1.1. Processo Sol-Gel

1. Introdução

A utilização de sistemas vítreos a base de silicatos tem sido proposto para aplicações médicas como, por exemplo, liberação de fármacos, já que tais sistemas permitem utilizar estes géis como “plugs” de baixa difusibilidade. Entre os vários aspectos a serem explorados nestes sistemas, os conhecimentos de como processos de transferência de H+, de como espécies ácido-base de tampões reacionam e ainda da interferência de solventes e co -solventes, é fundamental.

O estudo de processos prototrópicos de fotoácidos como o 8-hidroxi-1,3,6-pirenotrissulfonato de sódio (piranina) possibilita acompanhar mudanças relativas ao teor de água que ocorrem em sistemas vítreos obtidos pelo processo sol-gel [Kaufman et al., 1988; Wasiucionek et al., 1997; Brennan et al., 1999]. Esta possibilidade advém do fato da fotodissociação da piranina depender de água livre para ocorrer e, que estes sistemas sofrem uma grande transformação no teor de água durante o envelhecimento do gel [Brinker & Scherer et al., 1990].

As investigações de Brennan et al., 1999 evidenciaram que a transferência de próton da piranina em sistemas vítreos derivados do tetraetilortosilano (TEOS) contendo tampão fosfato varia conforme previsto com o envelhecimento. Em termos simples o processo de envelhecimento espontâneo, isto é, para amostras expostas ao meio ambiente e ao abrigo da luz, resulta na lixiviação de água e do etanol do seio do gel. Foi observado que ao final de cerca de quinze dias de envelhecimento, a extensão de dissociação de praticamente 100%, atribuída à presença de água residual presente no interior do monólito. Após este período a diminuição desta porcentagem sugere a densificação do sistema com perda de água de forma mais branda. Entretanto, o possível efeito do tampão no processo de transferência de H+ competindo com a água como aceptor não foi aventado. Tendo em vista a importância deste processo e a eventual possibilidade de transferências de H+ em géis “secos”, neste estudo dedicamo-nos a investigar o efeito de tampão nestes sistemas.

1.1. Processo Sol-Gel

Define-se processo sol-gel pela transição de sistema sol (solução) para um sistema gel (gelatina). Estes géis após completa secagem forma os denominados xerogéis. Neste processo parte-se de uma solução do alcoóxido precursor, TEOS, por exemplo, em um solvente ou em uma mistura de solventes adequados e promove-se a hidrólise. Dá-se inicio à condensação formando uma dispersão de partículas coloidais (partículas com dimensões entre 1 e 1000nm). Tipicamente neste período observa-se o branqueamento da suspensão, em seqüência ocorre a reticulação levando ao gel. Os géis coloidais resultam da agregação de partículas coloidais enquanto que os géis poliméricos são geralmente preparados a partir de soluções onde se promovem reações de polimerização e poli - condensação. O esquema 1 ilustra os eventos acima em função das condições do meio (pH, sal) na morfologia do gel. Deve-se notar o efeito do pH na formação seja de monólitos ou de partículas. Abaixo de pH 7, o precursor TEOS é transformado no respectivo ácido silícico, Si(OH)4,que condensa

para um monólito, a pH`s maiores ocorre a deprotonação do ácido silícico induzindo à repulsão de cargas e conseqüentemente a formação de partículas.

Esquema 1. Comportamento de polimerização da sílica aquosa. Em solução básica (B), as partículas crescem em tamanho com diminuição em número; em solução ácida ou na presença de sal (A) as partículas se agregam em cadeia tri – dimensional e formam géis. [Brinker & Scherer et al. 1990].

Existem três abordagens que são tradicionalmente empregadas na construção de géis monolíticos.

1. Gelificação de uma solução de um pó coloidal;

2. Hidrólise e poli - condensação de precursores alcoóxidos ou nitratos seguidos pela secagem hipercrítica do gel;

3. Hidrólise e poli – condensação de precursores alcoóxidos seguido pelo envelhecimento e secagem à temperatura ambiente.

A abordagem que empregamos para obtenção de sistemas vítreos foi à terceira, na qual hidrólise de alcoóxidos precursores empregando em meio ácido. Considerando materiais vítreos derivados do silício, três reações principais descrevem o processo sol-gel: 1. Hidrólise:

≡≡≡≡ Si −−−− OR + H

2

O ↔

↔

↔

↔ ≡

≡

≡

≡ Si −

−

−

− OH + ROH (1)

2. Condensação alcoólica:

≡

≡

≡

≡ Si −

−

− OR + HO −

−

−

− Si ≡

−

≡

≡

≡ ↔

↔ ≡

↔

↔

≡

≡ Si −

≡

−

−

− O −

−

− Si ≡

−

≡

≡

≡ + ROH (2)

3. Condensação aquosa:

≡

≡

≡

≡ Si −

− OH + HO −

−

−

−

− Si ≡

−

≡

≡ ↔

≡

↔

↔ ≡

↔

≡ Si −

≡

≡

−

−

− O −

−

− Si ≡

−

≡

≡

≡ + H

2

O (3)

onde R é um grupo alquil. Na reação de hidrólise ocorre a formação de grupos reativos do tipo silanol (Si − OH). Nas reações de condensação ocorre a formação dos grupos siloxanos (Si − O − Si), álcool (Equação 1) e água (Equação 2). Nesta etapa, o álcool e a água

produtos da reação permanecem nos poros da cadeia reticular [Hench & West et al., 1990]. Na condição utilizada neste trabalho, a concentração de água (razão molar H2O : Si >> 4)

em excesso implica na hidrólise quase que completa (reação 1) seguida da condensação. Durante as reações de hidrólise e condensação ocorre à formação numerosos partículas assim que o alcoóxisilano entra em contacto com a água. Devido à imiscibilidade entre alcoóxisilanos e água, normalmente um solvente mútuo é adicionado como agente de homogeneização. Entretanto, géis derivados do TEOS podem ser preparados sem a necessidade de um co-solvente, neste caso emprega-se ultra-som que promove a hidrólise do TEOS (passo denominado pré-hidrólise) e gera o ácido silícico que é solúvel em água na concentração de trabalho [Brinker et al., 1990; Brennan, et al., 1999]. Quando ligações siloxanos suficientemente interconectadas são formadas na região, estas respondem cooperativamente como partículas coloidais ou sol. Após este processo inicial a solução inicial é transferida para um recipiente adequado para envelhecimento (“casting”). Neste estudo empregou-se cubetas de poli – estireno, material inerte ao ácido silícico. Detalhes mecanísticos e outros podem ser encontrados em várias literaturas especializadas [Brinker et al. ; 1988; Scherer et al. ; 1988; Brinker & Scherer et al. ; 1990; Hench et al. ; 1990

]

.

1.2. Fluorescência

Espectroscopia de fluorescência é uma poderosa ferramenta analítica para estudar os efeitos de vários parâmetros físico-químicos (pH, polaridade, viscosidade, concentração, efeito dos solventes, processos moleculares no estado excitado, etc.) sobre as moléculas em solução e, ultimamente, em materiais vítreos derivados do processo sol-gel [Kaufman & Avnir, Pines & Huppert et al.,1988; Dunn & Zink et al., 1997; Wasiucionek & Breiter et al., 1997; Wittouck & Schryver , Snijkers-Hendrickx et al., 1997). A utilização desta técnica é função de sua inerente sensibilidade analítica [Lakowicz, 1983].

Fluorescência é a propriedade que alguns átomos ou moléculas (conhecidos por fluoróforos ou sondas fluorescentes) têm em absorverem luz em um determinado comprimento e posteriormente emitir luz em um comprimento de onda maior após um breve intervalo de tempo. Os vários níveis de energia envolvidos na absorção e emissão de luz são apresentados no diagrama de Jablonski (Figura 1).

