de validação analítica do método de quantificação. O método de doseamento por espectrofotometria por ultravioleta não permite o medição inequívoca da quantidade de fármaco contida no interior dos sistemas de liberação, devido à interferência dos constituintes da formulação. Com isso, a validação por cromatografia líquida de alta eficiência é imprescindível nesses sistemas. O objetivo desse trabalho foi preparar e caracterizar nanocápsulas contendo t-DCTN e validar um método de quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A validação do método cromatográfico seguiu os protocolos de validação preconizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e pela International Conference on Harmonisation. A validação da metodologia analítica se mostrou exata, precisa, sensível e reprodutível, sendo possível determinar quantitativamente a t-DCTN em nanocápsulas convencionais e furtivas. Os resultados revelaram que foi possível preparar nanocápsulas contendo 1,0 mg.mL1. de t-DCTN com uma eficiência de encapsulação superior a 97% em ambos os sistemas. poliméricos. Dessa forma, obteve-se nanocápsulas contendo t-DCTN e desenvolver um método analítico validado para quantificação do bioativo nos sistemas convencionais e furtivos de modo confiável..

(20) 18. OBJETIVOS.

(21) 19. 2 OBJETIVOS. 2.1 GERAIS. Desenvolver e validar um método analítico de doseamento de trans-desidrocrotonina em nanocápsulas convencionais e furtivas que apresente precisão, exatidão, linearidade, especificidade e robustez.. 2.2 ESPECÍFICOS. a. Desenvolver e validar um método analítico de doseamento de trans-desidrocrotonina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência; b. Desenvolver nanocápsulas convencionais e furtivas contendo trans-desidrocrotonina; c. Avaliar a interferência dos constituintes da formulação através do método validado; d. Efetuar o doseamento de trans-desidrocrotonina em nanocápsulas utilizando o método cromatográfico validado; e. Determinar a eficiência de encapsulação de trans-desidrocrotonina em nanocápsulas..

(22) 20. REVISÃO DA LITERATURA.

(23) 21. 3 REVISÃO DA LITERATURA. 3.1 TRANS-DESIDROCROTONINA. 3.1.1 Fitoquímica. O gênero Croton é o segundo maior da família das Euforbiáceas. Dentre as espécies desse gênero, se destaca a Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecida por “Sacaca”. Essa espécie é originária da região amazônica, porém não é exclusiva do território brasileiro (Figura 1). Classificada como megatérmica, por ser uma espécie de maior representatividade em regiões tropicais, ela é facilmente encontrada também na Venezuela, Peru e Bolívia e tem como área de distribuição as bordas das florestas de terra firme (CARUSO; CORDEIRO, 2008).. Figura 1. Padrões de distribuição de Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae) no Brasil (CARUSO; CORDEIRO, 2008)..

(24) 22. A infusão das cascas do caule da C. cajucara é amplamente utilizada na medicina popular, principalmente no estado do Pará, contra diversas afecções como, diarréia, malária, febre, problemas estomacais, inflamações do fígado, rins, vesícula, no controle do diabetes e de índices elevados de colesterol; como também, as folhas são utilizadas para auxílio da digestão (MACIEL et al., 2000). Além de infusões, são preparadas decoctos ou cápsulas a partir das cascas do caule da planta. A triagem Fitoquímica dessa planta permite observar a classe dos diterpenos do grupo dos clerodanos, além de flavonóides e esteróides (CAMPOS et al., 2002; MACIEL et al., 2002). A classe dos metabólitos secundários diterpenos tem como função primordial na planta a proteção contra ataque de insetos e fungos (COLE et al., 1991). Recentemente, temse aumentado o interesse pela classe dos diterpenos clerodanos, que incluem mais de 800 compostos de importância biológica (HAGIWARA; INOME; UDA, 1995). Os diterpenos clerodanos são encontrados em um importante número de espécies e têm-se intensificado seus estudos devido as suas diversas funções biológicos, tais como, inseticida, antifúngica, antitumoral (MCCHESNEY; CLARK; SILVEIRA, 1991; SIDDIQUI; MUNESADA; SUGA, 1992; COLL; TANDRÓN, 2005), antiinflamatória (ICHIHARA et al., 1992; CARVALHO et al., 1996), antiestrogênica (CARVALHO et al., 1996), hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997), antiulcerogênica (KITAZAWA; SATO; TAKAHASHI, 1980; HIRUMA-LIMA et al., 1999), alucinógena (TEKSIN et al., 2009). No entanto, é também atribuída a classe do clerodanos hepatotoxicidade e, devido a essa propriedade, alguns produtos derivados de plantas com altos teores desses metabólitos mantiveram seu uso restringido ou foram proibidas, como é o caso do gênero Teucrin sp., que está proibida na França desde 1992 (MOSTEFA-KARA et al., 1992). Dentre os vários compostos da classe dos diterpenos pertencentes à espécie Croton cajucara Benth, destacam-se a trans-desidrocrotonina (t-DCTN), trans-crotonina (t-CTN), cis-cajucarina B, cajucarina A, cajucarinolida, trans-cajucarina B e sacacarina, sendo o clerodano majoritário a t-DCTN, podendo ser encontrada em um teor de 1,4% nas cascas de plantas, na faixa de 4 a 6 anos de idade, enquanto que, em plantas de 3 anos, esse teor é de apenas 0,26%. Isso indica fortemente que esse metabólito secundário está ligado à maturidade do vegetal. Em plantas com até 18 meses, a t-DCTN não foi encontrada, sendo nessa idade o metabólito majoritário o triterpeno ácido acetil aleuritólico (AAA) (MACIEL et al., 2000)..

