Morus nigra: novo biocatalisador para obtenção de compostos de interesse industrial/Morus nigra: new biocatalyst for obtaining compounds of industrial interest

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 7, p.53403- 53413 jul. 2020. ISSN 2525-8761

Morus nigra: novo biocatalisador para obtenção de compostos de interesse

industrial

Morus nigra: new biocatalyst for obtaining compounds of industrial interest

DOI:10.34117/bjdv6n7-837

Recebimento dos originais:08/06/2020 Aceitação para publicação:30/07/2020

Rogério Aparecido Minini dos Santos

Doutor em Ciência Farmacêutica

Instituição: Universidade Cesumar – UNICESUMAR Endereço: Av. Guedner, nº 1610, MARINGÁ – PR, Brasil

E-mail: rogerio.santos@unicesumar.edu.br

Gabrielli Furlan

Discente do curso de Farmácia. Centro Universitário de Maringá – UNICESUMAR Instituição: Universidade Cesumar – UNICESUMAR

Endereço: Av. Guedner, nº 1610, MARINGÁ – PR, Brasil E-mail: gabriellifurlan@gmail.com

RESUMO

A síntese de compostos enantiomericamente puros é cada vez mais requisitada pelas indústrias farmacêutica, cosmética e agroalimentar, bem como está estabelecido a importância da quiralidade na atividade e propriedades biológicas de muitos compostos. Desta forma a biocatálise tornou-se uma alternativa viável na produção de compostos de interesse indústria. Assim o objetivo do presente estudo é avaliar as capacidades de biotransformação das folhas Morus nigra do terpenoide (+)-carvona, bem como determinar as condições biocatalíticas ideiais. Foram testadas as variáveis biomassa, concentração de substrato e pH do meio, sendo possível inferir que para todas as condições testadas as folhas de Morus nigra foram capazes de realizar hidrogenação do alceno ativado, bem como a redução da carbonila para álcool quiral. Estes resultados demonstram que a

Morus nigra é uma potencial ferramenta biocatalítica para a obtenção de compostos de interesse

industrial.

Palavras-chave: biocatálise, (+)-carvona, compostos quirais. ABSTRACT

The synthesis of enantiomerically pure compounds are increasingly required by the pharmaceutical, cosmetic and agrifood industries, as well as the importance of chirality in the activity and biological properties of many compounds. Thus, biocatalysis has become a viable alternative in the production of compounds of interest to industry. Thereby, the objective of the present study is to evaluate the biotransformation capacities of Morus nigra leaves of the terpenoid (+)-carvone, as well as to determine the ideal biocatalytic conditions. The variables biomass, substrate concentration and pH of the medium were tested, and it is possible to infer that for all conditions tested, the leaves of M.

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carbonyl to chiral alcohol. These results demonstrate that M. nigra is a potential biocatalytic tool for obtaining compounds of industrial interest.

Keywords: biocatalysis, (+)-carvone, chiral compounds.

1 INTRODUÇÃO

Os terpenos compreendem uma classe altamente diversificada de produtos naturais, da qual derivam diversos sabores comerciais, fragrâncias e medicamentos. Esses valiosos compostos são comumente isolados de plantas, micro-organismos e organismos marinhos (DEWICK, 2009).

Dentre estes terpenos destaca-se a D-carvona ou (4S)-(+)-carvona, que apresenta um cheiro de cominho/endro, sendo o principal constituinte dos óleos de sementes de alcaravia (Carum carvi) e endro (Anethum graveolens) (de CARVALHO; da FONSECA, 2006). São amplamente empregados pela indústria e como substratos em reações biocatalíticas, devido as várias aplicações, como fragrância e flavours, inibidor de brotos de batata e agente antimicrobiano, juntamente com sua relevância no campo médico (SOUZA et al., 2013). Dentre as aplicações na área da saúde já foi observado que a carvona inibe a patogenicidade da Candida albicans (MCGEADY et al, 2002).

Além disso, os produtos de hidrogenação da ligação dupla C=C ativada da D-carvona, as 2-metil-5-(1-metiletenil)-ciclo-hexanona (diidrocarvona) (2a e 2b) (Figura 1) são considerados blocos de construção renováveis atraentes em todo o mundo, que podem ser aplicados como compostos de partida quirais na síntese de poliésteres, produtos naturais (por exemplo, ácido estriatênico, ácido pechueloico), medicamentos antimaláricos e valiosos quirais sintons. (WINKLER et al., 2012; JIANG et al., 2007; ZHANG et al., 2008). Como exemplo, pode ser citado a utilização da diidrocarvona como precursor biossintético do dispiro-1,2,4,5-tetraoxano, um antimalárico (DONG et al., 2010), precursores quirais para síntese de pirazóis (de ROUVILLE et al., 2009) e valerolactonas (KRAWCZYK et al., 2007).

