Setembro 2016
Manual do Kit
ipsogen
®
BCR-ABL1 Mbcr RGQ
RT-PCR
24
Versão 1
Diagnóstico in vitro quantitativo
Para utilização com o equipamento Rotor-Gene
®Q MDx 5plex HRM
670923
QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden,
ALEMANHA
Índice
Utilização prevista ... 6
Resumo e explicação ... 6
Contexto sobre a leucemia mieloide crónica ... 6
Monitorização da doença ... 7
Princípio do procedimento ... 9
Materiais fornecidos ... 12
Conteúdo do kit ... 12
Materiais necessários, mas não fornecidos ... 13
Advertências e precauções ... 15
Informações de segurança ... 15
Precauções gerais ... 15
Armazenamento e manuseamento de reagentes ... 17
Condições de transporte ... 17
Condições de armazenamento... 18
Estabilidade ... 18
Manuseamento e armazenamento de amostras ... 19
Amostras de sangue total ... 19
Amostras de ARN ... 19
Procedimento ... 20
Protocolo de lise de eritrócitos para isolamento de leucócitos total a partir de sangue total ... 20
Isolamento do ARN total ... 22
Transcrição reversa ... 28
qPCR no equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM com rotor de 72 tubos ... 30
Processamento de amostras em equipamentos Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM com rotor de 72 tubos ... 31
Resultados ... 37
Princípio de análise dos dados ... 37
Curvas padrão e critérios de qualidade aplicáveis a dados não processados ... 38
Guia de resolução de problemas ... 46
Controlo de qualidade ... 48 Limitações ... 48 Características de desempenho ... 49 Limite do branco ... 49 Limite de deteção ... 50 Linearidade ... 50 Repetibilidade e reprodutibilidade... 50 Substâncias interferentes ... 51
Validação clínica e comparação de métodos ... 51
Estudo de concordância: Plasmídeo simples ERM-AD623 BCR-ABL1 (IRMM) contra padrões de plasmídeo simples ipsogen (QIAGEN) ... 53
Bibliografia ... 56
Símbolos ... 58
Informações de contacto ... 59
Utilização prevista
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR é um teste in vitro de diagnóstico quantitativo para a medição dos produtos de transcrição b3a2 (e14a2) e b2a2 (e13a2) do gene de fusão BCR-ABL1, presentes no ARN total extraído de amostras de sangue total.
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR destina-se à monitorização da resposta molecular profunda em pacientes diagnosticados com leucemia mieloide crónica (LMC) com o cromossoma Filadélfia positivo (Ph+) p210 em fase crónica.
Ajustado de acordo com o Painel de referência genética da Organização Mundial de Saúde (OMS).
Resumo e explicação
Contexto sobre a leucemia mieloide crónica
A LMC pertence ao grupo de neoplasias mieloproliferativas e em > 90% dos casos é caracterizada pela presença do cromossoma Filadélfia (Ph CHRS). Este cromossoma é o produto de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomas 9 e 22, t(9;22), com a breakpoint cluster region (BCR) localizada no cromossoma 22 e o oncogene c-ABL situado no cromossoma 9. O gene de fusão correspondente, o BCR-ABL1, é transcrito num ARNm de 8,5 kb, com 2 variantes de junção, b2a2 (detetado em 40% dos casos) e b3a2 (presente em 55% dos casos). Este gene de fusão codifica uma proteína quimérica, a p210, com uma atividade elevada de tirosina cinase. Os produtos de transcrição b2a3 e b3a3 representam menos de 5% dos casos. O cromossoma Ph também pode ser detetado
A incidência anual da LMC é de aproximadamente 1–2 por 100 000, sendo que a LMC perfaz 20% de todas as leucemias em idade adulta. Clinicamente é caraterizada por um excesso de células mieloides que se diferenciam e funcionam normalmente. Em 90–95% dos casos de LMC, os pacientes são diagnosticados na fase crónica ou estável da doença. Antigamente os pacientes desenvolveriam crises blásticas e leucemia aguda com consequências fatais no espaço de 4 a 6 anos. No entanto, a chegada do imatinib e, mais recentemente, da segunda geração de inibidores de tirosina cinases (ITC), alterou dramaticamente o curso natural da doença. A maioria dos pacientes permanecerá em remissão e, como tal, necessitará de acompanhamento a longo prazo e de monitorização da doença.
Monitorização da doença
O objetivo atual da terapia da LMC é alcançar uma taxa de sobrevivência de 100% e uma negatividade do cromossoma Ph. Por isso, a monitorização da doença é uma ferramenta essencial para avaliar a resposta ao tratamento e detetar recidivas em cada paciente, o mais cedo possível. Quando tratados com ITC, o progresso normal dos pacientes passa de remissão hematológica para citogenética e, em seguida, molecular, com uma redução correspondente no número de células leucémicas e produtos de transcrição do BCR-ABL1, conforme apresentado na Figura 1.
Figura 1. Definição da resposta molecular. Adaptada a partir das referências 1, 2 e 9. MR: resposta molecular. MMR: resposta molecular major.
O método de referência para estimar a carga tumoral em pacientes com LMC é uma análise citogenética convencional (bandeamento G) de metáfases da medula óssea (MO). A resposta citogenética é avaliada em, pelo menos, 20 metáfases da medula óssea. O nível de resposta citogenética é estimado com base na percentagem de metáfases positivas para o cromossoma Ph (3). No entanto, esta avaliação é influenciada pelo desempenho e competência do laboratório e tem uma baixa sensibilidade, de 5%, quando 20 metáfases são analisadas.
A reação em cadeia de polimerase quantitativa (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) em tempo real do ARNm do BCR-ABL1 Mbcr em amostras de sangue periférico (SP) define a resposta molecular, fazendo agora parte das técnicas de monitorização da doença utilizadas na LMC. É menos invasiva do que as tradicionais técnicas de citogenética de metáfases de medula óssea e apresenta uma maior sensibilidade.
MR4
(redução de ≥ 4 log; ≤ 0,01%IS)
• Doença detetada ≤0,01% BCR-ABL1IS ou
• Doença não detetada no ADNc com ≥10,000 ABL1
MR4.5
(redução ≥ 4,5 log; ≤ 0,0032%IS)
• Doença detetada ≤0,0032% BCR-ABL1IS ou
• Doença não detetada no ADNc com ≥32 000 ABL1 MR5
(redução ≥ 5 log; ≤ 0,001%IS)
• Doença detetada ≤0,001% BCR-ABL1IS ou
• Doença não detetada no ADNc com ≥100 000 ABL1
Redução logarítmica é uma redução realizada tendo em conta a linha de base IRIS
MR: Resposta molecular; MMR: Resposta molecular major
Escala internacional N ú m er o d e c él u la s leu cém ica s 100 % linha de base 10% 1% 0,1% MMR 0,01% 0,001% BCR-ABL1 não detetado
isto reforçando os objetivos de monitorização da doença. Em particular, os ITC de segunda geração causam uma resposta molecular mais significativa num maior número de pacientes com LMC, conseguindo o que se define como resposta molecular profunda, correspondendo a uma carga de BCR-ABL1 inferior a 0,01% (MR4.0) ou 0,0032% (MR4.5). A capacidade de quantificar de forma precisa estes níveis muito baixos da carga do BCR-ABL1 pode ser importante em termos clínicos, uma vez que ficou demonstrado em ensaios observacionais que a administração de ITC pode ser interrompida com segurança em pacientes com uma resposta molecular constante de MR4.5 (4). No entanto, estão a ser realizados ensaios clínicos adicionais para confirmar estas descobertas.
As recomendações mais recentes em relação à definição de resposta e à monitorização de pacientes com LMC tratados com ITC provêm dos peritos da ELN (3).
De um ponto de vista técnico, têm sido envidados esforços pelos peritos internacionais para harmonizar a os testes e relatórios de BCR-ABL1 Mbcr (5–7). Além disso, foi validado recentemente um painel de referência, sob os auspícios da OMS, para permitir uma padronização simples da quantificação de BCR-ABL1 (8).
Princípio do procedimento
A PCR quantitativa permite a quantificação exata de produtos de PCR durante a fase exponencial do processo de amplificação de PCR. Os dados quantitativos da PCR podem ser rapidamente obtidos sem processamento pós-PCR, através da deteção em tempo real de sinais fluorescentes durante e/ou após o ciclo de PCR, reduzindo assim drasticamente o risco de contaminação dos produtos de PCR. Atualmente estão disponíveis três tipos principais de técnicas de qPCR: análise de qPCR, utilizando o corante SYBR® Green I, análise de qPCR
utilizando sondas de hidrólise e análise de qPCR utilizando sondas de hibridação.