(25) 23. A t-DCTN está presente, além do caule, nas raízes e nas folhas; porém ainda não foi esclarecido o teor da molécula nessas outras partes da planta. Na triagem feita a partir das folhas da Croton cajucara Benth, encontraram-se três esteróides: β-sitosterol, stigmasterol e sotosterol-3,o,β-glucosideo; dois flavonóides: Kaempferol 3,4,7 trimetil éter e Kaempferol 3,7 dimetil éter e o clerodano Cajucarinolide (Figura 2) (MACIEL et al., 2000).. Figura 2. Metabólitos secundários encontrados nas folhas e caule do Croton cajucara Benth (MACIEL et al., 2000).. 3.1.2 Química. A espécie química (2'R,3R,4a'R,5R,8a'S)-5-(3-furil)-2',5'-dimetil-4,4',4a',5,8',8a'hexahidro-2'H-espiro[furano-3,1'-naftaleno]-2,7'(3'H)-diona. (ROYAL. SOCIETY. OF. CHEMISTRY, 2010) ou simplesmente trans-desidrocrotonina possui uma estrutura química e uma estrutura tridimensional que está representada na Figura 3. A t-DCTN é o mais ativo composto, dentre os isolados da Croton cajucara Benth, sendo atribuídas a esse diterpeno as atividades de hipoglicemiante, hipolipidêmica e antiinflamatória (SILVA et al., 2001), antiestrogênica, antiulcerogênica (MELO et al., 2003) e principalmente antitumoral (GRYNBERG et al., 1999), o que demonstra um maior interesse nessa substância..

(26) 24. Figura 3. Estrutura química (A) e estrutura tridimensional (B) da trans-desidrocrotonina. A barra mostra a escala em Angstrom (THOMPSON, 2004).. Quanto à atividade antiulcerogênica, alguns autores supõem que sua atividade pode ser de citoproteção ou através da supressão da secreção do ácido gástrico (HCl) e aumento da produção de prostaglandinas E2 (HIRUMA-LIMA et al., 1999), o que sugere uma ação na bioquímica das ciclooxigenases (MELO et al., 2003). A DL50 atribuída a t-DCTN é de 555 mg/kg, sendo considerada um composto seguro quando administrada por via oral por um curto período de tempo (SOUZA BRITO et al., 1998) e mostrou atividade hipolipidêmica na dose de 50 mg/kg e hipoglicêmica na dose de 25 mg/kg (CARVALHO et al., 1996; FARIAS et al., 1997). Na atividade antitumoral, a t-DCTN demonstrou grande atividade contra Sarcoma 180 e Carcinoma de Erlich nas doses de 80 e 120 mg/kg, respectivamente (CARVALHO et al., 1996; GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et al., 2000). A citotoxicidade contra o Carcinoma de Erlich foi de 16 mM para t-DCTN, bem eficiente quando comparado a outros metabólitos que tem sua atividade antitumoral já conhecida, como é o caso do flavonóide Quercetina, que tem citotoxicidade de 44 mM, todos em 48 horas de cultura celular (MACIEL et al., 2000). Uma atividade significante de TNF-α foi detectada, demonstrando assim uma ação de aumento na função imune (GRYNBERG et al., 1999). O uso de folhas em concentrações elevadas e em tratamentos prolongados tem vitimado usuários no Norte e Sudeste do país em consequência de uma hepatite tóxica..

(27) 25. Muitos desses usuários fazem uso da planta sem recomendação e desconhecem completamente os seus efeitos colaterais. No Hospital Universitário da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), há um relato de falecimento por causa hepática, em 2001 e em Belém/PA, no período de 1990, muitos casos de hepatite tóxica foram registrados; ocorrendo relatos populares de falecimentos (MACIEL et al., 2002). O Hospital Universitário da Universidade Federal do Pará (UFPA) possui um histórico significativo de pessoas vitimadas por doenças do fígado, as quais faziam uso indevido das folhas em dietas de emagrecimento (VEIGA JR; PINTO; MACIEL, 2005). Estudo realizado em pacientes da Região Amazônica, que faziam uso da sacaca registrou 25 casos de hepatotoxicidade atribuídos à sacaca, tendo sido evidenciado que 21 pessoas tiveram hepatite aguda, três de hepatite crônica e uma hepatite fulminante (PEREIRA SOARES, 2004). Contrariando os relatos toxicológicos descritos, outros estudos de atividade e toxicidade não descreveram os mesmos adversos. Essa contradição é explicada pela utilização da planta em períodos de tempo e dosagem menores daquelas observadas no uso popular. O estudo sugere que o uso indevido da planta, principalmente das folhas, em tratamento prolongado (chás ou cápsulas) é o responsável pela hepatite tóxica atribuída a sacaca (MACIEL et al., 2002). Através de um estudo multidisciplinar, esse grupo de pesquisa, isolou das cascas do caule, e testou em ensaios farmacológicos pré-clínicos, a substância majoritária clerodânica trans-desidrocrotonina (t-DCTN). Outros metabólitos secundários minoritários, todos de natureza química clerodânica isolados das cascas do caule de Croton cajucara, também foram testados e mostraram serem menos ativos do que a t-DCTN (MACIEL et al., 2000).. 3.2 NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA. A Nanotecnologia Farmacêutica é uma ciência multidisciplinar que envolve áreas como a física, química, matemática, farmacologia, e que se preocupa em buscar soluções tecnológicas para veicular fármacos ao sítio de ação de modo eficiente. Ela ainda se preocupa.

