EnVision™ DuoFLEX Doublestain System,
(Link)
Referência SK110
Edição 06/15
Índice
Página Finalidade ... 3 Resumo e explicação ... 3 Reagentes ... 4 Precauções ... 6 Conservação ... 8Preparação dos reagentes... 8
Colheita e preparação da amostra... 9
Procedimento ... 9
Controlo de qualidade... 12
Interpretação dos resultados ... 12
Finalidade
Para utilização em diagnóstico in vitro.
O Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System é indicado para utilização em imuno-histoquímica em conjunto com os instrumentos Dako Autostainer Link. O sistema destina-se à detecção simultânea de vários antigénios diferentes com uma amostra. O sistema detecta os anticorpos primários de ratinho e coelho e a reacção é visualizada através da utilização dos cromogénios EnVision™ DuoFLEX DAB+ e EnVision™ DuoFLEX Permanent Red. Os reagentes EnVision™ DuoFLEX destinam-se a ser utilizados em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina.
Resumo e explicação
O Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain System foi concebido para uma coloração ideal em instrumentos Dako Autostainer Link, aquando da utilização do protocolo recomendado neste folheto informativo. Este sistema é útil para a detecção simultânea de vários antigénios presentes em concentrações baixas ou elevadas numa única amostra. A visualização baseia-se em peroxidase (HRP) utilizando DAB+ como cromogénio e fosfatase alcalina (AP) e utilizando Permanent Red como cromogénio. O sistema não contém biotina, reduzindo assim, significativamente, a coloração não específica resultante da actividade endógena da avidina-biotina.
O procedimento consiste numa coloração dupla simultânea, na qual são visualizados dois antigénios utilizando HRP/DAB+ e AP/Permanent Red, respectivamente. O EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block inibe a actividade da fosfatase alcalina endógena, da peroxidase e da pseudoperoxidase presentes em alguns tecidos. Após o bloqueio das enzimas endógenas, a primeira etapa corresponde à incubação da amostra com um cocktail de anticorpos primários de ratinho e coelho diluído de forma ideal, seguida pela incubação com reagente EnVision™ DuoFLEX /HRP e, posteriormente, com EnVision™ DuoFLEX/AP. A reacção é visualizada através da utilização de EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen para o anticorpo de ratinho e de EnVision™ DuoFLEX Permanent Red para o anticorpo do coelho.
Todos os reagentes especificados, à excepção dos anticorpos primários, são fornecidos com o kit. Recomendamos a utilização do cocktail de anticorpos prontos a utilizar Dako DuoFLEX ou de anticorpos primários concentrados da Dako. O EnVision™ FLEX Antibody Diluent (K8006) é recomendado para a diluição dos anticorpos concentrados da Dako.
NOTA: Os reagentes neste kit destinam-se a operar como um sistema e devem ser utilizados conforme descrito na secção Procedimento. Em particular, todos os reagentes, antes da aplicação das soluções de cromogénio, devem ser utilizados conforme instruído, mesmo que seja necessário aplicar apenas um cromogénio. O incumprimento do protocolo especificado pode resultar em resultados da coloração inapropriados, incluindo a possibilidade de coloração não observável.
Reagentes
A: Materiais fornecidos com a Referência SK110
1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block Ready-to-Use
Solução de bloqueio enzimático endógeno pH 2, com peróxido de hidrogénio a 1-<5%, detergentes, inibidores enzimáticos e
conservante.
1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/HRP Ready-to-Use
Peroxidase de rábano e imunoglobulinas isoladas por afinidade na forma de polímero dextrano conjugado. Fornecido em tampão Tris/HCl, com proteína estabilizadora e conservante.
1 x 30 mL EnVision™ DuoFLEX/AP Ready-to-Use
Fosfatase alcalina e imunoglobulinas isoladas por afinidade na forma de polímero dextrano conjugado. Fornecido em tampão, com proteína estabilizadora e um conservante.
2 x 36 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer
Solução tampão de substrato, pH 7,5, com peróxido de hidrogénio a <0,1%, estabilizadores, intensificadores e um agente antimicrobiano. 1 x 2,16 mL EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen
Solução de cromogénio 3,3’-diaminobenzidina tetrahidrocloreto. 2 x 36 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Substrate Buffer
1 x 0,72 mL EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen
Solução de Permanent Red Chromogen.
3 x 30 mL EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
Concentrado 50x
Tampão Tris/EDTA, pH 9
1 x 1 L EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x)
Concentrado 20x
Solução salina com tampão Tris com Tween 20, pH 7,6 (±0,1). 3 x 12 mL Frasco de reagente enchido pelo utilizador, capacidade
para 12 mL
Os frascos devem ser utilizados para proceder à mistura e para conter a Solução de trabalho de DAB+ e a Solução de trabalho Permanent Red (consultar igualmente a secção Preparação dos reagentes).
