UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BRUNO VARELA MOTTA DA COSTA

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UNIVERSIDADEFEDERALDEPERNAMBUCO CENTRODECIÊNCIASBIOLÓGICAS

BRUNO VARELA MOTTA DA COSTA

EFEITO DO PENEIRAMENTO SOBRE A TOXICIDADE DE SEDIMENTO CONTAMINADO POR ÓLEO SUBMETIDO A TRATAMENTOS DE

BIORREMEDIAÇÃO

RECIFE 2010

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BRUNO VARELA MOTTA DA COSTA

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenação do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ciências Ambientais, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientadora: Profa. Dra. Lília Pereira de Souza Santos

RECIFE 2010

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BRUNO VARELA MOTTA DA COSTA

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenação do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ciências Ambientais, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.

Data de Aprovação: _____/_____/____

Nota:

BANCA EXAMINADORA:

_____________________________________

Profa. Dra. LÍLIA PEREIRA DE SOUZA SANTOS(Orientadora) Departamento de Oceanografia – UFPE

_____________________________________

Prof. Dr. GILVAN TAKESHI YOGUI (1º Titular)

Departamento de Oceanografia – UFPE

_____________________________________

Dra. CRISTIANE MARIA VARELA DE ARAÚJO CASTRO (2º Titular)

__________________________________________________

Profa. Dra. ELIETE ZANARDI LAMARDO (Suplente)

Departamento de Oceanografia – UFPE

RECIFE 2010

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço ao meu bom Senhor Jesus, o primeiro que em mim acreditou dando-me espontaneamente sua vida. Por causa deste sacrifício posso enfrentar e vencer os desafios da vida.

Ao meu pai Fred e minha mãe Suzana, que durante a vida tantos sacrifícios fizeram por amor aos filhos. Meus queridos pais, vocês colherão os frutos de tanto investimento feito em minha vida.

À minha orientadora, professora Lília, por ter me convidado a trabalhar em seu laboratório, no qual tive tantas oportunidades para aprender. Que a benção de Deus, como orvalho sobre a terra, esteja sobre tua vida e família.

À minha querida amiga Gaby, com quem tive o privilégio de trabalhar em vários experimentos e que me ajudou a crescer bastante no laboratório. Que Jesus, o Salvador, dê a você e sua família todas as bênçãos liberadas pelo Seu sacrifício na cruz.

Aos meus amigos do LACE, Kika, Lela, Bia, Lilian, Deloar, Cris, Nana, Ari, Cíntia, Petrus, Camila e a todos os amigos do DOCEAN. Agradeço a Deus pela oportunidade de tê-los conhecido. Suas vidas são por demais especiais, nunca se esqueçam disso.

Aos muitos amigos do curso de Ciências Ambientais, em especial a todos aqueles que fizeram parte minha turma (Jadson, Victor, Carlos, Allan, Mari e Leide, Ari, Iraci, Marli, Raquel, Thalita, Tainah, Paula, Camila, Marina). Que o amor incondicional de Deus possa guiá-los em todos os momentos e que vocês conheçam o propósito pelo qual foram criados.

À querida Professora Laura Mesquita Paiva, coordenadora do curso, pela amizade e carinho com que sempre me tratou. Que Jesus, o Autor da Vida, te abençõe e te encha de alegrias.

À todos os meus irmãos em Cristo do ministério Obreiros de Cristo e do ministério Rugido do Leão. Vocês também são a família que Deus me deu, e por vocês o Pai têm me dado muitas alegrias.

À FINEP e PETROBRÁS pelo financiamento do projeto Processos de Biorremedição da Rede Cooperativa em Recuperação de Áreas Contaminadas por Atividades Petrolíferas - RECUPETRO e sub-rede Resíduos Líquidos do Nordeste – RELINE , na qual se insere este estudo.

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“Porque Deus tanto amou o mundo que deu o seu Filho Unigênito, para que todo

o que nele crer não pereça, mas tenha a vida eterna.”

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RESUMO

Geralmente, a estrutura para processamento do petróleo está localizada próxima a ecossistemas costeiros altamente produtivos, como os manguezais. Os hidrocarbonetos do petróleo liberados nos manguezais depositam-se no sedimento, o qual pode se apresentar tóxico aos organismos. Tratamentos de biorremediação dos sedimentos se utilizam da capacidade de microorganismos para degradar hidrocarbonetos, que pode ser estimulada pela adição de fertilizantes. A eficácia dos tratamentos de biorremediação pode ser avaliada submetendo estes sedimentos a testes de toxicidade. Os sedimentos contaminados freqüentemente são peneirados como preparo das amostras para a realização dos bioensaios. Torna-se essencial avaliar possíveis impactos desta manipulação sobre a toxicidade do sedimento. O objetivo deste trabalho foi, portanto, avaliar o efeito do peneiramento sobre a toxicidade de sedimento submetido a tratamentos de biorremediação. Sedimentos cronicamente contaminados do estuário do rio São Paulo foram submetidos a tratamentos de bioestímulo com fertilizantes. Bioensaios com o copépodo Tisbe biminiensis foram realizados para avaliar a toxicidade ao longo do tempo de três tratamentos: referência, sem adição de fertilizantes; NPK e OSMOCOTE. Cada tratamento foi dividido em dois grupos: peneirado (< 63 µm) e não peneirado, e para cada tratamento foram feitas três réplicas. Os sedimentos do rio Maracaípe foram utilizados como controle. Os bioensaios foram realizados em recipientes-testes contendo 2 g do sedimento e 20 ml de suspensão de diatomácea, sendo colocadas 10 fêmeas em cada recipiente. Os bioensaios duraram 7 dias, ao fim dos quais as fêmeas eram coradas e fixadas para análise dos efeitos letais (sobre a sobrevivência) e sub-letais (fecundidade e percentual de copepoditos). Os sedimentos coletados no estuário do Rio São Paulo não se apresentaram letais às fêmeas de Tisbe biminiensis, porém reduziram drasticamente a fecundidade dos organismos expostos. O percentual de copepoditos foi significativamente maior que o controle nestes sedimentos. A introdução do fertilizante NPK interferiu na sobrevivência das fêmeas 24 h após adição dos fertilizantes, o mesmo não sendo observado no tratamento com OSMOCOTE. A fecundidade total dos organismos foi significativamente reduzida nos sedimentos do rio São Paulo e após adição dos fertilizantes. Porém, ao longo do tempo a fecundidade aumentou nos três tratamentos, não havendo diferenças significativas entre tais tratamentos. O percentual de copepoditos durante todo experimento foi significativamente maior nos tratamentos com NPK e OSMOCOTE relativamente ao controle e referência. A sobrevivência não variou significativamente entre o grupo peneirado e não peneirado, porém a fecundidade total foi significativamente menor no grupo peneirado. O percentual de copepoditos também foi significativamente menor no grupo peneirado. O grupo peneirado se apresentou mais tóxico aos organismos, e isto pode ser devido a uma maior concentração de hidrocarbonetos na fração de sedimento < 63 µm. A eficiência dos tratamentos de bioestímulo para reduzir a toxicidade foi semelhante ao tratamento referência, indicando que esta adição não foi eficiente na redução da toxicidade. A atenuação natural é indicada como melhor forma para tratamento dos sedimentos do rio São Paulo, não sendo indicada a adição dos fertilizantes investigados. Em adição, o peneiramento pode ser utilizado como técnica para preparo das amostras antes da realização dos bioensaios. Palavras-chave: manguezal; contaminação; óleo; toxicidade; Tisbe biminiensis

