Os sedimentos do estuário do rio São Paulo foram caracterizados por meio das análises físico-químicas quanto ao percentual de carbono orgânico total e concentração de amônia (mg/Kg). Estes sedimentos apresentaram um percentual de carbono orgânico de 4.7% e uma concentração de amônia 2.36 mg/Kg. Ao longo do experimento de biorremediação estes parâmetros foram medidos em cada tratamento apenas no grupo não peneirado, e as variações temporais podem ser avaliadas nos gráficos da Figura 9. A concentração da amônia permaneceu sempre baixa no tratamento referência, enquanto no tratamento NPK começou com um valor extremo de 323 mg/Kg e gradativamente vai decrescendo. No tratamento OSMOCOTE há um pico na concentração da amônia aos 30 dias de experimento, e em seguida os valores decrescem. O percentual de carbono orgânico permanece em torno de 5% em todos os tratamentos até os 45 dias de experimento, quando se observa um pico neste parâmetro em todos os tratamentos.
Análises de correlação foram realizadas para avaliar a associação da sobrevivência, fecundidade total e percentual de copepoditos na prole de Tisbe biminiensis no grupo peneirado e não peneirado com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia. Os resultados dos parâmetros físico-químicos foram obtidos a partir do sedimento bruto (não peneirado). Houve uma correlação significativa da sobrevivência no grupo peneirado com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia (mg/Kg), porém não houve correlação significativa destas variáveis no grupo não peneirado (Fig. 10).
A fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis se correlacionou positivamente com o percentual de carbono orgânico no grupo peneirado e não peneirado, porém se correlacionou negativamente com a concentração de amônia apenas no grupo peneirado (Fig. 11). Quanto ao percentual de copepoditos, somente houve correlação positiva significativa com a concentração de amônia no grupo peneirado (Fig. 12).
Figura 9 – Gráficos mostrando a variação da concentração da amônia e do percentual de carbono orgânico ao longo do tempo e nos três tratamentos de biorremediação.
0 100 200 300 400 1 8 15 30 45 60 C on c. N H 4+ ( m g/ K g) NPK OSMOCOTE REF 0% 2% 3% 5% 6% 1 8 15 30 45 60 % C O T Tempo (dias)
Figura 10 - Gráficos de correlação entre o número de fêmeas sobreviventes com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.
Figura 11 – Gráficos de correlação entre a fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.
Figura 12 – Gráficos de correlação entre o percentual de copepoditos na prole com o percentual de carbono orgânico e a concentração de amônia no grupo peneirado (esquerda) e não peneirado (direita). Os coeficientes de correlação de Pearson ou Spearman (r e rs) e os coeficientes de determinação (R²) estão no topo dos gráficos. Os * indicam correlação significativa.
6 DISCUSSÃO
Os sedimentos do estuário do Rio São Paulo apresentam um histórico de contaminação por óleo (VEIGA et al., 2008), e a qualidade destes sedimentos pode ser avaliada no início do experimento de biorremediação por meio do tratamento referência. Os sedimentos recém- coletados no estuário não apresentaram letalidade às fêmeas de Tisbe biminiensis (Fig. 5), corroborando desta forma com os dados obtidos por Torreiro (2008). Torreiro (2008) submeteu os sedimentos da mesma região a bioensaios com o copépodo T. biminiensis, observando ausência de efeitos letais. Evangelista et al. (2005) também analisaram a qualidade dos sedimentos da Área de Refino da Baía de Todos os Santos (BTS) por meio de bioensaios com a pós-larva do camarão Litopenaeus vannamei e não observaram toxicidade aguda nos sedimentos desta região.
Apesar da ausência de toxicidade aguda, houve uma redução da fecundidade total das fêmeas de Tisbe biminiensis no tratamento referência (Fig. 5), caracterizando um intenso efeito sub-letal. Este decréscimo na fecundidade total demonstra a sensibilidade deste parâmetro biológico, ecologicamente relevante, na avaliação da contaminação dos sedimentos estuarinos. O uso de parâmetros sub-letais, como a fecundidade e o desenvolvimento dos organismos, tem sido recomendado devido à sensibilidade das respostas à contaminação (DAHL et al., 2006). Em seu trabalho de avaliação da Área de Refino da BTS, Evangelista et al. (2005) utilizaram o ganho em peso seco das pós-larvas do camarão L. vannamei como parâmetro sub-letal, e observaram uma redução considerável no peso das pós-larvas quando expostas aos sedimentos desta região. Com base neste parâmetro, estes autores classificaram a Área de Refino como região de Máximo Impacto promovido pela indústria petrolífera.