(28) 26. em funcionalizar materiais que se localizam na escala nanométrica para alcançar objetivos como a saúde do paciente (BRANNON-PEPPAS; BIRNBAUM; KOSMALA, 1997). A Nanotecnologia Farmacêutica tem como um dos objetivos desenvolver sistemas coloidais de liberação controlada para a veiculação de agentes ativos e vacinas na forma de nanodispositivos, que podem oferecer, entre outras vantagens, um melhor controle da administração de fármacos. Isso é atribuído pelo aumento da eficácia terapêutica; liberação progressiva e controlada do fármaco; manutenção de níveis plasmáticos do fármaco no sítio de ação em concentrações terapêuticas; diminuição da instabilidade e decomposição dos fármacos sensíveis; redução da flutuação da concentração plasmática ou picos plasmáticos (Figura 4) com expressiva diminuição da toxicidade ou efeitos adversos; possibilidade de direcionamento a alvos específicos como, por exemplo, tumores ou tecidos; possibilidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos diversos sistemas; menor necessidade de administrações e quantidade de fármaco por administração; otimização do uso do fármaco culminando em uma maior conveniência para o paciente, aumento da adesão do paciente ao tratamento, promovendo uma redução dos custos à saúde (BRANNON-PEPPAS; BIRNBAUM; KOSMALA, 1997; DUNNE et al., 2003).. Figura 4. Perfil farmacocinético de formas farmacêuticas de liberação controlada (A) e convencionais (B).. Dentre os sistemas de liberação controlada, existem aqueles de escala nanométrica os quais apresentam características bem distintas quanto à natureza dos constituintes e a disposição do fármaco na partícula (Tabela 1). Para fármacos lipofílicos, é comum a.

(29) 27. distribuição homogênea na matriz polimérica de nanoesferas. Em nanocápsulas contendo núcleo oleoso, o fármaco lipofílico se distribui facilmente no óleo. Mas em lipossomas, a preferência é pela bicamada lipídica. Tabela 1. Comparação entre os sistemas de liberação controlada de fármacos.. Sistema de Liberação Nanocápsulas. Nanoesferas. Característica Principal. Fina camada polimérica envolvendo núcleo líquido ou semi-sólido. Massa sólida polímeros. Disposição do fármaco. Na sua maioria, dissolvido no núcleo. Disperso na polimérica. Vantagens. Desvantagens. Lipossomas de. Vesículas aquosas compostas por uma ou mais bicamadas de fosfolipídios. matriz. Depende da solubilidade do fármaco: lipofílico na bicamada lipídica e hidrofílico no compartimento interno.. Liberação mais gradual do fármaco. Possibilidade de encapsular fármacos lipofílicos e hidrofílicos. Possui características mais próximas das membranas biológicas. Utilização de solventes orgânicos no método de preparação. Limitação da dispersão da droga apenas a matriz polimérica; Uso de solventes orgânicos.. Sensibilidade dos fosfolipídios da membrana e liberação rápida da droga pela bicamada. Fonte: NISHIOKA; YOSHINO, 2001; VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009; GRIT et al., 1989; TORCHILIN, 2007. 3.2.1 Sistemas Nanoparticulados Poliméricos. As nanopartículas poliméricas têm sido extensivamente estudadas como carreadores de drogas no campo farmacêutico. Uma das características principais das nanopartículas é apresentar o tamanho variando entre 1 a 1000 nm, embora, geralmente, sejam obtidas partículas com diâmetro variando entre 100 a 500 nm. As nanopartículas são consideradas importantes sistemas para liberação de fármacos devido às vantagens como a capacidade de liberação controlada do princípio ativo, possibilidade de liberação no sítio de ação, esse direcionamento do fármaco é a grande promessa de diminuição dos efeitos adversos dos medicamentos pela utilização de quantidades menores do princípio ativo. Outras vantagens pertencentes aos sistemas nanoparticulados são: biodegradabilidade, não permitindo a acumulação no organismo de metabólitos secundários; uma menor quantidade de polímero em.