Este ensaio explora o princípio de hidrólise do oligonucleótido de corante duplo por qPCR. Durante a PCR, os primers diretos e inversos (forward e reverse) hibridam com uma sequência
específica. Na mesma mistura, está presente um oligonucleótido de corante duplo. Esta sonda, que consiste num oligonucleótido etiquetado com um corante-repórter em 5' e um corante de extinção 3' a jusante, hibrida com uma sequência-alvo presente no produto de PCR. A análise de qPCR com sondas de hidrólise explora a atividade de exonuclease 5'→3’ da polimerase de ADN de Thermus aquaticus (Taq). Quanto a sonda está intacta, a proximidade do corante repórter em relação ao corante de extinção resulta na supressão da fluorescência do repórter, principalmente através de transferências de energia do tipo Förster.
Durante a PCR, se o alvo de interesse estiver presente, a sonda hibrida especificamente entre os locais dos primers direto e inverso. A atividade de exonuclease 5'→3’ da polimerase de ADN faz a clivagem da sonda entre o corante repórter e o de extinção apenas se a sonda hibridar com o alvo. Os fragmentos da sonda são, depois, deslocados do alvo e a polimerização da cadeia continua. A terminação 3' da sonda é bloqueada para evitar a extensão da sonda durante a PCR (Figura 2). Este processo ocorre em cada ciclo e não interfere com a acumulação exponencial de produto.
O aumento do sinal de fluorescência é detetado apenas se a sequência-alvo for complementar à sonda e, por conseguinte, for amplificada durante a PCR. Devido a estes requisitos, a amplificação não específica não é detetada. Assim, o aumento da fluorescência é diretamente proporcional à amplificação do alvo durante a PCR.
Figura 2. Princípio da reação. É realizada uma transcrição reversa do ARN e o ADNc gerado é amplificado por PCR utilizando um par de primers específicos e uma sonda de corante duplo interna específica (FAM™–BHQ®-1). A sonda liga-se ao amplicon durante cada passo de hibridação do PCR. Quando a Taq se estende do primer ligado ao amplicon, desloca a extremidade 5' da sonda, que é depois degradada pela atividade de exonuclease 5'→3’ da polimerase do ADN de Taq. A clivagem continua até a sonda restante eliminar o amplicon. Este processo liberta o fluoróforo e o corante de extinção para dentro da solução, separando-os espacialmente e provocando um aumento de fluorescência da FAM e um decréscimo da fluorescência da BHQ-1.
Hibridação Hibridação de primers e sonda Deslocação da cadeia de polimerização Clivagem
Causa a libertação da emissão de sinal de fluorescência do corante de extinção e do corante repórter Polimerização concluída Corante repórter Produto final de PCR e acumulação do sinal de fluorescência em cada ciclo
Corante de extinção Sonda específica Produto de PCR Primers diretos e inversos Polimerase Taq
Materiais fornecidos
Conteúdo do kit
ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Kit
Referência Número de reações
(24) 670923 24 Reagents for reverse transcription (RT) (reagentes para
transcrição reversa (TR)) 24 µl
Reverse transcriptase (transcriptase reversa) Roxo 100 µl
RT Mix (Mistura RT) Roxo 300 µl
Reagents for calibration (Reagentes para calibração)
High Positive RNA Control (Controlo ARN de alta positividade) Branco 15 µl × 3 Low Positive RNA Control (Controlo ARN de baixa positividade) Branco 15 µl × 3 IS-MMR Calibrator (Calibrador IS-MMR) Branco 15 µl × 3 SP1-BCR-ABL Mbcr and ABL:
diluição padrão de plasmídeo simples Mbcr e ABL1 (101 cópias/5 µl)
Amarelo 35 µl
SP2-BCR-ABL Mbcr e ABL:
diluição padrão de plasmídeo simples Mbcr e ABL1 (102 cópias/5 µl)
Amarelo 35 µl
SP3-BCR-ABL Mbcr e ABL:
diluição padrão de plasmídeo simples Mbcr e ABL1 (103 cópias/5 µl)
Amarelo 70 µl
SP4-BCR-ABL Mbcr e ABL:
diluição padrão de plasmídeo simples Mbcr e ABL1 (104 cópias/5 µl)
Amarelo 35 µl
SP5-BCR-ABL Mbcr e ABL:
diluição padrão de plasmídeo simples Mbcr e ABL1 (105 cópias/5 µl)
Continuação da tabela da página anterior
Reagentes para qPCR
Taq DNA polymerase (polimerase de ADN de Taq) Verde-menta 85 µl
qPCR Mix ABL1 (mistura ABL1 qPCR)* Verde 720 µl × 3 qPCR Mix Mbcr (mistura Mbcr qPCR)† Vermelho 720 µl × 3
ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR Handbook (Manual do
Utilizador do kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR) 1
* Contém uma mistura de primers diretos e inversos para o gene de controlo ABL1 e uma sonda específica FAM–BHQ-1. * Contém uma mistura de primers diretos e inversos para o gene de controlo BCR-ABL1 e uma sonda específica FAM–BHQ-1.
Materiais necessários, mas não fornecidos
Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção. Para mais informações, consulte as fichas de dados de segurança (safety data sheets, SDS) apropriadas, disponíveis no fornecedor do produto.
Reagentes para lise de eritrócitos
Erythrocyte Lysis (EL) Buffer (tampão para lise de eritrócitos (LE)) (ref.ª 79217) 14,3 M β-mercaptoetanol*
RNeasy® Midi Kit (kit RNeasy® Midi) (ref.ª 75144)
Reagentes para isolamento de ARN total
RNeasy Midi Kit (Kit RNeasy Midi) (ref.ª 75144) Etanol (70%, 80% e 96–100%)
* Os produtos químicos e equipamento recomendado para lise de eritrócitos e isolamento de ARN podem ser perigosos. Certifique-se de que é utilizado o equipamento de proteção individual adequado e de que são tomadas
Passo de limpeza e concentração de ARN opcional: RNeasy MinElute® Cleanup Kit (kit
de limpeza RNeasy MinElute®) (ref.ª 74204)
Água de qualidade para PCR isenta de nuclease
Consumíveis
Pontas de pipetas de PCR, estéreis, isentas de nuclease e resistentes a aerossóis, com
filtros hidrófobos
Agulha de calibre 18–20* colocada numa seringa isenta de RNAse Tubos isentos de nuclease de 0,5 ml ou 0,2 ml
Tubos isentos de nuclease de 1,5 ml ou 2 ml Tubos de centrifugação de 50 ml
Strip Tubes and Caps 0.1 ml (tubos e tampas de tiras, de 0,1 ml) para Rotor-Gene Q
(ref.ª 981103 ou 981106)
Gelo
Equipamento
Pipetas* exclusivas para PCR (1–10 µl; 10–100 µl; 100–1000 µl)
Centrífuga de bancada* com rotor para tubos de reação de 0,2 ml e 2 ml (capaz de
atingir 8000 × g ou 10 000 rpm)
Espectrofotómetro*
Centrífuga de laboratório* com rotor para tubos de centrifugação de 15 e 50 ml
(capaz de atingir 3000–5000 × g) que permite centrifugação refrigerada (4 °C)
Termo-misturador, incubador orbital aquecido, bloco de aquecimento ou banho-maria
(para o passo de transcrição reversa)*
Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM* (ref.ª 9002032) e material específico associado Software Rotor-Gene Q, versão 2.1.0 ou superior
Advertências e precauções
Para utilização em diagnóstico in vitro
Informações de segurança
Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção. Para mais informações, consulte as fichas de dados de segurança (SDS) apropriadas. Estas estão disponíveis online no formato compacto e prático PDF em www.qiagen.com/safety, onde pode procurar, visualizar e imprimir as SDS de cada kit QIAGEN® e componente do kit.
Todos os produtos químicos e materiais biológicos são potencialmente perigosos. As amostras são potencialmente infeciosas e devem ser tratadas como materiais de risco biológico. O sangue é considerado potencialmente infecioso. Todas as precauções recomendadas pelas autoridades reguladoras no país de utilização devem ser consideradas ao manusear sangue total.
Os produtos químicos e equipamento recomendado para lise de eritrócitos e isolamento de ARN podem ser perigosos. Certifique-se de que é utilizado o equipamento de proteção individual adequado e de que são tomadas medidas de proteção antes da utilização.
Precauções gerais
A utilização de testes de qPCR exige boas práticas laboratoriais que incluem a manutenção do equipamento dedicado à biologia molecular e a conformidade com os regulamentos aplicáveis e com as normas relevantes. Os componentes deste produto são suficientes para executar 24 reações para cada ensaio.