Neste diagrama aparecem em linhas horizontais o estado fundamental (S0) e os

estados excitados singlete (spins emparelhados) (S1 e S2) e triplete (spins desemparelhados)

(T1, T2 e T3) com seus correspondentes níveis vibracionais. As linhas retas referem-se aos

processos radiativos e as sinuosas aos processos não radiativos. Os números nas linhas referem-se as seguintes definições:

1. Absorção de Luz. Uma molécula no estado fundamental (S0) pode absorver um fóton de

luz e tornar-se excitada com escala de tempo de 10-15s. A maioria das transições prováveis é S0 → S1 ou S0 → S2, embora transições de S0 para estados excitados singlete de maior

energia também são possíveis.

2. Relaxação Vibracional. A absorção do So para Sn envolve uma mudança do nível

vibracional zero do S0 para qualquer nível vibracional do estado excitado. Contudo, o nível

estado eletrônico fundamental, e v’ = 0 é também o nível vibracional do estado eletrônico excitado que é mais populoso no equilíbrio. Ao menos que a molécula dissocie antes do equilíbrio ser alcançado, existe um processo rápido (10-12 s) que relaxa o nível vibracional de maior energia do estado excitado para seu nível vibracional zero.

3. Conversão Interna. É um processo não radiativo que converte um estado eletrônico de maior energia para um de menor energia de mesma multiplicidade. Por exemplo, O nível vibracional zero do S2 é convertido em um nível vibracional do estado excitado S1 que tem

a mesma quantidade de energia. O nível vibracional excitado S1 pode então relaxar para seu

nível zero. A escala de tempo para a conversão interna é rápida (> 10 -10 s), especialmente quando os dois estados são próximos em energia.

4. Decaimento não Radiativo. É um processo pelo qual o estado eletrônico excitado retorna ao estado fundamental (tipicamente de S1 para S0) sem a emissão de luz. A escala

de tempo para decaimento não radiativo (< 10-6 s) é menor que para conversão interna devido à diferença de energia entre S1 e S0 que usualmente é maior do que entre S2 e S1.

5. Cruzamento Intersistema. É a conversão de um estado singlete em um estado triplete (ou vice versa), requer a mudança rápida do spin do elétron. A probabilidade do cruzamento intersistema depende, entre outras coisas, da diferença de energia entre o estado singlete e tripete, com escala de tempo entre 10-6 e 10-10 s. O estado Tn é menor em energia

do que o seu correspondente Sn devido a menor repulsão de elétron para elétrons não

emparelhados.

6. Fluorescência. É a emissão de luz de um estado excitado para o estado fundamental com a mesma multiplicidade. Usualmente a emissão é de S1→ S0, com escala de tempo entre 10 -9 _{e 10}-7 _{s. Alguns casos de fluorescência anormal S}

2→ S0 são encontrados ocorre em alguns

compostos, tais como o azuleno e compostos tiocarbonil.

7. Fosforescência. É a emissão de luz de um estado excitado para o estado fundamental com mudança de multiplicidade (usualmente de um estado excitado triplete para o estado fundamental), ocorrendo à tempos longos (10-3 a 102s). Este processo envolve mudança de

estado eletrônico e de spin, assim como absorção S0→ Tn, fosforescência é um processo

spin proibido.

8. Absorção Triplete – Triplete. Uma molécula no estado excitado triplete pode absorver um fóton para originar um estado triplete de maior energia, assim espectro UV/VIS pode ser obtido e o decaimento do estado excitado em função do tempo pode ser monitorado.

9. Absorção Singlete – Singlete. Estados tripletes podem persistir mais do que estados excitados singletes, portanto só era possível absorção triplete – triplete. Entretanto, com o advento da espectroscopia de pico e femto segundos, tornou-se possível medir transições de um estado excitado singlete para um outro singlete de maior energia.

10. Absorção Singlete – Triplete. Como fosforescência, este é um processo proibido, portanto a transição S0→Tn não é observada na espectroscopia UV/VIS [Carroll, 1998].

Três parâmetros fundamentais utilizados na descrição e comparação das sondas fluorescentes são: coeficiente de extinção molar (ε), rendimento quântico (φf) e tempo de

vida de fluorescência (τf).

O coeficiente de extinção molar (ε) converte unidades de absorbância em unidades de concentração molar para uma variedade de substâncias químicas, sendo determinado pela medida de absorbância a um particular comprimento de onda (usualmente, o ε utilizado é aquele relativo ao máximo valor de absorção no espectro UV/VIS) de um fluoróforo. Coeficiente de extinção é a medida direta da habilidade do fluoróforo em absorver luz, e aqueles fluoróforos que têm um alto coeficiente de extinção apresentam alta probabilidade de emissão de fluorescência.

Rendimento quântico (φf) é um padrão para medir a eficiência da emissão de

fluorescência relativa a todos os caminhos possíveis para relaxação, ou seja, representa a probabilidade de um fluoróforo excitado produzir um fóton emitido e é geralmente expresso por (4):

φ

φ

φ

φf = número de fótons emitido / número de fótons absorvido. (4)

Tempo de vida de fluorescência é o tempo característico que uma molécula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental e é o tempo disponível para a informação ser obtida do perfil de emissão. Durante o tempo de vida do estado excitado, o fluoróforo pode sofrer mudanças conformacionais ou interagir com outras moléculas e difundir através do ambiente local. A intensidade do decaimento de fluorescência como uma função do tempo em uma população uniforme de moléculas excitadas com um breve pulso de luz é descrito por uma função exponencial (5):

I

t

= I

0

– e (-t / ττττ

f

) (5)

τf é o tempo de vida de fluorescência.

Formalmente, o tempo de vida de fluorescência é definido como o tempo no qual a intensidade de fluorescência do fluoróforo decai para 1/e (~ 37%) da intensidade inicial, conforme Figura 2(a). Esta quantidade é o recíproco da constante de velocidade para o decaimento de fluorescência do estado excitado para o estado fundamental. Desde que, o nível de fluorescência é diretamente proporcional ao número de moléculas no estado excitado, medidas de tempo de vida podem se feitas através do decaimento de fluorescência após um breve pulso de excitação. Em um solvente uniforme, o decaimento de fluorescência é usualmente uma função mono-exponencial, conforme Figuras 2(a) e 2(b). Além disso, processos como conversão interna, cruzamento intersistema e supressão podem competir com emissão de fluorescência na relaxação dos elétrons do estado excitado para o estado fundamental. Exceto fluorescência e fosforescência, os processos não radiativos são mecanismos primários responsáveis pela relaxação dos elétrons do estado excitado. Todos os processos não fluorescentes que competem para a desativação dos elétrons no estado excitado podem ser combinados em uma única constante de velocidade, conhecida por constante de velocidade não radiativa (knr). Esta constante ignora qualquer contribuição da

relaxação vibracional devido à rápida velocidade (10-12 s) destas conversões que são várias ordens de magnitude mais rápida do que as transições de desativação (10-9 s). Portanto, rendimento quântico pode ser descrito em termos de constante de velocidade, segundo a expressão (6):

φφφφ

f

= k

f

/ (k

f

+ k

nr

) = ττττ

f

/ ττττ

0

(6)

onde: kf é a constante de velocidade para o decaimento por fluorescência,

τf é o tempo de vida de fluorescência medido,

τ0 é o tempo de vida intrínseco, ou seja, o tempo de vida do estado excitado na

ausência de todos os processos que competem com a fluorescência.