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ABSTRACT

In coastal areas, oil processing facilities are usually located in the vicinity of highly productive ecosystems such as mangroves. Petroleum hydrocarbons eventually leaked to mangroves are mainly deposited in sediments and may be toxic to organisms. Bioremediation is one of the methods employed for sediment clean up, and uses the capacity of microorganisms to degrade hydrocarbons. Growth of microorganisms can also be stimulated by addition of fertilizers. Sediment toxicity tests are a useful tool for evaluation of the effectiveness of bioremediation treatments. Preparation of samples prior to bioassays often includes sieving for retention of indigenous fauna that might influence result of the tests. So it is essential to assess possible impacts of this manipulation on sediment toxicity. This study investigated the effect of sieving on the toxicity of sediments exposed to bioremediation treatments. Chronically contaminated sediments from the São Paulo River estuary were subjected to biostimulation treatment with fertilizers. Bioassays with spawning female copepods (Tisbe biminiensis) were conducted to evaluate the toxicity of three treatments over time: reference (no fertilization), NPK and OSMOCOTE. Each treatment had three replicates and was divided into two groups: sieved (< 63 µm) and non-sieved. Estuarine sediment from Maracaípe River was used as control. Bioassays were carried out in tests containers with 2 g of sediment and 20 mL of a diatom suspension, and 10 females were added to each container. The bioassays lasted for 7 days. At the end of this period, copepod females were stained and fixed for counting and measurement of lethal (i.e., survival) and sublethal effects (i.e., fecundity and percentage of copepodites). Sediments collected in the São Paulo River estuary did not exhibit lethal effects on females of Tisbe biminiensis, but drastically reduced their fecundity. The percentage of copepodites was significantly higher in treatments than in the control sediment. According to the results, introduction of NPK fertilizer affected survival of females 24 hours after fertilization. This effect was not observed in sediments fertilized with OSMOCOTE. Initially, female fecundity was significantly reduced in sediments of the São Paulo River. Fertility rates then increased over time in all three treatments although no significant differences were observed between them. At all sampling times, the percentage of copepodites was significantly higher in NPK and OSMOCOTE treatments when compared to control and reference sediments. Survival did not vary significantly between the sieved and non-sieved group, but the total fertility rate was significantly lower in the former. The percentage of copepodites was significantly lower in the sieved group. This group was comparatively more toxic to organisms, and such a fact may be due to a higher concentration of hydrocarbons in the sediment fraction < 63 µm. The efficiency of biostimulation treatments to reduce sediment toxicity was similar to the reference treatment, indicating that addition of fertilizers was not effective in reducing toxicity. Therefore, natural attenuation is indicated as the best treatment for sediments of the São Paulo River estuary. In addition, sieving may be used as a technique for preparation of samples prior to bioassays.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Localização da Baía de Todos os Santos mostrando as áreas de atividades relacionadas à indústria petrolífera.

Figura 2. Mapa da Área de Refino da BTS mostrando a localização da RLAM, do separador óleo – água (S), da estação de tratamento de efluente (ETDI), do Terminal Marítimo (TEMADRE) e da Estação Pedra Branca

Figura 3. Fotos do galpão de simulação montado na Estação Pedra Branca, do sedimento coletado no rio São Paulo, dos aquários e das colunas de vidro onde os sedimentos foram colocados e submetidos a tratamentos de biorremediação.

Figura 4. Desenho esquemático dos aquários utilizados nos tratamentos de biorremediação mostrando os tempos de retirada das colunas.

Figura 5. Médias (± desvio padrão) da sobrevivência (A), fecundidade total (náuplios + copepoditos) e percentual de copepoditos na prole (C) de Tisbe biminiensis no bioensaio inicial, 24 h após início do experimento.

Figura 6. Médias (± DP) da sobrevivência de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO no grupo peneirado e não peneirado. Figura 7. Médias (± DP) da fecundidade total (náuplios + copepoditos) de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO no grupo peneirado e não peneirado.

Figura 8. Médias (± DP) do percentual de copepoditos na prole de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO no grupo peneirado e não peneirado.

Figura 9. Gráficos mostrando a variação da concentração da amônia e do percentual de carbono orgânico ao longo do tempo e nos três tratamentos de biorremediação.

Figura 10. Gráficos de correlação entre o número de fêmeas sobreviventes com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado e não peneirado.

Figura 11. Gráficos de correlação entre a fecundidade total com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado e não peneirado.

Figura 12. Gráficos de correlação entre o percentual de copepoditos na prole com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado e não peneirado.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultados das estatísticas para os bioensaios com Tisbe biminiensis.

Tabela 2 - Valores obtidos nos bioensaios com Tisbe biminiensis ao longo do tempo nos quatro tratamentos.

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...10 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...14 3 OBJETIVOS...17 3.1 Objetivo geral...17 3.2 Objetivos específicos...17 4 METODOLOGIA...18 4.1. Área de estudo...18 4.2 Coleta de sedimentos...21 4.3 Simulação de biorremediação ...22 4.4 Cultivo de copépodos...24 4.5 Cultivo de microalgas...25

4.6 Bioensaios com Tisbe biminiensis...25

4.7 Análises físico-químicas...26

4.8 Análises estatísticas...26

5 RESULTADOS...28

5.1. Bioensaio inicial – 24 h após início do experimento...28

5.2. Bioensaios com divisão entre grupo peneirado e não peneirado...28

5.3 Análises físico-químicas e correlações com parâmetros biológicos...37

6 DISCUSSÃO...38

7 CONCLUSÕES...45

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1 INTRODUÇÃO

A exploração de petróleo em território brasileiro se iniciou no final da década de 30 com a descoberta de campos de óleo no estado da Bahia, porém atualmente a exploração, o refino e transporte de óleo encontram-se difundidos pelo país. Dados da Agência Nacional de Petróleo (ANP) demonstram o tamanho e a importância desta indústria para a economia do país: no final de 2009 as reservas totais de petróleo foram contabilizadas em 21,1 bilhões de barris, refletindo um aumento anual na última década de 5,6% na descoberta de novos campos. Em 2009, a produção nacional diária de petróleo chegou a 711,9 milhões de barris, com 90% desta produção concentrando-se em campos marítimos. Para processar todo este petróleo produzido existem 16 refinarias instaladas no país e 62 terminais aquaviários para viabilizar o armazenamento e transporte (ANP, 2010).

Algumas das refinarias existentes no Brasil localizam-se próximas a ecossistemas costeiros e foram construídas antes de 1980, quando questões ambientais não eram levadas em consideração no planejamento, localização e construção destas plantas (SILVA et al., 1997) facilitando assim derrames acidentais e contaminação por petróleo e seus derivados. Ao longo da linha de costa brasileira, vários ecossistemas costeiros são encontrados, entre os quais os manguezais, que ocupam 90% da costa (SCHAEFFER-NOVELLI et al, 2000). Os ecossistemas costeiros diferem em sua sensibilidade a contaminação por óleo e derivados e, como demonstraram Gundlach e Hayes (1978), os manguezais são os mais sensíveis a esta contaminação.

