ROSANE DO SOCORRO POMPEU DE LOIOLA
ASSOCIAÇÃO DOS FATORES DE ADERÊNCIA babA2 E sabA DA
Helicobacter pylori E OS LIGANTES DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH
E LEWIS EM PACIENTES COM GASTRITE CRÔNICA DA
POPULAÇÃO DE BELÉM-Pa
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutoraem Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª Drª Tereza Cristina de Oliveira Corvelo Instituto de Ciências Biológicas/UFPa
Banca Examinadora: Profª Drª. Ermelinda do R. Moutinho da Cruz (Avaliadora) Centro de Ciências da Saúde/UFPA
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves (Avaliador) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA
Profª Drª Délia Cristina Figueira Aguiar (Avaliadora) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA
Profª Drª Hilma Lúcia Tavares Dias (Avaliadora)
Núcleo de Ciência Agrárias e Desenvolvimento Rural/UFPA Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto (Suplente) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA
DEDICATÓRIA
A minha filha Julia Loiola A minha mãe Francisca Pompeu de Loiola
EPÍGRAFE
A percepção do desconhecido é a mais fascinante das experiências. O homem que não tem os olhos abertos para o misterioso passará pela vida sem ver nada. (Albert Einstein)
AGRADECIMENTOS
Ao iniciar meus agradecimentos lembrei-me de uma frase de Paulo Freire “Se a educação sozinha não pode transformar a sociedade, tampouco sem ela a sociedade muda.” Acredito que seja oportuno aqui, porque nenhuma conquista é mérito unicamente de quem a almeja, mas de todos aqueles que de alguma forma, ainda que nos bastidores, contribuíram para o seu alcance. Então Meus sinceros agradecimentos
Aos pacientes que aceitaram participar deste estudo
À Profª. Dra. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo, pela orientação desta tese, e de toda vida minha profissional, pelo aprendizado adquirido, pela amizade e carinho dedicado nestes quase 20 anos de convivência.
À Profª Dra. Ermelinda do Rosário Moutinho da Cruz, pela inestimável orientação e colaboração neste estudo. Pelo apoio, incentivo, carinho e amizade dedicada a mim.
À Vivian Lúcia Aslan D’Annibale minha parceira de doutoramento e pela coleta do material biológico.
À Dra. Marileide Serra Carneiro (in memoriam), médica do Setor de Endoscopia do HUJBB, pela disponibilidade e colaboração na coleta das amostras.
À Eny Valente de Azevedo, pela colaboração e apoio dispensado na realização das técnicas laboratoriais para a realização deste trabalho.
A Gysele Mattos pela colaboração e apoio durante a realização deste estudo.
Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Imunogenética da UFPA, Marcelo Vieira, Daniel Ventura e Amanda Pamela, pelo ajuda na realização dos ensaios laboratoriais.
Ao seu Lenor Mandú, pelo auxilio laboratorial, companhia e pelo cafezinho matutino, que carinhosamente me oferecia diariamente.
À Kleiffeson Alves de Miranda, Diretor do Laboratório Central do Estado do Pará - SESPA em 2010, que concedeu a minha licença para realização do curso de doutoramento. À Regina Guimarães Diretora da EEEEFM Dr. Celso Malcher que concedeu a minha licença para realização do curso de doutoramento.
Aos meus amigos Waldinei do Carmo, Rosineide Brandão e Joana Darc Bezerra pelo incentivo e apoio durante a execução deste trabalho.
A minha família Francisca Pompeu de Loiola, minha mãe, Laudemir Crindstistina, Hidir, Edivaldo Junior, Edifranci, meus irmão, Andreza, Andrei, Tainá, Tiago, Nicole, Nivea, Leonardo e Sofia, meus sobrinhos; minhas cunhadas Sandra e Renata e cunhado Clebeson pelo apoio e compreensão nos muitos momentos de ausência.
A meu companheiro Mauricio Santana, imprescindível.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários UFPa, pela qualidade da formação oferecida e por ter proporcionado a realização deste trabalho. FAPESPA pelo incentivo financeiro para a execução da pesquisa.
Às diversas pessoas e instituições que direta ou indiretamente contribuíram para o planejamento, execução e conclusão desta tese.
SUMÁRIO Pág LISTA DE FUGURAS... LISTA DE TABELAS... LISTA DE ABREVIATURAS... RESUMO... ABSTRACT... 1.0. INTRODUÇÃO... 16
1.1. FATORES DE VIRULÊNCIA E PATOGÊNESE DA H. pylori... 18
1.1.1. Urease... 18 1.1.2. A ilha de patogenicidade Cag PAI... 20
1.1.3. Toxina VacA... 24
1.2. ADESINAS E PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA (OMPS)... 27
1.2.1. Adesina BabA... 28
1.2.1.1. Regulação do gene babA... 29
1.2.1.2. Mutação genômica na região codificadora do gene babA... 30
1.2.1.3. Regulação da transcrição do gene babA... 31
1.2.1.4. Função da proteína BabA... 31
1.2.2. Proteína ligante de ácido siálico (SabA)... 32
1.2.3. Proteína inflamatória externa (oipA)... 34
1.2.4. Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB)... 35
1.3. RESPOSTA IMUNOLÓGICA À Helicobacter pylori... 36
1.3.1. Macrófagos sinalizadores de linfócitos T na infecção pela H. pylori... 36
1.3.2 Macrófago como célula efetora na infecção pela H. pylori... 37
1.3.3. Células dendríticas... 38
1.3.4. Evasão da fagocitose pelos macrófagos... 38
1.3.5. Resposta imunológica mediada por linfócito T... 39
1.3.6. Os linfócitos B... 41
1.4. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO POR H. pylori COM AS DOENÇAS GÁSTRICAS... 41
1.5. ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH e LEWIS E A INFECÇÃO PELA H. pylori ... 45
