Regeneração óssea guiada com o uso
de matriz óssea bovina desmineralizada em defeitos
ósseos experimentais em cães
Guided bone regeneration with demineralized bovine bone
matrix on experimental bone defects in dogs
Heloisa Fonseca Marão1, sônia regina Panzarini2, Fernando Pozzi seMegHini gustaldi1, cassiano costa silva Pereira1, idelMo rangel garcia Júnior2
ARTIGO ORIGINAL
RESUMO
Introdução: Os princípios da regeneração tecidual para
a reconstrução de defeitos ósseos alveolares consistem na utilização de uma barreira biológica atualmente produzida de diferentes tipos de biomateriais. Dessa forma, o objetivo do trabalho é avaliar a regeneração óssea guiada (ROG) com o uso de membrana de matriz óssea bovina desmineralizada (MOBD) em defeitos ósseos experimentais em tíbias de cães.
Método: Foram utilizados 4 cães que, após anestesia,
tri-cotomia e antissepsia, tiveram sua tíbia direita exposta, onde foram realizados dois defeitos ósseos com broca trefina. Um dos defeitos foi preenchido por coágulo, constituindo o Grupo Controle, e no outro foi adaptada uma membrana de MOBD de forma a cobrir o defeito, sendo chamado de Grupo Tratado. Após 90 dias, os animais foram eutanasiados para a obtenção das peças. Resultados: Os resultados demonstraram que, no Grupo Tratado, houve neoformação óssea de 67,4% e, no Grupo Controle, houve perda de 32,6% de tecido ósseo quando comparado ao volume inicial de osso. Observou-se que a membrana permanecia integra até esse período e que a interface com o tecido ósseo não havia presença de inflamação.
Conclusão: Foi possível concluir que a membrana de MOBD
mostrou-se um material osteocondutor, biotolerável e que pode ser uma opção viável para a reconstrução de defeitos ósseos.
Descritores: Materiais biocompatíveis. Regeneração
óssea. Matriz óssea.
Correspondência: Heloisa Fonseca Marão
Rua José Bonifácio, 1193, Bloco 10A – Vila Mendonça – Araçatuba, SP, Brasil – CEP: 16015-050
E-mail: heloisafonsecamarao@yahoo.com.br 1. Aluno de doutorado do Departamento de Cirurgia e Traumatologia
Buco- Maxilo-Facial da Faculdade de Odontologia de Araçatuba-UNESP, Araçatuba, SP, Brasil.
2. Professor do Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da Faculdade de Odontologia de Araçatuba-UNESP Araçatuba, SP, Brasil.
ABSTRACT
Background: The principles of tissue regeneration
to repair alveolar bone defects are based on the fabri-cation of a biologic barrier with different biomaterials. Therefore, the present study aimed to investigate the guided bone regeneration (GBR) by using membrane of demineralized bovine bone matrix (DBBM) on expe-rimental defects in tibia of dogs. Methods: Four dogs were used and after anesthesia, shaving and antisepsis, two standardized bone defects were created on the right tibia of each animal with trephine drill. In the Control Group, the defects were filled with blood coagulum, while in the Treated Group, a membrane of DBBM was used to cover the defects. After 90 days, animals were sacrificed. Results: In the Treated Group, 67.4% of new bone formation was observed and, in the Control Group, 32.6% of the bone tissue reabsorbed when compared with initial bone volume. The membrane remained intact and no inflammatory tissue was observed on membrane/ bone interface. Conclusion: It was concluded that the use of DBBM is an osteoconductive material, presents biocompatibility and may be promise option to repair bone defects.
Key words: Biocompatible materials. Bone
INTRODUÇÃO
Os defeitos ósseos decorrentes de traumas1, doenças, atrofias maxilofaciais e alveolares têm sido um dos grandes desafios da implantodontia, particularmente em relação à sua reconstrução para possibilitar a instalação de implantes de titânio2-4. Em relação ao seu diagnóstico e tratamento cirúrgico, observa-se grande evolução nas últimas décadas.
Fatores como o desenvolvimento contínuo de numerosos biomateriais e o entendimento da biodinâmica óssea auxiliaram no restabelecimento do arcabouço ósseo e no reposicionamento dos tecidos5, otimizando resultados estéticos-funcionais.
Os princípios da regeneração tecidual começaram a ser empregados na Odontologia por Boyne6 para a reconstrução de defeitos ósseos alveolares. Posteriormente, a técnica denominada Regeneração Óssea Guiada (ROG), que consiste na utilização de uma barreira biológica (membrana) para a manutenção de um espaço entre o defeito ósseo e a superfície da membrana, passou a ser empregada para a correção dos defeitos ósseos alveolares e maxilofaciais7,8.