B. Materiais necessários, mas não fornecidos
Instrumento Autostainer Link Dako PT Link
Dako Proteinase K, Ready-to-Use (se necessário)
Cocktail de anticorpos prontos a utilizar Dako DuoFLEX ou anticorpos de coelho ou ratinho concentrados e diluídos de forma adequada da Dako
Utensílios de instrumentação Dako Lâminas de microscópio
Reagentes laboratoriais gerais para desparafinização das secções de tecido impregnadas em parafina.
Meio de montagem (base aquosa ou de solvente orgânico) e lamelas
C. Reagentes opcionais
K8004 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) 3 x 30 mL, concentrado 50x
K8005 EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) 3 x 30 mL, concentrado 50x
Tampão citrato, pH 6,1
K8006 EnVision™ FLEX Antibody Diluent 120 mL, pronto a utilizar
Tampão Tris, pH 7,2, contendo 15 mmol/L de NaN3, e proteína.
K8007 EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) 1 x 1 L, concentrado 20x
Solução salina com tampão Tris com Tween 20, pH 7,6 (±0,1) K8008 EnVision™ FLEX Hematoxylin
Precauções
1. Para utilizadores profissionais.
2. O EnVision™ DuoFLEX/HRP e o DuoFLEX/AP contêm materiais de origem animal. Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados.
3. Não expor o EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen ou o EnVision™ DuoFLEX Permanent Red Chromogen, a solução de trabalho preparada com DAB+ ou a solução de trabalho preparada com Permanent Red a luz intensa.
4. O EnVision™ DuoFLEX Endogenous Enzyme Block contém < 0,1% de 3(2H)-isotiazolona, 5-cloro-2-metil, mistura com 2-metil-3(2H)-isotiazolona, e está rotulado como:
Perigo
H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. H317 Pode provocar uma reacção alérgica cutânea.
P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção.
P261 Evitar respirar os vapores.
P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento.
P272 A roupa de trabalho contaminada não pode sair do local de trabalho. P304 + P340 +
P310
EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a vítima para uma zona ao ar livre e mantê-la em repouso numa posição que não dificulte a respiração. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO
ANTIVENENOS ou um médico. P301 + P310 +
P330 + P331
EM CASO DE INGESTÃO: Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. Enxaguar a boca. NÃO provocar o vómito.
P303 + P361 + P353 + P363 + P310
SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO
ANTIVENENOS ou um médico.
P302 + P352 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: lavar abundantemente com água/…
P333 + P313 Em caso de irritação ou erupção cutânea: consulte um médico. P305 + P351 +
P338 + P310
SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar
cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico.
P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional.
5. O EnVision™ DuoFLEX DAB+ Chromogen contém 1–5% de bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetra-amónio tetracloreto e está rotulado como:
Perigo
H350 Pode provocar cancro.
H341 Suspeito de provocar anomalias genéticas. P201 Pedir instruções específicas antes da utilização.
P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas as precauções de segurança.
P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção.
P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte um médico.
P405 Armazenar em local fechado à chave.
P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional.
6. Atenção. Este produto contém uma substância que ainda não foi totalmente testada. A ficha de dados de segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais mediante pedido.
7. A EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) contém 5-10% de trometamol, 1-5% de nonilfenol, etoxilado, e 1-5% de ácido (etilenodinitrilo)tetracético, de sal dissódico, di-hidratado. A EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) está rotulada como:
Atenção
H319 Provoca irritação ocular grave.
H411 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P280 Provoca irritação ocular grave.
P273 Tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. P264 Usar proteção ocular ou facial.
P305 + P351+ P338
SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar
cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: consulte um médico.
P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional. 8. O EnVision™ FLEX Wash Buffer (20x) contém 10-30% de
2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol cloridrato e está rotulado como:
Atenção
H319 Provoca irritação ocular grave. H315 Provoca irritação cutânea.
P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. P302 + P352 +
P362-2 + P363
SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: Lavar com sabonete e água abundantes. Retirar a roupa contaminada. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar.
P305 + P351 + P338
SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar
cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: consulte um médico.
9. O reagente opcional EnVision™ FLEX Antibody Diluent (Referência K8006) contém azida de sódio (NaN3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de
concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização.
10. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 11. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações
locais e nacionais.
Conservação
Conservar os reagentes EnVision™ DuoFLEX and EnVision™ FLEX a 2–8 °C.