Os manguezais apresentam características únicas tais como alta produtividade primária, detritos abundantes, alto percentual de carbono orgânico e condições anóxicas/redutoras (BERNARD et al., 1996) fazendo com que sejam capazes de absorver e preservar hidrocarbonetos de petróleo. Devido à grande quantidade de material particulado em deposição, os hidrocarbonetos tendem a se acumular no ambiente sedimentar (SOUSA, 2002), que passa a atuar tanto como sumidouro quanto como fonte para estes contaminantes (BURTON et al., 2002; NIPPER et al., 1998). Este acúmulo ocorre devido à característica hidrofóbica destes contaminantes e o alto coeficiente de partição água - sedimentos (Kd) (CHU; CHAN, 2000) também contribui para a adsorção dos contaminantes aos sedimentos.

Os sedimentos representam importante componente dos ecossistemas aquáticos, provendo áreas de habitat, alimentação, desova e criação para várias espécies (CHAPMAN;

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WANG, 2001), e o acúmulo de contaminantes pode apresentar riscos aos organismos que vivem neste habitat. Os efeitos da contaminação dos sedimentos por óleo sobre os organismos podem ser percebidos em várias fases do ciclo de vida destes e são variáveis, desde letalidade aguda até efeitos crônicos sub-letais (ABESSA et al., 2006), além de distúrbios ecológicos (CHAPMAN, 2002). Estes efeitos já foram documentados por meio de bioensaios com copépodos (BELLAS; THOR et al., 2007; LOTUFO, 1997;), camarão (WIRTH et al., 1998), anfípodos (LANDRUM et al., 2003) e também por avaliações da estrutura de comunidades de manguezais (ANDERSEN et al., 2008; MELVILLE et al., 2009).

Diante da contaminação dos manguezais por hidrocarbonetos e os efeitos negativos desta, algumas estratégias de remediação têm sido aplicadas. Cantagallo et al. (2007) destacou o uso de estruturas absorventes, esteiras recolhedoras e skimmers para remoção do óleo, porém estes métodos físicos podem causar danos às plântulas, remoção de organismos e revolvimento do substrato, transportando o óleo para camadas mais profundas do sedimento. A escolha inadequada do método de limpeza pode maximizar os danos provocados pelo óleo, exigindo então estratégias de remediação mais eficientes e seguras. Nesta perspectiva, novas estratégias estão surgindo como a aplicação de biossurfactantes, de fertilizantes para correção das concentrações de nutrientes do ecossistema e de consórcios de microorganismos eficientes na degradação dos hidrocarbonetos.

Estas novas estratégias de remediação dos manguezais se utilizam da capacidade intrínseca dos microorganismos deste ecossistema para degradar hidrocarbonetos (MILLS et al., 2003), e podem ser vantajosas por evitarem maiores danos a ecossistemas sensíveis (DOWTY et al., 2001). Os biossurfactantes são utilizados para aumentar a solubilidade de componentes do óleo na água (MULLIGAN, 2005) aumentando a disponibilidade destes aos microorganismos. Estes compostos de origem biológica estão substituindo os dispersantes químicos, cuja aplicação em ambientes costeiros no Brasil é proibida (BRASIL, 2000), e apresentam vantagens como baixa toxicidade e biodegradabilidade (RAHMAN; GAKPE, 2008). Contudo, a simples aplicação de biossurfactantes pode não ser muito eficiente na remoção do óleo, pois em ecossistemas como os manguezais o crescimento das populações de microorganismos é limitado pelas baixas concentrações de nutrientes (BURNS et al., 1999).

A adição de fertilizantes pode corrigir as concentrações de nutrientes nos manguezais, permitindo desta maneira o crescimento das populações de microorganismos e degradação do óleo. Esta estratégia é conhecida como bioestímulo e estudos têm encontrado altas taxas de

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remoção de componentes do óleo por meio dela (MILLS et al., 2004; YU et al., 2005). Porém, a adição de nutrientes pode não assegurar uma remoção eficiente de hidrocarbonetos. Nas comunidades microbianas existem várias espécies com potencial diferenciado de degradação do óleo, e a competição entre estas espécies pode diminuir a eficiência da biorremediação. Smith et al. (1998) expôs esta questão por meio da Teoria da Proporção do Recurso, afirmando que o crescimento de diferentes espécies microbianas pode ser influenciado por fatores como as proporções dos nutrientes. Desta maneira, os nutrientes devem ser adicionados numa proporção que estimule o crescimento das espécies com maior potencial de degradação dos hidrocarbonetos. A competição entre as espécies também pode reduzir a eficiência da técnica conhecida como bioaumentação (YU et al., 2005), que consiste na adição de consórcios de microorganismos ao ecossistema contaminado.

A eficiência das diferentes estratégias de biorremediação pode ser avaliada de diversas maneiras. Geralmente estas estratégias têm sido avaliadas por meio de análises químicas, cujo objetivo é quantificar a redução nas concentrações de hidrocarbonetos. Contudo, estas análises não conseguem mensurar os efeitos biológicos da contaminação (WANG et al., 2001), nem permitem avaliar a biorremediação quanto à redução da toxicidade aos organismos. Diante disso, tem sido recomendado que testes de toxicidade sejam utilizados para acompanhar o progresso da biorremediação de ecossistemas contaminados (DAWSON et al., 2007). Desta maneira, os testes de toxicidade apresentam-se como uma ferramenta para avaliar se as estratégias de biorremediação causaram algum efeito negativo à biota e se foram eficientes na redução da toxicidade.

As avaliações ecotoxicológicas podem ser utilizadas para avaliar a eficiência das estratégias de biorremediação, complementando assim as análises químicas. Mueller et al. (2003) mostraram ser vantajoso utilizar bioensaios para avaliar a dinâmica da toxicidade do sedimento contaminado com óleo e submetido ao bioestímulo. Estes testes são freqüentemente realizados em laboratório, o que implica a obtenção de amostras do campo e a preparação destas para os testes de toxicidade. O peneiramento do sedimento tem sido uma manipulação comum antes de submeter a amostra ao bioensaio. Esta manipulação tem como objetivo remover organismos indígenas que de outra forma poderiam interferir nos resultados dos bioensaios. Esta técnica, porém, pode alterar as concentrações do óleo nos sedimentos, prejudicando a interpretação dos resultados dos bioensaios. Torna-se, então, necessário avaliar possíveis efeitos do peneiramento sobre a toxicidade do sedimento.

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Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peneiramento sobre sedimentos que foram acidentalmente contaminados com óleo e submetidos a um tratamento de biorremediação pela adição de fertilizantes.

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2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Nas avaliações ecotoxicológicas, uma questão primordial é assegurar a integridade das amostras e, por conseguinte, o realismo dos testes ecotoxicológicos desenvolvidos em laboratório. Como os sedimentos são um meio semi-sólido, vários fatores podem desregular a integridade das amostras: métodos de coleta, manuseio, estocagem (PORTELA et al, 2006) e homogeneização das amostras após coleta. Uma vez que os sedimentos são conhecidos como uma matriz muito heterogênea, com partículas de diferentes origens, grãos de vários tamanhos e gradientes físico-químicos (AHRENS; DEPREE, 2004), os métodos de coleta e preparo das amostras para os bioensaios serão adequados se as mantiverem indeformadas (STEMMER et al., 1990) e não alterarem a distribuição dos contaminantes.