Elimine as amostras e os resíduos dos ensaios de acordo com os procedimentos de
segurança locais.
A diluição dos reagentes fornecidos pelo Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR é
ideal. Não efetue diluição adicional dos reagentes, pois poderia causar a diminuição do seu desempenho.
Todos os reagentes fornecidos no Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR devem ser
utilizados apenas com os outros reagentes fornecidos no mesmo kit. Não substitua qualquer reagente entre Kits ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR, pois isso pode afetar o desempenho.
Para advertências, precauções e procedimentos adicionais, consulte o manual do
utilizador do equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM.
A alteração dos tempos e/ou temperaturas de incubação pode dar origem a dados
erróneos ou discordantes.
Não utilize componentes que estejam fora de prazo de validade ou que tenham sido
incorretamente armazenados.
Tenha um cuidado extremo para evitar contaminação cruzada ao utilizar controlos positivos. Tenha um cuidado extremo para evitar a contaminação por transporte dos produtos de
ADNc ou PCR, o que causaria um sinal falso positivo.
Tenha um cuidado extremo para evitar a contaminação por RNAse ou DNAse, o que
poderia causar a degradação dos modelos de ARN ou ADNc.
Não abra o equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM enquanto a execução não
estiver concluída.
É necessário ter cuidado para garantir testes de amostras corretos, com ênfase na
entrada de amostra errónea, erro de carregamento e erro de pipetagem.
Portanto, recomendamos o seguinte:
Utilizar material de laboratório isento de nuclease (por ex., pipetas, pontas de pipetas,
frascos-ampola de reação).
Utilizar pontas de pipetas novas e resistentes a aerossóis em todas as fases de
pipetagem, para evitar a contaminação cruzada das amostras e dos reagentes.
Preparar a mistura principal de pré-PCR com material dedicado (pipetas, pontas, etc.)
numa área dedicada onde não sejam introduzidas matrizes de ADN (produtos de ADNc, plasmídeo ou PCR).
Adicionar o modelo numa zona separada (preferencialmente numa sala em separado)
com material específico (pipetas, pontas, etc.).
Consultar os respetivos manuais para obter informações de segurança específicas dos reagentes e kits utilizados para a preparação de amostras. As informações de segurança do RNeasy Midi Kit (kit RNeasy Midi) (ref.ª 75144) em associação com o Buffer EL (tampão LE) (ref.ª 79217) são fornecidas no manual do kit RNeasy Midi/Maxi (RNeasy Midi/Maxi
Handbook) e as informações de segurança do RNeasy MinElute Cleanup Kit (kit de limpeza
RNeasy MinElute) (ref.ª 74204) são fornecidas no manual deste kit (RNeasy MinElute Cleanup
Handbook).
Armazenamento e manuseamento de reagentes
Condições de transporte
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR é expedido em gelo seco. Se qualquer componente do Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR não chegar ao destino em estado congelado, se a embalagem exterior tiver sido aberta durante o transporte, ou se a remessa não contiver uma nota de embalagem ou os reagentes, contacte um dos Departamentos da Assistência Técnica QIAGEN ou os distribuidores locais (consulte o verso do manual ou visite-nos em www.qiagen.com).
Condições de armazenamento
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR deverá ser armazenado imediatamente após ser recebido, a uma temperatura entre –30 e –15 °C num congelador de temperatura constante. Deve tomar-se o cuidado de proteger as misturas qPCR da luz.
Para informações de armazenamento relativas aos reagentes e kits utilizados para a preparação de amostras: RNeasy Midi Kit (ref.ª 75144), Buffer EL (ref.ª 79217), RNeasy MinElute Cleanup Kit (kit de limpeza RNeasy MinElute) (ref.ª 74204), consulte os respetivos manuais.
Estabilidade
Quando armazenado nas condições de armazenamento especificadas, o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR permanecerá estável até à data do prazo de validade.
Uma vez abertos, os reagentes podem ser armazenados nas respetivas embalagens originais entre –30 e –15 °C até à data do prazo de validade indicada na embalagem. Não exceder um máximo de cinco ciclos de congelamento/descongelamento.
Para informações de estabilidade relativas aos reagentes e kits utilizados para a preparação de amostras: RNeasy Midi Kit (ref.ª 75144), Buffer EL (ref.ª 79217), RNeasy MinElute Cleanup Kit (kit de limpeza RNeasy MinElute) (ref.ª 74204), consulte os respetivos manuais.
Manuseamento e armazenamento de amostras
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR destina-se à utilização com amostras de ARN extraídas de sangue total. Todas as amostras devem ser tratadas como materiais potencialmente perigosos.
Amostras de sangue total
As amostras de sangue total deverão ser anticoaguladas com EDTA de potássio (K2EDTA)
e conservadas entre 2 e 8 °C durante um máximo de 4 dias antes da extração do ARN.
Não utilizar sangue congelado.
Etiquetar, manusear e armazenar amostras de sangue de forma controlada, em
conformidade com os procedimentos locais.
Nota: as amostras de sangue total devem ser expedidas sob as mesmas condições em que estavam armazenadas, para evitar alterações de temperatura.
Amostras de ARN
Após o isolamento, o ARN purificado pode ser armazenado a uma temperatura entre os
–30 e os –15 °C ou inferior (–90 a –65 °C), caso seja necessário um armazenamento a longo prazo.
Etiquetar, manusear e armazenar amostras de ARN de forma controlada,
em conformidade com os procedimentos locais.
Nota: as amostras de ARN devem ser expedidas sob as mesmas condições em que estavam armazenadas, para evitar alterações de temperatura durante o armazenamento e a expedição.
Procedimento
O ARN total deve ser purificado a partir de 10 ml de sangue total periférico recolhido em tubos EDTA.
Certificar-se de que os reagentes a utilizar para a lise de eritrócitos, isolamento de ARN
e concentração de ARN ainda se encontram dentro do prazo de validade e que foram transportados e armazenados em condições adequadas.
Utilizar o RNeasy Midi Kit (ref.ª 75144) e Buffer EL para lise de eritrócitos (ref.ª 79217)
para a purificação de ARN a partir de sangue total periférico.
Protocolo de lise de eritrócitos para isolamento de leucócitos total a
partir de sangue total
Este protocolo é concebido para o isolamento de leucócitos totais a partir de 10 ml de sangue humano total utilizando o Buffer EL (ref.ª 79217).
Nota: este protocolo não é concebido para a utilização de amostras de sangue total congeladas.
Notas importantes antes de iniciar o procedimento
O sangue e fluidos corporais de todos os sujeitos humanos são considerados
potencialmente infeciosos. Todas as precauções recomendadas pelas autoridades reguladoras no país de utilização devem ser consideradas ao manusear sangue total.
O tampão RLT pode formar um precipitado ao ser armazenado. Caso seja necessário,
O que fazer antes de iniciar o procedimento
Preparar o tampão RLT (fornecido com o Kit RNeasy Midi), adicionando β-mercaptoetanol (β-ME). Adicionar 10 µl β-ME por cada 1 ml de tampão RLT.
O tampão RLT permanece estável durante 1 mês após adição de β-ME. Nota: o β-ME é tóxico; colocar numa campânula de fumo e utilizar vestuário de proteção adequado.
Nota: o tampão RLT contém isotiocianato de guanidina, que pode formar compostos altamente reativos quando combinado com lixívia. Não adicionar lixívia nem soluções ácidas diretamente nos resíduos de preparações da amostra.
Procedimento
1. Adicionar 40 ml de tampão LE a 10 ml de sangue total num só tubo de centrifugação de 50 ml. Misturar virando brevemente ao contrário.
2. Incubar durante 15 minutos em gelo. Misturar virando brevemente ao contrário duas vezes durante a incubação.
Nota: a suspensão nebulosa torna-se translúcida durante a incubação, indicando a lise de eritrócitos.
3. Centrifugar a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C. Eliminar completamente o sobrenadante. Guardar o pellet de leucócitos.
Nota: os leucócitos formam um pellet após a centrifugação. Certificar-se da remoção completa do sobrenadante. Os vestígios de eritrócitos residuais que ainda possam restar são eliminados nos passos seguintes.
A remoção incompleta do sobrenadante vai impedir a lise e diluir o lisado, afetando as condições de ligação do ARN à membrana RNeasy. Ambos os efeitos podem reduzir a produção de ARN.
4. Adicionar 20 ml de tampão LE ao pellet de leucócito e suspender novamente através de pipetagem.
5. Centrifugar a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C. Eliminar completamente o sobrenadante. Guardar o pellet de leucócitos.
Nota: os passos de centrifugação seguintes (por ex., isolamento de ARN) têm de ser realizados a 20–25 °C.