Mediante a redução da carbonila da diidrocarvona, é possível obter os álcoois 2-metil-5-(1-metiletenil)-ciclo-hexanol (dihidrocarveóis) (3a, 3b, 3c e 3d) (Figura 1), os quais são fragrâncias usados em cosméticos decorativos, fragrâncias finas, shampoos, sabões e outros produtos de higiene, bem como em produtos domésticos, como produtos de limpeza e detergentes (BHATIA et al., 2008).

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Figura 1: Possíveis rotas biocatalíticas da (4S)-(+)-carvona; ER = ene-redutase; CR = carbonil redutase

Nos últimos anos, culturas de células vegetais e células vegetais inteiras têm sido estudadas como potenciais agentes para reações de biotransformação, como Machado et al. (2006) que observaram a capacidade de fragmentos de tecido de várias plantas, como as de Manihot dulcis,

Manihot esculenta (mandioca), Solanum melongena (berinjela), Daucus carota (cenoura), Colocasia esculenta e Ipomoea batatas, em realizar reduções de cetonas e aldeídos aromáticos em

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(2016) empregando cultura de células em suspensão de Catharanthus roseus, promoveu reações de hidroxilação e glicosilação do Δ9-tetrahidrocanabinol com o intuito de aumento de polaridade para facilitação em incorporação em formulações farmacêuticas.

A utilização de órgãos inteiros vegetais, sem qualquer preparação preliminar ou transformação, tem sido considerada (BRUNI et al., 2002; VANDENBERGHE et al., 2013). Esta metodologia oferece vantagens em termos de biodisponibilidade e economia de tempo, uma vez que não são necessárias etapas exigentes de preparação, extração, purificação e multiplicação do biocatalisador, promovendo assim a preservação de uma atividade catalítica máxima das enzimas (FONSECA et al., 2009; STRYJEWSKA et al., 2013). Além disso, este tipo de biocatalizador é eco-compatível, uma vez que as reações são realizadas em meio aquoso, à temperatura ambiente e geram apenas resíduos biodegradáveis (CORDELL et al., 2007). No entanto, as plantas e, portanto, suas enzimas não foram extensivamente estudadas para transformações de substratos xenobióticos para fins sintéticos. As enzimas presentes nas células das plantas podem ter propriedades desconhecidas e interessantes que permitiriam novas abordagens na biocatálise (BIROLLI et al., 2015; CORDELL et al., 2007).

Dentre estes subprodutos da agricultura estão as partes não comestíveis da amoreira (Morus sp). Este vegetal é o principal hospedeiro dos bichos-da-seda (Bombyx mori L.), e é explorada em escala comercial para a produção de seda. O gênero Morus tem muitas espécies em todo o mundo sendo a maioria encontrada na Ásia, especialmente na China e no Japão (MAMRUTHA et al., 2010). Este gênero é constituído de aproximadamente 24 espécies, uma subespécie, sendo descrito pelos menos 100 variedades (MACHII et al., 2000; TUTIN et al., 1996).

Neste estudo, as folhas de Morus nigra foram utilizadas como biocatalisador na redução de (4S)-(+)-carvona em sistema tampão para obtenção de diidrocarvonas e diidrocaveois. As condições operacionais para a reação biocatalítica, tais como biomassa do biocatalisador, massa de substrato e pH foram avaliadas, a fim de melhorar tanto a conversão quanto os valores de excesso diastereoisomérico dos produtos.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Produtos químicos

O substrato (4S)-(+)-carvona foi obtido da Sigma-Aldrich; o sulfato de sódio anidro, NaH2PO4, KH2PO4 e solventes são Synth.

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Redução química da (4S)-(+)-carvona

Com a finalidade de obter alcoóis racêmicos para serem utilizados como padrões nas análises de CG/EM, o substrato foi reduzido com NaBH4 de acordo com metodologia descrita e adaptada

por Ward e Rhee (1989). Em um balão de fundo rendondo de 50,0 mL foi adicionado 0,1 g do substrato diluído em 10,0 mL de álcool etílico 95° e resfriado a 0 °C, seguido da adição lenta de 0,1 g de NaBH4. O meio reacional foi mantido sob agitação durante 60 minutos. Após este período, foi

adicionado 20,0 mL de solução saturada de NH4Cl e promovido a extração em funil de separação

com duas porções de 20,0 mL de CH2Cl2. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 anidro. O solvente

foi evaporado sob pressão reduzida num evaporador rotativo. Os produtos foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM).

