ESTUDO IN VITRO DE Ageratum fastigiatum EM ELEMENTOS DO CITOESQUELETO E INTEGRINAS DE MEMBRANA DE LINFÓCITOS
HUMANOS
P. G. M. de Alvarenga¹; M. H. F. Ottoni²; B. E. Souza¹; B. A. Avelar-Freitas²; J.V.W. Silveira¹; A. B. Meireles²; C. F. F. Grael²; G. E. A. Brito-Melo²; L. A. Gonzáles-Torres¹
¹Instituto de Ciência e Tecnologia – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)
²Departamento de Farmácia – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)
Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000 - Diamantina - MG, 39100-000 E-mail: l.gozales@ict.ufvjm.edu.br
RESUMO
Extratos de Ageratum fastigiatum são utilizados na medicina popular para tratar dores e inflamações. Entretanto, o mecanismo envolvido na ação anti-inflamatória da planta, ainda não foi devidamente elucidado. O objetivo deste estudo é analisar a influência do óleo essencial de A. fastigiatum sobre integrinas de membrana, bem como sobre a conformação celular, utilizando métodos de citometria de fluxo e microscopia óptica. Os resultados indicam que o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de CD18, marcador de integrinas da membrana linfocitária. Além disso, pode modificar a estrutura do citoesqueleto, permitindo dessa forma interferir no mecanismo de migração celular. A compreensão desse fenômeno pode auxiliar no desenvolvimento de métodos de tratamento e diagnóstico de doenças do sistema imune.
INTRODUÇÃO
O Ageratum fastigiatum (Gardner) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae), conhecida popularmente no estado de Minas Gerais - Brasil como “matapasto” ou "enxota", é utilizada na medicina popular como anti-inflamatório e analgésico (2) (7). Seu extrato é preparado a partir de folhas e ramos frescos picados e submetidos a maceração ou decocção. O extrato aquoso, após filtração, é aplicado topicamente para tratar dor e inflamações. O óleo essencial pode ser obtido através de processos de hidrodestilação. Foi demonstrado in vivo, que o óleo essencial dessa planta tem um efeito anti-inflamatório e analgésico, através da redução de edema e da migração leucocitária induzidos em modelo animal (7). Contudo, os mecanismos envolvidos na ação anti-inflamatória da planta ainda não foram bem elucidados.
Alguns estudos demonstraram o efeito do óleo essencial de A. fastigiatum na redução de linfócitos e neutrófilos que produziram a citocina TNF-α (5), um mediador importante na resposta imune inflamatória, capaz de induzir a expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento celular para o sítio da inflamação (3) (9). Contudo, nenhum estudo avaliou o efeito do óleo essencial da planta sobre integrinas de membrana leucocitárias envolvidas na migração celular e nos arranjos de elementos do citoesqueleto. Tendo em vista a ação anti-inflamatória de A. fastigiatum e seu potencial de atuar sobre leucócitos, o objetivo desse estudo foi investigar o efeito do óleo essencial de A. fastigiatum sobre a expressão de CD18, marcador de integrinas de membrana leucocitárias, bem como avaliar mudanças geométricas nas células de culturas de células mononucleares do sangue periférico humano in vitro. As dimensões geométricas são avaliadas, devido à possível mudanças causadas por alterações no citoesqueleto.
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção e análise química do óleo essencial
O material vegetal fresco foi cominuído e a extração de seu óleo essencial foi realizada através de aparato de Clevenger, por 2 h(6). O óleo essencial foi
acondicionado em frasco tipo eppendorff e conservado a –20°C até o momento de análise química. A identificação dos constituintes químicos do óleo essencial foi realizada com base nos dados de análises através de cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM). Foram realizadas duas análises sob as mesmas condições experimentais: uma análise do óleo essencial sem a adição de nenhuma substância e outra análise do óleo essencial misturado com uma série homóloga de hidrocarbonetos (C7 a C40 - padrões de hidrocarbonetos saturados dissolvidos em hexano). A partir da primeira injeção do óleo essencial foram obtidos os espectros de massas dos componentes químicos. A segunda injeção foi realizada para se obter tempos de retenção dos constituintes químicos e dos hidrocarbonetos para se calcular o índice de retenção relativa, de acordo com a equação (A) (4).