6. Soltar o pellet de leucócitos batendo levemente no tubo em 4 ml de tampão RLT suplementado com β-ME. Agitar fortemente ou pipetar para misturar.
Nota: certificar-se de que o βME é adicionado ao tampão RLT antes de utilizar. 7. Garantir a rutura utilizando um homogeneizador de rotor-estator convencional durante,
no mínimo, 45 segundos à velocidade máxima, até a amostra ficar uniformemente homogénea. Em alternativa, agitar fortemente a amostra durante 10 segundos e passar o lisado pelo menos 10 vezes por uma agulha de calibre 18–20 colocada numa seringa isenta de RNAse.
Nota: uma rutura incompleta vai resultar numa produção reduzida através da obstrução da coluna RNeasy. A rutura com homogeneizadores de rotor-estator resulta geralmente numa produção de ARN total mais elevada quando comparada com outros métodos de homogeneização.
Nota: as amostras podem ser armazenadas entre –90 e –65 °C num tampão de lise após a rutura. As amostras congeladas permanecem estáveis durante meses.
Isolamento do ARN total
Este protocolo é concebido para isolamento de ARN celular total de lisado de leucócitos homogeneizado novamente suspenso em 4 ml de RLT/β-ME.
Notas importantes antes de iniciar o procedimento
O protocolo RNeasy deve ser realizado à temperatura ambiente. Trabalhar rapidamente
durante o procedimento.
Todos os passos de centrifugação são executados entre os 20 e os 25 °C. Certificar-se
de que a temperatura da centrífuga não se encontra abaixo de 20 °C.
O volume total tem que passar através da coluna em cada passo de centrifugação. Pode
ser necessário repetir a centrifugação.
O que fazer antes de iniciar o procedimento
Caso seja necessário, descongelar o lisado de leucócitos à temperatura ambiente antes
de iniciar o protocolo de isolamento de ARN.
Preparar 4 ml de etanol a 70% por amostra.
O tampão RPE é fornecido como um concentrado. Antes de utilizar pela primeira vez,
adicionar 4 volumes de etanol (96–100%), conforme indicado na garrafa, para obter uma solução de trabalho.
Procedimento
1. Adicionar 4 ml de etanol a 70% ao lisado e misturar bem, agitando vigorosamente. Não centrifugar.
Nota: é possível a formação de precipitados visíveis após a adição de etanol. Dissolver completamente os precipitados agitando vigorosamente e passar imediatamente para o passo 2. A dissolução insuficiente de precipitados pode causar contaminação de ADN, o que leva a uma amostra de ARN total impura.
2. Aplicar a amostra, incluindo qualquer precipitado que se possa ter formado, numa coluna RNeasy Midi colocada num tubo de centrifugação de 15 ml (fornecido). Fechar o tubo com cuidado e centrifugar durante 5 minutos a 4000 × g. Eliminar o flow-through. Nota: o volume de carga máximo é de 4 ml. Se o volume exceder os 4,0 ml, carregar alíquotas consecutivamente para a coluna RNeasy e centrifugar como acima. Eliminar o flow-through após cada passo de centrifugação.
3. Adicionar 4 ml de tampão RW1 à coluna RNeasy. Fechar cuidadosamente o tubo de centrifugação e centrifugar durante 5 minutos a 4000 × g para lavar a coluna. Eliminar o flow-through.
Nota: o flow-through contém tampão RLT ou tampão RW1 e, por isso, não é compatível com lixívia.
Voltar a utilizar o tubo de centrifugação no passo 4.
4. Adicionar 2,5 ml de tampão RPE à coluna RNeasy. Fechar cuidadosamente o tubo de centrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 4000 × g para lavar a coluna. Nota: o tampão RPE é fornecido como um concentrado. Certificar-se de que etanol é adicionado ao tampão RPE antes de utilizar.
Voltar a utilizar o tubo de centrifugação no passo 5. Não é necessário eliminar o flow-through.
5. Adicionar mais 2,5 ml de tampão RPE à coluna RNeasy. Fechar cuidadosamente o tubo de centrifugação e centrifugar durante 5 minutos a 4000 × g para secar a membrana de gel de sílica da RNeasy.
Nota: é importante secar a membrana RNeasy, uma vez que os resíduos de etanol podem interferir com as reações a jusante. A centrifugação garante que nenhum etanol é transportado durante a eluição.
Nota: após a centrifugação, remover a coluna RNeasy do tubo de centrifugação com cuidado para que a coluna não entre em contacto com o flow-through, pois isso leva a uma transferência de etanol.
6. Para eluir, transferir a coluna RNeasy para um tubo de colheita de 15 ml (fornecido). Pipetar 200 µl de água isenta de RNAse diretamente para a membrana de gel de sílica da RNeasy. Fechar cuidadosamente o tubo. Deixar repousar durante 1 minuto e, em seguida, centrifugar durante 3 minutos a 4000 × g.
Qualificação e quantificação de ARN
A qualidade do ensaio depende muito da qualidade do ARN de entrada. Antes de efetuar a análise, recomendamos a análise do ARN purificado por eletroforese em gel de agarose ou espectrofotometria.
Deve ser utilizado um branco de água isenta de nuclease de qualidade PCR para
calibrar o espectrofotómetro.
A DO de 1,0 a 260 nm é equivalente a aproximadamente 40 µg/ml de ARN de cadeia
simples.
Um rácio de DO260/DO280 entre 1,8 e 2,1 é um indicador de ARN altamente purificado.
Para executar o passo RT, a concentração necessária de ARN é de 200 ng/µl. Se a concentração de ARN no eluato for inferior a 200 ng/µl, a concentração de ARN no eluato deve ser aumentada utilizando o RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN, ref.ª 74204).
Se a concentração de ARN no eluato for superior ao limite superior, a concentração deve ser ajustada para 200 ng/µl com água isenta de RNAse.
Nota: verificar a concentração de ARN após a normalização.
Concentração de ARN
Este protocolo é otimizado para a concentração de ARN.
Notas importantes antes de iniciar o procedimento
A digestão de DNAse não é necessária uma vez que a tecnologia de membrana de
sílica do RNeasy MinElute remove grande parte do ADN de forma eficaz.
O tampão RLT contém sal de guanidina e, por isso, não é compatível com reagentes
Executar todos os passos do procedimento à temperatura ambiente (15–25 °C).
Trabalhar rapidamente durante o procedimento.
Executar todos os passos de centrifugação a 20–25 °C numa microcentrífuga padrão.
Certificar-se de que a temperatura da centrífuga não é inferior a 20 °C.
O tampão RLT pode formar um precipitado durante o armazenamento. Caso seja
necessário, dissolver mediante aquecimento e, em seguida, colocar à temperatura ambiente (15–25 °C).
O que fazer antes de iniciar o procedimento
Preparar 500 µl de etanol a 80% para cada amostra de ARN a ser concentrada. O tampão RPE é fornecido como um concentrado. Antes de utilizar pela primeira vez,
adicionar 4 volumes de etanol (96–100%), conforme indicado na garrafa, para produzir uma solução de trabalho.
Colocar as colunas à temperatura ambiente antes de iniciar o procedimento.
Medir o volume das amostras a serem tratadas e ajustar para que o volume de amostra
final seja de 200 µl.
Procedimento
1. Depois de ajustar o volume da amostra para 200 µl com água isenta de RNAse, adicionar 700 µl de tampão RLT e misturar bem.
2. Adicionar 500 µl de etanol a 96–100% ao ARN diluído e misturar bem mediante pipetagem. Não centrifugar. Passar imediatamente para o passo 3.
3. Transferir um máximo de 700 µl da amostra para uma coluna de rotação RNeasy MinElute colocada num tubo de colheita de 2 ml (fornecido). Fechar a tampa cuidadosamente e centrifugar durante 15 segundos a ≥8000 × g (≥ 10 000 rpm). Eliminar o flow-through. Transferir qualquer resto de amostra (até 700 µl) e repetir
4. Colocar a coluna de rotação RNeasy MinElute num novo tubo de colheita de 2 ml (fornecido).
5. Adicionar 500 µl de tampão RPE à coluna de rotação. Fechar a tampa cuidadosamente e centrifugar durante 15 segundos a ≥8000 × g (≥ 10 000 rpm) para lavar a
membrana da coluna de rotação. Eliminar o flow-through.
Nota: o tampão RPE é fornecido como um concentrado. Certificar-se de que etanol é adicionado ao tampão RPE antes de utilizar.
Voltar a utilizar o tubo de colheita no passo 6.