Estudos têm sido realizados para avaliar possíveis alterações da toxicidade do sedimento por meio de diferentes métodos de coleta. Vários instrumentos de amostragem têm sido utilizados e são úteis de acordo com o propósito da pesquisa. Amostradores em core mantêm a coluna de sedimento intacta, e permitem avaliar a toxicidade de diferentes camadas do sedimento. Amostradores como as dragas são utilizados para coletar sedimentos superficiais e avaliar a distribuição horizontal das características do sedimento, porém estes amostradores podem alterar o regime de exposição atualmente experimentado por organismos bentônicos. West et al. (1994) compararam a toxicidade e as concentrações de DDT no sedimento por meio destes dois métodos de coleta das amostras, e encontraram resultados similares de toxicidade e concentração de DDT para ambos os tipos de amostragens.

Em alguns estudos, restrições logísticas impõem a estocagem do sedimento por algum período antes do início dos testes de toxicidade (MOORE et al., 1995), e por isso esta técnica precisa ser avaliada quanto às possíveis alterações da toxicidade das amostras de sedimento. Tem sido recomendado que as amostras sejam refrigeradas entre 2°C e 4°C, no escuro, com tempo de estocagem variando de duas a oito semanas. Apesar destas recomendações, não existe um consenso sobre o tempo da estocagem, que dependerá basicamente do tipo de contaminante presente na amostra (ASTM, 2003). Alguns estudos têm demonstrado não haver redução da toxicidade com a estocagem (DEFOE; ANKLEY, 1998; MOORE et al. 1995), enquanto outros têm apontado uma variação nas repostas toxicológicas com períodos de estocagem (CARR; CHAPMAN, 1995; DILLON et al., 1994).

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A homogeneização das amostras de sedimento em laboratório tem sido uma manipulação freqüente, e refere-se a uma completa mistura do sedimento para obter consistência das propriedades físico-químicas por toda a amostra (ASTM, 2003). Apesar da homogeneização diminuir a variabilidade entre as réplicas, pode alterar a distribuição de contaminantes no sedimento. Burgess e Mckinney (1997) demonstraram haver um aumento da concentração de bifenilas policloradas (PCB, na sigla em inglês) nas fases dissolvidas e coloidal da água intersticial do sedimento após esta manipulação. A homogeneização prolongada do sedimento pode, ainda, alterar a distribuição de tamanho das partículas e causar a oxidação do sedimento. Isto, por sua vez, pode alterar a biodisponibilidade de contaminantes, particularmente metais, aumentado ou diminuindo sua disponibilidade (ANKLEY et al., 1996; U. S. EPA, 2001).

Para padronizar métodos de coleta e manuseio das amostras de sedimento, normas internacionais foram produzidas pela American Society for Testing and Materials (ASTM) (ASTM, 2003) e pela United States Environmental Protection Agency (U. S. EPA) (U. S. EPA, 2001). O objetivo principal destas é prover suporte técnico para o planejamento e realização de estudos de qualidade do sedimento. Estas padronizações garantem a qualidade dos dados obtidos em laboratório, minimizando assim resultados positivo ou falso-negativo. Nestas normas existem instruções para preparar as amostras para os bioensaios, sendo a técnica do peneiramento do sedimento apresentada com suas vantagens e desvantagens.

O peneiramento das amostras de sedimento tem sido um procedimento padrão em muitos testes de toxicidade (MELO; ABESSA, 2002; NASCIMENTO; EVANGELISTA, 2002; LOTUFO; ABESSA, 2002; ZAMBONI; COSTA, 2002) devido à necessidade de se remover organismos indígenas que podem interferir nos resultados e confundir as interpretações dos mesmos. Estas interferências podem ocorrer por predação dos organismos-teste ou por competição por espaço e alimento limitados. Reynoldson et al. (1994) demonstraram que organismos indígenas podem confundir a interpretação dos resultados de testes de toxicidade crônica, baseado no crescimento dos organismos-teste. Desta forma, os autores recomendaram a retirada destes organismos antes da realização dos bioensaios. Contudo, o peneiramento úmido das amostras pode remover a matéria orgânica e com ela todos os contaminantes associados.

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Recomendação contida na norma da U. S. EPA (2001) para remoção de organismos indígenas inclui retirada manual com pinças para indivíduos grandes da macrofauna ou peneiramento do sedimento por pressão com malhas de 1 a 2 mm. O peneiramento úmido com malhas de abertura menor ou igual a 500 µm não é recomendado, uma vez que pode diminuir o percentual de carbono orgânico e a concentração de contaminantes. Infelizmente, muitos ovos e juvenis de indivíduos da macrofauna, além dos organismos da meiofauna (aqueles que passam por malhas de 500 µm e ficam retidos em malhas de 42 µm (SOUZA-SANTOS et al., 2004)), podem passar por malhas de grandes aberturas, exigindo assim o peneiramento por malhas mais finas ou a utilização de outras técnicas para remoção destes organismos.

Apesar da necessidade do peneiramento para remoção de organismos indígenas, considerações são feitas quanto à associação de contaminantes com grãos de diferentes tamanhos. CHAPMAN e WANG (2001) afirmaram que a distribuição de tamanhos dos grãos é provavelmente o fator mais importante no controle das concentrações de metais no sedimento, porém para contaminantes orgânicos o principal fator de controle tem sido a fração orgânica do sedimento. Um peneiramento com malhas de pequena abertura pode diminuir consideravelmente o conteúdo orgânico do sedimento. Wang et al. (2001) analisaram a distribuição de HPAs em quatro frações de tamanho do sedimento (< 62, 62-125, 125-250 e > 250 µm) e encontraram as mais altas concentrações de HPAs associadas com as frações maiores. Neste estudo, houve um equilíbrio na partição dos HPAs nas quatro frações de tamanhos do sedimento, e o conteúdo orgânico foi o fator que determinou a maior concentração de HPAs na fração > 250 µm.

Em teste de toxicidade, apesar da remoção de organismos indígenas pelo peneiramento, pode haver uma alteração da concentração dos contaminantes no sedimento com este método. Grãos de diferentes tamanhos e a associação de contaminantes com classes de tamanhos podem ser fatores que confundem a interpretação dos testes de toxicidade (ANKLEY et al., 1994) pois podem alterar as respostas dos organismos-teste utilizados nos experimentos. Day et al. (1995) analisaram o efeito do peneiramento do sedimento em três diferentes malhas (2 mm, 500 e 250 µm) sobre as respostas de vários organismos e constataram que houve diferentes respostas biológicas (sobrevivência e crescimento de

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3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito do peneiramento sobre a toxicidade de sedimentos contaminados com óleo da Baía de Todos os Santos submetidos a tratamentos de biorremediação por meio de bioensaios com o copépodo bentônico Tisbe biminiensis.

3.2 Objetivos específicos

 Avaliar ao longo do tempo o efeito do peneiramento sobre a sobrevivência das fêmeas de Tisbe biminiensis para verificar possíveis alterações deste parâmetro por meio da manipulação.

 Avaliar ao longo do tempo o efeito do peneiramento sobre a fecundidade total e o percentual de copepoditos na prole de Tisbe biminiensis.

 Avaliar ao longo do tempo a eficiência dos tratamentos de biorremediação.

 Correlacionar os parâmetros químicos do sedimento com os parâmetros biológicos obtidos nos bioensaios com sedimento peneirado e não peneirado.