Atualmente, há membranas produzidas de diferentes tipos de biomateriais, sendo classificadas como absorvíveis (colá-geno, ácido polilático, ácido poligliólico, poliuretana e matriz dérmica acelular) ou não absorvíveis (celulose, politetrafluore-tileno expandido, teflon, látex, titânio e óxido de alumínio). Os biomateriais absorvíveis possuem a vantagem de não necessitar de um segundo tempo cirúrgico e apresentar menor índice de exposição ao meio bucal, sendo assim, a utilização dessas membranas tornou-se uma tendência9.
Osso bovino tem sido amplamente utilizado como material de enxerto devido à sua estrutura morfológica e composição química semelhantes ao osso humano10-12. As proteínas morfo-genéticas (BMP) presentes são responsáveis pelos eventos celulares que ocorrem no tecido ósseo, conduzindo a sua regeneração13,14.
O processo de obtenção da matriz óssea bovina por meio de ciclos de desmineralização não assegura a conservação do conteúdo protéico e não possibilita a sobrevivência de micro-organismos patogênicos15.
As matrizes ósseas desmineralizadas já foram utilizadas em procedimentos clínicos periodontais16, reconstruções maxilofa-ciais17, cirurgias pré-protéticas18 e traumatologia19.
Apesar de todos esses avanços, a busca por um biomaterial que seja reabsorvível, biocompatível, osteocondutor e com custo acessível ainda é uma constante.
Em razão dos poucos estudos realizados com esse tipo de membrana, é proposta deste trabalho avaliar a ROG com o uso de matriz óssea bovina desmineralizada (MOBD) em defeitos ósseos experimentais em tíbias de cães.
MÉTODO
O projeto de pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araça-tuba – UNESP e foi aprovado (protocolo número 2008 0 7589).
A obtenção do osso bovino para preparo da matriz óssea foi realizada em frigorífico de alto padrão, com inspeção Federal pelo Ministério da Agricultura – S.I.F. (Serviço de Inspeção Federal).
Imediatamente após o sacrifício do animal, removeu-se a porção do ramo mandibular, armazenando-a em solução gelada de cloreto de sódio 0,9% a uma temperatura variando entre 0° e 4°C, por um período de 60 minutos20. Em seguida, a porção óssea foi imersa em solução descalcificada de ácido clorídrico (HCL) a 0,4 mols, com temperatura variando entre 6° e 8°C, permanecendo por um período de 10 dias com trocas diárias da solução21.
Após este período, o tecido permitiu cortes para obtenção de lâminas retangulares, medindo aproximadamente 2,0 x 2,5 cm de comprimento e 0,4 mm de espessura, armazenadas em glicerina a 98% e mantidas em geladeira a uma temperatura variando em torno de 8ºC por um período de 20 dias.
Noventa minutos antes do procedimento cirúrgico de implantação, as matrizes ósseas foram removidas do meio de conservação em glicerina a 98%, lavadas e mantidas em solução fisiológica 0,9% gelada até a sua implantação.
Foram utilizados 4 cães machos, de mesma ninhada, adultos jovens da raça Beagle, com idade aproximada de 12 meses, com peso entre 10 e 12 quilos. Os animais foram mantidos em celas individuais com dieta padrão, ração sólida (Faro, Primor) e água ad libitum no Biotério da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, observando-se os cuidados diários de manipulação, limpeza e alimentação, realizados por pessoal treinado.
Todos os animais receberam a vacinação antirábica (Ra-sad, Lema Biologic do Brasil Ltda, Contagem, MG, Brasil), as vermifugações com pamoato de pirantel/prazinquantel (Drontal, Bayer S.A. Saúde Animal, São Paulo, SP, Brasil), na dosagem de 1 comprimido/10kg, via oral, e 1ml/50kg de ivermectina (Imectin, Irfa – Química e Biotecnologia Indus-trial Ltda., Porto Alegre, RS, Brasil), via subcutânea, além de hemogramas para controle de saúde.
Os animais foram mantidos em jejum nas 8 horas prévias ao procedimento cirúrgico, receberam pré-anestesia constituída de injeção intramuscular da associação dos medicamentos Acepran (Univet-vetnil, São Paulo Brasil) e Ketamina (Cris-tália, São Paulo, Brasil), na proporção de 1/1 ml, com finalidade de torná-los dóceis e receptivos às manobras da anestesia. A seguir, foi realizado o acesso venoso por meio de um scalp nº 21, e a administração endovenosa de uma solução contendo Zoletil (Virbac, EUA) e Xilazina (Cristália, São Paulo, Brasil) para a anestesia. Durante todo o período cirúrgico foi mantido endovenoso, soro fisiológico glicosado a 5% (Darrow, Rio de Janeiro, Brasil).
Realizou-se a intubação com sonda orotraqueal (6.5) e tamponamento orotraqueal com gaze. Quando necessário, a anestesia foi complementada para manter o efeito durante todo o período operatório.