1.6. OBJETIVOS... 54
1.6.1. Objetivo geral... 54
1.6.1 Objetivos específicos... 54
2.0. MATERIAL E MÉTODOS... 55
2.1. CASUÍSTICA... 55
2.2. AMOSTRAS E CRITÉRIOS DE INCLUSÃO EXCLUSÃO.... 55
2.3 COLETA E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS... 56
2.3.1. Amostras de sangue... 56
2.3.2. Coleta da saliva... 56
2.3.3. Coleta de biopsia gástrica... 57
2.3.4. Análise histopatológica de biópsias das regiões de antro e corpo gástrico... 57
2.4. DETERMINAÇÃO DOS FENÓTIPOS ABO E LEWIS E DO ESTADO SECRETOR DE ABH...
58
2.4.1. Determinação do fenótipo eritrócitos... 58
2.4.2. Determinação do Estado Secretor ABH na saliva... 58
2.4.3 Análise imunohistoquímica das biopsias gástricas ... 59
2.4.3.1. Controles da reação imunohistoquímica... 60
2.4.3.2. Análise semi-quantitativa da reação de imunohistoquímica... 60
2.5. PREPARAÇÃO DE DNA DE BIOPSIA GÁSTRICA... 60
2.6. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS TRIPLO POSITIVAS DA H. pylori... 61
2.7. GENOTIPAGEM DOS GENES FUT2 e FUT3 PELA PCR... 62
2.7.1. Gene FUT2... 62
2.7.2 Gente FUT3... 63
2.8. EXTRAÇÃO DE RNA PARA ANÁLISE DE PCR EM TEMPO REAL... 63
2.8.1 Conversão de RNA em cDNA... 64
2.9. DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DOS GENES babA2 e sabA DA H. pylori PELA PCR EM TEMPO REAL... 64
2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 64
3.0. RESULTADOS... 68
3.1. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA... 68
3.2. ANÁLISE DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA DA H. pylori... 72
3.3. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELA H. pylori COM OS GRUPOS SANGUÍNEOS ABO LEWIS E SECRETOR... 80
3.3.1. Avaliação dos polimorfismos T59G e G508A no gene Lewis do G428A no gene Secretor... 85
3.4. EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS ANTÍGENOS ABO E LEWIS NA MUCOSA GÁSTRICA... 89
3.5. EXPRESSÃO DE babA2 e sabA NA MUCOSA GÁSTRICA... 97
4.0. DISCUSSÃO... 103
5.0. CONCLUSÕES... 114
LISTA DE FIGURAS
Figura Descrição Pág
Figura 1. Representação esquemática dos principais resultados clínicos da infecção pela Helicobacter pylori ... 17 Figura 2. Diversidade dos sítios de tirosina fosforilação da proteína
CagA da Helicobacter pylori... 21 Figura 3 Proteína CagA e os domínios de fosforilação EPIYA... 22 Figura 4. Desregulação de SHP2 pela proteína CagA... 23 Figura 5. Estrutura da proteina VacA da Helicobacter pylori e seus
efeitos funcionais... 25 Figura 6. Proteínas de membrana da Helicobacter pylori... 27 Figura 7. Localização genômica dos genes babA, babB, e babC em
linhagens J99, 26.695, e HPAG1... 28 Figura 8. Espectro de doenças gástricas associadas com a infecção pela
Helicobacter pylori... 42
Figura 9. Representação esquemática das estruturas terminais dos epitopos ABH e Lewis em estruturas o-glicanos... 47 Figura 10. Alteração do padrão de glicosilação da mucosa gástrica frente
à infecção pela Helicobacter pylori... 51 Figura 11. Distribuição das doenças gástricas diagnosticadas na amostra
de pacientes atendidos no HUJBB em 2011-2012... 68 Figura 12. Distribuição dos marcadores de virulência da bactéria
Helicobacter pylori entre regiões do antro e corpo gástrico dos pacientes analisados... 72 Figura 13. Correlação entre o índice de lesões histopatológicas e o índice
de combinação dos genes vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA da H. pylori detectados em biópsias de corpo e antro de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 79 Figura 14. Distribuição dos fenótipos Lewis em relação a concordâncias
dos fenótipos Lewis eritrocitário e salivar dos pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 82 Figura 15. Distribuição dos fenótipos do sistema dos tipos Lewis em
relação aos grupos sanguíneos do sistema ABO dos pacientes 83
com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... Figura 16. Distribuição dos fenótipos Lewis concordantes e discordantes
em relação a infecção pela H. pylori e ao tipo de grupo sanguíneo ABO de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 84 Figura 17. Padrão de digestão enzimática das mutações T59G (A) e
G508A (B) no gene FUT3, pelas enzimas de restrição VspI e PvuII, respectivamente, corado com brometo de etídio em poliacrilamida 7% de agarose... 85 Figura 18. Distribuição de frequência dos genótipos Lewis entre
pacientes infectados e não infectados pela H. pylori... 88 Figura 19 Padrão homogeneo de expressão antígenica. (A e B) Padrão
Homogêneo do antígeno H e A respectivamente... 90 Figura 20. Padrão Heterogêneo de marcação. (C) Perda de Leb em área
de Metaplasia intestinal; (D) Ganho de Lea em área de Metaplasia intestinal; (E) padrão heterogêneo do antígeno Leb. Aumento 40x... 91 Figura 21. Distribuição da expressão dos antígenos dos sistemas ABH e
Lewis na mucosa gástrica dos pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 92 Figura 22. Distribuição da expressão imunohistoquímica ABH e Lewis
em relação ao nível de inflamação na mucosa gástrica dos pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa, 2011-2012... 93 Figura 23. Comparação da expressão dos antígenos de grupos sanguíneos
entre na saliva e mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica de Belém – Pa... 94 Figura 24. Comparação entre o Ct da expressão do RNAm dos genes
babA2 e sabA verificados na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 98 Figura 25. Relação entre a detecção dos genes BabA2 por PCR e a
presença de expressão de seus RNAm verificados na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 99 Figura 26. Média dos escores de expressão imunohistoquímica dos
antígenos ABH e Lewis em relação a expressão dos genes BabA2 e SabA da H. pylori detectados na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa... 102
LISTA DE TABELAS
Tabela Descrição Pág
Tabela 1. Infecção por Helicobacter pylori em países da America Latina... 16 Tabela 2. Anticorpos específicos para antígenos sistemas de grupo sanguíneo
ABO e Lewis... 60 Tabela 3. Sequências dos iniciadores para tipagem dos genes FUT2 e FUT3
por RFPL-PCR... 66 Tabela 4. Sequências dos iniciadores para tipagem da Helicobacter pylori... 67 Tabela 5. Lesões histopatológicas presentes no corpo e antro de pacientes com
gastrite crônica atendidos no hospital João de Barros Barreto... 69 Tabela 6. Comparação dos métodos de detecção da H. pylori entre pacientes
com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 70 Tabela 7. Associação das lesões histopatológicas na presença de Helicobacter
pylori nas áreas de corpo e antro gástrico de pacientes atendidos no Hospital de Barros Barreto 2011... 71 Tabela 8. Associação dos genes de virulência detectados no estomago dos
pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012 73 Tabela 9. Correlação entre os genes de virulência detectados no antro e corpo
gástrico de pacientes infectados por H. pylori atendidos no HUJBB em 2011-2012... 74 Tabela 10. Correlação das diferentes combinações dos fatores de virulência da
H. pylori entre corpo e antro gástrico de paciente com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 75 Tabela 11. Correlação entre os genes de virulência e lesão histopatológicas
detectadas na mucosa de corpo e antro gástrico de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 78 Tabela 12. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB
em 2011-2012 de acordo com a infecção pela H. pylori e os tipos de grupo sanguíneo ABO, Lewis e estado secretor salivar em relação a população de Belém ... 81 Tabela 13. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB
em 2011-2012 de acordo os fenótipos Lewis eritrocitário e salivar 81 Tabela 14. Distribuição da infecção pela H. pylori entre pacientes Lewis
concordantes e discordantes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 84
Tabela 15. Frequências alélicas e genotípicas dos loci FUT2 e FUT3 entre pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em Belém/Pa em 2011-2012... 87 Tabela 16. Comparação das frequências genotípica de FUT3 entre pacientes
com gastrite crônica e população de Belém... 88 Tabela 17. Comparação da expressão dos antígenos A, B, H, Lea e Leb na
camada foveolar da área do antro gástrico entre as graduações forte e fraca das lesões histopatológicas na mucosa gástrica de paciente com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 95 Tabela 18. Análise da expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e
Lewis na mucosa gástrica em relação à presença dos fatores de virulência da H. pylori em pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012... 96 Tabela 19. Distribuição da expressão dos genes BabA2 e SabA em função das
lesões histopatológicas diagnosticadas na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2012-2012 100 Tabela 20. Distribuição dos grupos sanguíneos em função da expressão dos
genes babA2 e sabA na mucosa gástrica de com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2012-2012... 101
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
L Microlitro
µm Micrometro
Cm Centímetro
AlpA/B Lipoproteínas A e B associadas à aderência APCs Células apresentadoras de antígenos