Na prática, o tempo de vida de fluorescência é diminuído pela presença de processos não radiativos, resultando em um tempo de vida medido que é a combinação do

tempo de vida de fluorescência e dos mecanismos de relaxação não fluorescentes. Já que o tempo de vida medido é sempre menor que o tempo de vida intrínseco, o rendimento quântico nunca excede ao valor unitário [www.olympusfluoview.com].

Figura 2: Perfil do decaimento do tempo de vida de fluorescência [www.olympusfluoview.com]

1.3. Equilíbrio Ácido- Base no Estado Excitado

Em 1931, Weber observou que o comprimento de onda de fluorescência do 1-naftilamina-4-sulfonato apresenta alterações em função do pH da solução sem que houvesse alterações no espectro de absorção. Em 1949, a observação de Weber foi interpretada corretamente por Förster que considerou a possibilidade de que a constante de equilíbrio ácido-base no estado excitado fosse diferente da constante de equilíbrio no estado fundamental, [Förster et al., 1949; 1950].

In te n s id a d e Tempo (a) 1/e In te n s id a d e Tempo (a) 1/e L o g d a I n te n s id a d e Tempo (b) Inclinação -1/τ L o g d a I n te n s id a d e Tempo (b) Inclinação -1/τ

A relação entre deslocamento de comprimento de onda acompanhada de protonação e mudança na constante de equilíbrio sob excitação é formalizada no diagrama de energia do Ciclo de Förster, ilustrada na Figura 3.

Figura 3: Ciclo de Förster [Carroll, 1998].

onde: ∆H e ∆H* são entalpias de dissociação do ácido AH em sua base conjugada A- no estado fundamental e no estado excitado singlete mais baixo, respectivamente;

hν’ e hν” são as energias de transição eletrônica entre o estado fundamental e estado singlete mais baixo para AH e A- , respectivamente;

Conforme o ciclo de Förster, é evidente que:

∆

∆

∆H* + hν

∆

ν

ν

ν’ = ∆

∆

∆

∆H + hν

ν

ν

ν” (7 )

∆

∆

∆H* = ∆

∆

∆

∆H + (hν

∆

ν

ν” - hν

ν

ν

ν

ν’) (8 )

Assumindo que a variação de entropia é a mesma no estado fundamental e excitado e que ∆

∆ ∆

∆G = ∆∆∆∆H - T∆∆∆∆S, a equação (8) torna-se:

∆

∆

∆H* - ∆

∆

∆

∆

∆H ≈

≈ ∆

≈

≈

∆

∆

∆G* - ∆

∆

∆

∆G (9)

e utilizando a relação entre ∆G e equilíbrio

∆

∆

∆

∆G = 2,303 RT pK (10)

tem-se a relação (11), na qual pode-se determinar o valor pK* a partir do pK do estado fundamental.

pK* - pK = (hνννν” - hνννν’) / (2,303 RT) (11)

onde: R é a constante universal dos gases; T é a temperatura em Kelvin.

Conforme o surgimento da emissão de fluorescência da base ou do ácido conjugado (ou seja, um ácido ou base mais forte no estado excitado) essas substâncias passaram a ser conhecida como fotoácidos e fotobases, respectivamente [Ireland & Wyatt et al., 1976; Parker, 1968; Eigen et al., 1964; Weller et al., 1961; Gutman et al., 1981; Schulman, 1977].

Uma molécula no estado excitado pode ser considerada como um isômero metaestável da mesma molécula no estado fundamental, uma vez que as propriedades físicas e químicas são determinadas pelo arranjo do orbital eletrônico. Essa nova molécula

pode exibir reações não mostradas no estado fundamental (reações fotoquímicas) e ainda pode tomar parte em reações análogas àquelas do estado fundamental. Entre estas reações estão as reações denominadas de prototrópicas (Prototropismo significa dissociação e associação de prótons) [Parker, 1968].

Dependendo das escalas de tempo envolvidas entre o processo prototrópico no estado excitado (P) e o decaimento de fluorescência (D), e considerando-se fotoácidos, existem três casos possíveis para o equilíbrio de protonação no estado excitado singlete.

1. Deprotonação é muito mais lento que o decaimento de fluorescência; 2. Deprotonação é muito mais rápido que o decaimento de fluorescência; 3. Deprotonação é competitivo com o decaimento de fluorescência.

No caso 1, prevalece a fluorescência, e não ocorre o processo de transferência de próton, ou seja, a espécie ácida quando excitada irá fluorescer antes de ser convertida na base conjugada. A fluorescência observada será devido à forma que estiver no estado excitado (ácida ou básica). Substâncias que se comportam desta maneira são ótimas sondas para determinar o pH, uma vez que a técnica fluorimétrica apresenta maior sensibilidade em relação à técnica espectrofotométrica. Os casos 2 e 3 podem ser explicados considerando um equilíbrio entre o ácido excitado AH* e sua base conjugada A-* (pKa* <<

pKa) e ambas as espécies fluorescem. Em solução alcalina, a população do estado

fundamental consiste de A- e sob excitação luminosa observa-se o processo (12) e em meio fortemente ácido, AH será a espécie predominante e a emissão de fluorescência corresponderá ao processo (13):

A

-

*

kf”

A

-

+ hνννν” (12)

AH*

kf’

AH + hνννν’ (13)

onde: h é a constante de Planck;

ν” é a freqüência de emissão de

A

-; ν’ é a freqüência de emissão de AH.

Em um valor de pH intermediário (pKa* +1 < pH < pKa – 1) a espécie presente no

estado fundamental é AH mas, sob excitação luminosa, a espécie AH* dissociar-se-á parcialmente aparecendo a emissão devido a espécie

A

-*.

Se o prototropismo no estado excitado é muito mais rápido que o decaimento por fluorescência (caso 2), ocorre o processo de transferência de próton no estado excitado sendo que a quantidade das espécies ácida e básica no estado excitado dependerá da magnitude das constantes envolvidas.

Se o prototropismo é competitivo com o decaimento por fluorescência (caso 3) atinge-se um estado de quasi-equilíbrio, onde ocorre o processo de transferência de próton, mas o equilíbrio não é totalmente estabelecido, devido à competitividade entre os dois processos.

Neste trabalho utilizou-se fotoácidos, como piranina e 2-naftol, para monitorar a transferência de próton no interior dos monólitos derivados do TEOS. Estes fotoácidos apresentam deprotonação no estado excitado mais rápido que o decaimento por fluorescência.

1.4. Fotólise de Relâmpago induzido a Laser (Salto de pH)

De acordo com o conceito de fotoácidos e fotobases estabelecido por Förster, sabe-se que álcoois aromáticos e aminas protonadas tornam-sabe-se ácido mais forte em sabe-seu estado excitado singlete do que em seu estado fundamental enquanto que ácidos carboxílicos aromáticos e ésteres usualmente tornam-se base mais forte. Em ambos os casos, uma rápida mudança na concentração de próton provocada pelo salto de pH pode ser detectada pela observação dos deslocamentos no espectro das espécies no estado fundamental.

A rápida mudança de pH causada pelo salto de pH têm sido estudada a partir de álcoois aromáticos em solução [Gutman et al., 1981; Huppert et al., 1981; Gutman et al., 1983; Pines et al., 1983; Politi et al., 1984] e em sol-gel [Mckiernan et al., 1994].