Após tricotomia na região de tíbia direita e antissepsia com solução de PVP-I (Polivinil pirrolidona iodo) degermante e tópico a 10% foi realizada anestesia local com mepivacaína a 2% (DFL - Indústria de Comércio S.A., Rio de Janeiro, RJ, Brasil) para a obtenção de hemostasia e anestesia adequada.
Uma incisão dermoperiostal com lâmina de bisturi n°15 permitiu o descolamento dos tecidos e exposição do tecido ósseo para a realização de dois defeitos ósseos na região central da tíbia direita. Esses defeitos foram realizados com uma broca trefina de diâmetro 5 cm, adaptada em um contra-ângulo e sob irrigação externa de soro fisiológico.
Tabela 1 – Somatória entre a área de perda óssea
(grupo controle) e área de ganho ósseo (grupo tratado).
Espécimes Área POC Área GOT Soma (C+T)
1 72 254 326
2 290 389 679
3 122 178 300
4 92 372 464
Tabela 2 – Somatória da área total de tecido ósseo
estudada, da área total GOT e da área total POC.
Área total estudada 1769
Área total GOT 1193
Áreas total POC 576
Um dos defeitos ósseos foi preenchido por coágulo e cons-tituiu o Grupo Controle e o outro foi coberto com a membrana MOBD constituindo o Grupo Tratado. Em seguida, os tecidos foram reposicionados e a sutura do plano profundo foi reali-zada com Poliglactina 910 n° 4.0 e a do plano superficial com Nylon 5.0 (Ethicon).
Todos os animais receberam Pentabiótico IM (0,1mL/kg, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo, Brasil) em dose única, Diclofenaco de Sódio (3 mg/kg/dia, Voltaren, Novartis, Suíça), durante 3 dias, e Dipirona Sódica (1mg/kg/ dia, Ariston Indústrias Químicas e Farmacêuticas Ltda, São Paulo, Brasil) no total de 3 doses.
A eutanásia foi realizada aos 90 dias pós-operatórios, por meio de perfusão. As peças obtidas foram fixadas em solução de formol neutro a 10% e descalcificadas em solução de EDTA a 20%. Após a descalcificação as peças foram incluídas em parafina de forma longitudinal e foram realizados cortes semiseriados de 6 µm de espessura, corados com hematoxilina e eosina (HE).
Análise quantitativa
Os cortes histológicos dos espécimes foram capturados por meio de uma câmera Axio Cam MRc5 (Carl Zeiss do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) acoplada a um estereomicroscópio Stemi 2000 – C (Carl Zeiss do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, Brasil). Essa imagem foi salva como figura no programa Axio Vision 4.5 (Carl Zeiss do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) e utilizada para a quantificação no programa ImageLab 2000 (Laboratório de Informática Dedicado à Odontologia, LIDO, USP, São Paulo, Brasil).
Inicialmente, no Grupo Controle, foi mensurada a área total de osso perdido em relação ao volume ósseo inicial e, no Grupo Tratado, a quantidade de osso formado (Tabela 1). Sendo assim, foram somados os valores obtidos resultando na área total de tecido ósseo (Tabela 2). A partir desses resultados, foi estabele-cida a porcentagem que identificou a quantidade de neoformação óssea no Grupo Tratado (NOT) e a quantidade de osso perdido no Grupo Controle (PC) em relação ao volume inicial.
Posteriormente, foi mensurado o perímetro total da membrana de MOBD e o quanto dessa interface estava composta por tecido ósseo ou tecido conjuntivo.
RESULTADOS Grupo Controle – coágulo
O defeito ósseo foi preenchido por tecido ósseo maduro. A formação óssea apresentou-se mais uniforme próxima ao periósteo, e mais desorganizada à medida que se aproximava do canal medular, onde se observou a presença de trabéculas ósseas esparsas envolvendo espaços intertrabeculares amplos (Figura 1). No interior dos espaços intertrabeculares, nota-se a presença osteoblastos e matriz óssea em processo de mineralização. O padrão aleatório de orientação das lamelas osteocíticas sugere que ainda não houve remodelação. O tecido ósseo neoformado estabelece íntima relação com osso remanescente da cortical da tíbia. A borda do defeito cirúrgico apresenta padrão ordenado das lamelas osteocíticas do osso remanescente que difere do padrão aleatório de organização das lamelas do tecido neoformado.
Em alguns espécimes (Figura 2), a superfície do tecido ósseo neoformado apresenta pontos de reabsorção.
Grupo tratado – MOBD
O tecido ósseo neoformado ocupa todo o defeito cirúrgico, constituído por trabéculas ósseas espessas, delineando amplos espaços intertrabeculares e distribuído uniformemente por toda espessura da cortical óssea (Figura 3).