6. Adicionar 500 µl de etanol a 80% à coluna de rotação RNeasy MinElute. Fechar a tampa cuidadosamente e centrifugar durante 2 minutos a ≥ 8000 × g (≥ 10 000 rpm) para lavar a membrana da coluna de rotação. Eliminar o flow-through e o tubo de colheita.
Nota: o flow-through contém tampão RLT e, por isso, não é compatível com lixívia. Nota: após a centrifugação, remover cuidadosamente a coluna de rotação RNeasy MinElute do tubo de colheita para que a coluna não entre em contacto com o flow-through. Caso contrário, ocorrerá transferência de etanol.
7. Colocar a coluna de rotação RNeasy MinElute num novo tubo de colheita de 2 ml (fornecido).
8. Abrir a tampa da coluna de rotação e centrifugar a toda a velocidade durante 5 minutos. Eliminar o flow-through e o tubo de colheita.
Para evitar danificar as tampas das colunas de rotação, colocar as colunas de rotação numa centrífuga com, pelo menos, uma posição vazia entre as colunas. Posicionar as tampas de forma a que estejam viradas para o sentido oposto à rotação do rotor (por ex., se a rotação do rotor for realizada no sentido dos ponteiros do relógio, posicionar as tampas no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio).
É importante secar a membrana da coluna de rotação, uma vez que os resíduos de etanol podem interferir com as reações a jusante. Centrifugar as colunas de rotação com as tampas abertas garante que não ocorre transferência de etanol durante a eluição de ARN.
9. Colocar a coluna de rotação RNeasy MinElute num novo tubo de colheita de 1,5 ml (fornecido).
10. Adicionar 20 µl de água isenta de RNAse diretamente no centro da membrana da coluna de rotação. Fechar cuidadosamente a tampa e centrifugar durante 1 minuto a toda a velocidade para eluir o ARN.
11. Após a conclusão do passo de eluição, colocar as amostras em gelo.
12. Medir o volume das amostras a serem tratadas e ajustar para que a concentração final seja de 200 ng/µl.
Consultar “Qualificação e quantificação de ARN”, na página 25, para mais detalhes, caso seja necessário.
Transcrição reversa
O que fazer antes de iniciar o procedimento
Descongelar todos os componentes necessários, exceto a transcriptase reversa, que deve
ser mantida no congelador quando não estiver a ser utilizada. Colocar os tubos que contêm os componentes a serem descongelados no gelo.
Nota: não ultrapassar os 30 minutos no passo de descongelamento para evitar qualquer degradação de material.
Limpar a área da bancada dedicada à preparação da mistura de transcrição
reversa (TR) para assegurar que não há contaminação de modelos nem de nuclease.
Misturar bem, pipetando 10 vezes os tubos que contêm reagentes de transcrição
reversa, amostras de ARN, controlos positivos, calibrador IS-MMR e centrifugar brevemente antes de utilizar. Em seguida, manter em gelo.
O controlo negativo de TR é gerado durante o passo de transcrição reversa utilizando
Procedimento
1. Incubar 15 µl de cada amostra, controlos positivos (controlos de positividade elevada e baixa), água (utilizada para gerar controlos negativos de TR) e calibrador IS-MMR durante 5 minutos a 65 °C. Em seguida, arrefecer imediatamente em gelo durante, pelo menos, 5 minutos.
2. Centrifugar brevemente (aproximadamente 5 segundos) para recolher o líquido no fundo do tubo. Em seguida, manter em gelo.
3. Preparar a seguinte mistura de TR em função do número de amostras, controlos e calibradores a processar.
Tabela 1. Preparação da mistura de TR
Componente Volume por amostra
(µl) 12 + 1 reações (µl) Mistura de TR: Concentração final
Mistura de TR, 3,33× 7,5 97,5 1×
Transcriptase reversa, 10× 2,5 32,5 1×
Volume final da mistura de TR (a ser adicionada
no passo 4) 10 130 –
Amostra, controlos positivos, calibrador IS-MMR ou água
(do passo 1) 15 15 cada –
Volume total 25 25 cada –
Nota: o volume final por reação tem de ser de 25 µl.
4. Pipetar 10 µl de mistura de TR para cada tubo etiquetado contendo amostra de ARN, controlos positivos, água ou calibrador (do passo 3).
5. Misturar bem, pipetando 10 vezes e centrifugar brevemente (aproximadamente 5 segundos) para recolher o líquido no fundo do tubo.
Nota: voltar a colocar os reagentes de transcrição reversa no Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR no congelador depois de preparar as reações para evitar qualquer degradação do material.
6. Colocar os tubos no termociclador e preparar o programa de transcrição reversa (Tabela 2).
Tabela 2. Perfil de temperatura
Passo Parâmetros
Transcrição reversa 1 Temperatura: 25 °C Tempo: 10 min Transcrição reversa 2 Temperatura: 46 °C
Tempo: 45 min Inativação Temperatura: 85 °C Tempo: 5 min Arrefecimento Temperatura: 4 °C Tempo: 5 min
7. Assim que o programa tiver terminado, centrifugar os tubos brevemente
(aproximadamente 5 segundos) para recolher o líquido no fundo do tubo. Manter os tubos em gelo ou a uma temperatura de –20 °C até à execução do ensaio qPCR.
qPCR no equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM com rotor de
72 tubos
Recomendamos a execução de todas as medições em duplicado, conforme indicado na Tabela 3. O kit permite testar oito amostras de ADNc no mesmo ensaio em duplicado. Podem ser realizados três ensaios com o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR.
Tabela 3. Número de reações para o equipamento Rotor-Gene Q com rotor de 72 tubos
Amostra Reações
Com a mistura ABL1 qPCR (34 reações)
8 amostras de ADNc 8 × 2 reações 1 controlo de alta positividade de ADNc 2 reações 1 controlo de baixa positividade de ADNc 2 reações 1 calibrador IS-MMR de ADNc 2 reações Padrões de plasmídeo simples 4 x 2 reações
(SP3, SP4, SP5 e SP6) Controlo negativo de TR 2 reações
Controlo de água 2 reações
Com a mistura Mbcr qPCR (34 reações)
8 amostras de ADNc 8 × 2 reações 1 controlo de alta positividade de ADNc 2 reações 1 controlo de baixa positividade de ADNc 2 reações 1 calibrador IS-MMR de ADNc 2 reações
Padrões de plasmídeo simples 5 x 2 reações (SP1, SP2, SP3, SP5 e SP6)
Controlo de água 2 reações
Processamento de amostras em equipamentos Rotor-Gene Q MDx
5plex HRM com rotor de 72 tubos
Recomendamos o teste de, pelo menos, oito amostras de ADNc no mesmo ensaio, para otimizar a utilização de misturas de padrões, primers e sondas. O esquema do rotor na Figura 3 apresenta um exemplo de ensaio.
Figura 3. Preparação do rotor para cada ensaio. SP1–SP6: padrões BCR-ABL1 Mbcr e ABL1; RTneg: controlo negativo de TR; IS-MMR: calibrador de escala internacional; HC: controlo de alta positividade; LC: controlo de baixa positividade; H2O: controlo de água; S1–S8: amostras ADNc. Nota: preencher todas as posições vazias com tubos vazios. Os números representam as posições no bloco de carregamento e indicam a posição final no rotor.
Mistura Mbcr qPCR Polimerase de ADN de Taq Mistura ABL1 qPCR Polimerase de ADN de Taq
Deteção Bcr-ABL1 Mbcr Deteção ABL1
O que fazer antes de iniciar o procedimento
Descongelar todos os componentes necessários exceto a polimerase de ADN de Taq,
que deve ser mantida no congelador quando não estiver a ser utilizada. Colocar os tubos que contêm os componentes a serem descongelados no gelo.
Nota: não ultrapassar os 30 minutos no passo de descongelamento para evitar qualquer degradação de material.
Limpar a área da bancada dedicada à preparação da mistura de PCR para assegurar
que não há contaminação de modelos nem de nuclease.
Misturar bem, pipetando 10 vezes os tubos que contêm a mistura ABL1 qPCR e a mistura
Mbcr qPCR e centrifugar brevemente antes de utilizar. Em seguida, manter em gelo.
Procedimento
1. Preparar a mistura principal PCR de acordo com o número de amostras a processar. A Tabela 4 descreve o esquema de pipetagem para a preparação de uma mistura de reagentes, calculada para alcançar um volume de reação de final de 25 µl. É preparada uma pré-mistura em função do número de reações, utilizando a mesma mistura de primers e sondas (mistura ABL1 qPCR ou mistura Mbcr qPCR). São incluídos volumes extra para compensar erros de pipetagem.