(A)
Onde:
IRR = número do índice de retenção relativa;
n = número de átomos de carbono do hidrocarboneto eluído imediatamente antes do composto “x” de interesse;
tn e tn+1 = tempos de retenção dos hidrocarbonetos eluídos imediatamente antes e após o composto “x” de interesse, respectivamente;
tx = tempo de retenção do composto “x”.
Os espectros interpretados e os IRR calculados foram comparados com dados da literatura (1) e de sites especializados e de acesso livre (http://www.pherobase.com/ e http://www.flavornet.org/flavornet.html) para se confirmar a identificação dos componentes químicos do óleo analisado. Os espectros obtidos experimentalmente foram comparados a espectros contidos na espectroteca (NIST).
Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum
Para avaliar o efeito do óleo essencial da A. fastigiatum sobre a viabilidade dos leucócitos, 5x106 células foram incubadas com meio RPMI
(acrescido de soro humano (10%), L-glutamina (1%) e coquetel antibiótico e antimicótico (1%)) e tratadas com óleo essencial nas concentrações finais de 25x10-3 μL/mL, 12,5x103 μL/mL e 6,25x10-3 μL/mL por 5 dias, em estufa com 5% de CO2 e 37ºC. Culturas celulares contendo apenas RPMI e culturas acrescidas de dimetilsulfóxido (DMSO) constituíram a cultura controle e controle do solvente, respectivamente. O óleo essencial à 25x10-3 μL/mL. Após o período de incubação as células foram removidas da placa por lavagem com tampão fosfato salina (PBS) gelado, centrifugadas a 200 G, 10 min, 4ºC. O precipitado foi suspenso em PBS para avaliação da viabilidade pela técnica de exclusão de azul de tripan por citometria de fluxo (5). A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).
Estimulação das células com óleo essencial
Inicialmente foram testados dois protocolos, sendo o primeiro com estimulação de sangue total por 4 h e o segundo estimulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por 24 h.
Cultura de sangue total
Para teste do protocolo 500 μL de sangue total foram estimulados ou não com PMA-ionomicina (25 ng/mL). As culturas permaneceram por 4 h em estufa úmida a 37ºC e 5 % de CO2. Em seguida, as amostras foram submetidas à lise das hemácias por adição de uma solução de lise eritrocitária e incubadas à temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e as células suspensas em PBS (PBS 0,015 M pH 7,4). As células foram então marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD18 conjugados com phycoerythrin (PE) por 30 min. Terminada a incubação, as células foram lavadas com PBS e avaliadas por citometria de fluxo (FACScanto - Becton Dickinson), procedendo-se a aquisição de 30.000 eventos por tubo.
As PBMCs foram obtidas a partir de sangue periférico venoso após centrifugação em Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA). O anel de PBMC, formado após a centrifugação, foi recolhido e lavado duas vezes em PBS. O precipitado de células foi em seguida suspenso em 1 mL de PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após contagem das células em câmara hemocitométrica de Neubauer, as células foram novamente centrifugadas e suspensas em PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementado com L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2 mM), e coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, USA) na concentração de 1x107 células/mL.
A partir de um volume de 50 μL, 5x105 células foram incubadas em RPMI da suspensão celular. As culturas tratadas com os produtos naturais foram estimuladas ou não com o PMA. A cultura estimulada com PMA constituiu o controle positivo. As células foram incubadas por 24 h em estufa úmida, a 37ºC contendo 5% de CO2. Após o período de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS. Foi realizada a marcação com anticorpos anti-CD18 e realizada a leitura de 30.000 eventos por citometria.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Análise da composição do óleo essencial de A. fastigiatum
A análise da cromatografia gasosa revelou a presença das substâncias listadas na Tabela 1. Das substâncias elucidadas, as que se encontram em maiores concentrações são o germacreno e α-pineno, os quais já foram encontradas em outras amostras do óleo essencial desta planta (5)(7).