(30) 28. sua constituição diminuindo os custos de utilização de polímeros com alto grau de pureza; aumento dos benefícios terapêuticos por apresentar uma menor quantidade de administrações e, com isso, uma maior adesão do paciente ao tratamento (KREUTER, 1991; 1994). O progresso na química de polímeros foi determinante para o surgimento de nanopartículas com propriedades físico-químicas bem definidas que se aproximam dos objetivos da vetorização de fármacos (BRAUNECKER; MATYJASZEWSKI, 2007). Apesar dos avanços na química dos polímeros, existe somente um número limitado de polímeros que podem ser utilizados no desenvolvimento dessas formas farmacêuticas. Isso se deve ao fato de que, para ser utilizado in vivo, o polímero precisa cumprir alguns requisitos. Entre eles estão: ser biodegradável, poder ser removido completamente dos sistemas biológicos, possibilitando repetidas administrações sem o risco de acúmulo no organismo; atóxico e não-imunogênico. O polímero e seus metabólitos não podem agredir o organismo ou produzir reações de anafilaxia e, por fim, deve apresentar propriedades bem definidas e alto grau de pureza, para que não prejudique as características das nanopartículas ou afete os objetivos de vetorização dos fármacos (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009). Muitas vezes, devido a problemas de pureza, de necessidade de reticulação polimérica ou de incompatibilidades com os fármacos, no que diz respeito às limitações dos polímeros naturais, polímeros sintéticos biodegradáveis vêm sendo bastante utilizados para o encapsulamento de fármacos nas últimas décadas, alguns poucos são aceitos pelas autoridades sanitárias para a administração parenteral, outros são apenas liberados para uso tópico ou em preparações orais (HANS; LOWMAN, 2002). Portanto, apenas alguns poucos polímeros podem ser utilizados como recurso para delineamento de nanocápsulas. Os poliésteres como o poliácido láctico (PLA), o poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros (PLGA) (Figura 5) despertam grande interesse devido à excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade. O uso do PLGA é bastante difundido em processos de micro e nanoencapsulamento (SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000; BIRNBAUM; BRANNON-PEPPAS, 2003). Os sistemas particulados produzidos podem ser delineados para um perfil de liberação específico pela modificação de propriedades (como o grau de cristalinidade) dos polímeros, das razões monoméricas e condições de polimerização, produzindo-se sistemas de liberação para meses e até anos (BRANNON-PEPPAS, 1995). Por exemplo, pode-se aumentar a taxa de degradação do sistema, aumentando a razão de PLA (hidrofóbico) em relação à de PGA (hidrofílico) (HANS; LOWMAN, 2002)..

(31) 29. Monômero de ácido glicólico. Monômero de ácido láctico. Figura 5. Fórmula estrutural do ácido polilático e do ácido poliglicólico (Adaptado de ATHANASIOU; NIEDERAUER; AGRAWAL, 1996).. Na obtenção desses sistemas nanoparticulados, podem ser utilizados polímeros naturais (proteínas ou polissacarídeos) e sintéticos, como polímeros simples, copolímeros, blendas (mistura física de polímeros). Durante a última década, um grande número de polímeros surgiu em consequência da necessidade de alterar as características de superfície dos sistemas poliméricos ou modificar as interações com proteínas do corpo ou com o sistema imunológico. O desenvolvimento de polímeros, principalmente os de Polietilenoglicol (PEG), se mostrou eficientes como estabilizantes, suprimindo a necessidade de surfactante adicional (DES RIEUX et al., 2006). O PEG é utilizado por ser biodegradável, biocompatível, não-tóxico, flexível e hidrofílico, tendo sido autorizado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o uso interno no organismo humano (BRANNON-PEPPAS, 1995; KUMAR; RAVIKUMAR; DOMB, 2001). A incorporação do PEG torna esses polímeros mais hidrofílicos, o que permite diminuir o reconhecimento pelas opsoninas e captura pelos macrófagos do organismo. Essas partículas são, então, denominadas “furtivas” (Stealth®) ou de “longa circulação”. Trabalhos recentes mostram a habilidade de micropartículas e nanopartículas de PEG-PLA e PEGPLGA de perdurarem o tempo na circulação sanguínea e de melhorarem a estabilidade no trato gastrintestinal (GREF et al., 2001)..

(32) 30. 3.2.1.1 Nanocápsulas. Nanocápsulas são partículas de diâmetro nanométrico que contêm uma fina camada polimérica envolvendo um núcleo líquido ou semisólido. Esses sistemas têm a capacidade de encapsular diferentes fármacos em seu interior, dependendo da natureza do núcleo. Inicialmente, as nanocápsulas possuíam um núcleo composto de óleo ou misturas oleosas; mas, com o desenvolvimento tecnológico, é possível, atualmente, produzir nanocápsulas com núcleo aquoso e, dessa forma, melhor solubilizar fármacos mais hidrofílicos (VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009). As nanocápsulas são formas farmacêuticas versáteis (no delineamento de formas farmacêuticas), pois o núcleo pode se adequar às necessidades de solubilidade dos fármacos. Outra vantagem de sistemas nanocápsulas, como carreadores de fármacos, é a alta eficiência de encapsulação, otimizada pela solubilidade do núcleo, baixo conteúdo de polímero comparado a outros sistemas nanoparticulados; além da proteção do fármaco de fatores de degradação como pH, luz e redução da irritação tecidual devido à cobertura polimérica (TORCHILIN, 2007).. 3.2.1.2 Métodos de preparação. Os principais métodos de preparação das nanocápsulas estão esquematizados abaixo (Figura 6). Atualmente, existem seis métodos de preparação de nanocápsulas: nanoprecipitação,. emulsificação-difusão,. revestimento polimérico e camada por camada.. emulsão-coarcervação,. emulsão. múltipla,.