baba Gene promotor da proteína BabA
BabA Adesina ligante de antígenos de grupos sanguíneos cagA Gene promotor da citotoxina CagA
CagA Citotoxina associada ao gene A
cagPAI Região da ilha de patogenicidade do cromossoma da bactéria c-Met Fator de crescimento de hepatócito
dNTP Desoxirribonucleotídeos
EPIYA Motivo glutamato-prolina-isoleucina-tirosina-alanina EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
H Antígeno H de grupo sanguíneo H. pylori Helicobacter pylori
HCl Ácido Clorídrico
HUJBB Hospital Universitário João de Barros Barreto IgA Imunoglobulina de cadeia pesada α (alfa) IgG Imunoglobulina de cadeia pesada γ (gama) IgM Imunoglobulina de cadeia pesada µ (mu) IL- Interleucina - 1, 4, 5, 6, 8 e 17
Le Antígeno Lewis de grupo sanguíneo Lea Antígeno Lewis a de grupo sanguíneo Leb Antígeno Lewis b de grupo sanguíneo Lex Antígeno Lewis x de grupo sanguíneo Ley Antígeno Lewis y de grupo sanguíneo
mM Micromolar
MALT Linfoma de tecido linfóide associado à mucosa MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitro
N Normalidade
nL Nanolitro
NaCl Cloreto de Sódio NaOH Hidróxido de sódio
oipA Gene promotor da proteína OipA
OipA Proteína inflamatória da membrana externa A OMP Famílias de proteínas da membrana externa PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico pMol Picomolar
rpm Rotações por minuto
SabA Adesina ligante de ácido siálico
Se Secretor
SLex Sialil-Lewis x
T4SS Sistema de secreção tipo 4
ureA Gene promotor da atividade da uréase UFPA Universidade Federal do Pará
vacA Gene responsável pela toxina VacA VacA Citotoxina vacuolizante A
ZnCl2 Cloreto de Zinco
RESUMO
A H. pylori causa doenças gástricas severas. Vários genes bacterianos têm sido associados com o grau de severidade das doenças gástricas, entre eles o gene cagA, VacAs1m1, babA2 e sabA, estes últimos se ligam em receptores carboidráticos de grupo sanguíneo expressos nas células epiteliais gástricas. Estes antígenos de grupo sanguíneo podem sofrer variações nos padrões de expressão resultado da interação de loci como ABO, Hh, Sese, Lele. A presença dos SNPs T59G e G508A no gene FUT3 e G428A no gene FUT2 podem alterar os padrões de glicosilação da mucosa assim como a infecção pela H. pylori. Assim este estudo investigou a relação da infecção pelo H. pylori com os polimorfismos de grupo sanguíneos ABH e Lewis. Foram envolvidos 216 pacientes sintomáticos para doenças gástricas, atendidos no HUJBB. Foram coletadas as amostras de sangue, saliva e biópsias gástricas. Foram aplicados os ensaios da RFLP-PCR para verificar os SNPs T59G; G508A e G428A. As expressões antigênicas dos sistemas ABH e Lewis foram analisadas pela imunohistoquímica, Dot-ELISA e Hemaglutinação direta. Foi realizada análise histopatológica pela HE e Gram-modificado e detectado fatores de virulência da H. pylori por PCR e a expressão dos genes babA2 e sabA pela PCR em tempo real. A H. pylori atingiu taxa de 59,26%. A infeção foi associada com vários achados inflamatórios, cujo risco relativo variou de 111.78 a 5.36. As frequências dos marcadores de virulência vacAm1s1, cagA, babA2, e sabA atingiram proporções de 79,69%, 66,40%, 49,21% e 89,84%, respectivamente. Foi verificada correlação significativa (rs = 0.7201; t = 11.1299; <0.0001), entre as diferentes combinações dos fatores de virulência bacteriano entre corpo e antro e entre o maior número de genes de virulência e o índice de lesão na mucosa gástrica tanto no antro (rs = 0.2263; p = 0.0125) quanto no corpo gástrico (rs = 0.2083; t = 2.3527; p = 0.0202). A presença dos genótipos Le/_ foi maior entre pacientes infectados pela H. pylori enquanto a frequência de le*/le* foi maior entre os pacientes sem infecção. A perda de expressão antigênica A/B foi relacionada a forte inflamação e à presença de cagA. e a perda de H e Leb foi relacionada a presença do gene sabA. Em relação à expressão de babA2, 88,3% dos pacientes expressavam o antígeno Leb entre as bactérias babA2 com ausência de expressão apenas 67,74% expressavam este antígeno. A presença do alelo Lewis funcional confere maior risco de infecção pela H. pylori. E na dinâmica da interação bactéria-hospedeiro a expressão dos antígenos Lewis podem ser alteradas estando relacionada à presença de H. pylori vacAm1s1, cagA+ e sabA+, concedendo maior risco de transformação maligna no estômago.
ABSTRACT
The H. pylori may cause severe gastric diseases. Many bacterial genes have been related with severity degrees of gastric illnesses, among them the cagA, vacAs1m1, babA2 and sabA genes, these last ones can bind in carbohydrate receptors of blood group expressed in gastric epithelial cells. These blood group antigens may suffer variations in their expressions pattern, a result of loci interaction as ABO, Hh, Sese and Lele. The presence of T59G and G508A SNPs in FUT3 gene and G428A in FUT2 gene might change the mucosal glycosylation patterns just like the infection by H. pylori. So, this study investigated the relation of H. pylori infection with polymorphisms of ABH and Lewis blood groups. Were investigated 216 patients presenting symptoms to gastric diseases attended at HUJBB. Were collected blood, salive and gastric biopsy samples and performed the RFLP-PCR to verify T59G, G508A and G428A SNPs. The antigenic expressions of ABH and Lewis blood groups were analyzed by Immunohistochemistry assays, Dot-ELISA and direct hemagglutination. The histopathological analysis was made by HE and Gram-modified staining, the detection of H. pylori virulence factors was performed by PCR and the babA2 and sabA genes expression was analyzed by real time PCR. The H. pylori reached a frequence rate of 59.26%. The infection was associated with many inflammatory findings, whose relative risks varied of 111.78 to 5.36. The frequencies of vacAm1s1, cagA, babA2, and sabA virulence markers reached proportions of 79.69%; 66.40%; 49.21% and 89.84% respectively. Was verified the significative correlation (rs = 0.7201; t = 11.1299; <0.0001) among different bacterial virulence factors combinations in antrum and body gastric regions, the highest number of virulence genes and lesion index of gastric mucosa found in antrum (rs = 0.2263; p = 0.0125) and body (rs = 0.2083; t = 2.3527; p = 0.0202) regions. The presence of Le/_ genotypes was higher among H. pylori-infected patients while le*/le* frequency was higher among non-infected patients. The loss of A/B antigenic expression was related to strong inflammation and the presence of cagA, while the loss of H and Leb was related to sabA gene presence. About babA2 expression, 88.3% of patients demonstrated carry Leb antigen and among babA2 with absence of expression just 67.74% showed this antigen. The presence of functional Lewis allele confers a higher H. pylori infection risk. In the bacteria-host interaction dynamic the Lewis antigens expression may be changed if it is related to vacAm1s1, CagA+ and SabA+ of H. pylori, providing a higher risk of malignant transformation in stomach.
1.0. INTRODUÇÃO
Helicobacter pylori é um onco-patógeno que coloniza o estômago humano resultando em infecção assintomática ou com sintomas, que vai de gastrite leve até doenças mais severas como úlcera, carcinoma gástrico e linfoma de MALT (Marshall, 1989; Parsonnet et al., 1991; Parsonnet et al., 1994). Este patógeno é um bacilo curvo espiralado, gram negativo, microareofílico, geneticamente heterogêneo, isto é as cepas apresentam diferentes padrões de virulência (Marshall & Warren, 1984, McClain et al., 2009).
Esta infecção afeta aproximadamente 50% da população mundial (Parsonnet et al., 1992) e usualmente é adquirida na infância podendo persistir ao longo da vida, se não for tratada (Suerbbaum & Micheiti, 2002). Na América Latina dados revelam que a taxa de infecção varia entre 47,7% a 77,8% (Tabela 1).
Tabela 1. Infecção por Helicobacter pylori em países da America Latina. Pais Tamanho amostral
(N)
Taxa de
infecção (%) Referência
Argentina 533 56,1 Vega et al.; (2010)
Bolivia 424 74,0 Apud Santos et al.; (2009)
Brasil 1007 70,7 Apud Santos et al.; (2009)
Cuba 996 47,7 Apud Santos et al.; (2009)
México 71 59,2 Apud Santos et al.; (2009)
Venezuela 418 77,8 Apud Santos et al.; (2009)
A progressão para doenças severas resulta da interação entre fatores bacterianos, fatores do hospedeiro assim como fatores ambientais. Uma das características da infecção é a resposta inflamatória acentuada e a incapacidade do hospedeiro eliminar a bactéria, resultando na infeção persistente, com aumento da produção ácida e dano tecidual (Beswick et al., 2006). A ulceração e a carcinogênese são resultados multuamente exclusivos desta infecção. A infecção é persistente e em áreas de elevadas prevalências a reinfecção é muito comum. Pacientes nos Estados Unidos infectados com H. pylori tem 3,5 vezes maior risco de desenvover doença de úlcera péptica do que as pessoas não infectadas (Covacci et al., 1999). No Norte do Brasil, uma percentagem muito alta de úlceras gástricas e duodenais (até 93%) é atribuída à infecção por H. pylori (Martins et al., 2002).