Tabela 4. Preparação da mistura principal PCR
Componente 1 reação (µl)
Pré-mistura ABL1 ou Mbcr:
34 + +2 reações (µl) Concentração final Mistura qPCR (ou mistura
ABL1 qPCR ou mistura Mbcr
qPCR) 19,75 711 1×
Polimerase de ADN de Taq 0,25 9 1×
Amostra, padrão, controlo ou calibrador IS-MMR (a ser adicionado no passo 3)
5 5 cada –
Volume total 25 25 cada –
2. Dispensar 20 µl de pré-mistura qPCR em cada tubo de 0,1 ml do Rotor-Gene Q. 3. Adicionar 5 µl de produto de TR (ADNc) obtido nas transcrições reversas (consulte
“Transcrição reversa”, na página 28), padrões, controlos ou calibrador IS-MMR em função da disposição das amostras, conforme apresentado na Figura 3 (volume total de 25 µl). 4. Misturar cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo.
5. Colocar os tubos no adaptador fornecido com o equipamento.
Nota: as posições não utilizadas têm de ser preenchidas com tubos vazios. 6. Colocar o anel de aperto por cima dos tubos e pressione para bloquear. 7. Carregar o adaptador completo no equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. 8. Programar o equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM com o programa de ciclagem
térmica, conforme indicado na Tabela 5.
Nota: voltar a colocar todos os componentes do Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR no congelador, para evitar qualquer degradação de materiais.
Tabela 5. Perfil de temperatura
Passo Parâmetros
Modo de análise Quantificação Em espera 1 Temperatura: 95 °C
Tempo: 15 min Ciclagem 50 ciclos
94 °C; 15 s
60 °C; 60 s com aquisição de fluorescência FAM no canal verde.
9. Clicar em “Gain Optimisation” (Otimização de aquisição de dados) na caixa de diálogo “New Run Wizard” (Assistente de nova execução) para abrir a caixa de diálogo “Auto-Gain Optimisation Setup” (Configuração de otimização de auto-aquisição). Verificar o intervalo do canal verde de “5 Fl” para “Min Reading” (Leitura mín.) para “10 Fl” para “Max Reading” (Leitura máx.) e o intervalo de aquisição aceitável de –10 para 10.
10. Verificar se a “Perform Optimisation Before 1st Acquisition” (Efetuar otimização antes da 1.ª aquisição) está assinalada e fechar a caixa de diálogo “Auto-Gain Optimisation Setup”.
11. Iniciar o programa de ciclagem térmica.
12. Criar subconjuntos ABL1 e Mbcr, preenchendo a janela “Edit samples” (Editar amostras). 13. Assim que a ciclagem térmica tiver terminado, selecione “Options” (Opções) e “Crop
Start Cycles” (Eliminar ciclos de início). Remover os dados antes do ciclo 10. Em seguida, selecionar “Analysis” (Análise) e “Cycling A. Green from 10” (Ciclagem A. Verde de 10), indicado no relatório como “left threshold = 10.00” (Limiar
esquerdo = 10,00).
14. Proceder da seguinte forma, tanto para ABL1 como para Mbcr:
Se a janela “Calculate Automatic Threshold” (Calcular limiar automático) abrir,
selecionar “Cancel” (Cancelar).
Selecionar “Dynamic Tube” (Tubo dinâmico) como método de normalização no
relatório e “Slope Correct” (Declive correto) para corrigir o declive do ruído.
Verificar se “Outlier Removal” (Remoção do outlier) está definido para 0%
(correspondendo ao limiar NTC) e “Reaction Efficiency Threshold” (Limiar da eficiência da reação) está desativado.
Definir o gráfico para escala linear e “Auto-Scale” (Escala automática). Clicar com o botão direito do rato na janela que apresenta as curvas de
amplificação e verificar se “Digital filter” (Filtro digital) está definido para “Light” (Luz).
Selecionar a opção “named on” (denominado em) (à direita da janela), para se
certificar de que todas as amostras são apresentadas.
Assim que todos os passos estiverem concluídos, certificar-se de que todos os dados
não processados foram guardados e avançar para a análise de resultados conforme descrito abaixo.
Resultados
Princípio de análise dos dados
Na tecnologia TaqMan®, o número de ciclos de PCR necessários para detetar um sinal acima
do limiar é designado limiar de ciclo (CT) e é diretamente proporcional à quantidade de alvo
presente no início da reação.
Utilizando padrões com um número conhecido de moléculas, é possível estabelecer uma curva-padrão e determinar a quantidade precisa de alvo presente na amostra de teste. As curvas padrão são baseadas em plasmídeo. Para garantir curvas padrão exatas, são utilizadas quatro diluições padrão para ABL1 e cinco diluições padrão para Mbcr. O kit também inclui um calibrador IS que permite a conversão de resultados para a escala internacional. A Figura 4 e a Figura 5 apresentam exemplos de curvas de amplificação TaqMan semelhantes às obtidas para padrões, calibrador IS-MMR, controlo ARN de alta positividade e controlo ARN de baixa positividade com o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR. Fluor. norm. Controlo de baixa positividade Calibrador IS-MMR Controlo de alta positividade Ciclo
Figura 5. Deteção de BCR-ABL1 Mbcr com controlos e padrões SP1, SP2, SP3, SP5 e SP6. 101, 102, 103, 105 e 106 cópias/reação.
Curvas padrão e critérios de qualidade aplicáveis a dados não
processados
Reprodutibilidade entre duplicados
A variação em valores de CT entre duplicados deve ser ≤ 2 ou o duplicado deve ser
invalidado, exceto nos seguintes casos:
se a média de CT ≥ 36 ou CTa ≥ 36 e CTb for “não detetada”, os critérios ∆CT não se aplicam;
o duplicado está em conformidade. Se for este o caso, o número de cópias (CN) calculado para CTa deve ser dividido por 2.
Nota: os utilizadores devem medir a reprodutibilidade no seu laboratório. Fluor. norm.
Controlo de baixa positividade Calibrador IS-MMR
Controlo de alta positividade
Curvas padrão
Os dados não processados podem ser copiados para um ficheiro Excel® para análise.
Para cada gene (ABL1 e BCR-ABL1 Mbcr), os valores CT obtidos de diluições padrão de
plasmídeo são representados de acordo com o número de cópias log (3, 4, 5 e 6 para SP3, SP4, SP5 e SP6; 1, 2, 3, 5, e 6 e SP1, SP2, SP3, SP5 e SP6). A Figura 6 apresenta um exemplo de uma curva ABL1 calculada em quatro diluições padrão. A Figura 7 apresenta um exemplo de uma curva BCR-ABL1 calculada em cinco diluições padrão.
Figura 6. Curva padrão para ABL1 calculada a partir de quatro diluições padrão. É calculada uma curva de regressão linear (y = ax + b), na qual “a” é o declive da linha e “b” é a intersecção y, que é a coordenada y do ponto onde a linha atravessa o eixo y. A equação e o coeficiente de determinação (R²) são apresentados no gráfico.
Figura 7. Curva padrão para BCR-ABL1 Mbcr calculada a partir de cinco diluições padrão. É calculada uma curva de regressão linear (y = ax + b), na qual “a” é o declive da linha e “b” é a intersecção y, que é a coordenada y do ponto onde a linha atravessa o eixo y. A equação e o coeficiente de determinação (R²) são apresentados no gráfico.
Como os padrões são diluições multiplicadas por dez, o declive teórico da curva é –3,3. Um declive entre –3,1 e –3,6 é aceitável desde que R² seja > 0,95. Contudo, é desejável um valor para R² > 0,98 para resultados precisos.
Nota: a diluição padrão SP1 (plasmídeo BCR-ABL1, 10 cópias) tem de ser detetada para estabelecer a curva padrão BCR-ABL Mbcr.
Número de cópias (CN)
A equação da curva padrão ABL1 ou BCR-ABL1 Mbcr deve ser utilizada para transformar valores CT não processados (obtidos com a mistura ABL1 qPCR ou a mistura Mbcr qPCR para
as amostras desconhecidas) em números de cópias ABL1 ou BCR-ABL1 (ABL1CN ou BCR-ABL1
Log10 amostra
ABL1CNCN =
CT médio para ABL – Intersecção da curva padrão de ABL1
Declive da curva padrão ABL
Log10 amostra
BCR-ABL1 MbcrCN
=
CT médio para BCR-ABL1 Mbcr – Intersecção da curva padrão de
BCR-ABL1 Mbcr
Declive da curva padrão BCR-ABL1 Mbcr
Controlo de qualidade em todos os valores ABL1CN
Uma má qualidade do ARN ou problemas durante o RT-qPCR pode resultar em números de cópias de ABL1 baixos.