Tabela 1: Substâncias presentes no óleo essencial
Composto identificado Tempo de retenção (min)
IRR calculado
IRR
literatura Área do pico*
α-pineno 6,90 934,9 932 143.331.056 β-pineno 8,22 979,1 974 16.696.142 β-mirceno 8,55 990,3 988 4.322.807 d-limoneno 9,96 1029,6 1024 87.911.992 β-ocimeno 10,60 1046,6 1044 11.151.418 α-copaeno 24,45 1379,7 1374 9.273.628 4,8-β-epóxi-cariofileno 26,31 1425,1 1423 64.096.240 Germacreno 28,82 1487,6 1484 151.216.768 Biciclogermacreno 29,43 1502,9 1500 12.008.181 NI 34,17 1627,7 - 81.561.200 NI 34,93 1648,5 - 8.961.346 NI 40,92 1819,0 - 19.160.288
*Área absoluta do pico no cromatograma; corrente de íons total, sem padronização; NI= não identificado.
Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum.
A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis). Os resultados indicaram que o tratamento com até 25x10-3 μL/mL do óleo essencial de A. fastigiatum em DMSO, em cultura celular não altera a viabilidade dos linfócitos para culturas com incubação de 5 dias. De tal forma,
todas as concentrações utilizadas em tais testes foram consideradas de baixa toxicidade (Figura 1).
Controle DMSO 25 12,5 6,25 Óleo Essencial de A. fastigiatum
x10-3 μL/mL 0 1 2 3 % C é lu la s I n v iá v e is
Figura 1: Percentual de células inviáveis após incubação com concentrações do óleo essencial A. fastigiatum por cinco dias. Anova seguida de Tukey, n=4.
Até o momento o que se pode concluir é que o óleo essencial na concentração de 25x10-3 μL/mL não foi tóxico e, portanto, é a primeira concentração a ser utilizada nos ensaios de inibição da expressão de moléculas de adesão como a CD18.
Resultados da padronização do experimento para escolha do uso de Sangue Total ou PBMC
Os resultados com sangue total indicaram que após 4 horas e incubação e análise dos linfócitos o PMA não foi capaz de induzir o aumento na expressão de citocinas. O percentual de células CD18+, bem como a intensidade de fluorescência das culturas estimuladas e não estimuladas foram semelhantes. Portanto o estimulo do PMA (25 ng/mL) por quatro horas não produziu o efeito desejado (Figura 2).
Figura 2: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 4 h em sangue total para expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
Já a análise com PBMC indicou que após 24 h de incubação foi possível observar o efeito do PMA na indução da expressão de CD18 em linfócitos (Figura 3). Portanto os testes para verificação do efeito do óleo essencial de A. fastigiatum foram realizados com o a incubação de 24 h. Tendo em vista que os neutrófilos e hemácias presentes no sangue total possuem tempo de vida limitado em culturas, para incubação de 24 h foram utilizadas células PBMC’s.
Figura 3: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 24 h em sangue PBMC na expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).
Expressão de CD18 em linfócitos estimulados com PMA e tratados com o óleo essencial de A. fastigiatum
O CD18 representa uma família de integrinas expressas na superfície de leucócitos que vão auxiliar na adesão dos leucócitos para a diapedese e migração nos tecidos. Na inflamação ocorre uma alta taxa de migração celular, a fim de restaurar a homeostase tecidual. No entanto, em algumas doenças autoimunes é necessária a intervenção farmacológica para cessar os efeitos da inflamação. Os resultados indicaram que o óleo essencial na 1/160 reduziu a intensidade de fluorescência das células marcadas com anti-CD18, o que demonstra que as células tratadas com o óleo essencial da planta reduziram o efeito provocado pelo PMA de induzir a expressão de CD18 (Figura 4). As células estimuladas com PMA apresentaram uma intensidade média de fluorescência (IMF) para a marcação de CD18 no valor de 1008, as células estimuladas com PMA e tratadas com o óleo essencial apresentaram o valor de IMF de 619, muito próximo do controle não estimulado IMF 622. É possível que parte dos mecanismos envolvidos na ação do CD18 sejam medidas pela diminuição do recrutamento de células inflamatórias para o tecido.
Figura 4: Resultados da Intensidade média de fluorescência (IMF) das culturas marcadas com anti-CD18 nas culturas: controle não marcado (A), controle
negativo (B), controle positivo estimulado com PMA (C) e cultura teste estimulada com PMA e tratada com óleo essencial (D).