A maior sensibilidade de parâmetros reprodutivos relativamente à sobrevivência dos organismos-teste tem permitido avaliar a contaminação de sedimentos cronicamente poluídos. Bejarano et al. (2004), expondo o copépodo Amphiascus tenuiremis a sedimentos associados com vários usos das áreas adjacentes, não encontraram diferenças significativas quanto à sobrevivência deste copépodo exposto aos diferentes sedimentos contaminados. Porém, quando consideraram a fecundidade total do organismo, observaram uma drástica redução deste parâmetro, e desta forma concluíram que a contaminação dos sedimentos representa um alto risco para manutenção das populações de A. tenuiremis. Outros estudos têm confirmado a sensibilidade dos parâmetros reprodutivos (BELLAS; THOR, 2007; HACK et al., 2008;
LOTUFO, 1997), demonstrando assim a utilidade destes parâmetros para avaliação da qualidade ambiental.
O percentual de copepoditos na prole é uma medida do desenvolvimento dos organismos, do estágio de náuplios até o estágio de copépodos. A taxa de desenvolvimento dos organismos é fortemente afetada pela quantidade de alimento (PINTO et al., 2001), e tem sido considerado que a dieta dos copépodos é constituída por diatomáceas, bactérias, fungos e detritos (ARAÚJO-CASTRO; SOUZA-SANTOS, 2005). O percentual de copepoditos nos sedimentos do estuário do rio São Paulo e após adição dos fertilizantes foi significativamente maior relativamente ao controle (Fig. 5). Nos bioensaios com divisão entre grupo peneirado e não peneirado houve um aumento significativo do percentual de copepoditos com o tempo, e os tratamentos NPK e OSMOCOTE tiveram um percentual significativamente maior que os tratamentos controle e referência (Tab. 2).
Provavelmente este incremento no percentual de copepoditos está relacionado a um aumento das populações microbianas nestes sedimentos. Ramsay et al. (2000) avaliaram o tamanho das populações microbianas após adição de óleo e após adição do fertilizante OSMOCOTE como estratégia de biorremediação. Após adição de óleo foi estimado um número de bactérias da ordem de 104 a 105; a aplicação do fertilizante aumentou a população por três ordens de magnitude: de 105 para 108. Além deste aumento das populações microbianas, a presença de detritos nos sedimentos do rio São Paulo pode ter contribuído para o alto percentual de copepoditos.
Os sedimentos de mangue contaminados com hidrocarbonetos podem ser submetidos a diferentes estratégias de biorremediação, entre elas o bioestímulo das comunidades microbianas pela adição de fertilizantes. Outra opção que tem sido considerada é a autodepuração do óleo pelo próprio manguezal, sem interferência antrópica de qualquer natureza. No presente estudo, a eficiência da autodepuração do manguezal sem adição de nenhum composto foi avaliada por meio do tratamento referência, e foi comparada com tratamentos de bioestímulo que se utilizaram de dois fertilizantes (NPK e OSMOCOTE). Os fertilizantes NPK e OSMOCOTE são semelhantes em sua composição, porém diferem no tempo de liberação dos nutrientes, sendo a liberação do NPK mais rápida.