Para alcançar a sensibilidade ideal do teste, o ABL1CN deve ser igual ou superior a 100 000
para o controlo ARN de alta positividade, controlo ARN de baixa positividade e calibrador IS-MMR.
Controlos de TR negativa e controlos de água
O controlo sem modelo (no template control, NTC) para o passo PCR (controlo de água) e para o passo de transcrição reversa (controlo de TR negativo) deve ser um CN igual a zero tanto para ABL1 como para BCR-ABL1 Mbcr. Consequentemente, não deve ser obtido qualquer valor CT ou o valor CT é superior à intersecção de curvas padrão, respetivamente.
Um resultado positivo para estes NTC indica contaminação cruzada durante a transcrição reversa e/ou qPCR.
Número de cópias normalizado (NCN)
O rácio destes valores de CN fornece o número de cópias normalizado (NCN):
NCN =
BCR-ABL1 MbcrCN
× 100 ABL1CN
Calcular o resultado NCN para o controlo ARN de alta positividade (NCNHC), o controlo
ARN de baixa positividade (NCNLC), o calibrador IS MMR (NCNcal) e cada amostra
(NCNamostra).
Controlo de qualidade nos valores de número de cópias normalizados
O controlo ARN de alta positividade, controlo ARN de baixa positividade e o calibrador IS-MMR permitem a monitorização dos passos de transcrição reversa e amplificação de ABL1 e BCR-ABL1 Mbcr durante a quantificação de transcrição.
O resultado NCN obtido para o calibrador IS-MMR, testado com o Kit ipsogen
BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR tem de se encontrar no intervalo 0,05–0,3 pois, caso contrário, os valores NCN não podem ser convertidos para a escala internacional.
A sensibilidade do ensaio só pode ser avaliada se o controlo ARN de baixa
positividade for detetado.
Conversão para escala internacional
Nota: antes da interpretação, consultar o valor indicado na etiqueta do tubo do calibrador IS-MMR ou no certificado de análise fornecido com o kit. (Verificar se é indicado o mesmo
Utilizar o resultado NCN (NCN cal) do calibrador IS-MMR experimental e o respetivo valor atribuído (valor IS-Cal), indicado no certificado da análise, para calcular o número de cópias normalizado na escala internacional (IS-NCNamostra).
IS-NCNamostra =
NCNamostra × valor IS-Cal
NCNcal
Controlo de qualidade dos valores IS-NCN
O resultado IS-NCNHC (NCN na escala internacional para o controlo ARN de alta
positividade) não deve fornecer resposta molecular major (“No MMR” (Sem MMR), consulte “Registo de resposta molecular”).
O resultado IS-NCNLC (NCN na escala internacional para o controlo ARN de baixa
positividade) deve ser < 0,01 (MR4) para garantir que o estado MR4.5 pode ser estabelecido com confiança.
Registo de resposta molecular
Determinar o estado da resposta molecular de cada amostra de acordo com a interpretação na Tabela 6.
Resumo dos critérios de qualidade
Tabela 6. Registo de resposta molecular
Caso ABL CN BCR-ABL1 Mbcr CN IS-NCN% Estado
1 < 10 000 < 10 – Amostra de má qualidade 2 < 10 000 ≥ 10 > 0,1 Sem MMR ≥ 10 ≤ 0,1 Inconclusivo 3 10 000 ≤ CNABL < 32 000 ≥ LOD > 0,1 Sem MMR ≤ 0,1 MMR LOB < CN < LOD Substituir CN por LOD
> 0,1 Sem MMR
≤ 0,1 MMR
≤ LOB – Não detetado/MR4
4 32 000 ≤ CNABL < 100 000 ≥ LOD > 0,1 Sem MMR 0,01 < IS ≤ 0,1 MMR ≤ 0,01 MR4 LOB < CN < LOD Substituir CN por LOD
> 0,1 Sem MMR 0,01 < IS ≤ 0,1 MMR
≤ 0,01 MR4
≤ LOB – Não detetado/MR4.5
5 > 0,1 Sem MMR 100 000 ≤ CNABL ≥ LOD 0,01 < IS ≤ 0,1 MMR 0,0032 < IS ≤ 0,01 MR4 ≤ 0,0032 MR4.5 LOB < CN < LOD Substituir CN por LOD
> 0,1 Sem MMR 0,01 < IS ≤ 0,1 MMR 0,0032 < IS ≤ 0,01 MR4
≤ 0,0032 MR4.5
≤ LOB – Não detetado/MR5
Tabela 7. Resumo dos critérios de qualidade
Critérios Valores/resultados aceitáveis Variações em valores CT
entre duplicados
≤ 2 CT
Exceto se a média de CT ≥ 36 ou CTa ≥ 36 e CTb for “não detetada”: o duplicado está em conformidade. O CN calculado para CTa deve ser divido por 2. Declive para curvas padrão Entre –3,1 e –3,6
R2 para curvas-padrão Pelo menos > 0,95 (e idealmente > 0,98) Diluição padrão SP1
(BCR-ABL1 10 cópias de
plasmídeo) Tem de ser detetado para estabelecer a curva padrão Controlo de qualidade no
valor ABLCN para amostras
biológicas Consulte a Tabela 6 Controlo ARN de alta
positividade, Controlo ARN de baixa positividade e o calibrador IS-MMR ABL1CN ≥ 100 000 Controlos RTneg e NTC (água)
Para cada ABL1CN = 0 e MbcrCN = 0
(sem valor CT ou CT > intersecção de curva padrão) NCN obtido para calibrador
IS-MMR (NCNcal) Tem de ficar dentro do intervalo 0,05–0,3 Controlo ARN de alta
positividade Tem de ser detetado Controlo ARN de baixa
positividade Tem de ser detetado
IS-NCNHC Estado: sem resposta molecular major IS-NCNLC
IS-NCNLC ≤ 0,01 (MR4)
Tem de ser detetada para garantir que o estado MR4.5 pode ser estabelecido com confiança.
CT: ciclo do limiar; HC: controlo de alta positividade; IS: padrão internacional; LC: controlo baixo; MR: resposta molecular; MMR: resposta molecular major; NCN: número de cópias normalizado; NTC: controlo sem modelo; RTneg: transcrição reversa negativa.
Guia de resolução de problemas
Este guia de resolução de problemas pode ser útil para resolver qualquer problema que possa surgir. Para obter mais informações, consulte também a página de perguntas frequentes no nosso Centro de Suporte Técnico: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Os cientistas da Assistência Técnica da QIAGEN estão sempre prontos a responder a qualquer questão que possa surgir sobre as informações e protocolos constantes deste manual ou sobre as tecnologias de amostragem e ensaio (para informações de contacto, consultar o verso do manual ou visitar www.qiagen.com).
Comentários e sugestões Isolamento de ARN
Para resolução de problemas de purificação de ARN a partir do sangue total utilizando o Kit RNeasy Midi e tampão LE, consulte os manuais dos kits relevantes.
ARN insuficiente no eluato Utilizado sangue
insuficiente Repetir isolamento do ARN utilizando mais amostras. Considerar fazer o pool de ambos os eluatos e concentrar ARN utilizando o RNeasy MinElute Cleanup Kit (ref.ª 74204).
ARN insuficiente no eluato A concentração de ARN tem de ser de 200 ng/µl para uma sensibilidade ideal
Utilizar o RNeasy MinElute Cleanup Kit (ref.ª 74204) para concentrar a amostra e, em seguida, ajustar a concentração para 200 ng/µl. Padrão, controlo ou IS-Cal não detetado
a) Erros de pipetagem ou omissão de reagentes; inversões de tubo ou poço
Verificar o esquema de pipetagem e a preparação da reação. Repetir a execução de PCR.
b) Armazenamento inapropriado dos componentes do kit
Armazenar o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR entre os –30 °C e os –15 °C e proteger a mistura ABL1 qPCR e a mistura Mbcr qPCR da luz.
Comentários e sugestões Sem sinal, incluindo sem sinal para controlos
a) Nenhum tubo de reação na posição 1 do equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM
Ter o cuidado de colocar sempre uma amostra na posição 1 do rotor. Caso contrário, o equipamento não realizará a calibragem e serão adquiridos dados de fluorescência incorretos.
b) Erros de pipetagem ou omissão de reagentes; inversões de tubo ou poço
Verificar o esquema de pipetagem e preparação da reação. Repetir a execução de PCR.
c) Armazenamento inapropriado dos componentes do kit
Armazenar o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR entre os –30 °C e os –15 °C e proteger as misturas de primers e sondas da luz.