O salto de pH é alcançado pela irradiação da piranina em solução aquosa com um intenso pulso de laser (λ=355nm, com largura de pulso da ordem de ~ 80ns)) resultando no seu estado excitado singlete S1. A piranina caracteriza-se pelo menor valor de pka* (~ 0,5)

em relação ao pka (~7,0). Deste modo, o pulso de laser converte a piranina de um ácido

fraco para um ácido forte e dentro de 100 ps [Smith & Kaufmann; Huppert; Gutman et al., 1979], esta se dissocia liberando prótons para a água. Esta mudança de concentração é transitória; então a piranina relaxa para seu estado fundamental dentro (τf ~6 ns). O sistema

irá relaxar ao nível pré-pulso pela reprotonação da forma alcalina da piranina no estado fundamental, processo este modulado pelo pH da solução [McKiernan; Simoni; Dunn; Zink; et al.; 1994]. O esquema 2 apresenta o equilíbrio prototrópico da piranina.

Esquema 2: Representação do Equilíbrio Prototrópico da Piranina. O índice “*” refere-se às espécies no estado excitado. POH e PO- são as espécies protonada e deprotonada da piranina; kass. e k diss. são as constantes de velocidade para as reações de associação e

dissociação, kf e kf’são as constantes de velocidade para o decaimento por fluorescência da

sonda protonada e deprotonada, knr e knr’ são as constantes de velocidade para o decaimento

não radioativo da sonda protonada e deprotonada, respectivamente [Fernandez et al.; 1996].

POH* + H

₂

O

PO

-

*

+ H

₃

O

+ k_ass.*

POH + H

₂

O

PO

-

_{+ H}

3

O

+ k_diss. λ_máx.= 403 nm λ_máx.= 455 nm λ_máx.= 445 nm λ_máx.= 510 nm

excitado

fundamental

k_diss.

*

pK

a*_{= 0.5} k_ass.

pK

a = 7.2 knr

´

knr kf

´

kf

POH* + H

₂

O

PO

-

*

+ H

₃

O

+ k_ass.*

POH + H

₂

O

PO

-

_{+ H}

3

O

+ k_diss. λ_máx.= 403 nm λ_máx.= 455 nm λ_máx.= 445 nm λ_máx.= 510 nm

excitado

fundamental

POH* + H

₂

O

PO

-

*

+ H

₃

O

+ k_ass.*

POH + H

₂

O

PO

-

_{+ H}

3

O

+ k_diss. λ_máx.= 403 nm λ_máx.= 455 nm λ_máx.= 445 nm λ_máx.= 510 nm

excitado

fundamental

k_diss.

*

pK

a*_{= 0.5} k_ass.

pK

a = 7.2 knr

´

knr kf

´

kf

1.5. Reações de Transferência de Prótons

Reações de transferência de prótons estão entre os mais comuns e importantes processos químicos que ocorrem em soluções aquosas na biosfera [Bell et al., 1973]. Tratam-se também de reações extremamente rápidas, da ordem de 1010 _{a 2 x 10}11 _M-1_s-1

[Gutman, et al., 1986]. Muito do que se conhece a respeito de equilíbrio químico, cinética química, efeitos isotópicos, transporte de massa em solução, relações de energia livre e reatividade química é derivado do estudo de reações de transferência de prótons [Huppert et al., 1981].

Na química clássica de soluções aquosas, a dissociação de prótons é tratada como uma simples reação de primeira ordem. Na verdade trata-se de uma reação bastante complexa envolvendo mais de uma etapa [Huppert et al., 1982].

O esquema da transferência de próton proposto pelo autor [Huppert et al., 1981] está expresso em (14):

k1 k2 k3

AH + B AH...B A...BH A- + BH+ (14) k-1 k-2 k-3

onde: k1 e k-1 representam os processos de encontro e separação dos reagentes;

k2 e k-2 descrevem a transformação química e;

k3 e k-3 representam os processos de encontro e separação dos produtos.

Essa reação pode ser dividida em três partes: a difusão dos reagentes para o raio da atmosfera iônica; difusão acelerada até a distância de encontro e subseqüente conversão do complexo de encontro até os produtos. Em reações onde o equilíbrio é estabelecido

rapidamente com o complexo de encontro, as equações de velocidade são dominadas por processos de difusão. Isso resulta na perda da informação sobre a dinâmica do complexo de encontro. O solvente exerce papel fundamental nessa reação.

Pelo uso de fotoácidos, o processo de dissociação total após o pulso de laser, pode ser dividido em dois passos consecutivos de reação e difusão. No estágio reativo, ocorre uma rápida separação de carga e forma-se um par iônico pelo estiramento da ligação do doador de próton que é estabilizado pelo solvente. O tempo de vida desse estado transiente é muito curto, comparável com o tempo da vibração. Para uma ligação OH esse tempo é de 30fs. Compostos com baixo valor de pKa irão atingir o estado [RO-...H+] numa freqüência

alta , enquanto que aqueles com alto valor de pKa irão atravessar muitas vibrações até que a

energia de estiramento supere o limiar para formar o par iônico [Gutman et al., 1984; Pines & Huppert et al., 1986; Pines et al., 1988]. O estado [RO-...H+] é muito instável, estando sujeito a uma enorme atração eletrostática. Sendo assim, não ocorre dissociação sem que haja assistência do solvente. O próton carregado positivamente interage com o dipolo das moléculas de água circunvizinhas e a camada de hidratação é formada num domínio de tempo de 20 a 50fs [Rao & Berne et al., 1981; Warshel, et al., 1982]. O próton estabilizado pode assim difundir (segundo estágio) da sua base conjugada devido a movimentos randômicos térmicos, mas essa difusão ainda dentro do raio formado pela gaiola coulômbica (ver adiante), está sujeito a forças eletrostáticas.

O processo reverso é a recombinação geminada (neutralização) dos dois íons separados, tanto por colapso direto do par iônico, ou pelo reencontro geminado dos íons “livres” solvatados, conforme (15).

Uma descrição simples e direta deste processo foi apresentada por Eigen [Eigen et al., 1964; Eigen et al., 1964]:

kD k2

RO- + H+ [RO-...H+] ROH (15) k-D k1

onde: R é o radical orgânico;

[RO-...H+] é o par iônico formado entre o ânion molecular RO- e o próton H+; kD e k-D são as constantes de velocidade direta e reversa, que podem ser obtidas da

solução da equação de Debye-Smoluchowski (equação 16) de estado estacionário e,

k2 e k1 são as constantes de velocidade de recombinação e dissociação molecular do

par iônico.

k = [(4ππππNR0ΣD) / 1000].[δδδδ / (eδδδδ - 1)].[eδδδδ (R0κκ / (1 + Rκκ 0κκκκ))] (16)

A equação de Debye - Smoluchowski (16) fornece a constante de velocidade controlada por difusão. O primeiro termo da equação define a velocidade de colisão entre os reagentes na ausência de interações eletrostáticas. Os parâmetros que aparecem no primeiro termo são N (número de Avogadro), R0 (distância de colisão) e ΣD (somatória dos

coeficientes de difusão dos reagentes). Como o coeficiente de difusão do próton é muito maior do que qualquer outra espécie, pode-se aproximar ΣD ~ DH+ onde, DH+ = 9,3 x 10-5

cm2s-1. Sendo assim, para um próton difundindo livremente e com R0 ~ 6Å, a velocidade

resultante do encontro entre H+ e uma espécie não carregada é aproximadamente 4 x 1010 M-1s-1.

Os outros termos na equação (16) levam em conta a interação eletrostática entre o H+ _{e o aceptor. A intensidade de interação é expressa pelo termo δ que é a razão entre o raio}

da gaiola coulômbica (ou o raio de Debye, RD) e R0. O RD é a distância na qual a interação

tanta atrativa quanto repulsiva entre os reagentes, se iguala à energia térmica (e0 é a carga

eletrônica e kB é a carga de Boltzmann), segundo a equação (17).