Os fertilizantes NPK e OSMOCOTE foram adicionados no início do experimento, e os efeitos da adição destes fertilizantes sobre os parâmetros do ciclo de vida de Tisbe biminiensis podem ser observados no bioensaio inicial, 24 h após esta adição. Houve uma redução
drástica da sobrevivência das fêmeas de T. biminiensis no tratamento NPK, o mesmo não sendo observado no tratamento OSMOCOTE. A fecundidade total das fêmeas de T.
biminiensis também foi reduzida nestes dois tratamentos de biorremediação, tendo
apresentado valores mínimos no tratamento NPK (Fig. 5). O fertilizante NPK utilizado neste experimento contém sulfato de amônio ((NH4+)2SO4) e fosfato de amônio ((NH4+)3HPO4), em
uma proporção de 1:1. A dissolução destes compostos libera os íons amônio, e a velocidade na qual esta dissolução ocorre pode aumentar rapidamente a concentração deste íon nos sedimentos. Isto pode ser observado pela concentração média de íons amônio no tratamento NPK 24 h e 8 dias após início dos experimentos: 323 mg/Kg e 285 mg/Kg, respectivamente. Estes valores extremos contrastam com as concentrações de 2,36 e 20,5 mg/Kg obtidas no estuário do rio São Paulo e no tratamento OSMOCOTE no primeiro bioensaio, respectivamente (RECUPETRO, 2009).
Em soluções aquosas, a amônia pode se apresentar sob a forma de íons amônio (NH4+)
ou na forma não-ionizada e mais tóxica (NH3), sendo estas formas intercambiáveis (REIS;
MENDONÇA, 2009). A soma da concentração destes dois íons corresponde aos valores de nitrogênio amoniacal total e a resolução CONAMA 357 (BRASIL, 2005) determina valores máximos de nitrogênio amoniacal total para águas salobras que variam de 0,4 a 0,7 mg/L. A concentração do íon amônio no início do tratamento NPK, apesar de ter sido medida no sedimento, é 800 vezes maior que o limite imposto pela resolução. Ao longo do tempo, as concentrações do íon amônio no tratamento NPK diminuíram (Fig. 9), observando-se uma atenuação da toxicidade aguda neste tratamento (Fig. 6). Esta associação também pode ser observada pela correlação negativa entre a concentração de amônia e a sobrevivência das fêmeas de Tisbe biminiensis no grupo peneirado (Fig. 10).
A toxicidade da amônia tem sido avaliada para algumas espécies de copépodos. Marzio et al. (2009) calcularam a CL50-96 h da amônia em solução para cinco espécies de copépodos de água doce e encontraram valores que variaram de 17.8 a 18.63 mg/L. Linden et al. (1979), para o copépodo de água salgada Nitocra spinipes, reportaram CL50-96 h de 4,5 mg/L e BUTTINO (1994) encontrou valores de CL50 -24 h de 0,91 mg/L para o copépodo calanóide Acartia clausi. Nos sedimentos, a amônia está presente em concentrações detectáveis na água intersticial, sendo esta a rota de exposição para as comunidades bentônicas (WHITEMAN et al., 1996). Estas medidas de toxicidade letal devem ser levadas em consideração na escolha dos fertilizantes a serem utilizados nos processos de biorremediação, de forma a não permitir que as concentrações de amônia sejam elevadas.
Além disso, altas concentrações do fertilizante NPK podem promover um distúrbio nas comunidades bentônicas do manguezal, reduzindo a densidade de organismos da meiofauna (SANTOS et al., 2009).
Porto Rosa e Trigüis (2006) realizaram experimentos de biorremediação com NPK e 24 horas após adição deste fertilizante observaram um indício de toxicidade por meio de testes com a bactéria Vibrio fischeri. Apesar da redução da toxicidade com o tempo, os autores atribuíram estes indícios de toxicidade a um erro de manipulação das amostras antes das análises, e concluíram que estes indícios não deveriam ser considerados com cautela ou mesmo desconsiderados. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que a utilização do fertilizante NPK deve ser vista com cautela, e sugerem a utilização de compostos não amoniacais como fonte de nitrogênio.
A fecundidade total das fêmeas de Tisbe biminiensis pode ser utilizada como parâmetro biológico para comparar a eficiência das diferentes estratégias de biorremediação. A Análise de Variância bifatorial para ambos os grupos, peneirado e não peneirado, revelou um aumento significativo da fecundidade total com o tempo e diferenças significativas entre os tratamentos (Tab. 2). A fecundidade total foi significativamente menor que o controle nos três tratamentos, porém não houve diferenças significativas entre os tratamentos referência, NPK e OSMOCOTE. A ausência de diferenças quanto à fecundidade total entre os tratamentos referência e os tratamentos NPK e OSMOCOTE indica que a adição destes fertilizantes não foi eficiente na atenuação da toxicidade do sedimento.