Conservar o EnVision™ FLEX Hematoxylin (Referência K8008) à temperatura ambiente. Não utilizar após o prazo de validade indicado no kit. Não trocar componentes do kit de lotes diferentes. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o produto, contactar o nosso serviço técnico.
Preparação dos reagentes
1. EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH
Diluir uma quantidade suficiente de EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH usando água destilada ou desionizada para o procedimento de coloração que está planeado. A solução diluída não utilizada pode ser conservada entre 2─8 ºC durante um mês. Eliminar a solução, caso fique turva. Quando utilizada no PT Link para o procedimento de preparação de amostras 3 em 1, a solução diluída pode ser utilizada 3 vezes num período de 5 dias, quando conservada à temperatura ambiente.
2. EnVision™ FLEX Wash Buffer
Diluir uma quantidade suficiente de EnVision™ FLEX Wash Buffer usando água destilada ou desionizada, para o procedimento de coloração que está planeado. A solução diluída não utilizada pode ser conservada entre 2─8 °C durante um mês. Eliminar a solução, caso fique turva.
3. Solução de trabalho de DAB+
A Solução de trabalho de DAB+ é preparada através da mistura minuciosa de 1 mL de EnVision™ DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer com 1 gota de (25─30 µL) de DAB+ Chromogen. Preparar apenas o volume necessário para o número de lâminas que irão ser coloridas. A Solução de trabalho de DAB+ preparada permanece estável durante, aproximadamente, 5 dias quando conservada a 2─8 °C. Antes de ser utilizada, esta solução deve ser completamente misturada. O desenvolvimento de precipitado, no período de 5 dias, na solução não afecta a qualidade da coloração. A Solução de trabalho de DAB+ deve ser preparada num frasco de reagente Autostainer Link Reagent Bottle quando utilizada no instrumento Dako Autostainer Link.
4. Solução de trabalho de Permanent Red
A Solução de trabalho de Permanent Red é preparada, misturando minuciosamente 100 partes de Permanent Red Substrate Buffer com 1 parte de Permanent Red Chromogen, por exemplo, misturar 1 mL de Permanent Red Substrate Buffer com 10 µL de Permanent Red Chromogen. Preparar apenas o volume necessário para o número de lâminas que irão ser coloridas. Utilizar a solução no prazo de 30 minutos. A Solução de trabalho de Permanent Red deve ser preparada num frasco Autostainer Link Reagent Bottle quando utilizada no instrumento Dako Autostainer Link.
5. Directriz para uma diluição ideal de anticorpos primários
O EnVision™ DuoFLEX Doublestain System é compatível com o cocktail de anticorpos prontos a utilizar Dako DuoFLEX. A diluição ideal deve ser determinada pelo utilizador para outros cocktails de anticorpos produzidos a partir de concentrados.
Colheita e preparação da amostra
As amostras poderão ser secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina. Para a conservação das amostras podem ser utilizados vários agentes de fixação. As amostras não deverão ser fixadas em formol neutro tamponado durante mais do que 24 horas, sendo preferível um período mais curto.
A espessura ideal das secções impregnadas em parafina é de, aproximadamente, 4µm.
As amostras devem ser montadas em lâminas de microscópio. As secções devem ser montadas nas lâminas o mais planas e lisas possível. Secções de tecido demasiado enrugadas poderão afectar os resultados da coloração.
NOTA: As lâminas de microscópio têm que ter uma largura adequada para os instrumentos Dako Autostainer Link. Consultar o Manual do Operador do instrumento Dako individual para mais informações sobre a definição de lâminas de microscópio utilizáveis.
As secções de parafina devem ser montadas a partir de um banho de água pré-aquecido com água destilada ou desionizada. O banho de água não deve conter aditivos (como, por exemplo, gelatina, poli-L-lisina, etc.). As secções devem ser secas por aquecimento, normalmente a uma temperatura <60 °C durante, no mínimo, 60 minutos (durante a no ite, por exemplo). Para garantir uma aderência adequada das secções às lâminas, é importante drenar a água que se encontra por baixo das secções antes do processo de secagem no forno.
Procedimento
Os instrumentos Dako Autostainer Link utilizam técnicas baseadas em diferentes princípios para se obter um resultado de coloração ideal. Antes de se processar os protocolos no instrumento Dako Autostainer Link, ler atentamente o Manual do Operador para o respectivo instrumento Dako. Recomenda-se que o porta-lâminas seja sempre totalmente carregado com lâminas, para confirmar a recuperação do epítopo reprodutível. Isto assegura um aquecimento idêntico das secções em todos os processos.
Todos os reagentes no kit são fornecidos em frascos de reagente Autostainer Link Reagent Bottles.