R

D

= |Z

1

Z

2

| e

02

/ εεεε k

B

T (17)

Por definição RD é sempre positivo. Em solução aquosa, à temperatura ambiente,

A natureza da interação eletrostática é dada pelo sinal de δ que corresponde ao produto (Z1Z2), e reflete se o próton dentro da distância RD será atraído pelo ânion ou

repelido pelo cátion. Interações atrativas terão um valor negativo de δ, enquanto que forças repulsivas têm um valor positivo de δ.

Uma vez que o próton (ou outra partícula carregada) penetra a gaiola coulômbica, sua difusão é dificultada pela interação eletrostática. Se a interação é atrativa (δ < 0) os íons irão colidir em menos de 1 ns. Interações repulsivas (δ > 0) causarão um desvio da partícula e a probabilidade de encontro irá diminuir. A relação entre δ e a velocidade da reação é dada pelo segundo termo [δ / (eδ _{- 1)] da equação 1. Um potencial fortemente repulsivo, δ >}

1 faz reduzir a expressão muito rapidamente. Por outro lado, para potencial atrativo, a expressão se aproxima da linearidade para δ < - 3. Assim, um aceptor muito positivo pode efetivamente evitar a protonação, enquanto que cargas negativas não conseguem aumentar a velocidade de protonação mesmo que por um fator de 10.

O último termo na equação 16 considera o efeito da força iônica na velocidade da reação entre partículas carregadas. Ele combina δ, o comprimento de Debye (κ = 3,3 x 10-7 x µ½ cm-1) e o raio de encontro (R0) numa expressão que suprime a intensidade de interação

eletrostática. Quanto maior a carga do aceptor, mais este será susceptível aos efeitos do íon em solução. Sob condições fisiológicas, um ânion carregado com uma única carga irá reagir com um próton numa velocidade de aproximadamente 2 a 4 x 1010 _M-1 _s-1_{. Constantes de}

velocidades menores que esse valor sugerem algumas peculiaridades no sítio de ligação do próton [Gutman & Nachliel et al., 1995].

A aplicabilidade da equação 1 para o cálculo do coeficiente de difusão de um par próton-ânion foi demostrada por Pines & Huppert (1983). Esta é uma ferramenta útil para calcular o coeficiente de difusão do próton em espaços microscópicos onde outros métodos não podem ser empregados [Gutman et al., 1989].

Resumidamente, a equação de Debye-Smoluchowski (16) descreve a busca mútua entre os reagentes até que a distância entre eles seja igual ao raio de Debye (RD). Assim que

o próton penetra na superfície da esfera limitada pelo raio de Debye, também denominada gaiola coulômbica, a velocidade dos eventos é altamente acelerada pela forte atração eletrostática. Em fração de nanosegundos, o próton se aproximará da distância de contato (R0) e a formação da ligação covalente irá se processar. Em comparação com a busca mútua

que é relativamente longa, os eventos dentro da gaiola coulômbica são ignorados.

A Gaiola Coulômbica é o espaço no qual a energia potencial eletrostática ao redor de um íon é maior que sua energia térmica. A aproximação de um próton até a gaiola coulômbica de um ânion é uma reação controlada por difusão e é medida em escala de microsegundos.Uma vez que o próton penetra na gaiola coulômbica, sua trajetória é dominada pelo potencial eletrostático e colisão com o ânion, que é da ordem da nanosegundos, uma escala de tempo que é comparável com o tempo de vida dos indicadores de pH fluorescentes. A avaliação das medidas de fluorescência deve considerar a dinâmica interna à gaiola coulômbica, ou seja, é importante dar ênfase à constante dielétrica, ao coeficiente de difusão e à geometria do espaço reacional. Outro termo que afeta as reações dentro da gaiola coulômbica é a geometria do espaço reacional. Quando se considera a interação próton-ânion em meio aquoso, o espaço reacional é esférico. Mas, quando a porção dissociante está inserida numa cavidade definida, a dispersão do próton não ocorre num meio simetricamente esférico. Ambos os fatores, campo elétrico local e espaço reacional não esférico são tratados quantitativamente pelo formalismo da recombinação geminada entre próton e ânion por Pines e seus colaboradores [Pines et al., 1988].

1.5.1. Efeito do Solvente

O solvente pode afetar a velocidade de dissociação de fotoácidos e fotobases por três efeitos independentes:

1. Velocidade de hidratação do próton.

2. Velocidade da difusão.

3. Constante dielétrica do meio.

No primeiro efeito, a água tem papel fundamental na solvatação do próton que é dissociado, e uma das características do solvente é refletida diretamente na velocidade da dissociação, que pode ser utilizada como uma ferramenta para investigar o meio onde o reagente se encontra. Embora a natureza exata da solvatação do próton em água seja controversa, reconhece-se que a solvatação do próton e sua difusão em água pura envolvem algum tipo de participação cooperativa de moléculas de água [Pines & Fleming et al., 1991]. Na representação clássica da estrutura da água [Bernal & Fowler et al., 1933] assume-se que o próton é solvatado por 4 moléculas de água formando um complexo de geometria tetraédrica. Em outras palavras, primeiro o próton se ligaria a uma única molécula de água e posteriormente os hidrogênios se ligariam as três primeiras camadas de solvatação de moléculas de água [Robinson et al., 1986; Eigen, 1964]. Utilizando a técnica de salto de pH induzido por laser e utilizando fotoácidos em várias misturas de água-álcool, os seguintes autores [Robinson et al., 1986; Huppert & Kolodney, 1981; Huppert et al, 1982] em experimentos independentes, interpretaram a diminuição das velocidades de dissociação do próton como uma manifestação da quebra da estrutura da água causada pela diluição da água pelo solvente orgânico.

Os outros dois efeitos (velocidade de difusão do próton e constante dielétrica do meio) afetam a velocidade com a qual o próton escapa da gaiola coulômbica. A difusão dos prótons é mediada por uma troca rápida na rede de ligações de hidrogênio. Qualquer ruptura da rede encurta a distância sobre a qual o próton pode migrar. Assim, solventes

orgânicos encurtam o trecho de passagem rápido e tornam o próton mais lento no seu caminho de saída da gaiola coulômbica. Por sua vez, a constante dielétrica dos solventes orgânicos expande o tamanho da gaiola coulômbica, o que também diminui a probabilidade do sucesso do escape.

A constante de velocidade da dissociação do próton é extremamente sensível ao meio. Exceto para fotoácidos muito fortes (pKa* < 0), não ocorre dissociação a menos que

moléculas de água estejam na vizinhança para atuar como receptoras de prótons. Ainda, essas moléculas de água precisam estar livres para reagir com o próton na escala de tempo comparável com o tempo de vibração (30fs). Durante esse período curto de tempo, as moléculas de água estão praticamente fixas no espaço e somente aquelas moléculas que já se encontram numa distância igual a da primeira e da segunda camada de hidratação irão participar da reação. Simulações de dinâmica molecular [Rao & Berne et al.,1981] demonstraram que o processo de hidratação total de um íon de carga positiva ocorre dentro de uma esfera de menos de 4Å. Portanto, a cinética da dissociação do próton pode ser considerada uma técnica adequada para medir a atividade da água.