É bem aceito que a infecção crônica pela H. pylori é um importante fator de risco no desenvolvimento de câncer gástrico, esta bactéria induz mudanças na mucosa gástrica (Figura 1) que pode contribuir para surgimento de tumor gástrico (Correa & Piazuelo, 2012).
Figura 1. Representação esquemática dos principais resultados clínicos da infecção pelo H. pylori (Correa & Piazuelo, 2012).
O câncer gástrico continua sendo a segunda causa de morte por câncer no mundo. Numa escala global este tipo de tumor responde por cerca de 700.000 mortes anualmente. Nos EUA foram estimadas 10.540 mortes por câncer de estômago no ano de 2012 (Siegel et al., 2012). Dados da Agência Internacional para Pesquisa do Câncer revelaram uma incidência de 5,1% de câncer gástrico, em ambos os sexos, nos últimos 5 anos na América Latina e Caribe (IARC, 2012). No Brasil a estimativa para o ano de 2012, considerando 100.000 habitates é que fossem diagnosticados 12.670 novos casos entre homens e 7420 entre as mulheres, destes 680 casos ocorrerão no Pará (INCA, 2012).
Mucosa gástrica normal Gastrite não atrófica Gastrite não atrófica Gastrite Atrófica multifocal Mataplasia intestinal Displasia Câncer H. pylori CagA-VacA s2m2 CagA+ VacA s1m1
A infecção pela H. pylori também desempenha um importante papel no desenvolvimento do linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), a H. pylori está presente no estômago da maior parte dos pacientes, mas em 75% destes o linfoma regride após a erradicação da bactéria (Nakamura et al., 1997, Parsonnet & Isaacson 2004).
1.1. FATORES DE VIRULÊNCIA E PATOGÊNESE DA H. pylori
A H. pylori coloniza a superfície apical do epitélio gástrico, mas os mecanismos precisos de adesão e patogênese ainda estão sendo elucidados. Cepas aderentes são capazes de sobreviver na mucosa gástrica, colonizar em alta densidade e também de recolonizar, enquanto as cepas não aderentes são facilmente eliminadas (Hayashi et al., 1998).
Assim, a adesão é crucial para Helicobacter pylori persistir e causar doença, pois a ligação do patógeno ao epitélio gástrico conduz em transdução de sinal e ativação de Fator Nuclear-κβ e subsequente indução de interleucina-8, que uma citocina pró-infamatória importante no combate da infecção (Beswick et al., 2006).
Vários fatores de virulência bacterianos estão presentes nas cepas de H. pylori, que são implicados no desenvolvimento das doenças gástricas, entre eles estão a urease, a citotoxina associada ao gene A (CagA) da ilha de patogenicidade cagPAI, algumas variantes do gene da citotoxina vacuolatizante (VacA), proteína externa de membrana (OMPs), tais como adesina ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA), adesina ligante de ácido siálico (SabA), proteínas externa inflamatória do tipo A (OipA) e lipoproteinas associadas a aderância (AlpA e AlpB) (Marcus & Scott, 2001; Censini et al., 1996; Telford et al., 1994; Ilver et al., 1998; Madavi et al., 2002; Franco et al., 2008; Odenbreit et al., 1999).
1.1.1. Urease
A urease é um importante fator de virulência da H. pylori, presente em abundância na bactéria, pois é usada para diminuir a acidez do ambiente gástrico. A urease degrada a ureia, que é secretada como resíduo metabólico, resultando em amônia e
carbonato, cuja função principal é tamponar o meio ácido do estomago, permitindo a sobrevivência da H. pylori (Marcus & Scott, 2001; Hu & Mobley 1990).
A urease é constituída por duas subunidades, a subunidade alfa com aproximadamente 24 kDa e beta, com 68 kDa. A quantidade de urease produzida pela H. pylori representa cerca de 5 a 10% das proteínas totais da bactéria (Marcus & Scott, 2001; Hu & Mobley 1990). Esta enzima é crucial para a H. pylori colonizar o estômago, estudos realizados por Tsuda et al., (1994) e Karita et al., (1995), relataram que cepas cujos genes da urease foram nocalteados, não tiveram a capacidade de colonizar espécies animais devido a incapaciade de tamponar o ambiente gastrico (Tsuda et al., 1994; Karita et al., 1995). Williams et al., (1996) afirmam que cepas de H. pylori nocalteadas para o gene da urease não conseguem colonizar o estômago, porque a amônia, gerado pela urease, também serve como fonte de nitrogênio para sintetizar aminoácidos, assim como na proteção contra peroxinitrito (Kuwahara, et al., 2000). Outros estudos relatam que a urease é importante para H. pylori, porque participa do processo de escape da resposta imunológica, proporcionando um aumento na sobrevida da bactéria no macrófago (Schwartz & Allen, 2006), escape da fagocitose (Makristathis et al., 1998) e da opsonização mediada pelo complemento (Rokita et al., 1998).
Embora uma maior quantidade de urease esteja localizada intracelularmente, algumas moléculas estão presentes na superfície da bactéria (Rokita et al., 2000) podendo, assim, agir como uma antígeno ligante que induz a síntese de citocinas inflamatórias, pelas células epiteliais gástricas e macrófagos, (Harris et al., 1998, Takahashi et al., 2004) além de ativar a apoptose de algumas células (Fan et al., 2000). Como o mecanisno de ação associado a estas respostas é disparado pela urease, ainda não está totalmente claro. A indução de apoptose pode resultar como consequência da ligação ao MHCII. A subunidade β urease também pode se ligar ao CD74 e induzir a produção de IL-8 pelas células epiteliais gástricas (Beswick et al., 2006). Ambas as respostas são importantes na patogênese geral observada na infecção pela H. pylori. Diferentes explicações apoiam a interação da urease com o tecido do hospedeiro, além da atividade catalítica, a urease ativa macrófago (Gobert et al., 2002a), monócito (Harris et al., 1996), plaqueta, desregula o complexo de junção das células epiteliais gástricas, induz a produção de citocinas a partir das células epiteliais gástricas (Harris et al., 1998; Takahashi et al., 1998) através da ligação ao CD74 (Beswick et al., 2006).
1.1.2. A ilha de patogenicidade Cag PAI e o fator de virulência cagA
Devido á heterogeneidade genética presente no genoma da Helicobacter pylori, os fatores de virulência bacterianos têm um importante papel na determinação do resultado da infecção. A ilha de patogenicidade cag (cag PAI) é um elemento de inserção de DNA com 40-kb constituído por 27 a 31 genes flaqueado por uma região de repetição direta com 31 pares de bases. Esta ilha contém uma das mais estudadas proteína da H. pylori, a proteína CagA (Censini et al., 1996; Akopyants et al., 1998; Covacci & Rappuoli, 2000).
A proteína CagA foi inicialmente identificada no inicio de 1990 e sua expressão foi associada com ulceração péptica (Cover et al., 1990; Crabtreet al., 1991). Devido a associação com esta manifestação clínica, a ilha cag PAI é um determinante de virulência muito bem caracterizado da H. pylori e o gene da proteína CagA é frequentemente usado como indicador da presença desta da ilha.
Aproximadamente 60 a 70% das cepas de H. pylori ocidentais e quase 100% das do leste asiático expressam CagA (Censini et al., 1996; Tomb et al., 1997; Alm et al., 1999). Embora todas as cepas induzam gastrite, cepas com a ilha cag PAI aumentam o risco para gastrite severa, gastrite atrófica e câncer gástrico distal quando comparados a cepas que não apresentam a ilha (Blaser et al., 1995; Cover et al., 1990; Crabtreet al., 1991; Crabtreet al., 1993; Kuipers et al., 1995; Parsonnet et al., 1997; Peek et al., 1995; Queiroz et al., 1998; Rudi et al., 1997; Shimoyama et al., 1998; Torres et al., 1998; Vorobjova et al., 1998).