(33) 31. Figura 6. Esquema de preparação de nanocápsulas por nanoprecipitação (A), emulsificação – difusão (B), emulsificação – coarcervação (C), emulsão múltipla (D), revestimento polimérico (E) e camada por camada (F) (adaptado de MORA-HUERTAS et al., 2010).. O método de preparação das nanocápsulas se baseia em duas principais etapas: a primeira é a preparação de um sistema emulsionado, que normalmente determina o tamanho final da nanopartícula; e a segunda fase é a formação propriamente dita na nanocápsulas. Essa última fase, que normalmente leva o nome do método, pode se basear na precipitação, geleificação dos polímeros, ou ainda, na polimerização de monômeros (Figura 7). Em alguns casos, a formação das nanopartículas ocorre ao mesmo tempo em que a emulsificação do sistema. Poucos métodos não requerem uma emulsificação anterior; esses métodos se baseiam na espontânea precipitação do polímero ou pela formação de nanogéis ou complexos polieletrólitos (MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010)..

(34) 32. Figura 7. Esquema mostrando as forças envolvidas na fase de formação das emulsões (A) e a acomodação do sistema durante a formação das nanocápsulas pela remoção do solvente (B) (Adaptado de VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009).. No método de extração de solvente, a remoção da solução orgânica promove a formação da nanopartícula. Existem diversas formas de extrair a fase orgânica que dissolve o polímero, entre elas está a: rotaevaporação do solvente, rápida difusão do mesmo para o solvente aquoso e o método de salting out. O que vai determinar se haverá um núcleo ou não é a adição de óleo a solução polimérica ou a formação de uma emulsão múltipla. Essa última produziria nanocápsulas com um núcleo aquoso, mas possuem a desvantagem de produzir nanocápsulas de tamanho maior (BILATI; ALLÉMANN; DOELKER, 2005). As nanocápsulas desenvolvidas por Fessi (FESSI et al., 1989) diferem das demais por um procedimento simples de preparação de nanopartículas. Além de simples, é reprodutível, rápido, econômico e a facilidade de transposição para escala industrial. A técnica baseia-se na emulsificação espontânea de uma solução orgânica contendo polímeros pré-formados e óleo que irá compor o núcleo, e uma solução aquosa. A escolha do solvente se dá pela miscibilidade em água e a facilidade de remoção por evaporação. Com isso, é frequente a escolha da acetona como solvente orgânico nesse método (LEGRAND et al., 2007). As nanocápsulas formam-se imediatamente quando se verte a fase orgânica na fase aquosa, isso se deve a rápida difusão da acetona na água. Nanocápsulas formadas por esse método geralmente possuem tamanho médio entre 150 a 250 nanômetros com uma distribuição Gaussiana estreita (baixo índice de polidispersão). O uso de surfactantes ou copolímeros com características anfifílicas permite uma melhor estabilidade física das suspensões formadas quando estocadas por longos períodos de tempo, evitando a agregação (MOSQUEIRA et al., 2001)..

(35) 33. Outras vantagens desse método de nanoprecipitação incluem, por exemplo, a ausência de reações químicas, quando comparado com outros métodos como a polimerização interfacial, adequação de vários tipos polímeros ao método. Mas a utilização de solventes orgânicos, ainda que completamente retirado pela rotaevaporação, continua sendo a principal limitação do método (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008).. 3.2.1.3 Métodos de caracterização. Caracterizações físico-químicas nos sistemas desenvolvidos são fatores importantes para a melhoria das características das formulações farmacêuticas. Dentre os parâmetros físico-químicos utilizados para caracterização, estão o doseamento e a eficiência de encapsulação. A eficiência de encapsulação e a quantificação do fármaco podem ser determinadas por dissolução do sistema polimérico numa solução orgânica adequada para que seja possível a extração do conteúdo das nanocápsulas. Solventes, tais como diclorometano, acetonitrila, metanol e tetra-hidrofurano são comumente utilizados na extração da molécula bioativa contida nas nanocápsulas poliméricas. Contudo, metodologias para uma quantificação adequada do fármaco encapsulado são desenvolvidas através de técnicas como, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou espectrofotometria por ultravioleta (UV). Mas quando a formulação em questão são nanocápsulas o método espectrofotométrico pode não ser o mais adequado. Isso ocorre devido à interferência dos componentes da formulação no mesmo comprimento de onda de absorção máxima do fármaco e, com isso, métodos por HPLC/CLAE se tornam mais adequados. Para se ter uma metodologia confiável, é importante que se faça validação por cromatografia líquida de alta eficiência. Desse modo, consegue-se determinar corretamente parâmetros quantitativos, como, por exemplo, a eficiência de encapsulação do processo (SANTOS et al., 2005)..

