1 Doutorando, UFLA/Departamento de Biologia, marcelpalmieri@yahoo.com.br 2
Graduanda, UFLA/ Departamento de Biologia, barrosobioufla@gmail.com 3 Professora Doutora, UFLA/ Departamento de Biologia, larissa.vieira@dbi.br 4 Professora Doutora, UFLA/ Departamento de Química, marcussi@dqi.ufla.br
ANÁLISE CITOGENOTÓXICA DO EFEITO DE PEÇONHA DE TITYUS SERRULATUS (ESCORPIÃO AMARELO) EM CÉLULAS MERISTEMÁTICAS DE LACTUCA SATIVA
(ALFACE)
MARCEL J PALMIERI1, AMANDA BARROSO2, LARISSA FONSECA ANDRADE-VIEIRA3, ,
SILVANA MARCUSSI4, LISETE CHAMMA DAVIDE5
RESUMO: Sementes de Lactuca sativa (alface) foram expostas a solução de peçonha de Tityus
serrulatus (escorpião amarelo) a fim de estudar os efeitos dessa sobre o material genético. Os resultados mostram que a peçonha provoca redução no Índice Mitótico e causa alterações expressivas no ciclo celular.
Palavras-chave: Lactuca sativa, Tityus serrulatus, peçonha, toxidade INTRODUÇÃO
As proteínas de peçonhas animais podem atuar sobre o sistema de coagulação, plaquetas, sistema imunológico e apoptose celular, sendo alvos de diversos estudos. Contudo, a ação de peçonhas sobre o DNA foram pouco exploradas até o presente momento (Marcussi et al. 2011), não havendo resultados relacionando as quebras no DNA e ao desenvolvimento de mutagênese ou ao processo de apoptose.
O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da peçonha de Tityus serrulatus (escorpião amarelo) sobre o genoma e o processo de morte celular em células de Lactuca sativa (alface), vegetal comumente utilizado como modelo para prospecção de efeitos biológicos tóxicos sobre o material genético (Ribeiro et al. 2013). Foram avaliados dois parâmetros, o índice mitótico (IM) e alterações no ciclo celular (ACC) utilizando-se da citogenética clássica.
REFERENCIAL TEÓRICO
Bioensaios de Toxidade em Vegetais
O uso de modelos vegetais em bioensaios de toxidade é vantajoso e justificável, eles são de baixo custo, apresentam boa correlação com outros modelos e sistemas de teste, como os animais e são muito confiáveis, constituindo candidatos para programas de monitoramento de cito e genotoxidade. (Fiskejö 1985; Grant e Owens 2006; Feretti et al. 2007; Dong e Zang 2010). Além disso, o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP), Organização Mundial de Saúde (OMS) e a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US- EPA) (Grant 1982; Grant 1999) considerados bioensaios vegetais como sistemas de teste adequado para avaliação de toxidade.
Pçonha de Tityus serrulatus
No Brasil, ferroadas de escorpião são responsáveis pela maioria dos acidentes relacionados a animais peçonhentos, sendo a maior parte desses ocasionados pela espécie Tityus serrulatus (Cologna et al . 2009).
A peçonha do escorpião amarelo é composta principalmente por neurotoxinas, enzimas (hialuronidase) e proteases. Há também alguns componentes antimicrobianos e outros peptídeos cujas funções biológicas ainda não foram totalmente esclarecidas (Pucca et all, 2014).
MATERIAL E MÉTODOS Obtenção do Material
Sementes comerciais de Lactuca sativa variedade Crespa Grand Rapidis foram pré-germinadas em placa de petri coberta por papel umedecido em água destilada durante 24 horas. Após esse período, aquelas sementes que emitiram raízes foram transferidas para outra placa de petri coberta por papel filtro umedecido em 500µL de solução de concentração 0,5 mg/mL da peçonha de Tityus serrulatus. Após 24h de exposição as raízes foram coletadas e fixadas por um período mínimo de 24 horas em solução de etanol/ácido acético (3:1). Como controle negativo foi utilizado à água destilada.
Preparo das Lâminas
As raízes foram lavadas em água destilada e em seguida deixadas em HCL 5N por 12 minutos para que ocorresse a hidrólise da parede celular. Posteriormente estas raízes foram montadas em uma lâmina através da técnica de esmagamento, o material foi corado com orceína acética. Dez lâminas foram montadas por tratamento e 500 células foram contadas por lâmina (totalizando cinco mil células avaliadas por tratamento).
Parâmetros Avaliados
Os parâmetros avaliados foram o Índice Mitótico (IM), dado pela razão entre o total de células em divisão pelo total de células avaliadas, e as alterações no ciclo celular (ACC). As frequência de cada alteração dentro do total de ACC foram também medidas.
Teste Estatístico
Os dados foram avaliados usando o software R e o teste estatístico de Tukey com significância de 5% foi empregado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As diferenças entre dois parâmetros e o controle foram significativas, havendo uma diminuição de aproximadamente 33% no IM e um aumento de cerca de 15 vezes nas ACC no tratamento de Tityus em relação ao controle (Tabela 1). Estes dados mostram que a peçonha do escorpião amarelo possui efeito tóxico sobre o DNA, afetando a estrutura cromossômica e causando prejuízo ao ciclo celular.