O gene cagA sintetiza a proteína CagA que tem 120 a 140 kDa é translocada para célula do hospedeiro pelo sistema de secreção tipo IV (T4SS), após adesão da bactéria. Uma vez dentro da célula hospedeira, a CagA é tirosina fosforilada no motivo glutamato-prolina-isoleucina-tirosina-alanina (EPIYA) e induz mudanças morfológicas na célula, inicialmente denominada de fenótipo “beija-flor”(Asahi et al., 2000; Odenbreit et al., 2000; Segal et al., 1999; Stein et al., 2002, Stein et al., 2000).
Até o momento quatro distintos motivos EPIYA (EPIYA-A, B, C e D) foram identificados na região polimórfica carboxi-terminal da proteína CagA, e eles são distinguidos por diferenças sequências de aminoácidos envolvendo o motivo EPIYA (Hatakeyama, 2004; Higashi, et al., 2005; Naito et al., 2006). Quanto ao padrão de fosforilação, os motivos EPIYA-A e B são fosforilados em menor grau quando comparados com o EPIYA-C. Os motivos EPIYA-A e B estão presentes em cepas do
mundo todo, enquanto o EPIYA-C é encontrada em cepas de regiões ocidentais (Europa, América do Norte e Austrália). O número de sitios EPIYA-C pode variar, embora a maioria das proteínas CagA tenha um único motivo EPIYA-C. Em cepas ocidentais, um aumento do número de CagA EPIYA-C é um importante indicador de risco para o desenvolvimento de câncer gástrico (Basso, et al., 2008). O motivo EPIYA-D é encontrado com predominância em cepas do leste asiático, Japão, Coreia do sul e China, e cepas que contêm este motivo induzem a produção de uma grande quantidade de interleucina-8 (IL-8) pelas células epiteliais gástricas do que cepas CagA dos tipos A-B-C (Figura 2), encontradas no ocidente (Hatakeyama, 2004; Argent et al., 2008;).
Figura 2. Diversidade dos sítios de tirosina fosforilação da proteína CagA da Helicobacter pylori. (Traduzido de Hatakeyama, 2004).
Uma vez fosforilada por membros Ab1 e Src da família das kinases, o complexo fosfo-CagA interage com numerosos efetores intracelulares, se ligando e ativando uma tirosina fosfatase eucariótica (SHP-2) (Figura 3), levando a ativação substancial de proteínas reguladoras de sinal extracelular kinases 1 e 2 (ERK1/2), do adaptador Crk e da tirosina kinase Src-C (Figura 4). A proteína CagA tipo A-B-C do leste asiático exibe uma
forte atividade ligante com SHP-2 do que CagA tipo A-B-C ocidental (Higashi et al., 2002). A interação da fosfo-CagA com a kinase Src-C ativa rapidamente uma via de retroalimentação para regular negativamente a sinalização Src (Tsutsumi et al., 2003).
Figura 3. Proteína CagA e os domínios de fosforilação EPIYA. (Adaptado de Peek et al., 2010)
Figura 4. Desregulação de SHP2 pela proteína CagA (traduzido de Hatakeyama, 2004).
Em linhagens de células de adenocarcinoma gástrico (AGS) a translocação e subsequente fosforilação de CagA resulta no efeito “beija-flor”, um fenótipo associado com o alongamento da célula (Moeset al., 2004; Segal et al., 1999). Em células AGS, a interação entre fosfo-CagA e SHP-2 aumenta o tempo de ativação da ERK de uma maneira independente de ras ou kinase 3 fosfatidilinositol (PI3K), desfosforila e inativa kinase de adesão focal (FAK) resultando no alongamento da célula (Higashi et al., 2004; Tsutsumi et al., 2006). A proteína CagA fosforilada induz alongamento porque danifica o mecanismo de retração celular (Bourzac et al., 2007). Além disso, a atividade catalítica da c-Src é inibida pela CagA fosforilada, que leva a desfosforilação da tirosina da actina ligante das proteínas cortactina, ezrina e vinculina levando ao elongamento celular (Moeset al., 2007; Selbach et al., 2004, Selbach et al., 2003).
A proteína CagA não fosforilada também exerce um efeito na célula, que contribui para a patogênese. A translocação do CagA, mas não sua fosforilação, leva a ativação aberrante da β-catenina, destruindo o complexo de junção apical e a perda da polaridade celular (Amieva et al., 2003; Bagnoli et al., 2005; Franco et al.,2005; Murata-Kamiya et al., 2007; Saadat et al., 2007; Suzuki et al., 2005). Além disso, a CagA não fosforilada altera a proteína de adesão celular, caderina-E, o receptor do fator de crescimento de hepatócito (c-Met), fosfolipase gama-C (PLC-γ), o adaptador da proteína Grb2 e a kinase de particionamento defeituosa 1b, kinase regulatoria microtúbulo 2 (PAR1b/MARK2), que leva a resposta proinflamatória e mitogênica, distruindo a junção celular com perda da polaridade da célula (Churin et al., 2003; Mimuro et al., 2002; Murata-Kamiya et al., 2007; Saadat et al., 2007).
A CagA não fosforilada também ja foi associada com a proteína da zona oclusiva do complexo de junção fechada epitelial (ZO-1) e a molécula A de adesão juncional de proteína transmenbrana (JAM-A) levando a montagem incompleta do complexo de junção fechado do sítio ectópico de ligação bacteriana (Amieva et al., 2003). Recentemente, foi mostrado que CagA está diretamente ligada ao Par1/b/MARK2, um regulador central da polaridade celular, que uma vez associado inibe a atividade da kinase, assim como desregula a formação do fuso mitótico, promovendo a perda da polaridade celular (Lu et al., 2009; Umeda et al., 2009; Saadat et al., 2007).
1.1.3. Toxina VacA
Um lócus da H. pylori associado com risco de doença severas gástrica é o da toxina VacA (Cover et al., 1992, Cover et al., 1994, Phadnis et al., 1994, Schmit & Haas, 1994). A toxina VacA foi primeiramente identificada com uma proteína citotóxica que induz vacuolização intracelular de células em cultura (Leunk et al., 1988). Esta proteína é codificada pelo gene vacA, que codifica uma preprotoxina de aproximadamente 139 kilodaltons , que inclui um peptídio sinal amino-terminal e um domíno carboxi-terminal de 50 kDa, que são clivados na secreção para produzir monômeros maturos da toxina de 87 a 95 KDa (Telford et al., 1994).
A proteína VacA suprime a resposta por linfócitos T, que pode contribuir para a longevidade da infecção gastrica (Gebert et al., 2003; Beevers et al., 2004; Sundrud et al., 2004)
A proteína VacA é codificado pelo gene vacA que está presente na maioria das cepas de H pylori, embora diferenças consideráveis na atividade vacuolizante sejam observadas entre as cepas. Esta variação é atribuída à estrutura do gene vacA, que é constituído por uma região sinalizadora (s), uma região média (m), e posteriormente uma região intermediária (i), que está localizada entre as regiões s e m foi descrita (Rhead et al., 2007).
A região s é estratificada em dois subtipos s1 e s2 e codifica um componente do peptídeo sinal e a terminação N da proteína madura. A região m codifica parcialmente a subunidade C-terminal com 55 KDa e é classificada em tipo m1 ou m2 (Figura 5).