A atenuação natural se baseia na capacidade dos microorganismos para utilizar matéria orgânica como fonte de carbono, podendo esta matéria orgânica ser de origem vegetal ou de contaminantes orgânicos, como os hidrocarbonetos de petróleo. Este processo de atenuação natural pode ser medido em termos de redução nas concentrações dos contaminantes ou na redução da toxicidade dos contaminantes à biota. As comunidades microbianas são heterogêneas em sua composição, e fatores abióticos como nutrientes e níveis de oxigênio limitam o crescimento dos microorganismos. A compreensão de como os fatores abióticos estruturam as comunidades microbianas torna-se essencial para garantir a eficiência de tratamentos de biorremediação, como o bioestímulo. Smith et al. (1998) apresentaram a Teoria da Proporção do Recurso (Resource-Ratio Theory), que faz predições sobre como os nutrientes estruturam as comunidades: 1) a proporção de fornecimento de nitrogênio e fósforo é responsável pela composição das comunidades microbianas; e 2) um fornecimento absoluto
nos níveis dos nutrientes, mantendo-se as proporções constantes, aumentará a biomassa das comunidades. A consideração destas predições na aplicação dos tratamentos de biorremediação pode aumentar as taxas de degradação de hidrocarbonetos e a eficiência na redução da toxicidade.
No presente estudo, o tratamento referência foi eficiente na redução da toxicidade dos sedimentos contaminados do estuário do Rio São Paulo, promovendo um aumento na fecundidade total das fêmeas de T. biminiensis. Yu et al. (2005) avaliaram a eficiência da atenuação natural em termos de redução na concentração dos hidrocarbonetos, e encontraram níveis elevados de atenuação: ao final de 4 semanas de experimento houve uma degradação de 99% dos hidrocarbonetos. Mills et al. (2003) analisaram a eficiência de remoção de hidrocarbonetos saturados e aromáticos e encontraram taxa de degradação de 95%.No presente estudo, a fecundidade total no tratamento referência aumentou cerca de 200% no grupo peneirado, e 700% no grupo não peneirado (Tab. 2). Este surpreendente aumento da fecundidade pode estar correlacionado com altas taxas de degradação do óleo nos sedimentos do rio São Paulo.
A adição dos fertilizantes NPK e OSMOCOTE no presente estudo não aumentou a eficiência da atenuação natural (tratamento referência) na redução da toxicidade. Embora altas taxas de degradação de hidrocarbonetos tenham sido observadas após o tratamento de bioestímulo (BRADDOCK et al., 1997; MILLS et al, 2004), uma diminuição da taxa de degradação de hidrocarbonetos no solo foi observada por Johnson e Scow (1999) após correção dos níveis de nutrientes. Estes resultados contrastantes demonstram correlação entre a eficiência de remoção dos hidrocarbonetos e a Teoria da Proporção do Recurso. Uma vez que as diferentes espécies das comunidades microbianas diferem em sua capacidade para metabolizar hidrocarbonetos, devem-se criar condições para o crescimento daquelas com maior potencial de degradação de hidrocarbonetos. Os tratamentos NPK e OSMOCOTE no presente estudo não foram mais eficientes que o tratamento referência na atenuação da toxicidade, e isto pode estar relacionado com a proporção dos nutrientes nitrogênio, fósforo e potássio nos fertilizantes.
O teste t para amostras pareadas revelou um efeito significativo do peneiramento sobre a fecundidade total das fêmeas de Tisbe biminiensis (Tab. 1). Este parâmetro foi significativamente menor no grupo peneirado relativamente ao grupo não peneirado. Esta redução da fecundidade total no grupo peneirado indica que esta fração do sedimento (< 64
µm) se apresentou mais tóxica. Os sedimentos do estuário do rio São Paulo apresentam em sua composição 59,9% de areia e 40,1% de lama, tendo sido classificado como sedimento com textura de areia lamosa (RECUPETRO, 2009). Na amostra bruta do sedimento (grupo não peneirado, > 63 µm) o percentual orgânico foi de 4,7%, porém no presente estudo não foi medido o percentual orgânico associado com a fração de sedimento menor que < 63 µm. Estas características precisam ser levadas em consideração na avaliação da toxicidade.