(36) 34. 3.3 VALIDAÇÃO ANALÍTICA. Para o desenvolvimento de uma validação analítica, se faz necessário cumprir certos requisitos convenientemente descritos no Guia de Validação de Procedimentos Analíticos. A linearidade é uma delas; ela consiste na comprovação de que um procedimento analítico habilitado pode obter resultados diretamente proporcionais a concentração da substância à ser analisada numa amostra (ICH, 1996). A linearidade pode ser determinada diretamente pela substância a ser analisada por diluições de uma solução padrão ou por pesagens isoladas de misturas sintéticas dos componentes (ICH, 1996). No caso de haver uma correlação linear, os dados devem ser avaliados através de métodos estatísticos e, nos casos em que não houver, a amostra deve ser descrita por uma função adequada à concentração da substância analisada na amostra. Para o estabelecimento da linearidade, é recomendada a análise de pelo menos cinco níveis de concentrações diferentes. O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser 0,99 (ANVISA, 2002; BAKSHI; SINGH, 2003). Outro importante fator é a especificidade de uma amostra. Trata-se de um termo analítico que consiste na capacidade de avaliar de forma precisa uma substância na presença de outros componentes que pode eventualmente compartilhar de um mesmo meio numa amostra. Esses podem ser: impurezas, produtos de degradação, matriz ou simplesmente os componentes da formulação. Tal definição tem como base a identificação, de modo inequívoco, do analito em questão (LI, 2008). A exatidão de um procedimento analítico expressa o grau de concordância entre o valor que é aceito como verdadeiro ou um valor de referência aceito. Isso às vezes é chamado de rigor e, é normalmente esse valor é expresso em porcentagem. Precisão é um procedimento analítico que expressa o grau de concordância entre uma série de medições obtidas por uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Para se considerar a precisão de um método, são necessárias três determinações: a repetitibilidade que expressa à precisão nas condições de funcionamento em um curto espaço de tempo; a precisão intermediária, que é demonstrada em situações distintas como: dias diferentes, analistas diferentes e equipamentos diferentes; e, por ultimo, a reprodutibilidade, que exprime, sobretudo, a precisão entre laboratórios, sendo esse último mais utilizado em validações que se pretende indexar em farmacopéias.

(37) 35. (DEJAEGHER; VANDER HEYDEN, 2006). A precisão de um método analítico pode ser expressa como o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma série de medidas. A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo ou coeficiente de variação, segundo a fórmula 1, DPR. x100. (1). em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada. O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5%. O limite de detecção (LD) de um método analítico consiste em um processo individual de análises, onde se determina a menor quantidade da substância analisada que pode ser detectada. No entanto, ela pode não ser quantificada. O limite de quantificação (LQ) consiste na detecção precisa e exata da menor quantidade de uma substância que se encontra numa amostra. Esse método é empregado para ensaios quantitativos em que há baixos níveis de compostos nas matrizes. E é utilizado para determinação de impurezas e produtos de degradação que venham a estar na amostra. Os limites de detecção e de quantificação são expressos pelas equações 2 e 3 abaixo, onde “σ” é o desvio padrão da resposta e “S” é o slope, ou inclinação da curva de calibração (RIBANI et al., 2004). LD. 3,3. (2). 10. (3). A robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do método e depende do tipo de procedimento em estudo. Deve expressar a confiabilidade da análise quando submetido a variações deliberadas nos parâmetros do método, se as medições são susceptíveis a variações nas condições analíticas. As condições analíticas devem ser adequadamente controladas ou uma declaração de precaução deve ser incluída no procedimento. Exemplos de variações típicas são: a estabilidade das soluções analíticas, tempo de extração, a influencia do pH na fase móvel, diferentes colunas (lotes e/ ou fornecedores), influencia na composição da fase móvel, temperatura, entre outras (ICH, 1996)..

(38) 36. Todos os dados devem utilizar testes estatísticos que comprovem a fiabilidade dos dados, no nível de confiança de 95%. Com base nesses parâmetros, é possível se validar analiticamente qualquer composto e com isso ter uma ferramenta hábil para a determinação de compostos em diversas matrizes (ANVISA, 2002)..

(39) 37. CONCLUSÕES.

(40) 38. 4 CONCLUSÕES. . O presente trabalho permitiu o desenvolvimento e validação de um método analítico de quantificação da trans-desidrocrotonina sem a interferência da matriz analítica;. . O método de dosagem t-DCTN utilizando cromatografia líquida de alta eficiência foi assaz aplicado em nanocápsulas convencionais e furtivas;. . O método cromatográfico utilizou um simples processo de solubilização dos constituintes da formulação;. . O método obtido se mostrou seletivo, sensível, preciso, reprodutível, com limites de detecção e quantificação abaixo da faixa de trabalho e com baixa interferência da matriz;. . O estudo demonstrou que as nanocápsulas contendo trans-desidrocrotonina obtidas pelo método de nanoprecipitação possuíam uma eficiência de encapsulação superior a 97%.. . O estudo ainda permitiu observar que as formulações de nanocápsulas continham valores superiores a 1,0 mg.mL-1 de t-DCTN..

(41) 39. PERSPECTIVAS.