Figura 5. Estrutura da proteina VacA da Helicobacter pylori e seus efeitos funcionais. (traduzido de Polk & Peek, 2010)
Dados da literatura demosntraram que cepas da H. pylori vacAs1m1 têm maior pontencial de induzir vacuolização quando comparadas com cepas vacAs2m2, (Atherton et
al., 1995; Cover e Blaser, 1992; Rhead et al., 2007, Van Doorn et al., 1999). Não existe consenso na associação de bactéria vacAs1m1 com a severidade das doenças gástrica, pois estudos realizados em populações ocidentais, revelaram que o o gene variante VacAs1m1 estava fortemente associado com doenças de úlcera gástrica e duodenal e com câncer gástrico (Atherton et al., 1995; Atherton et al., 1997; Miehlket al., 2000). Enquanto que
outros estudos realizados no leste asiático não demonstraram nenhuma com um resultado clínico específico.
Outras regiões polimórficas no gene vacA já foram descritas, entre elas uma região denominada de i, que classificada em dois subtipos i1 e i2; cuja função foi associada com a atividade vacuolizante, já que cepas vacAs1/i1/m2 são vacuolizante e cepas VacAs1/i2/m2 não induzem vacuolização. Todas as variantes vacAs1m1 são do tipo i1 e as variantes
vacAs2m2 são do tipo i2. As variantes vacAs1m2 podem ser i1 ou i2 (Rhead et al., 2007). Estudos envolvendo pacientes no Iram demonstrou forte associação entre cepas com região i1 e o câncer gástrico e no Iraque e Itália esta região i1 foi relacionada ao maior risco de úlcera gástrica (Rhead et al., 2007; Basso et al., 2008; Douraghi et al., 2009; Hussein et al., 2008), em relação aos pacientes do leste e sudeste asiático, que apresentam altas taxas de câncer gástrico, o subtipo i da região i do vacA não foi associado com o risco da doença (Ogiwara et al., 2008).
Em 2009 foi identificada e denominada de região d, uma deleção de 81 pares de base entre a região m e a região i; cepas d1 não têm a deleção, enquanto cepas do subtipo d2 contêm esta deleção (Ogiwara et al., 2009). Um pequeno número de cepas ocidentais vacA do tipo d1, mas não do leste asiático, foi significativamente associado com infiltração neutrofílica e atrofia da mucosa gástrica demonstrando que os genótipos da região “d” constituem um outro locus de risco para câncer gástrico e ulceração péptica (Ogiwara et al., 2009).
A proteína VacA exerce múltiplos efeitos na estrutura da célula epitelial gástrica resultando em fenótipo que incluem destruição da função da barreira epitelial gástrica e da modulação da resposta inflamatória. Outro efeito da proteína VacA é a destruição do compartimento endossomal posterior, que resulta na formação do vacúolo (Leunk et al., 1988; Papini et al., 1994), e afeta também a mitocôndria, levando a uma diminuição no potencial transmembrana mitocondrial, com liberação de citocromo C, além da ativação de caspase 8 e 9, e indução de apoptose in vitro (Cover e Blaser, 1993; Galmichet al., 2000; Manentet al., 2008; Peek et al., 1999; Willhitet al., 2003).
Um das várias proteínas em que VacA se liga, nas células epiteliais gástricas, é o receptor de fosfatase tiroxina Kinase RPTPβ. Este receptor regula a proliferação das células, diferenciação e adesão, mecanismos estes envolvidos na ulcerogênese (Fujikawa et al., 2003).
1.2. ADESINAS E PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA (OMPS)
A aderência da H. pylori na mucosa gástrica é muito importante na colonização inicial e para o longo tempo de persistência no epitélio gástrico humano. A análise de três genomas completos da H. pylori (cepas 26695, J99 e HPAG1) confirmou a presença de quatro famílias de proteínas externas de membrana (OMPs), que compreende aproximadamente 4% do genoma da bactéria. Entre estas famílias os membros do grupo Hop (proteína externa de membrana de Helicobacter) foram os primeiros a serem caracterizados. Várias OMPs da família Hop foram descritas como moléculas de adesão bacteriana, entre elas a molécula ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA), a molécula ligante de ácido siálico (SabA), lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB), proteína inflamatória externa de membrana (OipA) e HopZ (Yamaoka, 2008) (Figura 6).
A expressão das OMPs foi associada com doenças gastroduodenais e com o risco aumentado para o desenvolvimento do câncer gástrico (Dossumbekoya et al., 2006).
Figura 6. Proteinas de membrana da Helicobacter pylori (Adaptada de Magalhães & Reis, 2010)
1.2.1. Adesina BabA
A adesina ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA) é uma proteína de 75 K-Da codificada pelo gene babA, que possui três variantes babA1, babA2 e babB. A forma ativa do gene é a variante babA2 que tem a capacidade de expressar a proteína BabA (Ilver et al., 1998).
Estudos independentes usando as cepas 26695, J99 e HPAG1-0876 demonstraram que cada uma possui um gene babA e um babB (Alm et al., 1999; Oh et al., 2006; Tomb et al., 1997). A localização genômica dos genes babA e babB são completamente diferentes nas três cepas (Figura 7). Na cepa J99, babA (JHP0833) está localizado depois do gene hypD (JHP0835) sobreposto a um gene especifico (JHP0833) da cepa J99, e babB (JHP1164) está localizado após o gene s18 (JHP1165). Na cepa 26695, as localizações de babA e babB são reversas. A localização cromossômica posteriores aos genes hypD e s18 são referidas como locus A e B, respectivamente. Na cepa HPAG1, um gene OMP posicionado na região dos locus A e B das cepas 26695 e J99, foi denominado de babC, mas a função ainda não é desconhecida (Tomb et al., 1997 Alm et al., 2000; Colcbeck et al., 2006).
Figura 7. Localização genômica dos genes babA, babB, e babC em linhagens J99, 26695, e HPAG1 (Yamaoka, 2008).
O gene bab foi incialmente clonado da cepa CCUG17875 que têm dois genes babA e um gene babB Experimento de inativação gênica demosntrou que apenas um gene (chamado de babA2) tem atividade ligante Leb, enquanto que o outro gene babA1 não tem (Ilver et al., 1998).
1.2.1.1. Regulação do gene babA
Existem diferentes mecanismos de regulação da expressão babA, tanto ao nível da transcrição quanto da tradução. Um exemplo de regulação da tradução é a formação de proteínas quiméricas BabA e BabB, que foi descrito por Pride e Blaser (2002), estes autores descreveram que dois de 42 (5%) isolados clínicos tivereram os primeiros 56 pares de base do gene babB substituídos pelos dos babA (quimera babA/B) na extermidade 5' gene. Além disso, estes autores mostraram que a frequência de conversões gênicas (10-3) ocorridas em cepas de H. pylori são eventos recA-dependente e DNase-resistentes, indicando que o gene quimérico babA/B provavelmente resulta de recombinação intragenômica. Proteínas quimeras BabA/B também foram descritas na infecção experimental por H. pylori em Macacos Rhesus (Solnick et al., 2004).
Além das quimeras BabA/B, proteínas do tipo BabB/A também já foram descritas. Uma cepa mutante babA2 (CCUG17875), incapaz de se ligar ao antígeno Leb, recuperou a sua atividade por recombinação homóloga do gene silencioso babA1 com o locus babB, resultando em uma quimera babB/A (Backstrom et al., 2004).
A análises detalhadas do gene quimérico babB/babA mostrou que os primeiros 47 pares de base eram babB específico, os seguintes 66 pb foram partilhados entre ambos babA e babB, e a sequência restante eram babA específica. Um segundo evento de recombinação, provavelmente ocorre dentro de uma região onde as sequências do babA1 e o locus babB são idênticos. A proteína quimérica BabB/A tem o potencial de se ligar ao antígeno Leb, no entanto, a produção desta proteína está sujeita a variação de fase da bactéria, que é gerada através do pareamento desigual, resultante do número de repetição de resíduos de cisteína-treonina na região 5' do gene babB (Yamaoka, 2008).
Inicialmente, foi descrito que apenas cinco genes, que codificam as OMPs na H. pylori (oipA, Saba, sabB, babB e hopZ), estão submetidos a variações de fase na extremidade 5' do gene, de tal modo que nem todas as cepas produzem proteínas
funcionais (Tomb et al., 1997; Alm et al., 1999;). Mas, estudos posteriores confirmaram que a variação de fase é um método de regular a produção da proteína BabA em algumas cepas (Solnick et al., 2004, Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006).