Análise por CG/EM

Foi utilizado um CG/EM Agilent Technologies 5977-A, equipado com uma coluna HP-5MS (30 mx 0,25 mm x 0,250 µm). O gás carreador foi o hélio (vazão 1,0 mL/min); o injector no modo

split (20:1) a 220 ºC 1:20; detector quadrupolo à 400 ºC; Impacto de elétrons: 70 eV; temperatura

de fonte de íons à 230 ºC; linha de transferência à 250 ºC; a foi coluna programada com uma rampa de 60-90 °C (3 °C/min) e 90-285 °C (50 °C/ min). O volume injetado foi de 2 μL. A identificação dos produtos foi feita usando o índice de retenção de Kovats (Adams, 2012) e a comparação com a NIST 11.0 library spectra.

Avaliação quantitativa da seletividade do biocatalisador

A conversão (c) dos substratos em produtos foi calculada através da razão entre as áreas dos picos correspondente ao substrato e seus respectivos produtos (Equação 1) e o excesso diastereoisomérico (e.d.) através da Equação 2 (GORETTI et al, 2009; COLLINS, 2014):

Equação 1

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Reação biocatalítica

As folhas frescas da Morus nigra foram obtidas com produtores da cidade de Mandaguaçu-PR (Brazil), as quais foram lavadas em água corrente, secas com papel filtro e cortadas em pedaços (0,5 cm2) e descontaminadas em solução de NaClO a 1% (MACHADO et al., 2006; CHANG et al., 2010).

Com o objetivo de avaliar a melhor condição biocatalítica, as variáveis biomassa, concentração de substrato e pH foram testadas: em Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de solução tampão Sφrensen (Na2HPO4 -KH2PO4) (pH 4, 7 ou 9), foi adicionado a biomassa da M.

nigra (1, 2 ou 3 g) e o substrato (10 ou 20 µL). Os frascos reacionais foram mantidos sob agitação

de 120 rpm à 28°C por 5 dias. Após este período foi realizado filtração e extração dos produtos obtidos com duas porções de 10 mL de acetato de etila. Os extratos resultantes foram concentrados sob pressão reduzida e analisados CCD e CG/EM.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As possíveis rotas de biotransformação da cetona α,β-insaturadas, (4S)-(+)-carvona, catalisada pela Morus nigra podem ser observadas nas Figuras 1. Estas rotas são possíveis devido a presença das enzimas ene-redutases (ERs), pertencentes à família “Old Yellow Enzyme” flavina dependentes, extensivamente estudadas por sua capacidade de catalisar a hidrogenação assimétrica de alcenos eletronicamente ativados, como C=C da (4S)-(+)-carvona (GORETTI et al., 2012; WINKLER et al., 2012). A redução da carbonila para álcool quiral pode ser justificada pela presença de carbonil redutases, dependentes de NADH ou NADPH (NI; XU, 2012; WINKLER et al., 2012). Como pode ser observado na Tabela 1, estas rotas metabólicas foram observadas para todas condições biocatalíticas testadas, demonstrando a capacidade das células M. Nigra em realizar reações de biotranformação.

Observa-se na Tabela 1 e na Figura 2, que a variável na qual mais influenciou na eficiência biocatalítica foi a biomassa, ou seja, quanto maior a massa de vegetal utilizada, maior a capacidade de conversão observada. Além disso, a proporção de biomassa e substrato mostrou-se importante na reação, ou seja, maior quantidade do vegetal e menor concentração de substrato, demonstrou maior capacidade em realizar as reações biocatalíticas. Uma possíel explicação é o fato que a alta concentração do substrato pode promover inibição de diferentes enzimas presentes nas células, além disso alguns compostos podem ser tóxicos para a maioria das células vivas (SILVA et al., 2013). Este resultado era esperado mediante observação de outros estudos, como Chang et al. (2010) que promoveram a redução da acetofonona utilizando diversos vegetais, na qual empregaram várias

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concentrações de substrato (10 a 50 mmol/L), sendo observado que a menor concentração de acetofenona também favoreceu um maior rendimento reacional.