A MOBD apresentou-se acelularizada e sem indícios de reabsorção e foi envolvida por tecido conjuntivo, semelhante a um periósteo neoformado (Figura 4). Não foi observada área de reabsorção do material ou processo inflamatório.
Observou-se neoformação óssea de 67,4% no Grupo Tratado e perda de tecido ósseo de 32,6% no Grupo Controle em relação ao volume ósseo inicial.
A interface da membrana de MOBD foi constituída de 79% de tecido conjuntivo (tecido conjuntivo fibroso e medula óssea) e 21% de tecido ósseo.
Figura 1 – Grupo Controle: defeito preenchido por
tecido ósseo. A formação óssea apresentou-se mais uniforme próxima ao periósteo e desorganizada à medida que se
DISCUSSÃO
A técnica de RGO consiste na utilização de uma barreira biológica para manutenção de um espaço entre o defeito ósseo e a superfície da membrana, onde as células originárias do osso possam migrar e se proliferar sem a interferência de células de outros tecidos. No entanto, a pressão externa do tecido mole e consequente colapso da membrana protetora são considerados uma das principais razões para o fracasso do processo regenerativo22. Apesar do alto potencial de regeneração do tecido ósseo, alguns tipos de defeitos não podem ser reparados devido à instabilidade do local, ao tamanho do defeito ou à existência de tecidos na região. Portanto, vários materiais e técnicas têm sido utilizados para regeneração desses tecidos23.
As características físicas e o alto custo das membranas não absorvíveis são as suas principais desvantagens e levaram à busca de alternativas, como as membranas absorvíveis que vêm apresentando bons resultados e custo mais acessível9.
Outra opção de biomateriais para a correção de defeitos ósseos são os heterógenos ou xenógenos, que são de origem animal tratados quimicamente para torná-los compatíveis quando em contato com os tecidos humanos, como a MOBD, que possui BMPs e fatores de crescimento capazes de induzir a osteogênese24. Porém, a capacidade osteoindutora pode ser perdida totalmente ou parcialmente durante o processamento do material25.
Foi observado que, em ambos os grupos, houve formação óssea, porém no Grupo Tratado a proteção dada pela membrana MOBD proporcionou maior neoformação na superfície da cavidade, que se distribuiu de forma organizada por todo o
Figura 2 – Grupo Controle: tecido ósseo neoformado
apresenta pontos de reabsorção óssea. H.E., original 160x. conjuntivo, semelhante a um periósteo neoformado. H.E., original 160x. Figura 4 – MOBD: membrana de MOBD foi envolvida por tecido
Figura 3 – MOBD: presença de tecido ósseo neoformado
Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, UNESP, Araçatuba, SP, Brasil. Artigo recebido: 15/1/2011
Artigo aceito: 2/6/2011
defeito, quando comparado ao Grupo Controle. Esse tecido ósseo neoformado mostrou-se maduro, com poucos espaços medulares e canais harvesianos definidos, o que sugere a capa-cidade osteogênica das células do tecido ósseo circunjacente. A membrana de MOBD permaneceu durante todo período experimental no leito implantado, em íntimo contato com os tecidos neoformados, sem sofrer processo de reabsorção, processo inflamatório ou de calcificação. Desta forma, demons-trou ser um material biocompatível, que pode permanecer por longo período no interior dos tecidos humanos, diferentemente do substituto de fáscia temporal humana, utilizado também como uma barreira bioabsorvível26.
A interface da membrana da MOBD foi constituída na sua maior parte (79%) de tecido conjuntivo, sem presença de inflamação, o que demonstra a biocompatibilidade do material.
Este estudo demonstrou que a implantação da membrana MOBD não interferiu no processo local de neoformação óssea e funcionou como um arcabouço, permitindo o crescimento de tecido ósseo, assim como demonstrado por Queiroz et al.22.
Outro material que apresentou resultados semelhantes à membrana de MOBD é a membrana Lactosorb. Ambas membranas comportam-se como materiais osteocondutores, porém devido a sua constituição (82% de ácido polilático e 18% de ácido poligli-cólico), a membrana Lactosorb é totalmente reabsorvida após 12 semanas27, diferentemente da membrana de MOBD.
A membrana de MOBD foi bem tolerada, permitiu o crescimento ósseo e apresentou tecido conjuntivo sem reação inflamatória aguda ou crônica ao seu redor, demonstrando potencial osteocondutor.
Com os resultados obtidos, a utilização da membrana de MOBD na ROG para o tratamento de defeitos ósseos pode ser uma opção para diminuir a necessidade de um leito doador e consequente morbidade do paciente.
A membrana de MOBD mostrou-se um material osteo-condutor, biotolerável, que pode ser uma opção viável para a reconstrução de defeitos ósseos.
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