Análises detalhadas do gene babA com repetições de TC mostraram que o peptídeo sinal está intimamente relacionado com aqueles das proteínas parálogas de babB, as seqüências “downstream” foram seqüências típicas de babA (Hennig et al., 2006). Assim, o gene babA, com repetição CT, pode ser resultado da translocação de babA para babB, gerando um gene quimérico babB/babA. Um dado observado era que o gene babC na cepa HPAG1possuía repetição CT no segmento codificador na posião 5', enquanto que o gene babC da cepa 26695 não apresentava, sugerindo que quimeras babB/C também pode ocorrer em algumas cepas. Estes foram casos de cepas mistas entre os genes babA e babB, especialmente no locus B (Colbeck et al., 2006). A freqüência de babA translocado para o locus babB foi entre 10-3 e 10-4, que está de acordo com a freqüência em cepas CCUG17875 (Backstrom et al., 2004).
A investigação detalhada de 10 cepas mostrou que um evento de recombinação foi identificado a partir de aproximadamente 50 a 200 pb posterior ao códon ATG em cinco cepas (todas as recombinações ocorraram no locus B) e antes do códon ATG nas outras cinco cepas. No primeiro caso, o gene resultante forma o babB/A, enquanto a recombinação completa ocorreu no último caso. Eventos de translocação, em geral é freqüente entre os genes babA e babB e parece ser o principal mecanismo de regulação da expressão babA. Portanto, H. pylori utiliza tanto a variação antigênica e a variação de fase para regular expressão de babA (Colbeck et al., 2006).
1.2.1.2. Mutação genômica na região codificadora do gene babA
O gene babA inicialmente foi clonado de cepas CCUG17875, que contém um gene silencioso babA1 e um alelo ativo com babA2 (Ilver et al., 1998). A sequencia desses dois genes diferem unicamente em uma deleção de 10 pares de bases na sequencia peptídica sinal do gene babA1 que resulta na perda do códon de iniciação da tradução. Fujimoto et al., (2007) mostraram que pelo menos 80 cepas do leste e oeste asiático tinham o códon de iniciação ATG intacto no gene baba, enquanto outros estudos detectaram a ausência da deleção no gene babA1 (Pridet al., 2001; Pride & Blaser 2002; Sheu et al., 2003; Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006). De um modo geral a deleção do códon de
iniciação da tradução do gene babA1, descrito na cepa CCUG17875, pode ser um evento raro. A mutação de ponto pode resultar em um códon de parada, deleção e inserção em outras regiões do gene babA, mas também não são comuns. Hennig et al., (2006) encontraram 1 cepa no total de 24 babA positivas, que apresentava uma mutação (na posição do aminoácido 55), que gerava deslocamento de leitura co inibinção da expressão da proteína BabA.
1.2.1.3. Regulação da transcrição do gene babA.
Segundo Backstrom et al., (2004) a atividade transcricional do gene babA é regulada pelo número do nucleotídeo adenina (poli A), presentes nos box -10 e -35 na região promotora do gene babA. Esta região é estável quando existem 10 adeninas, conferido atividade trancricional do gene babA2, mas se o número adenina se eleva para 14, a atividade transcricional do gene é perdida, uma caracteristica presentes no gene babA1.
Backstrom et al., (2004) também sugeriram que a região mencionada acima pode ser propensa à mutações, pois geram deslocamento no quadro de leitura, o que poderia levar a mudanças nos níveis trasnscricionais do gene. Apesar disso, outros estudos não confirmaram que este mecanismo tenha um papel importante na regulação da expressão do gene babA.
Existem pelo menos cinco tipos de mecanismos distintos para cepas de H. pylori não expressarem o gene babA: a) ausência de gene babA, incluíndo o quimera babA/B; b) o gene babA está presente, mas está inativo pelo deslocamento no quadro de leitura; c) o gene está presente sem o código de iniciação da tradução; d) o gene está presente mas com mutação sem sentido inviabilizando a tradução; e) o gene está presente mas sem mutação aparente e também sem explicação para a ausência de expressão (Yamaoka 2008).
1.2.1.4. Função da proteína BabA
A proteína BabA se liga ao antígeno difucosilado Leb presente na superfície das células epiteliais gástricas (Borén et al., 1993; Gerhard et al., 1999; Ilver et al., 1998). Um
estudo experimental com ratos transgênicos, que expressam Leb nas células epiteliais gástricas, indicou que o antígeno Leb é um receptor da bactérial, pois após a infecção experimental, uma gastrite mais severa foi observada nestes ratos quando comparados com os tipos selvagens, sugerindo que a colonização mediada pelo Leb pode aumentar o potencial patogênico da H. pylori (Guruget al., 1998).
A análise de ligantes específicos de cepas de H. pylori sugere que a adesina BabA está envolvida na modificação do padrão de glicosilação da mucosa gástrica para permitir que H. pylori se adapte e mantenha a persistência de colonização no seu hospedeiro (Aspholm-Hurtig et al., 2004; Pohl et al., 2009).
A presença do gene babA2 foi associado com doença gástricas e quando encontrado com em conjunto com cagA e variante VacAm1s1 aumenta o risco doenças mais severa como carcinoma e úlcera (Gerhard et al., 1999).
A análise do babA2 como marcador de virulência tem produzido dados conflitantes em relação a sua expressão e os resultados clínicos, mostrando que a importância do babA2 nas doenças gástricas dependente da origem geográfica das cepas de H. pylori. Em populações portuguesas, babA2 não é um biomarcador de doença de úlcera péptica ou câncer gástrico (Chomvarin et al., 2008; Gatti et al., 2006). Contudo cepas isoladas na Alemanha, Turkia e ou norte de Portugal a expressão de babA2 está associada com severidade das doenças gástricas (Azevedo et al., 2008; Erzin et al., 2008, Gerhard et al., 1999)
1.2.2. Proteína ligante de ácido siálico (SabA)
A adesina ligante de ácido siálico (SabA) é uma proteína de 70 KDa com 651 aminoácidos, que se liga à estrutura carboidrática LewisX sializado expressas nas células epiteliais gástricas da mucosa inflamada (Madavi et al., 2002). Esta proteína é codificada por um gene que apresenta uma diversidade genética entre as cepas de H. pylori (Shao et al., 2010). Shao et al., (2010) demonstraram uma variação genética entre cepas isoladas de amostras clínicas, atingindo 5 a 11,5% na fita nucleotídica e de 5,1% a 13,5% na sequência de aminoácido. A análise filogenética, a partir da sequência do gene sabA, demonstrou que as cepas de H. pylori se agrupam de acordo com sua origem geográfica, assim foi evidenciado um agrupamento com todos os isolados do Japão e outro com cepas de países ocidentais (Shao et al; 2010).
A expressão do gene sabA está associada com o risco aumentado de câncer gástrico, mas com risco diminuído para úlcera duodenal (Yamaoka et al., 2006). Além disto, o gene sabA é regulado pela variação de fase, porque a expressão da proteína SabA pode ser rapidamente modulada “ON/OFF” para se adaptar às mudanças no nincho gástrico (Yamaoka et al., 2006).
Yanai et al., (2007) relataram uma alta prevalência de sabA funcional (81%) em 108 isolados de H. pylori, a partir de amostras clínicas de pacientes japoneses. Eles demonstraram, ainda, uma estreita relação entre o estado do gene sabA e gastrite atrófica, mas o mecanimo de controle da regulação da expressão do gene sabA ainda é pouco conhecido.
Um estudo realizado em Taiwan baseado em análise de blotting de 145 isolados clinicos de H. pylori de pacientes do ocidente detectou que apenas 31% das cepas expressam a proteína SabA (Sheu et al., 2006). Sheu et al., 2006 sugerem que a regulação da expressão do gene sabA está submetida a variação de fase da bactéria.