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4 METODOLOGIA

4.1 Área de estudo

A Baía de Todos os Santos (BTS) está inserida entre as coordenadas 12º39’40’’- 13ºS de latitude e 38º40’00’’ - 38º43’30’’W de longitude (Fig. 1), sendo a maior e mais importante baía da costa brasileira, com aproximadamente 450 km de costa e orla recoberta por um extenso manguezal (CELINO; QUEIROZ, 2006). Esta baía recebe um volume de água do mar duas vezes maior que o de água doce, portanto suas características são claramente marinhas (LEÃO; DOMINGUEZ, 2000). A profundidade média da Baía de Todos os Santos é 6,9 m, e nela as correntes fluem com velocidade média de 41 cm/s, determinando um baixo tempo de residência da água na baía (ORGE et al., 2000). A granulometria dos sedimentos superficiais varia ao longo das porções da baía, com predomínio de sedimentos argilosos na porção norte.

A descoberta e exploração de poços de petróleo na Baía de Todos Santos se iniciou na década de 1940, e isto motivou a construção de uma grande refinaria e terminal marítimo (PESO-AGUIAR et al., 2000), e a partir de então todo este ecossistema tornou-se sujeito à contaminação por hidrocarbonetos de petróleo. A empresa Petróleo Brasileiro (Petrobrás) concentra suas atividades na região norte/nordeste da Baia de Todos os Santos, que pode ser dividida em função da atividade desenvolvida: Área de Produção, Área Portuária, na qual se localiza o Terminal Marítimo de Madre de Deus (TEMADRE), e Área de Refino (Fig. 1). Segundo dados da ANP (2010), em 2009 a Bahia tinha 117 milhões de barris em reservas totais de petróleo no mar, porém neste mesmo período conseguiu produzir cerca de 340 mil barris oriundos do mar. Na Área de Refino está instalada a Refinaria Landulpho Alves Mataripe (RLAM), que em 2009 conseguiu processar 221 mil barris/dia, sendo este o terceiro maior processamento do país no período (ANP, 2010).

Na Área de Refino, além da RLAM, estão localizados um separador água-óleo e uma Estação de Tratamento de Efluente (ETDI) (Fig.2), além de portos, dutos e outras instalações cujas atividades são potencialmente poluidoras. Em 1998 um canal de emissão de efluente começou a ser construído para levar resíduos da refinaria até uma área de mangue próxima a RLAM (ORGE et al., 2000), e por conta destas instalações podem ser observadas algumas exsudações de óleo nos sedimentos do manguezal. Derrames acidentais de óleo têm ocorrido nesta região, e esta contaminação tem sido registrada ao longo do tempo. Venturini e

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Tommasi (2004), analisando amostras obtidas em 2000, encontraram concentrações totais de HPAs variando de 8 a 4163 ng/g ps, sendo esta maior concentração obtida em uma estação mais próxima a RLAM. Analisando as fontes destes HPAs, estes autores concluíram que há aportes pirolíticos e petrogênicos, com uma mistura de óleo fresco e intemperizado nas diferentes estações. Celino e Queiroz (2006) fizeram coletas na Área de Refino entre 2000 e 2002, analisando-as quanto a concentrações de HPAs (com 2 a 6 anéis) e encontraram uma concentração média de 53,4 ng/g. Evangelista et al. (2005) encontrou concentrações totais de HPAs na Área de Refino de 440 e 310 ng/g dw do sedimento nas estações seca e chuvosa, respectivamente.

Nesta região também está localizado o estuário do Rio São Paulo, onde existe o Complexo Estuarino de Areia Branca, que em 2003 foi definido pelo Ministério do Meio Ambiente como área prioritária para conservação. Por conta deste passivo ambiental, um projeto de biorremediação financiado pela Rede RECUPETRO foi iniciado, a qual montou um galpão experimental de 78 m² na Estação Pedra Branca (Fig. 2), a fim de promover tratamentos de biorremediação com os sedimentos contaminados do estuário do rio São Paulo.

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Figura 1 – Localização da Baía de Todos os Santos mostrando as áreas de atividades relacionadas a indústria petrolífera (modificado de PESO-AGUIAR et al., 2000).

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Figura 2 – Mapa da Área de Refino da BTS mostrando a localização da RLAM, do separador óleo – água (S), da estação de tratamento de efluente (ETDI), do Terminal Marítimo (TEMADRE) e da Estação Pedra Branca (modificado de VENTURINI e TOMMASI, 2004).

4.2 Coleta de sedimento

Sedimentos contaminados foram coletados na região inter-maré do estuário do rio São Paulo durante a baixa-mar, com auxílio de uma espátula de metal. A amostragem consistiu na coleta sistemática de sedimentos do manguezal em Agosto/Setembro de 2008. Esta coleta foi feita com um testemunhador de aço com capacidade para coletar testemunhos de até 30 cm, e logo em seguida toda esta coluna de sedimento foi homogeneizada, pois nesta região é marcante a presença de manchas pontuais de óleo no sedimento. No Galpão de Simulação, estes sedimentos foram acondicionados em colunas de vidro vazadas no topo e na base, com 30 cm de altura e 5 cm de diâmetro, previamente revestidas com sacos de algodão brancos (Fig. 3). As colunas de vidro foram acomodadas em aquários de vidro com dimensões de 30 x 30 x 35 cm (largura x comprimento x profundidade) através de suportes de madeira (Fig. 3). Cada aquário foi preenchido com água do próprio manguezal, e para renovação desta água um sistema de circulação foi montado, que renovava 1/3 do volume total da água a cada 12 horas.

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Figura 3 – Fotos do galpão de simulação montado na Estação Pedra Branca, do sedimento coletado no rio São Paulo, das colunas de vidro e dos aquários onde os sedimentos foram colocados e submetidos a tratamentos de biorremediação.

4.3 Simulação de biorremediação

As colunas de sedimentos contidas nos aquários foram submetidas a dois tratamentos de biorremediação com fertilizantes amplamente utilizados na agricultura. Três tratamentos foram avaliados nos experimentos de biorremediação, os quais são:

1) Referência, com sedimentos contaminados do manguezal que não receberam nenhum fertilizante, e indicativo do processo de atenuação natural;

2) NPK, com sedimentos contaminados que receberam o fertilizante NPK;

3) OSMOCOTE – com sedimentos contaminados que receberam o fertilizante OSMOCOTE, que possui a mesma composição do fertilizante NPK, contudo com liberação mais lenta dos nutrientes.

Cada tratamento foi representado por três réplicas de aquários, totalizando nove aquários, com oito colunas cada (Fig. 4). Foram adicionados 1,5 g de fertilizante em cada

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coluna de sedimento correspondente ao tratamento, com intervalos de dez dias, constituindo três aplicações ao longo do experimento (aplicação, portanto, somente no primeiro mês do experimento). O fertilizante agrícola NPK utilizado é da marca Produquímica e contém sulfato de amônio ((NH4)2SO4), fosfato de amônio ((NH4)3HPO4) e cloreto de potássio (KCl)

em proporções de N:P:K equivalentes de 1:1:1. O fertilizante OSMOCOTE, da mesma marca, possui (N), pentóxido de fósforo (P2O5) e óxido de potássio (K2O) nas mesmas proporções.

Cada coluna de sedimento representa um tempo de avaliação dos tratamentos de biorremediação. Estas foram retiradas um dia depois de adicionados os fertilizantes (24 h) e após 8, 15, 30, 45, 60 e 90 dias de experimento. Após coleta das colunas, os sedimentos foram acondicionados em recipientes de vidro lavados com ácido clorídrico, seguido de água destilada, sendo mantidos refrigerados em caixa térmica para preservar a integridade das amostras. Em seguida, os recipientes foram transportados para o Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) na Universidade Federal de Pernambuco em um período inferior a 24 h para realização dos bioensaios.