Tabela 1: Bioconversão de (4S)-(+)-carvona por folhas frescas de Morus nigra. Variáveis

% de conversãoa

% dos produtos formados (e.d.)b

Exp. N° Biomassa (g) Substrato (mg) pH 2a 2b 3a 3b 3c 1 1 10 4 45 16 29 (28) - - - 2 1 20 4 13,8 1,3 12,5(81) - - - 3 2 10 4 97 5,4 18,6(55) 3,6 69(88) 0,8 4 2 20 4 59 19,7 40(34) 3,5 30(79) - 5 3 10 4 100 4,3 4,4(1) 7 82,5(81) 1,8 6 3 20 4 85 13,3 38(48) - 7,8(100) - 7 1 10 7 48 3,7 22,5(78) - 1,8(100) - 8 1 20 7 28 6 22(75) - - - 9 2 10 7 80,6 12 66(69) - 2,6(100) - 10 2 20 7 78,2 9 52(70) 1 16,2(88) - 11 3 10 7 99,8 14,7 82(70) - 3,1(100) - 12 3 20 7 75,5 12,5 63(67) - - - 13 1 10 9 47,3 10 21,7(37) 1,8 7,3(16) 3 14 1 20 9 18 5 13(44) - - - 15 2 10 9 85 29,5 38,8(14) 6 10,5(27) - 16 2 20 9 73 23,5 45(31) - 3,3(100) - 17 3 10 9 88,5 19,8 22,5(6) 7,8 26,9(43) 3 18 3 20 9 45,5 20,5 22,8(5) 12,7 30,4(41) -

a_{Conversão da reação de biocatálise determinada por CG.} b_{Excesso diastereoisomérico}

Figura 2: Bioconversão de (4S)-(+)-carvona versus biomassa da Morus nigra.

Fonte: Dados da pesquisa

A construção de compostos quirais contendo um ou mais estereocentros é certamente um dos desafios mais atraentes e importantes da química orgânica sintética contemporânea (HANESSIAN et al., 2013). De encontro a esta realidade, pode ser observado na Tabela 1 que ocorreu a reação de hidrogenação do alceno ativado em todos os protocolos testados, com

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prevalência da formação da (1S,4S)-diidrocarvona, ou seja, ocorreu trans-hidrogenação. Este resultado foi semelhante ao trabalho realizado por Maczka et al. (2018), que utilizaram diferentes vegetais para biocatalizar a (4S)-(+)-carvona.

Este resultado é extremamente relavante, pois a (4S)-carvona possui três ligações não saturadas e um centro estereogênico em C-5, o que pode proporcionar muitos problemas de seletividade: quimioseleção entre os grupos funcionais C=C e C=O; regioselectividade entre a ligação C=C conjugada e isolada; e diastereosseletividade cis versus trans em relação ao substituinte C-5 nas reduções de ligações C=O e C=O (CHEN et al., 2012). Sem controle sobre a seletividade, são possíveis 8 produtos de hidrogenação diferentes.

A síntese assimétrica de compostos quirais enantioméricos pode ser alcançada com uma ampla gama de enzimas com excelentes perfis de especificidade e seletividade. Em 2010, foi relatado que 70% das substâncias ativas em formulações farmacêuticas eram compostos quirais (BEZBORODOV; ZAGUSTINA, 2016). Logo, a M. nigra representa um possível biocatalizador quiral para obteção de álcoois quirais, pois como pode ser observado na Tabela 1, o diastereoisômero preponderante foi o (1R,2S,4S)-(+)-diidrocarveol (3b).

Em alguns protocolos testados (Tabela 1), foi obtido um excesso diastereoisomérico (e.d.) de 100% no experimento 6, 7, 9, 11 e 16. Desta forma, não é possível inferir qual foi a viariável que influenciou no e.d. Entretanto, é possível afirmar que a enzima foi Prelog estereoespecíficas, ou seja, o íon hidreto do NAD(P)H foi transferido para a face Re da cetona proquiral, produzindo o (S)-álcool (ITOH, 2014).

4 CONCLUSÃO

Ficou demonstrado que a folha em pedaços da Morus nigra apresenta atividade biocatalítica satisfatória, além de apresentar muitas vantagens em relação aos métodos químicos e bioquímicos clássicos: baixo custo, boa enantio- e diastereosseletividade, condições reacionais brandas e resíduos menos poluentes. Portanto, é possivel afirmar que a biocatálise representa uma ferramenta promissora para produção de álcoois opticamente ativos e pode despertar o interesse pela indústria química e farmacêutica.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Cesumar – Unicesumar pelo suporte financeiro e estrutural para o desenvolvimento desta pesquisa.

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