Tem sido demonstrado que a matéria orgânica associada com diferentes frações do sedimento é o principal fator que controla a distribuição de contaminantes orgânicos no sedimento (WANG et al., 2001). Kim et al. (1999) observaram que as concentrações de HPAs se correlacionaram positivamente com o percentual de carbono orgânico e com o conteúdo de silte e argila do sedimento. Grãos de argila apresentam polaridade e grande área superficial, o que torna estes grãos capazes de adsorver uma grande quantidade de matéria orgânica. A fração < 63 µm é composta por grãos de silte e argila, e um alto percentual orgânico pode estar associado com esta fração devido às propriedades mencionadas acima. Isto pode explicar a maior toxicidade observada na fração de sedimento menor < 63 µm.
Outra característica que deve ser levada em consideração na dinâmica de hidrocarbonetos é a qualidade da matéria orgânica presente no sedimento. A qualidade da matéria orgânica varia de altamente biodegradável (lábil), como o conteúdo orgânico das algas, a menos assimilável (refratária), como a lignina (GUNNARSSON et al., 1999). Estas diferenças influenciam na capacidade da matéria orgânica para adsorver contaminantes orgânicos e no uso dela como alimento pelos organismos detritívoros. Gunnarsson et al. (1999) analisaram a importância da qualidade da matéria orgânica para biodisponibilidade de contaminantes orgânicos, e observaram que as maiores taxas de acumulação de contaminantes foram observadas nos tratamentos com substratos orgânicos lábeis. Nos sedimentos do estuário do rio São Paulo a matéria orgânica é proveniente principalmente da vegetação superior representada pelo manguezal (VEIGA et al., 2008), sendo esta a caracterização da matéria orgânica no sedimento bruto (não peneirado, > 63 µm). Outra possível fonte de material orgânico são os organismos bentônicos e planctônicos, e esta pode estar associada com a fração < 63 µm. Desta forma, os hidrocarbonetos de origem petrogênica podem estar em maior concentração na fração < 63 µm, tornando-a mais tóxica a Tisbe biminiensis.
A utilização da matéria orgânica sedimentar como alimento pelas fêmeas de Tisbe
fêmeas sobreviventes se correlacionou positivamente com o percentual de carbono orgânico apenas no grupo peneirado, e isto pode ser devido a utilização de matéria orgânica mais assimilável como alimento, provavelmente associada com a fração < 63 µm. A correlação positiva da fecundidade total de T. biminiensis em ambos os grupos pode demonstrar a versatilidade deste organismo na utilização da matéria orgânica de variadas fontes. No presente estudo, não houve correlação do percentual de copepoditos com o percentual de carbono orgânico, contrastando com a correlação positiva obtida para fecundidade.
Correlações negativas entre a sobrevivência e fecundidade total das fêmeas de T.
biminiensis e a concentração de amônia somente foram observadas no grupo peneirado (Fig.
10; Fig. 11), e isto pode ser devido a uma maior associação dos íons amônio (NH4+) com os
grãos de argila. No grupo peneirado, os coeficientes de determinação (R) explicaram 47% e 32% da variação observada na sobrevivência e fecundidade total, respectivamente. O percentual de copepoditos se correlacionou positivamente com a concentração de amônia apenas no grupo peneirado, e isto pode ser devido a um aumento na abundância de microorganismos após utilização dos compostos nitrogenados como nutrientes.
7 CONCLUSÕES
Os bioensaios com Tisbe biminiensis demonstraram ser uma ferramenta prática para avaliar a eficiência dos tratamentos de biorremediação.
O tratamento de biorremediação conhecido como bioestímulo, pela adição dos fertilizantes NPK e OSMOCOTE, não foi mais eficiente que a referência na atenuação natural da toxicidade dos sedimentos do estuário do rio São Paulo.
Não é indicada a utilização de fertilizantes com compostos amoniacais como estratégia de biorremediação em manguezais, pois 24 h após adição do fertilizante NPK houve um intenso efeito letal.
O peneiramento pode ser utilizado como técnica para preparar os sedimentos a serem submetidos aos bioensaios com Tisbe biminiensis.
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