Figura 4 – Desenho esquemático dos aquários utilizados nos tratamentos de biorremediação mostrando os tempos de retirada das colunas.

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4.4 Cultivos dos copépodos

O copépodo Harpacticoida Tisbe biminiensis foi coletado na Praia do Farol, em Olinda, Pernambuco, e passou a ser cultivado no Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE), no Departamento de Oceanografia da UFPE. Esta espécie apresenta altas taxas exponenciais de crescimento populacional (PINTO et al, 2001), ciclo de vida curto e facilidade para cultivo e manipulação em laboratório. Os cultivos foram mantidos em recipientes de polietileno, contendo 5 L de água do mar filtrada, salinidade em torno de 34, sem substrato. A temperatura foi mantida entre 25 e 27ºC e fotoperíodo controlado de 12:12 claro/escuro. A água dos cultivos foi renovada semanalmente passando todo conteúdo dos recipientes por uma malha de 63 µm de abertura, que retinha os organismos. Os organismos retidos na malha foram transferidos para recipientes limpos, e então alimentados com 200 ml da alga Thallassiosira fluviatilis ou Chaetoceros calcitrans mais ração para peixes.

Ao longo do desenvolvimento dos indivíduos de T. biminiensis seu tamanho varia de 70 a 896 µm (SOUZA-SANTOS et al, 2006) e as fêmeas ovígeras apresentam ciclo de vida aproximado de 32 dias, produzindo cerca de nove ninhadas, porém há uma redução na fecundidade com o número de ninhadas (PINTO et al, 2001). Para realizar os bioensaios com fêmeas ovígeras jovens, obtendo assim uma fecundidade maior e redução na mortalidade natural, fêmeas com 12 dias de idade foram utilizadas, segundo metodologia de Araújo-Castro et al. (2009). Para obter estas fêmeas com idade controlada, os cultivos de T. biminiensis passaram pela peneira de 250 µm para separar os adultos dos estágios naupliares e de copepoditos existentes no cultivo. As fêmeas adultas ovígeras retidas nesta malha foram colocadas separadamente para desovar por um período de 24 horas em um recipiente de polietileno. Após este período, as fêmeas foram separadas da prole produzida passando o cultivo por duas peneiras consecutivas de 250 e 63 µm. A prole retida na peneira de 63 µm foi colocada num recipiente separado. Este novo cultivo cresceu por 12 dias, período no qual houve renovação da água e adição de alimento (alga mais ração). Após estes 12 dias de desenvolvimento, fêmeas ovígeras são visualizadas no cultivo com sacos de ovos grandes e pretos, podendo ser utilizadas nos bioensaios.

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4.5 Cultivo das microalgas

As microalgas Thallassiosira fluviatilis e Chaetoceros calcitrans foram cultivadas em meio f/2 (GUILLARD, 1975) e utilizadas como alimento para os cultivos de T. biminiensis. Para preparação do meio, água do mar filtrada recebeu nutriente f/2, 1 ml de silicato e 2 ml da solução tampão de TRIS (ph 7,7) antes da esterilização na autoclave. A solução de vitamina f/2 foi esterilizada pela filtração (0.2 µm) e adicionada ao meio antes da inoculação da alga. Os cultivos de alga foram mantidos a temperatura ambiente (26±1 ºC), fotoperíodo controlado 12:12 claro:escuro e a concentração da microalga foi expressa como unidade de clorofila α (µg Chl- a/ml).

4.6 Bioensaios com Tisbe biminiensis

Bioensaios com T. biminiensis foram realizados em cada um dos tempos de retirada das colunas. No LACE, os sedimentos foram peneirados por uma malha de 63 µm para remoção de possíveis predadores. A partir do experimento com 8 dias após início dos experimentos, cada tratamento foi dividido em dois grupos: Peneirado e Não Peneirado, os quais foram submetidos a avaliações ecotoxicológicas por meio dos bioensaios.

Os bioensaios seguiram metodologia estabelecida por Araújo-Castro et al. (2009), e ocorreram em recipientes de vidro de 40 ml, os quais receberam cerca de 2 g dos sedimentos submetidos ao processo de biorremediação e 20 ml de suspensão algal como alimento. Esta solução algal em todos os experimentos foi mantida na concentração 0,2 g Chl a/ml, e para manter esta concentração, amostras da solução algal foram expostas a vários comprimentos de onda em um espectrofotômetro para determinar a concentração da clorofila a (LORENZEN, 1967; PARSONS; STRICKLAND, 1963). A determinação da concentração da clorofila a permitiu ajustar a proporção algal na suspensão de alimento. Após 24 horas, 10 fêmeas ovígeras foram colocadas em cada recipiente com auxílio de uma pipeta Pasteur. Cada bioensaio durou 7 dias, com alimentação a cada dois dias. Terminando-se o bioensaio, todo o conteúdo dos recipientes foi corado com Rosa de Bengala e fixado com formol a 4% para contagem. Efeitos letais foram avaliados pela contagem das fêmeas bem coradas (indicativo de que estavam vivas ao final do experimento). Efeitos sub-letais sobre a prole produzida (fecundidade total, representada pelo número de náuplios mais copepoditos) e percentual de copepoditos na prole também foram analisados. Sedimentos coletados no estuário do rio Maracaípe foram utilizados como controle do laboratório em todos os experimentos, sempre com 5 réplicas.

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Testes com a substância de referência dicromato de potássio foram realizados paralelamente aos experimentos, visando analisar a sensibilidade do lote de copépodos utilizados nos experimentos. A CL50-96h foi obtida pelo método do Trimmed

Spearman-Karber (HAMILTON et al., 1977) e comparada com a carta controle estabelecida por Araújo-Castro et al. (2009).

4.7 Análises físico-químicas

Análises físico-químicas foram feitas nos sedimentos do estuário do rio São Paulo e nas amostras brutas do sedimento (não peneirado) em cada tempo de avaliação (24 h e 8, 15, 30, 45 e 60 dias) dos tratamentos de biorremediação. As análises químicas foram realizadas no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), da Universidade Federal da Bahia.

As seguintes análises foram realizadas: amônia (Método de Kjeldahl por via úmida - EMBRAPA, 1999) e carbono orgânico total (COT) (WALKEY-BLACK, 1947). Os dados destas análises foram cedidos por RECUPETRO (2009), para correlacioná-los aos parâmetros biológicos de Tisbe biminiensis.

4.8 Análise Estatística

No bioensaio inicial, 24 h após adição dos fertilizantes NPK e OSMOCOTE, a Análise de Variância com um fator foi realizada para comparar as médias da sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos entre o controle e os demais tratamentos. A partir do segundo bioensaio, 8 dias após adição dos fertilizantes, cada tratamento foi dividido em dois grupos: peneirado e não peneirado. Para comparar os dados da sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos na prole das fêmeas de Tisbe biminiensis nos grupos peneirado e não peneirado foi realizado o teste t pareando-se os valores quanto ao tratamento (Referência, NPK e OSMOCOTE) e tempo experimental. A Análise de Variância bifatorial foi realizada em cada grupo (peneirado e não peneirado) para comparar os tratamentos de biorremediação com o controle em cada tempo experimental, e avaliar possível interação do fator tempo com o fator tratamento. O teste a posteriori de Tukey foi utilizado para detectar diferenças significativas entre as médias nas Análises de Variância uni- e bifatorial. O teste t para amostras independentes foi realizado em cada tempo experimental para avaliar possíveis diferenças entre os grupos peneirado e não peneirado em um mesmo tratamento. Estes testes paramétricos foram realizados após verificação da normalidade das variáveis e homogeneidade das variâncias. Quando estes pressupostos não foram satisfeitos, o teste não paramétrico pareado de Wilcoxon substituiu o teste t paramétrico. Nas Análises de

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Variância, os dados foram submetidos à transformação log 10 para adequação aos pressupostos. Em todos os testes sempre foi utilizado o nível de significância (α) de 0,05.