Estudos mostraram que a variação de fase é um método de regulação da expressão da proteína SabA em algumas cepas (Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006; Solnick et al., 2004). A funcionalidade é regulada por um mecanismo de pareamento desigual que é mediada pelo número de timina-citosina na posição 5 'do gene.
As seqüências do genoma das cepas de H. pylori J99 mostram que o gene sabA tem nove repetições de timina-citosina fora do quadro de leitura (Mahdavi et al., 2002). Mahdavi et al. (2002) usaram a cepa J99 como ligante de sLex para identificar expressão da proteína sabA, embora os isolados possuíssem 10 repetições CT, a proteína SabA ainda sim era funcional (Mahdavi et al., 2002).
Yamaoka et al., (2002) em estudo experimental, usando o murino como modelo experimental de infecção para H. pylori, observaram que tanto o gene sabA quanto o sabB mudam seu estado funcional (de "on" para "off"). Durante o período de experimentação, quatro semanas após a inoculação, foi verificado que o estado funcional do gene sabA presente nas cepas JK101, inoculadas e posteriormente isoladas de um dos camundongos infectados, foi modificado (duas de nove colônias alteraram sabB de "on" para "off" e uma das nove colônias alterou de sabA de "on” para" off "). Os dados deste estudo revelaram que, a densidade bacteriana em ratos infectados com H. pylori, que alteraram o perfil para "off" foi reduzido em comparação com as de camundongos que não demonstram nenhuma mudança no perfil. Assim, este estudo verificou o estado funcional do gene sabA pode
responder rapidamente às mudanças das condições no estômago ou em diferentes regiões do estômago (Yamaoka et al., 2006).
A análise da repetição TC do gene sabA em cepas isoladas de pacientes de Taiwan (Sheu et al., 2006), revelou que dentre 145 cepas de H. pylori isoladas, 116 (80%) apresentavam o gene sabA por PCR, mas apenas 45 (31%) expressaram a proteína SabA, quando detectada por técnica de IMUNOBLOT. Também foi observado neste estudo, que o sequencimento dos produtos de PCR sabA positivos, a partir de 92 isolados, identificaram que 60% (n = 55) tinham a sequencia de repetição CT, ao passo que os outros 40% (n = 37) tinham repetição de TC diferentes (isto é, CTTTCTCTATCC) na região 5' do gene sabA. Entre aquelas com um intervalo regular de repetição CT, 18 cepas tiveram uma seqüência de quadros traduzível (subtipo "on"), mas apenas 13 destes tiveram a tradução do fragmento completo da proteína.
1.2.3. Proteína inflamatória externa (oipA)
A proteína oipA é outra adesina externa de membrana da H. pylori, que foi associada significativamente com a presença de úlcera duodenal, câncer gástrico e aumento da infiltração neutrofílica (Franco et al., 2008, Yamaoka et al., 2006).
A expressão de oipA foi relacionada com o aumento de produção de IL-8 (Yamaoka et al., 2004). Um estudo usando o Moglian gerbilis infectado com cepas de Helicobacter pylori tipo selvagem e uma cepa isogênica mutante para oipA demonstrou que oipA induz a produção das citocinas IL-1, IL17 e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e conseqüentemente inflamação da mucosa gástrica. A proteína oipA está também envolvida na regulação positiva da metaloproteínase matrix I, MMP associado com o câncer gástrico (Wu et al., 2006), na indução da kinase glicose sintetase 3 (GSK-3β) (Tabassam et al., 2009) e na translocação da catenina para o núcleo. O acúmulo de β-catenina resulta na formação de heterodímero com o fator transcricional LEF/TCF e na ativação transcricional de genes que podem influenciar na carcinogênese (Franco et al., 2008).
1.2.4. Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB)
Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB) são proteínas da membrana externa da Helicobacter pylori envolvidas na adesão às células epiteliais gástricas. Constituem dois genes homólogos ligados, que codificam uma proteína de 518 aminoácidos cada um. A AlpA carreia uma seqüência sinal para uma lipoproteína funcional. Já AlpB apresenta uma sequência sinal do tipo padrão N-terminal e mostra uma grande homologia da sequência de amino-ácido com AlpA. Ambos os genes são organizados em um operon, mas nenhuma sequência promotora consensual, no síto inicial da transcrição, foi descrita até o momento para estes genes. A porção C-terminal de ambas as proteínas formam uma proteína externa da membrana do tipo tubo-beta porina, consistindo de 14 lâminas-beta transmembrana anfipática (Odenbreit et al., 1999).
Odenbreit et al., (2002) observaram, através de estudos in vitro, que o operon Alp (que consiste em AlpA e AlpB) está envolvido na adesão da Helicobacter pylori à células epiteliais gástricas, eles demonstram que o OMPs Alp contribui significativamente para o sucesso da infecção pela H. pylori em cobaias.
A diminuição acentuada na eficiência de colonização através de AlpA e mutantes AlpB foi atribuída a uma deficiência dos mutantes em se aderir às células epiteliais gástricas in vivo (Jonge et al., 2004). Como consequência da inativação da codificação dos genes destas duas proteínas de membrana externa, a H. pylori pode provavelmente ser removida com facilidade do estômago, portanto não sendo capaz de persistir na superfície epitelial e causar inflamação da mucosa gástrica.
A transcrição do gene alpA in vivo em tecido gástrico humano, bem como em tecido gástrico de murino, está presente nos primeiros 3 meses de infecção (Rokbi et al., 2001). A transcrição de alpA é dez vezes superior 1 h pós-infecção quando comparda a transcrição da urease e do 16S rRNA, indicando que essas proteínas desempenham um papel ativo no estabelecimento e manutenção inicial da colonização gástrica (Rokbi et al., 2001.).
1.3. RESPOSTA IMUNOLÓGICA À Helicobacter pylori
A Helicobacter pylori induz tanto a resposta imunológica humoral quanto a celular. Uma resposta por anticorpo produzido no local e ao nível sistêmico tem sido demonstrada e incluem isotipos IgA, IgM e IgG (Crabtre et al., 1991, Rathbon et al., 1986; Wyatt et al., 1986). Estudos iniciais com modelos de ratos demonstraram que a imunização com antígenos da bactéria H. pylori podem induzir uma resposta protetora (Marchetti et al., 1995).
Embora proteínas da H. pylori tenham sido demonstradas na lâmina própria do estômago (Mai et al., 1992), H. pylori é geralmente considerada como um patógeno não invasivo, se localizando primeiramente na lâmina do muco extracelular. Contudo, tem sido demonstrado a habilidade da H. pylori invadir as células epiteliais gástricas tanto in vitro (Amieva et al., 2002) quanto in vivo usando estômago humano e de macaco (Semino-Mora et al., 2003), assim como em ratos com gastrite atrófica (Oh et al., 2005).
Já foi demosntrado a ligação da H. pylori em eritrócito de microvasos da lâmina própria (Aspholm et al., 2006). A técnica de imagem de microscopia eletrônica de transmissão e a detecção de imunoouro foram usadas para demonstrar que células de H. pylori estão em contato direto com células imunológicas da lâmina própria na maioria de pacientes com gastrites e câncer gástrico (Moes et al., 2007).
1.3.1. Macrófagos sinalizadores de linfócitos T na infecção pela H. pylori
Macrófagos são essenciais na resposta imune inata contra a H. pylori e para a sinalização das células epiteliais gástricas, que estão em contato direto com a bactéria na superfície da mucosa. Os macrófagos e monócitos são importantes coordenadores da resposta imunológica desencadeada ao patógeno, e no caso da H. pylori, eles são prováveis ativadores, junto com células dendríticas (DCs), da imunidade adaptativa pela produção de fatores, como a IL-12, que estimula células Th1, resultando na produção de citocinas como IFN-γ (Haerbelet al., 1997, Meyer et al., 2003, Meyer et al., 2000).
A proteína ativadora de neutrófilo (NAP) do Helicobacter pylori contribui para a polarização da resposta Th1 estimulando a secreção e ambas as citocinas IL-12 IL-23 de neutrófilos e monócitos (Amedei et al., 2006). A produção de IL-12 na mucosa gástrica