1.5.2. Efeito do Tampão

As espécies oriundas do tampão afetam diretamente o tratamento cinético de reações de transferência de próton. Após um pulso de acidificação de uma solução, a protonação de um sítio será afetada pela presença das espécies do tampão por mais de uma maneira. Por um lado, as espécies do tampão competirão pelos prótons livres, diminuindo assim a velocidade de protonação direta. Por outro lado, a difusão livre do tampão pode fazer com que este atue como um carregador de prótons. A difusão de prótons em soluções aquosas se dá pela troca de hidrogênios ligados covalentemente entre prótons solvatados e a matriz circundante. Devido a esse mecanismo, a difusibilidade da carga protônica em água (DH+ = 9,3 x 10-5 cm2s-1) é maior do que qualquer outro íon; esta é mais rápida até do que a

ácido em solução numa escala macroscópica não representa somente a difusão do próton. Trata-se de uma somatória de muitos processos, tais como difusão do próton livre, liberação e captura de prótons pelo tampão e difusão de moléculas protonadas de tampão. Generalizando-se, pode-se assumir que o tampão sempre irá reduzir a difusibilidade do ácido abaixo do medido em água pura. E ainda, qualquer coeficiente de difusão medido pela dispersão da acidez em uma solução tamponada é um coeficiente aparente e não representa o parâmetro molecular de DH+.

2. Objetivos

Este trabalho tem como objetivos:

1. Estudar a transferência de próton nos monólitos derivados do TEOS através de reações fotoinduzidas da piranina.

2. Estudar a participação das espécies H2PO4- e HPO4= oriundas do tampão fosfato no

interior dos monóliotos derivados do TEOS no processo prototrópico.

3. Estudar o comportamento dos indicadores ácido-base dopados nos monólitos derivados do TEOS.

4. Estudar a participação da água nas reações de transferência de próton em sistemas “secos” constituídos por espécies de tampão fosfato.

3. Materiais, Equipamentos e Métodos.

3.1. Materiais.

Os materiais, abaixo relacionados, foram todos de qualidade analítica e utilizados como recebidos.

Tetraetilortosilano (TEOS), foi obtido da Acros Organic. Piranina foi obtida da Eastman Kodak.

2-Naftol foi obtido daJ. T. Baker Chemical.

Fosfato de potássio monobásico foi obtido da Mallinckrodt Chemicals. Fosfato de potássio dibásico foi obtido daJ. T. Baker Chemical.

Dodecil Sulfato de Sódio foi obtido da Sigma-Aldrich. Azul de Bromofenol (BFB), foi obtido daSigma-Aldrich.

Azul de Bromotimol (BTB), foi obtido daSigma-Aldrich.

Lilás de Bromocresol (BCP), foi obtido da J. T. Baker Chemical. Vermelho Cresol (CR), foi obtido da Merck.

Verde de Bromocresol (BCG), foi obtido da Merck.

Cubetas de poli-estireno, com 1 cm de caminho óptico e 4 faces polidas e transparentes foram obtidasdaSigma-Aldrich.

3.2. Equipamentos.

Balança Analítica, Sartorius e Analitical Plus. pH-metro, Orion modelo 307.

Sonicador de haste, Braun Sonic 1510, foi utilizado para acelerar a hidrólise do TEOS, com potência de 70W.

Sonicador de Banho, Branson modelo N, foi utilizado para assegurar a homogeneização na preparação do monólito derivado do TEOS.

Espectrofotômetro, Cary 300.

Espectrofluorímetro, Hitachi F-200 e SPEX modelo DM 3000F. Fotólise de Relâmpago a Laser, Applied Photophysics.

3.3. Métodos.

3.3.1. Medidas de fluorescência da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS.

Os ensaios de fluorescência da Piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS foram realizados no HITACHI com geometria de 90°, com largura de banda de 10 nm e com uma tensão de 400V na fotomultiplicadora, nas seguintes condições:

a) λexcitação = 350 nm com varredura entre 420 e 600 nm;

b) λemissão = 510 nm com varredura entre 350 e 470 nm.

3.3.2. Medidas de fluorescência da piranina e 2-naftol dopados na mistura de KH2PO4

e K2HPO4.

As medidas de fluorescência da piranina e 2-naftol dopados na mistura de KH2PO4 e

K2HPO4 foram realizadas no SPEX utilizando geometria de face frontal, com 2 mm de

fendas de excitação e de emissão (largura de banda 13nm/mm), nas seguintes condições:

a) Piranina:

a1) λexcitação = 400 nm com varredura entre 420 e 600 nm;

a2) λemissão = 540 nm com varredura entre 350 e 470 nm.

b) 2-Naftol:

b1) λexcitação = 294 nm com varredura entre 320 e 500 nm;

3.3.3. Medidas de Fotólise de Relâmpago.

As medidas de fotólise de relâmpago a laser de Nd: YAG com ~20 mJ de potência, pulsado em 355 nm, com largura de pulso de ~80 ns e monitorado à 455 nm via Lâmpada de Xenônio e demais componentes eletrônicos para captura e digitalização de sinais.

3.3.4 Preparação do hidrolisado de TEOS.

Uma mistura de TEOS e água bi-destilada (Razão molar Si: H2O = 1: 4) em meio

ácido (HCl 2mM) foi agitada em um sonicador de haste até a obtenção de uma mistura miscível e translúcida. Esta mistura foi mantida em banho de gelo para evitar a gelificação durante a pré-hidrólise. Este hidrolisado de TEOS foi utilizado para preparar todos os monólitos. Convém ressaltar que nesta etapa não houve a adição de álcool como co-solvente, tornando o meio adequado para aplicações biológicas [Avnir et al. 1987; Brennan et al. 1999].

3.3.5. Preparação dos Monólitos derivados do TEOS.

Todos os monólitos derivados do TEOS foram preparados em cubetas de poli-estireno. Após a preparação dos monólitos, as cubetas foram mantidas à temperatura ambiente e na ausência de luz. Os monólitos obtidos foram submetidos aos ensaios de UV/VIS, fluorescência e fotólise de relâmpago.

3.3.5.1. Monólitos derivados do TEOS contendo piranina.

Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 20 µl de piranina, 1,5 ml de água ou 1,5 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato (pH 6,0), e 1,5 ml do pré-hidrolisado de TEOS. Durante a adição do pré-pré-hidrolisado de TEOS, a cubeta foi mantida

em sonicador de banho para assegurar a homogeneização do monólito derivado da gelificação do TEOS. A razão molar final de Si : H2O é de 1 : 16,5 e a concentração final

da piranina foi de 50 µM. As concentrações finais de solução tampão fosfato estão apresentadas nas legendas.

3.3.5.2 Monólitos derivados do TEOS contendo piranina e dodecil sulfato de sódio.

Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 20 µl de piranina, 0,75 ml de água ou 0,75 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato (pH 6,0), 0,75 ml de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio), e 1,5 ml do pré-hidrolisado de TEOS. Durante a adição do pré-hidrolisado de TEOS, a cubeta foi mantida em sonicador de banho para assegurar a homogeneização do monólito derivado da gelificação do TEOS. A razão molar final de Si : H2O é de 1 : 16,5 e as concentrações finais de piranina e de SDS foram 50 µM e 20 mM,

respectivamente. As concentrações finais de solução tampão fosfato estão apresentadas nas legendas.

3.3.5.3 Monólitos derivados do TEOS contendo indicadores ácido-base

Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 40 µl de diferentes indicadores ácido-base, 1,5 ml de água ou 1,5 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato (pH 6,0) e 1,5 ml do pré-hidrolisado de TEOS. Durante a adição do pré-hidrolisado de TEOS, a cubeta foi mantida em sonicador de banho para assegurar a homogeneização do monólito derivado da gelificação do TEOS. A razão molar final de Si: H2O é de 1 : 16,5 e

as concentrações finais de indicadores ácido-base e de solução tampão fosfato foram 10 µM e 50 mM; 40 mM; 30mM; 20 mM e 5 mM, respectivamente.