Análises de correlação linear de Pearson foram realizadas entre as variáveis biológicas (sobrevivência, fecundidade e percentual de copepoditos) no grupo peneirado e não peneirado e as variáveis físico-químicas (amônia e percentual de carbono orgânico). Estas correlações foram realizadas após verificação da normalidade das variáveis e homogeneidade das variâncias. Quando estes pressupostos não foram satisfeitos, a correlação de Spearman foi realizada. O nível de significância (α) sempre foi de 0,05.

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5 RESULTADOS

5.1 Bioensaio inicial – 24 h após início do experimento

No bioensaio inicial, 24 h após adição dos fertilizantes NPK e OSMOCOTE, os sedimentos de todos os tratamentos foram submetidos ao peneiramento por malha de 63 µm, não havendo divisão entre grupo peneirado e não peneirado. Neste primeiro bioensaio houve diferença significativa entre as médias de sobrevivência das fêmeas de Tisbe biminiensis (Tab. 1), com o tratamento NPK apresentando o menor percentual de sobrevivência (20%), enquanto nos demais tratamentos o percentual foi sempre maior que 75% (Fig. 5). A fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis, que corresponde ao número de náuplios mais copepoditos, foi reduzida significativamente nos três tratamentos relativamente ao controle (Tab. 1). Enquanto no controle cada fêmea produziu cerca de 280 indivíduos, nos tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE houve uma produção média de 40, 20 e 45 indivíduos, respectivamente (Fig. 5). O percentual de copepoditos na prole das fêmeas de T. biminiensis reflete o desenvolvimento dos náuplios para copepoditos, e esta variável aumentou significativamente em relação ao controle nos três tratamentos (Tab. 1; Fig. 5). Apesar da sobrevivência e fecundidade total terem sido mínimas no tratamento NPK, houve um maior percentual de copepoditos neste tratamento.

5.2 Bioensaios com divisão entre grupo peneirado e não peneirado

A partir do segundo bioensaio, 8 dias após adição dos fertilizantes, houve uma divisão entre grupo peneirado e não peneirado em cada tratamento. Testes pareados foram realizados para comparar a sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos entre o grupo peneirado e não peneirado. Não houve diferenças significativas quanto à sobrevivência das fêmeas de T. biminiensis entre os dois grupos, porém a fecundidade total e o percentual de copepoditos na prole destas foram significativamente menores no grupo peneirado (Tab. 1). A sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos foi em média 8,5 fêmeas, 155 indivíduos e 39% no grupo peneirado, enquanto no grupo não peneirado foi 8,6, 186 e 54%, respectivamente.

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Figura 5 - Médias (± desvio padrão) da sobrevivência (A), fecundidade total (náuplios + copepoditos) (B) e percentual de copepoditos na prole (C) de Tisbe biminiensis no bioensaio inicial, 24 h após início do experimento. Os * denotam diferenças significativas relativa ao controle (p<0,05).

0% 25% 50% 75% 100%

Cont. Ref. NPK OSMO

A * 0% 25% 50% 75%

C * * * 0 150 300 450

B

* *

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A Análise de Variância (ANOVA) bifatorial foi realizada separadamente no grupo peneirado e não peneirado, e permitiu avaliar o efeito dos fatores tempo (8, 15, 30, 45, 60 e 90 dias) e tratamento (Controle, Referência, NPK e OSMOCOTE) sobre a sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos na prole de T. biminiensis, assim como possíveis interações entre estes dois fatores. O controle em nenhum tempo experimental foi dividido em peneirado e não peneirado, de forma que todos os sedimentos controle utilizados no experimento foram submetidos ao peneiramento por malha de 63 µm.

No grupo peneirado, a ANOVA bifatorial realizada sobre os dados da sobrevivência demonstrou que não houve uma variação significativa desta variável ao longo do tempo, porém houve diferenças significativas entre os tratamentos quanto à sobrevivência das fêmeas de T. biminiensis (Tab. 1). A sobrevivência nos tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE não foi estatisticamente diferente, porém foi significativamente menor que no controle, com valores médios nos tratamentos controle, referência, NPK e OSMOCOTE de 9,5; 8,5; 8,3 e 8,6 sobreviventes, respectivamente. A alta sobrevivência no tratamento controle em cada tempo experimental tornou os valores relativos aos três tratamentos de biorremediação sempre significativamente menores (Tab. 2).

No grupo não peneirado, ambos os fatores tiveram um efeito significativo sobre a sobrevivência das fêmeas de T. biminiensis, e houve uma interação significativa entre estes fatores (Tab. 1). Considerando-se o fator tempo, a partir do segundo bioensaio (15 dias), a sobrevivência tornou-se significativamente maior que no primeiro bioensaio (8 dias). A média geral de sobrevivência nos tratamentos controle, referência, NPK e OSMOCOTE foi de 9,6; 8,8; 8,3 e 8,8 sobreviventes, respectivamente. Apenas no tratamento NPK a sobrevivência foi significativamente menor que no controle. A interação entre os fatores tempo e tratamento no grupo não peneirado demonstrou ser significativa (Tab. 1) e apontou uma diferença significativa entre os tratamentos controle e NPK/OSMOCOTE no primeiro bioensaio (8 dias) (Tab. 2). O teste t para amostras independentes não apontou para cada tratamento diferenças significativas entre o grupo peneirado e não peneirado em nenhum tempo experimental (Fig. 6). No primeiro bioensaio, 8 dias após adição dos fertilizantes, observa-se no tratamento NPK, em ambos os grupos, a maior redução da sobrevivência obtida neste experimento de biorremediação (Tab. 2).

A fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis é uma medida da produção de indivíduos pelas fêmeas, e corresponde ao número de náuplios mais copepoditos na prole. A

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ANOVA bifatorial no grupo peneirado demonstrou um efeito significativo dos fatores tempo e tratamento sobre a fecundidade total, havendo também uma interação significativa entre estes fatores (Tab. 1). Considerando-se o fator tempo, a partir do segundo bioensaio, a fecundidade total tornou-se significativamente maior que no primeiro bioensaio. Quanto ao fator tratamento, a fecundidade total média no tratamento controle foi de 400 indivíduos, enquanto nos tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE foi de 159, 153 e 153 indivíduos produzidos, respectivamente, sendo estes valores significativamente menores que o controle. Não houve diferenças estatisticamente significativas quanto à fecundidade total nos tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE.

No grupo não peneirado, o padrão observado no grupo peneirado mantém-se, com efeito significativo dos fatores tempo e tratamento, além da interação significativa entre estes fatores (Tab. 1). Quanto ao fator tempo, a partir do quarto bioensaio (45 dias) a fecundidade total tornou-se significativamente maior que no primeiro bioensaio. Os tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE foram significativamente menores que no controle, porém entre si não foram estatisticamente diferentes. O teste t para amostras independentes demonstrou em alguns tempos experimentais diferenças estatisticamente significativas entre o grupo peneirado e não peneirado nos três tratamentos (Fig.7).