(42) 40. 5 PERSPECTIVAS. Tem-se a perspectiva de produzir um artigo sobre os nanosistemas utilizados no presente trabalho. Para isso, deve-se caracterizar físico-quimicamente o sistema nanoparticulados obtido; determinar a cinética de liberação in vitro da t-DCTN a partir das nanocápsulas; analisar o comportamento dos nanossistemas em sistemas biológicos (in vivo) e verificar uma possível diminuição da toxicidade da t-DCTN após a utilização dos sistemas nanoparticulados..

(43) 41. REFERÊNCIAS.

(44) 42. REFERÊNCIAS. ANTON, N.; BENOIT, J. P.; SAULNIER, P. Design and production of nanoparticles formulated from nano-emulsion templates-A review. Journal of Controlled Release, [S.l.], v. 128, n. 3, p. 185-199, 2008. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.044749087481&partnerID=40&md5=f3d1a74a951cc59402ac5854af64aaed>. Acesso em: 10 jan. 2010. ANVISA. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Brasília: 2002. Disponível em: <http://elegis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=15132&mode=PRINT_VERSION>. Acesso em: 10 jan. 2010. ATHANASIOU, K. A.; NIEDERAUER, G. G.; AGRAWAL, C. M. Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials, [S.l.], v. 17, n. 2, p. 93-102, 1996. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00030061447&partnerID=40&md5=75aefcc953b6c5f73fe9b67641307b83>. Acesso em: 10 jan. 2010. BAKSHI, M.; SINGH, S. ICH guidance in practice: stress degradation studies on metronidazole and development of a validated stability-indicating HPLC assay method. Pharmaceutical Technology, [S.l.], v. 27, n. 10, p. 148-156, 2003. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.07944224312&partnerID=40&md5=091e4aad4c504163a9ecf09e09b08037>. Acesso em: 10 jan. 2010. BILATI, U.; ALLÉMANN, E.; DOELKER, E. Poly(D,L-lactide-co-glycolide) protein-loaded nanoparticles prepared by the double emulsion method - Processing and formulation issues for enhanced entrapment efficiency. Journal of Microencapsulation, [S.l.], v. 22, n. 2, p. 205-214, 2005. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.020144367507&partnerID=40&md5=25a42161cc0371b6b66997f7448b69dc>. Acesso em: 10 jan. 2010. BIRNBAUM, D. T.; BRANNON-PEPPAS, L. Molecular weight distribution changes during degradation and release of PLGA nanoparticles containing epirubicin HCl. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, [S.l.], v. 14, n. 1, p. 87-102, 2003. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00037289172&partnerID=40&md5=9a61c56caa51a25f0ac9f7b5b782460a>.

(45) 43. BRANNON-PEPPAS, L. Recent advances on the use of biodegradable microparticles and nanoparticles in controlled drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, [S.l.], v. 116, n. 1, p. 1-9, 1995. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2s2.0-0028837083&partnerID=40&md5=7d5cb247b401e0982dcb68bd3e48dbb7> BRANNON-PEPPAS, L.; BIRNBAUM, D. T.; KOSMALA, J. D. Polymers in controlled release. Polymer News, [S.l.], v. 22, n. 9, p. 316-318, 1997. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00008891377&partnerID=40&md5=7b0312ff9df19106926f6517cbd0c5ee>. Acesso em: 10 jan. 2010. BRAUNECKER, W. A.; MATYJASZEWSKI, K. Controlled/living radical polymerization: features, developments, and perspectives. Progress in Polymer Science, [S.l.], v. 32, n. 1, p. 93-146, 2007. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.033846841153&partnerID=40&md5=45498ce9bcbcf58754b558e1b486552a>. Acesso em: 10 jan. 2010. CAMPOS, A. R. et al. Investigations on the antinociceptive activity of crude extracts from Croton cajucara leaves in mice. Fitoterapia, [S.l.], v. 73, n. 2, p. 116-120, 2002. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00036222920&partnerID=40&md5=c666cd6e36abfde5ae1105ab61da3eab>. Acesso em: 10 jan. 2010. CARUSO, M. B. R.; CORDEIRO, I. Sistemática e biogeografia de Croton sect. Cleodora (Klotzsch) Baill. Guarulhos: Referata Biodiversa, 2008. Disponível em: <http://www.dpi.inpe.br/referata/arq/29_BIA/PadroesDistribuicao_Cleo.pdf>. Acesso em: 10 jan. 2010. CARVALHO, J. C. T. et al. Investigation of anti-inflammatory and antinociceptive activities of trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane diterpene from Croton cajucara. part 1. Planta Medica, [S.l.], v. 62, n. 5, p. 402-404, 1996. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00000833568&partnerID=40&md5=0612a85174b103e0f5f4a095dac03b03>. Acesso em: 10 jan. 2010. COLE, M. D. et al. Antifungal activity of neo-clerodane diterpenoids from Scutellaria. Phytochemistry, [S.l.], v. 30, n. 4, p. 1125-1127, 1991. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00000030116&partnerID=40&md5=7962032cd79724da450143d2ee790efd>. Acesso em: 10 jan. 2010. COLL, J.; TANDRÓN, Y. Isolation and structure elucidation of three neo-clerodane diterpenes from Teucrium fruticans L. (LABIATAE). Phytochemistry, [S.l.], v. 66, n. 19, p..