Não exceder um máximo de três ciclos de congelamento/descongelamento. d) O Kit ipsogen BCR-ABL1
Mbcr RGQ RT-PCR expirou Verificar as condições de armazenamento e o prazo de validade dos reagentes (consultar a etiqueta) e, se necessário, utilizar um novo kit. e) Selecionado canal de
deteção incorreto Definir o canal de deteção para Cycling Green ou 470 nm/510 nm. f) Sem programa de
aquisição de dados Verificar o programa de ciclagem. Consultar “Tabela 5”, na página 35. Selecionar o modo de aquisição “Single” (simples) no final de cada segmento de hibridação do programa PCR.
A intensidade da fluorescência varia Erros de pipetagem ou omissão de reagentes; inversões de tubo ou poço
Verificar o esquema de pipetagem e preparação da reação. Repetir a execução de PCR.
Intensidade da fluorescência demasiado baixa a) Armazenamento
inapropriado dos componentes do kit
Armazenar o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR entre os –30 °C e os –15 °C e proteger a mistura ABL1 qPCR e a mistura Mbcr qPCR da luz. Não exceder um máximo de três ciclos de congelamento/descongelamento. b) O Kit ipsogen BCR-ABL1
Mbcr RGQ RT-PCR expirou Verificar as condições de armazenamento e o prazo de validade dos reagentes (consultar a etiqueta) e, se necessário, utilizar um novo kit. c) Quantidade muito reduzida
Comentários e sugestões O controlo negativo (H2O) apresenta um resultado positivo
Contaminação cruzada, contaminação de reagente, erro do equipamento, inversão do poço ou capilar ou degradação da sonda
Substituir todos os reagentes críticos ou utilizar um novo kit.
Manusear sempre as amostras, componentes do kit e consumíveis de acordo com as práticas normalmente aceites para evitar a contaminação cruzada. Proteger as misturas ABL1 qPCR e Mbcr qPCR da luz.
Verificar a existência de leituras de falsos positivos nas curvas de fluorescência. Verificar a preparação da reação.
Controlo de qualidade
O controlo de qualidade do kit completo foi efetuado num equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. Este kit é fabricado de acordo com a norma ISO 13485. Os certificados de análise estão disponíveis quando solicitado através de www.qiagen.com/support/.
Limitações
O kit destina-se à utilização profissional.
O produto deve ser utilizado apenas por pessoal com formação especial, especializado em técnicas de biologia molecular e familiarizado com esta tecnologia.
Este kit deve ser utilizado seguindo as instruções constantes deste manual, em combinação com um equipamento validado indicado em “Materiais necessários, mas não fornecidos”, na página 13.
Todos os reagentes fornecidos no kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR devem ser utilizados apenas com os outros reagentes fornecidos no mesmo kit. A utilização de outros reagentes ou reagentes de outros lotes pode afetar o desempenho.
O Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR é válido apenas para sangue total anticoagulado em potássio EDTA (K2EDTA) colhido em pacientes diagnosticados com LMC com cromossoma Filadélfia (Ph+) p210 positivo em fase crónica.
O desempenho do Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR foi estabelecido utilizando o RNeasy Midi Kit (ref.ª 75144), o Buffer EL (ref.ª 79217) e o RNeasy MinElute Cleanup Kit (ref.ª 74204) para o passo opcional de limpeza e concentração.
Apenas o equipamento Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM foi validado para PCR com este kit.
Qualquer outra utilização não indicada deste produto e/ou modificação dos componentes anulará qualquer responsabilidade da QIAGEN.
Todos os resultados de diagnóstico gerados têm de ser interpretados em conjunto com outros resultados clínicos ou laboratoriais.
O utilizador é responsável por validar o desempenho do sistema para quaisquer procedimentos utilizados no seu laboratório que não estejam cobertos pelos estudos de desempenho da QIAGEN.
Características de desempenho
Limite do branco
O limite do branco (Limit of blank, LOB) foi determinado seguindo a norma CLSI/NCCLS EP17-2A relativa a amostras de sangue total saudável, (sete amostras, 12 medições/dois lotes).
Determinou-se que o LOB era igual a 1,02 cópias de transcrição de BCR-ABL1 Mbcr.
Limite de deteção
O limite de deteção (limit of detection, LOD, ou sensibilidade analítica) foi determinado com base na “abordagem clássica” descrita na norma CLSI/NCCLS EP17-2A. Neste estudo foram analisadas amostras positivas baixas conhecidas (sete amostras, 12 medições/dois lotes).
Determinou-se que o LOD era igual a 3,21 cópias de transcrição BCR-ABL1 Mbcr ou 0,0030% IS-NCN.
Linearidade
A linearidade foi determinada seguindo a norma CLSI/NCCLS EP6-A com um lote do Kit
ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR em nove amostras diferentes preparadas por diluições
consecutivas de ARN positivo extraído de linha celular misturado em ARN negativo extraído de dadores saudáveis. A determinação foi efetuada para três entradas de ARN diferentes.
A quantificação da transcrição do BCR-ABL1 Mbcr é linear a partir do valor de LOD para IS-NCN de 56%, desde que a concentração de ARN da amostra quantificada seja aproximadamente 200 ng/µl, a entrada recomendada para o ensaio (entrada total de 3 µg).
Com uma entrada de ARN mais baixa, o intervalo de linearidade pode ser reduzido.
Repetibilidade e reprodutibilidade
O estudo de precisão foi efetuado de acordo com a norma CLSI/NCCLS EP5-A2. Os testes foram efetuados em nove amostras diferentes, testadas 45 vezes em duplicados em
Tabela 8. Resultados de precisão
Amostra
Média de IS-NCN de BCR-ABL1 Mbcr
SDR+ SDRUN++ SDTOTAL+++ CVTOTAL
S1 64,5243 4,3105 12,3610 13,0910 20,29% S2 36,1684 1,7104 5,9078 6,8581 18,96% S3 6,4876 0,4231 0,7857 1,0941 16,86% S4 0,7305 0,0512 0,0779 0,1178 16,12% S5 0,0754 0,0068 0,0073 0,0133 17,62% S6 0,0075 0,0016 0,0009 0,0022 28,81% S7 0,0036 0,0014 0,0002 0,0014 38,64% S8 0,0020 0,0010 0,0000 0,0010 48,71% S9 0,0011 0,0007 0,0000 0,0007 63,32%
CVTOTAL: coeficiente de variação para a precisão total (BCR-ABL1 Mbcr IS-NCN); SD: desvio padrão; R+: repetibilidade; RUN++: reprodutibilidade entre execuções; S: padrão; TOTAL+++: precisão total (incluindo interequipamento, interoperador e interlote).
Substâncias interferentes
A estrutura do estudo foi baseada em recomendações descritas na norma de NCCLS EP7-A2 “Interference Testing in clinical Chemistry” (Testes de interferência em química clínica). As seguintes substâncias potencialmente presentes nas amostras de sangue ou que podem ser introduzidas durante a purificação do ARN foram escolhidas pelo seu efeito potencial na PCR (bilirrubina não conjugada, bilirrubina conjugada, hemoglobina [humana], albumina sérica [humana], excesso de potássio EDTA [K2-EDTA], etanol).
Os resultados obtidos não mostraram efeitos interferentes para estas substâncias.
Validação clínica e comparação de métodos
Foram realizados dois estudos para comparar o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR com métodos alternativos.
Estudo 1: 76 amostras de ARN extraídas de sangue periférico foram analisadas com o Kit
ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR e com o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX.
A regressão de Deming comparou os IS-NCN medidos em ambos os métodos. Existiu uma correlação forte entre o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR e o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX (R2 = 0,97), conforme apresentado na Figura 8.
Figura 8. Gráfico de IS-NCN obtido com o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR e o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX.
Estudo 2: 39 amostras de ARN extraídas do sangue periférico de pacientes previamente Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr IS-MMR DX
Ki t ips og en BCR -A BL 1 M bc r RG Q RT -P CR
em laboratório (método de referência). O método de referência pode produzir resultados padronizados em relação à escala internacional utilizando um fator de conversão.
A seguinte tabela de contingência foi criada para comparar o estado clínico estabelecido com ambos os métodos. Existiu uma forte concordância entre o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR e o método de referência (concordância geral = 97,4%), conforme apresentado na Figura 9. Método de referência Ki t i pso gen B CR -A BL 1 Mb cr RG Q RT -P CR sem MR 4 MR 4 ou inferior n sem MR 4 15 1 16 MR 4 ou inferior 0 23 23 n 15 24 39
Figura 9. Tabela de contingência comparando o Kit ipsogen BCR-ABL1 Mbcr RGQ RT-PCR e um teste desenvolvido em laboratório padronizado em relação à escala internacional.