O percentual de copepoditos na prole permite avaliar o desenvolvimento dos organismos para o estágio de copepodito, sendo obtido pela razão número de copepoditos/fecundidade total. A ANOVA bifatorial sobre os dados do percentual de copepoditos no grupo peneirado demonstrou um efeito significativo dos fatores tempo e tratamento, assim como uma interação significativa entre estes fatores (Tab. 1). Houve um máximo percentual de copepoditos na prole no terceiro e quarto bioensaio (30 e 45 dias), com uma brusca diminuição nos bioensaios seguintes. Considerando-se o fator tratamento, o percentual de copepoditos nos tratamentos NPK e OSMOCOTE foi significativamente maior que nos tratamentos controle e referência. O tratamento NPK nos dois primeiros bioensaios (8 e 15 dias) teve um percentual de copepoditos maior que 50%, apesar da sobrevivência e fecundidade total terem sido reduzidas relativamente ao controle (Tab. 2).

No grupo não peneirado, os fatores tempo e tratamento também tiveram um efeito significativo sobre o percentual de copepoditos na prole, havendo uma interação significativa entre estes dois fatores (Tab. 1). Ao longo do tempo, houve três máximos no percentual de copepoditos, os quais aconteceram no terceiro, quarto e sexto bioensaio. Considerando-se o

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fator tratamento, houve um aumento significativo no percentual de copepoditos nos três tratamentos relativamente ao controle, porém o tratamento referência foi significativamente menor que os tratamentos NPK e OSMOCOTE. O teste t para amostras independentes demonstrou em alguns tempos experimentais diferenças estatisticamente significativas entre o grupo peneirado e não peneirado no tratamento referência (Fig.8).

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Tabela 1 - Resultados das estatísticas para os bioensaios com Tisbe biminiensis. Os * indicam diferenças significativa para α = 0,05; ** indicam diferenças significativas para α = 0,01; ns significa não significativo.

Variável Estatística

ANOVA Unifatorial

Bioensaio inicial (24 h) F P

Sobrevivência 40.1 <0.001 **

Fecundidade transf. log10 49.9 <0.001 **

% Copepoditos transf. log10 10.45 0.002 **

Teste pareado

Teste t Teste de Wilcoxon P

Sobrevivência 1.06 0.28

Fecundidade -2.237 0.0295*

% Copepoditos -4.3 <0.0001*

A partir do

bioensaio com 8 dias ANOVA Bifatorial

Fator

Tempo Tratamento Interação F F F PENEIRADO

Sobrevivência 2.3(ns) 10.3 ** 1.1 (ns)

Fecundidade transf. log10 21.6 ** 78 ** 10.7 **

% Copepoditos 13.1 ** 40.8 ** 5.8 **

NÃO PENEIRADO

Sobrevivência 13.2 ** 6.03 ** 2.6 **

Fecundidade 14.4 ** 62.7 ** 4.3 **

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Tabela 2 – Valores médios (n = 3) obtidos nos bioensaios com Tisbe biminiensis ao longo do tempo nos quatro tratamentos. As letras comparam os valores de um tratamento ao longo do tempo. As barras abaixo dos números indicam os valores significativamente diferentes do controle naquele tempo (α = 0,05).

Parâmetros Grupo

81

ͣ ᵇ

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Figura 6 - Médias (± DP) da sobrevivência de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO. Os * denotam diferenças significativas entre o grupo Peneirado e Não Peneirado (α = 0,05). 0 2 4 6 8 10 8 15 30 45 60 90 A 0 2 4 6 8 10 8 15 30 45 60 90

S

o

b

re

v

iv

en

te

s

Cont Peneirado Não Peneirado B 0 2 4 6 8 10 8 15 30 45 60 90 Tempo (dias) C

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Figura 7 - Médias (± DP) da fecundidade total (náuplios + copepoditos) de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO. Os * denotam diferenças significativas entre o grupo Peneirado e Não Peneirado (α = 0,05).

0 150 300 450 600 8 15 30 45 60 90 F ec un di da de t ot al Cont Peneirado Não Peneirado B * 0 150 300 450 600 8 15 30 45 60 90 A * * 0 150 300 450 600 8 15 30 45 60 90 Tempo (dias) C * * *

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Figura 8 - Médias (± DP) do % de copepoditos na prole de Tisbe biminiensis quando exposto aos tratamentos (A) Referência, (B) NPK e (C) OSMO. Os * denotam diferenças significativas entre o grupo Peneirado e Não Peneirado (α = 0,05).

0% 25% 50% 75% 100% 8 15 30 45 60 90 A * * * * * 0% 25% 50% 75% 100% 8 15 30 45 60 90 % d e C op ep od it os Cont Peneirado Não Peneirado B 0% 25% 50% 75% 100% 8 15 30 45 60 90 Tempo (dias) C

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5.3 Análises físico-químicas e correlação com parâmetros biológicos

Os sedimentos do estuário do rio São Paulo foram caracterizados por meio das análises físico-químicas quanto ao percentual de carbono orgânico total e concentração de amônia (mg/Kg). Estes sedimentos apresentaram um percentual de carbono orgânico de 4.7% e uma concentração de amônia 2.36 mg/Kg. Ao longo do experimento de biorremediação estes parâmetros foram medidos em cada tratamento apenas no grupo não peneirado, e as variações temporais podem ser avaliadas nos gráficos da Figura 9. A concentração da amônia permaneceu sempre baixa no tratamento referência, enquanto no tratamento NPK começou com um valor extremo de 323 mg/Kg e gradativamente vai decrescendo. No tratamento OSMOCOTE há um pico na concentração da amônia aos 30 dias de experimento, e em seguida os valores decrescem. O percentual de carbono orgânico permanece em torno de 5% em todos os tratamentos até os 45 dias de experimento, quando se observa um pico neste parâmetro em todos os tratamentos.

Análises de correlação foram realizadas para avaliar a associação da sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos na prole de Tisbe biminiensis no grupo peneirado e não peneirado com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia. Os resultados dos parâmetros físico-químicos foram obtidos a partir do sedimento bruto (não peneirado). Houve uma correlação significativa da sobrevivência no grupo peneirado com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia (mg/Kg), porém não houve correlação significativa destas variáveis no grupo não peneirado (Fig. 10).

A fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis se correlacionou positivamente com o percentual de carbono orgânico no grupo peneirado e não peneirado, porém se correlacionou negativamente com a concentração de amônia apenas no grupo peneirado (Fig. 11). Quanto ao percentual de copepoditos, somente houve correlação positiva significativa com a concentração de amônia no grupo peneirado (Fig. 12).

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Figura 9 – Gráficos mostrando a variação da concentração da amônia e do percentual de carbono orgânico ao longo do tempo e nos três tratamentos de biorremediação.

0 100 200 300 400 1 8 15 30 45 60 C on c. N H 4+ ( m g/ K g) NPK OSMOCOTE REF 0% 2% 3% 5% 6% 1 8 15 30 45 60 % C O T Tempo (dias)

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Figura 10 - Gráficos de correlação entre o número de fêmeas sobreviventes com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.

(42)

Figura 11 – Gráficos de correlação entre a fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.

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Figura 12 – Gráficos de correlação entre o percentual de copepoditos na prole com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.