Análise de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular
Utilizando-se o protocolo de obtenção de PBMC, dessa vez, após a mesma cultura de 24 h, foram feitas análises em microscópio óptico para que fossem tomadas medidas dos eixos das células. Foi padronizado um número de dez medidas por amostra (não marcada, não estimulada, controle positivo e tratada com óleo essencial). A Figura 5 apresenta um comparativo do resultado médio e do desvio padrão das medições dos diâmetros (em μm).
Figura 5: Diâmetros das células com e sem influência de óleo essencial.
Apesar das análises em citometria de fluxo apresentarem alterações na intensidade de fluorescência de células marcadas com CD18 quando tratadas com óleo essencial de A. fastigiatum, não foi possível observar alterações significativas no tamanho das células. Porém a falta de mudanças morfológicas perceptíveis se deve ao fato de que essa é uma medida indireta e pouco sensível para avaliar a deformação do citoesqueleto.
CONCLUSÃO
Sugere-se que o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de CD18, reduzindo assim a migração linfocitária. Ensaios em microscopia óptica foram realizados no sentido de avaliar a alteração na conformação celular, porém em virtude do método pouco sensível, os resultados foram inconclusivos. Diante dos resultados, é possível inferir, que parte da ação
anti-inflamatória de A. fastigiatum se dê pela redução da migração celular para o sítio da inflamação.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer à FAPEMIG e à CNPq pelo suporte financeiro para a realização desse trabalho e ao laboratório de imunologia da UFVJM por todo suporte estrutural para o desenvolvimento da pesquisa.
REFERÊNCIAS
(1) ADAMS, R. Identification of Essential Oils Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Allured Pub., Carol Stream, IL. 2001. (2) ALMEIDA, V.G. EFEITO CITOTÓXICO E POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng) R, M. King & H. Rob (ARNICADO-CAMPO) EM CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE
PERIFÉRICO HUMANO, IN VITRO. Disponível em:
<http://acervo.ufvjm.edu.br/jspui/bitstream/1/716/1/valeria_gomes_almeida.pdf> Acesso em: 28 de abril de 2016.
(3) APOSTOLAKI, M., ARMAKA, M., VICTORATOS, P., KOLLIAS, G. Cellular Mechanisms of TNF Function in Models of Inflammation and Autoimmunity. Curr Dir Autoimmun 11, 1-26. 2010.
(4) AQUINO NETO, F.R.; NUNES, D.S.S. Cromatografia - princípios básicos e técnicas afins. Editora Interciência, Rio de Janeiro, RJ, 2003.
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(6) CUNHA, A.P.; CAVALEIRO, C.; ALGUEIRO, L. Fármacos aromáticos (plantas aromáticas e óleos essenciais) In: CUNHA, A.P. (Coord.). Farmacognosia e Fitoquímica. Lisboa, Fundação CalousteGulbenkian. Cap. 16, p. 339-402, 2005
(7) DEL-VECHIO-VIEIRA, G; SOUSA, O.V; MIRANDA, M.A.; SENNA-VALLE, L; KAPLAN, M.A.C. Analgesic and Anti-inflammatory Properties of essential Oil from Ageratum fastigiatum. Braz. Arch. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151689132009000500 008&lang=pt>. Acesso em: 28 de Abril de 2016.
(8) SURESH, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Apr. 2007. (9) WAJANT, H. The role of TNF in cancer. Res. Probl Cell Dif.49, 1-15, 2009.
Ageratum fastigiatum IN VITRO STUDY ON CYTOSKELETON ELEMENTS AND HUMAN INTEGRINS MEMBRANE
ABSTRACT
A. fastigiatum essential extracts are employed to treat pains and inflammations. Even though, the mechanism, involved in the anti-inflammatory action, is not elucidated properly. The objective of this study is to analyze the influence of different essential oils contents over the leucocytes internal structure, by the flux cytometry and optical microscopy methods. Results showed that the A. Fastigiatum reduces the CD18 expression, an integrin marker from lymphocyte membrane. Also, it could modify the cytoskeleton structure, interfering in the cell migration mechanism. The comprehension of this phenomena can help the development of diagnosis and treatment methods for immunological system diseases.