3.3.6 Mistura de KH2PO4 e K2HPO4 dopadas com piranina e 2 - naftol

Em um almofariz foi triturado uma mistura de KH2PO4 e K2HPO4 na proporção de

pHaparente= 4,0 à 6,0 dopada com piranina ou 2 - naftol. Esta mistura foi submetida à

secagem a vácuo por 1 hora e a 150 ºC. Estas misturas foram submetidas ao ensaio de fluorescência.

4. Resultados e Discussão.

4.1 Efeito da concentração de tampão fosfato sobre a piranina em solução.

A Figura 4 apresenta o espectro de absorção da piranina em solução ácida e aquosa, no qual observa-se somente a presença da espécie protonada, POH, (λmáx. = 403 nm e ε =

29.900 cm-1 M-1 , onde ε representa o coeficiente de absortividade) e em solução básica somente a presença da espécie deprotonada, PO-, (λmáx. = 455 nm e ε = 26.000 cm-1 M-1) no

estado fundamental.

A Figura 5 apresenta o espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350

nm, εácido = 14.150 cm-1 M-1 e εbásico = 2.450 cm-1 M-1) em soluções ácida, aquosa e básica.

Em solução ácida, verifica-se a presença da espécie ácida, POH*,(λmáx. = 445 nm) e uma

leve contribuição da espécie básica, PO-*, (λmáx. = 510 nm). Esta contribuição é resultante

da dissociação prototrópica da espécie POH* _{no estado excitado, conforme equilíbrio}

prototrópico da piranina (Esquema 1). A piranina em solução aquosa apresenta uma pequena contribuição da espécie POH* _{e a da espécie básica, PO}-*_{; esta última espécie é}

resultante da dissociação da espécie POH* _{no estado excitado. Em solução básica apresenta}

somente a presença da espécie PO-*que é o reflexo da excitação da espécie PO- presente no estado fundamental.

Figura 4: Espectro de absorção da piranina em soluções (
) ácida (pH 1), () aquosa e () básica (pH 10). 380 400 420 440 460 480 500 520 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

a

b

s

o

rb

â

n

c

ia

λ

λ

λ

λ

(nm)

Figura 5: Espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350 nm) em soluções

(
) ácida (pH 1), () aquosa e () básica (pH 10).

420 450 480 510 540 570 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

in

te

n

s

id

a

d

e

n

o

rm

a

li

z

a

d

a

(

u

.

a

r.

)

λ

λ

λ

λ

(nm)

A Figura 6 apresenta o espectro de excitação de fluorescência da piranina (λem. =

510 nm) em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. Independente da concentração, observa-se a presença da espécie POH (λmáx. = 403 nm) e uma leve

contribuição da espécie PO- _(λ

máx. ~ 445 nm, na região ampliada). De acordo com a região

ampliada, verifica-se que a contribuição da espécie PO- é diretamente proporcional à concentração de solução tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração salina, maior é a dissociação prototrópica da piranina, e conseqüentemente menor é o valor do pKa da piranina.

A Figura 7 apresenta o espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350

nm) em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. Observa-se a presença majoritária da espécie PO-* (λmáx. = 510 nm) e uma leve contribuição da espécie POH*

(λmáx. = 440 nm, região ampliada) para todas as concentrações de tampão, indicando a

dissociação prototrópica da piranina no estado excitado. De acordo com a região ampliada, verifica-se que a dissociação prototrópica da piranina é diretamente proporcional à concentração de solução tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração de tampão maior é dissociação prototrópica da piranina.

Figura 6: Espectro de excitação de fluorescência da piranina (λem. = 510 nm) em função

da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0 (
) 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, () 0,5 mM, e () água. 390 405 420 435 450 465 0 150 300 450 600 750 900 1050 430 440 450 460 470 0 20 40 60 80 100

in

te

n

s

id

a

d

e

(

u

.

a

r.

)

λ

λ

λ

λ

(nm)

Figura 7: Espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350 nm) em função da

concentração de solução tampão fosfato pH 6,0 (
) 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, () 0,5 mM, e () água. 420 450 480 510 540 570 600 0 100 200 300 400 500 600 430 440 450 460 5 10 15 20 25 30

in

te

n

s

id

a

d

e

(

u

.a

r.

)

λ

λ

λ

λ

(nm)

As Figuras 8 (A) e 8 (B) apresentam os transientes obtidos por fotólise de relâmpago da piranina em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. A partir destes transientes, pode-se calcular a constante de reprotonação observada da piranina no estado fundamental (Tabela 1). A espécie POH presente na solução é submetida a um pulso de laser tornando-se um ácido mais forte, POH*. Esta espécie ácida dissocia-se em PO-* _{que por sua vez relaxa na forma de PO}- _{sendo reprotonada, completando o equilíbrio}

prototrópico da piranina (Esquema 1). Observa-se que a constante de reprotonação observada é diretamente proporcional à concentração de tampão fosfato.

Tabela 1: Constante de reprotonação observada da piranina em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0.

[tampão fosfato] kreprotonação obs (s-1)

50 mM

2,80E+06

40 mM

2,12E+06

30 mM

1,56E+06

20 mM

8,90E+05

5 mM

2,50E+05

água

5,60E+05

Figura 8: Transientes obtidos por fotólise de relâmpago (1600W) a 325 nm e monitorado a 455 nm para a piranina em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. (A) (
) 50 mM, () 40 mM e () 30 mM; (B) () 20 mM, () 5 mM e () água, respectivamente. 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 a b s o rb â n c ia tempo (µµµµs) (A) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 a b s o rb â n c ia tempo (µµµµs) (B)

4.2. Efeito da concentração de ácido clorídrico sobre o monólito derivado do TEOS

Na preparação do hidrolisado de TEOS, concentrações de HCl na ordem de 10 mM e 100 mM apresentaram soluções turvas e posteriormente monólitos opacos. Portanto, a utilização de 2 mM de HCl na preparação do hidrolisado foi a concentração adequada para a obtenção de monólitos transparentes.

4.3 Efeito da concentração de tampão fosfato sobre o monólito derivado do TEOS

Dados experimentais mostraram que a concentração de tampão fosfato interfere no tempo de gelificação do monólito derivado do TEOS. A gelificação foi praticamente instantânea, com a formação de um sólido opaco e quebradiço, para o monólito contendo 500 mM de tampão. O tempo de gelificação foi de 5 minutos para o monólito com 250 mM e dentro de 24 horas para os monólitos com 5 mM e 0,5 mM de tampão fosfato pH = 6,0, com a formação de monólitos uniformes e translúcidos. Após a gelificação, os monólitos sofrem contração em todo o seu volume ao longo do tempo.

Após a preparação dos monólitos, monitorou-se a perda de massa e a transferência de próton da piranina até o momento em que a massa dos monólitos e os respectivos espectros da piranina tornaram-se praticamente constante.

As Figuras 9 (A) e 9 (B) apresentam o espectro de absorção dos monólitos derivados da gelificação do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 após 7 dias de envelhecimento sem SDS e com SDS, respectivamente. Em ambos os casos, observa-se a presença da espécie protonada, POH, (λmáx. = 403 nm) e uma leve

contribuição da espécie deprotonada, PO-_{, (λ}

máx. = 455 nm, na região ampliada). Esta leve

contribuição da espécie deprotonada é diretamente proporcional à concentração de solução tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração salina, maior é a dissociação prototrópica da piranina. A dissociação prototrópica da piranina, neste caso, é atribuída a presença de sal que favorece a dissociação da espécie protonada e estabiliza os íons PO- e

H3O+. Em outros termos o aumento da força iônica conduz a uma diminuição do pKa e

assim mantendo-se o pH constante observar-se-á o predomínio das espécies dissociadas (Fernandez et al., 1996). A dependência do pKa com a força iônica segue a função

representada pela equação (18).

pK

aµ≠o piranina

= pKa

µ=o

- [(1,02 x Z

1

x Z

2

x µ

½

) / (1 + 2 x µ

½

)] (18)

onde: µ é a força iônica; µ = ½ΣCiZi2

Z1 e Z2 são as cargas das espécies;

Ci é a concentração molar das espécies.