Dentre as ACCs encontradas estão, pontes, micronúcleso, cromossomos pegajosos, c-metáfases, pontes, fragmentos cromossômicos, cromossomos não orientados, anáfases multipolares e núcleos condensados. A Figura 1 traz exemplos de algumas das ACC observadas nas lâminas avaliadas para esse trabalho.
A alteração mais abundante foi o micronúcleo, representando 33% do total de alterações (Tabela 2). Esta alteração é um excelente indicador de toxidade (Hoshina e Marin–Morales, 2009). Os micronúcleos podem ser definidos como estruturas no citoplasma contendo cromatina envolvida por uma membrana sem que haja nenhuma ligação aparente ou visível com o núcleo principal da célula (Ma et al, 1995). Eles são formados pela exclusão de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos durante a divisão celular e, portanto, sua presença indica que o agente possui atividade aneugênica ou clastogênica.
Micronúcleos podem ser relacionados com a presença de fragmentos cromossômicos (5,3%) indicando um efeito clastogênico, ou com cromossomos não orientados (5,3%) indicando um efeito aneugênico da peçonha (Fenech e Crott, 2002). Sabe-se que esta possui proteases em sua composição, oque permite inferir que a peçonha age sobre o arcabouço proteico do cromossomo desestabilizando-o
afetando o alinhamento adequado durante a divisão. Essas proteases também são, provavelmente, capazes de danificar a molécula de DNA diretamente originando os fragmentos cromossômicos.
Outra alteração com alta ocorrência (20%) foram os cromossomos pegajosos. O surgimento de cromossomos pegajosos se dá após alterações na estrutura cromossômica básica, oque promove a perda das características normais de condensação dos cromossomos formando aglomerados (Silva e Fonseca, 2003). Esta alteração também é causada, provavelmente, pela ação dass enximas proteolíticas da peçonha.
Núcleos Condensados também foram encontrados em abundância (18,67%). Esta alteração é considerada um marcador citológico da morte celular programada (MCP) e está relacionada à indução pelo agente tóxico de fragmentação no material genético, resultando em um fenômeno conhecido como DNA laddering (Danon et al., 2000).
A MCP faz parte do ciclo de vida normal de um vegetal e é amplamente empregada em diversos processos fisiológicos. Uma das funções deste mecanismo e atuar como uma defesa, impedindo que alterações genéticas sofridas por células do vegetal se propaguem. Porém esta defesa só é acionada caso os mecanismos de reparo do DNA não sejam capazes de remediar o dano sofrido, portando, a ocorrência de MCP, evidenciada citologicamente pela presença de núcleos condensados, é considerada como um ótimo marcador de toxidade (Doorn e Woultering, 2010). O alto índice de núcleos condensados encontrado, portanto, indica que a toxidade da peçonha do escorpião amarelo é de grande magnitude. Finalmente a redução do IM observada tem relação com a frequência de núcleos condensados, pois as células que sofram MCP não entramem divisão.
Por fim, os resultados trouxeram informações relevantes para o melhor entendimento dos mecanismos de ação da peçonha. Além disso, o modelo vegetal foi bastante responsivo aos efeitos tóxicos desta peçonha sobre o material genético, sendo, portanto um sitema de teste viável para avaliações de toxidade de peçonhas animais.
Tabela 1 – Resultados observados seguidos de desvio padrão nos dois parâmetros avaliados para o
tratamento controle e o tratamento de Tityus. IM é expresso em porcentagem e ACC em frequência por cem células.
Tratamentos IM ACC
Controle 9.29 ± 2.40 0.099 ± 0.103
Tityus 6.23 ± 2.19* 1.49 ± 0.58*
Dados seguidos por um * diferem significativamente do controle de acordo com teste de Tukey (α=5%).
Tabela 2 – Frequências dentro do total de alterações observadas para cada tipo de alteração
encontrada no ciclo celular de raízes de Lactuca sativa expostas a peçonha de Tityus serrulatus. Dados estão em porcentagem Alterações Frequência MCN 32.00 Núcleo Condensado 18.67 Cromossomo Pegajoso 20.00 C – metáfase 12.00 Anáfase Multipolar 1.33 Fragmento 5.33
Cromossomo Não Orientado 5.33
Ponte 5.33
Figura 1- Algumas alterações cromossômicas observadas em células de Lactuca sativa expostas a
peçonha de Tityus serrulatus. A – Micronúcleo, B – Ponte Cromossômica, C – C- metáfase, D – Cromossomos Pegajosos + Cromossomos não Orientados.
As barras representam 5 µm
CONCLUSÃO
A peçonha de Tityus apresentou alta toxidade, exercendo danos na mólecula de DNA que foram evidenciados pela redução do índice mitótico e aumentando em grande escala da ocorrência de alterações no ciclo celular em relação ao tratamento controle. Além disso, modelo vegetal utilizado se mostrou adequado para avaliação de toxidade de peçonha animal e poderia apresentar uma alternativa mais rápida e barata para estudos nesta área.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxílio financeiro à pesquisa.
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