(46) 44. 2298-2303, 2005. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.026044476615&partnerID=40&md5=c198b7b8a0084aeb83f1b3ffeb824adc>. Acesso em: 10 jan. 2010. DEJAEGHER, B.; VANDER HEYDEN, Y. Robustness tests. LC-GC Europe, [S.l.], v. 19, n. 7, p. 418-423, 2006. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2s2.0-33745858683&partnerID=40&md5=50f6361882168c44b8173452b9c0b663>. Acesso em: 10 jan. 2010. DES RIEUX, A. et al. Nanoparticles as potential oral delivery systems of proteins and vaccines: A mechanistic approach. Journal of Controlled Release, [S.l.], v. 116, n. 1, p. 127, 2006. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.033751253462&partnerID=40&md5=d83bed24480e28a5105712bfd83e9347> DUNNE, M. et al. Encapsulation of protamine sulphate compacted DNA in polylactide and polylactide-co-glycolide microparticles. Journal of Controlled Release, [S.l.], v. 92, n. 1-2, p. 209-219, 2003. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00141629764&partnerID=40&md5=3a9759d460a9b472a8c91dbb08eb2c9e>. Acesso em: 10 jan. 2010. FARIAS, R. A. F. et al. Hypoglycemic effect of trans-dehydrocrotonin, a nor-clerodane diterpene from Croton cajucara. Planta Medica, [S.l.], v. 63, n. 6, p. 558-560, 1997. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00031440373&partnerID=40&md5=89fa0867edbd9d65b5cbcab706e9dfb3> FESSI, H. et al. Nanocapsule formation by interfacial polymer deposition following solvent displacement. International Journal of Pharmaceutics, [S.l.], v. 55, n. 1, 1989. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00024457576&partnerID=40&md5=1967db1533514ad9391453bf5ff5bdb7> GREF, R. et al. Development and characterization of CyA-loaded poly(lactic acid)poly(ethylene glycol)PEG micro- and nanoparticles. Comparison with conventional PLA particulate carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, [S.l.], v. 51, n. 2, p. 111-118, 2001. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00035134749&partnerID=40&md5=b0189fa13afbb496b424292e7fb03f0d>. Acesso em: 10 jan. 2010. GRIT, M. et al. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. International Journal of Pharmaceutics, [S.l.], v. 50, n. 1, p. 1-6, 1989. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00024570253&partnerID=40&md5=cbb9812eb4d21f4331dd77d62f7855d6>. Acesso em: 10 jan. 2010..

(47) 45. GRYNBERG, N. F. et al. Anti-tumour activity of two 19-nor-clerodane diterpenes, transdehydrocrotonin and trans-crotonin, from Croton cajucara. Planta Medica, [S.l.], v. 65, n. 8, p. 687-689, 1999. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00032760637&partnerID=40&md5=77c304ea072b09cd0f6668c419feb4e0> HAGIWARA, H.; INOME, K.; UDA, H. A total synthesis of an antibacterial clerodane, 16hydroxycleroda-3,13(14) Z-dien-15,16-olide. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, [S.l.], n. 7, p. 757-764, 1995. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.037049070054&partnerID=40&md5=8e58d5b87203303c53e9d0a7eda846da> HANS, M. L.; LOWMAN, A. M. Biodegradable nanoparticles for drug delivery and targeting. Current Opinion in Solid State and Materials Science, [S.l.], v. 6, n. 4, p. 319327, 2002. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00036707316&partnerID=40&md5=f479ee68e93bab34d05dafdc50530e20> HIRUMA-LIMA, C. A. et al. Antiulcerogenic mechanisms of dehydrocrotonin, a diterpene lactone obtained from Croton cajucara. Planta Medica, [S.l.], v. 65, n. 4, p. 325-330, 1999. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00032967583&partnerID=40&md5=92a9cbcda061fb317e2c5f54102b6906> ICH. Validation of Analytical Procedures : Methodology. Harmonized Tripartite Guideline Q2B, 1996. ICHIHARA, Y. et al. Cajucarinolide and isocajucarinolide: Anti-inflammatory diterpenes from Croton cajucara. Planta Medica, [S.l.], v. 58, n. 6, p. 549-551, 1992. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00027055287&partnerID=40&md5=053ae6fef559168cabe98c47adecfbae>. Acesso em: 10 jan. 2010. KITAZAWA, E.; SATO, A.; TAKAHASHI, S. Novel diterpenelactones with anti-peptic ulcer activity from Croton sublyratus. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, [S.l.], v. 28, n. 1, p. 227-234, 1980. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00018852453&partnerID=40&md5=0bc071d2da1d28a46de9b078b4ae8adf>. Acesso em: 10 jan. 2010. KREUTER, J. Drug targeting with nanoparticles. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, [S.l.], v. 19, n. 3, p. 253-256, 1994. Disponível em: <http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.00027994872&partnerID=40&md5=1a1ba8ac8d73277087db871bcedb62c5>.