Observou-se que os espectros de absorção coletados ao longo de 74 dias não apresentaram alterações com relação à dissociação prototrópica no estado fundamental, independendo da utilização do SDS. O SDS foi introduzido na tentativa de compartimentalizar espécies e de alguma forma conduzir a cinéticas mais lentas. Estas e outras alternativas, como o uso de outros surfatantes e tampões será realizada futuramente.

Figura 9: Espectro de absorção da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 (
) 50 mM, () 40 mM, () 30 mM, () 20 mM, () 5 mM e () água, após 7 dias de envelhecimento (A) sem SDS e (B) com SDS. 380 400 420 440 460 480 500 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 440 460 480 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 a b s o rb â n c ia λ λ λ λ (nm) (A) 380 400 420 440 460 480 500 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 440 450 460 470 480 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 a b s o rb â n c ia λ λ λ λ (nm) (B)

Nas Figuras 10 (A) e 10 (B) estão apresentados os espectros normalizados de emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina dopada nos monólitos derivados do

TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0, após 1 e 51 dias de preparação do monólito, respectivamente. De acordo com a Figura 10 (A), observa-se a presença da espécie POH* (λmáx. = 431 nm) e da espécie PO-* (λmáx. = 505 nm) para todas

as concentrações, indicando a dissociação prototrópica no estado excitado. Ao longo de 51 dias, observa-se somente a presença da espécie PO-* _{para as concentrações de 250 mM e 50}

mM; e a presença das espécies POH* e PO-* para as demais concentrações. Ambos os espectros, mostram que a presença da espécie POH* é inversamente proporcional à concentração de tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração de tampão fosfato menor é a presença da espécie POH*e, maior é a dissociação prototrópica no estado excitado.

Os monólitos contendo SDS apresentaram praticamente o mesmo comportamento em relação aos monólitos que não continham SDS, conforme ilustra as Figuras 11 (A) e 11 (B).

Figura 10: Espectros normalizados de emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina

dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 (
) 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, () 0,5 e () água, após (A) 1 e (B) 51 dias de preparação, respectivamente.

420 450 480 510 540 570 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 in te n s id a d e n o rm a li z a d a λ λ λ λ (nm) (A) 420 450 480 510 540 570 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 in te n s id a d e n o rm a li z a d a λ λλ λ (nm) (B)

Figura 11: Espectros normalizados de emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina

dopada nos monólitos derivados do TEOS contendo SDS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 (
) 50 mM, () 40 mM, () 30 mM, () 20 mM, () 5 mM e () água, após (A) 1 e (B) 74 dias de preparação, respectivamente.

420 450 480 510 540 570 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 in te n s id a d e n o rm a li z a d a λ λ λ λ (nm) (A) 420 450 480 510 540 570 600 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 in te n s id a d e n o rm a li z a d a λ λ λ λ (nm) (B)

Uma vez que os monólitos derivados do TEOS sofrem encolhimento com o processo de envelhecimento, o posicionamento da amostra no mesmo caminho óptico no espectrofluorímetros fica comprometido. Desta maneira as intensidades medidas são bastante variantes. Tendo em vista que, cada espectro contém os percentuais das espécies POH* e PO-* e que ambas as espécies tem rendimento quântico de fluorescência próximo à unidade, pode-se empregar a razão de intensidades como parâmetro analítico. Monitorou-se, portanto a extensão de dissociação nos vários géis (e sistemas secos, vide infra) através do percentual de PO-*. O percentual de PO-* é a relação entre as espécies POH* e PO-*, segundo a expressão (19).

% PO

-*

= I(PO

-*

)

/ (I

(POH

*

) + I (PO

-*

))

(19)

onde: I (PO-*)é a intensidade de fluorescência da espécie deprotonada;

I (POH*)é a intensidade de fluorescência da espécie protonada.

A Figura 12 apresenta o percentual de PO-* da piranina dopada nos monólitos derivados de TEOS em função do tempo. Até ~12 dias, observa-se o aumento da transferência de próton para todas as concentrações de tampão. Observa-se que a extensão da transferência de próton é diretamente proporcional à concentração de tampão fosfato. Inicialmente, a atividade relativamente baixa da transferência de próton é devida à presença de etanol, proveniente da hidrólise de TEOS, que é lixiviado juntamente com a água assim que o monólito derivado do TEOS envelhece. Conforme apresentado na introdução, a transferência de próton da piranina em solução aquosa é inibida pela presença de etanol [Chaudhury et al., 2003; Huppert & Kolodney et al., 1981]. Posteriormente ao envelhecimento inicial, observa-se que para os monólitos contendo 250 mM e 50 mM de tampão fosfato a transferência de próton mantém-se constante ao longo do tempo. Entretanto, as demais concentrações (5 mM, 0,5 mM e na presença de água) apresentam uma pequena estabilização (até ~ 22 dias), seguida pela diminuição da extensão de transferência de prótons.

Figura 12: Percentual de PO-* da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função do tempo, para as concentrações de solução tampão fosfato pH = 6,0 (
) 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, () 0,5 mM e () água.

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

52

50

60

70

80

90

100

%

P

O

-*

tempo (dias)

As Figuras 13 (A) e 13 (B) apresentam os transientes obtidos por fotólise de relâmpago da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato após 2 e 19 dias de preparo, respectivamente. Verifica-se que a constante de reprotonação observada é diretamente proporcional à concentração de tampão fosfato e que esta constante torna-se maior após 19 dias de preparo. Na Tabela 2 são apresentados os valores da constante de reprotonação observada da piranina em função do tempo para os monólitos sem e com SDS relativos aos dias 1 e 8 de envelhecimento dos géis. Os monólitos contendo SDS apresentaram uma pequena diminuição da difusibilidade do H+ atribuida à partição desta espécie em micelas de SDS.

Tabela 2: Constante de reprotonação observada da piranina dopada nos monólitos derivados de TEOS sem e com SDS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 ao longo do tempo.

[tampão fosfato]

dia 1

dia 8

dia 1

dia 8

50 mM

2,41E+06

1,99E+06

1,85E+06

2,10E+06

40 mM

2,25E+06

1,96E+06

1,75E+06

1,97E+06

30 mM

2,08E+06

1,76E+06

1,71E+06

1,99E+06

20 mM

2,04E+06

1,57E+06

1,43E+06

1,73E+06

5 mM

2,35E+06

1,78E+06

2,08E+06

1,91E+06

água

2,33E+06

1,68E+06

1,79E+06

1,88E+06

com SDS

sem SDS

Figura 13: Transientes obtidos por fotólise de relâmpago (1600W) a 325 nm e monitorado a 455 nm para a piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 (
) 50 mM, () 40 mM e () 30 mM; (B) () 20 mM, () 5 mM após (A) 2 dias e (B) 19 dias de preparação, respectivamente. 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 a b s o rb â n c ia tempo (µµµµs) (A) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 -0.01 0.00 0.01 0.02 0.03 a b s o rb â n c ia tempo (µµµµs) (B)