A Solução de trabalho de DAB+ e a Solução de trabalho de Permanent Red devem ser preparadas em frascos de reagente Autostainer Link Reagent Bottles quando utilizadas no instrumento Dako Autostainer Link.
Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20–25 °C). Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente.
É necessário efectuar as seguintes etapas de pré-tratamento antes de utilizar o EnVision™ DuoFLEX Doublestain System em secções de tecido fixadas em formol e impregnadas em parafina. A amostra deve ser desparafinizada e hidratada. Consultar as informações específicas sobre a preparação das amostras na secção A.5 e no folheto informativo dos cocktails de
Procedimento recomendado para a preparação de amostras 3 em 1 utilizando o PT Link:
1. Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution em água destilada ou desionizada.
2. Encher os tanques do PT Link com uma quantidade suficiente (1,5 L) de solução de trabalho para cobrir as secções de tecido.
3. Definir o PT Link para pré-aquecer a solução até atingir 65 °C.
4. Imergir os tecidos montados, fixados em formol e impregnados em parafina na EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (solução de trabalho) pré-aquecida e incubar durante 20 a 40 minutos a 97 °C. O utilizador deverá determinar o t empo de incubação ideal.
5. Deixar as secções arrefecerem no PT Link até 65 °C.
6. Retirar cada suporte de lâminas do tanque do PT Link e mergulhar, imediatamente, as lâminas num frasco/tanque (por exemplo, PT Link Rinse Station, Referência PT109) com EnVision™ FLEX Wash Buffer, Referência K8007, diluído e à temperatura ambiente.
7. Deixar as lâminas no EnVision™ FLEX Wash Buffer, Referência K8007, diluído, à temperatura ambiente, durante 1 a 5 minutos.
8. Colocar as lâminas num instrumento Dako Autostainer Link e prosseguir com a coloração. As secções não devem secar durante o tratamento ou durante o processo de coloração imuno-histoquímico. As amostras secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica.
Quando utilizada no PT Link para o procedimento HIER, a solução Target Retrieval Solution diluída e o Wash Buffer diluído podem ser utilizados 3 vezes num período de 5 dias, quando conservados à temperatura ambiente.
Procedimento HIER utilizando o PT Link:
Após a desparafinização e hidratação em tampão (água), a maioria das secções de tecido poderão necessitar de ser submetidas a recuperação do epítopo induzida por calor (HIER).
1. Preparar uma solução de trabalho, diluindo o concentrado de EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution em água destilada ou desionizada.
2. Encher os tanques do PT Link com uma quantidade suficiente (1,5 L) de solução de trabalho para cobrir as secções de tecido.
3. Definir o PT Link para pré-aquecer a solução até atingir 65 °C.
4. Imergir os tecidos desparafinizados/hidratados manualmente na EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution (solução de trabalho) pré-aquecida e incubar durante 20 a 40 minutos a 97 °C. O utilizador deverá determinar o tempo de incub ação ideal.
5. Deixar as secções arrefecerem no PT Link até 65 °C.
6. Retirar cada suporte de lâminas do tanque do PT Link e mergulhar, imediatamente, as lâminas num frasco/tanque (por exemplo, PT Link Rinse Station, Referência PT109) com EnVision™ FLEX Wash Buffer, Referência K8007, diluído e à temperatura ambiente.
7. Deixar as lâminas no EnVision™ FLEX Wash Buffer, Referência K8007, diluído, à temperatura ambiente, durante 1 a 5 minutos.
8. Colocar as lâminas num instrumento Dako Autostainer Link e prosseguir com a coloração. As secções não devem secar durante o tratamento ou durante o processo de coloração imuno-histoquímico. As amostras secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica.
9. Para uma coloração de hematoxilina offline, imergir as lâminas num banho de hematoxilina. O tempo de incubação depende da concentração de hematoxilina utilizada. Após a contrastação com hematoxilina, deve ser realizada uma lavagem completa em água destilada ou desionizada.
Para os frascos Coplin:
1. Colocar os frascos de coloração com EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution diluída num banho de água.
2. Aquecer o banho de água e os frascos cheios com EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution a 95–99 °C. Cobrir os frascos com tampas d e modo a estabilizar a temperatura e evitar a evaporação.
3. Imergir as secções à temperatura ambiente na EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution pré-aquecida que se encontra nos frascos de coloração.
4. Restaurar a temperatura do banho de água e da EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution para 95–99 °C.
5. Retirar o frasco com as lâminas de dentro do banho de água. Deixar as lâminas arrefecer em EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution durante 20 (± 1) minutos à temperatura ambiente. 6. Decantar a EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution e lavar as secções com EnVision™
FLEX Wash Buffer.
7. Colocar o suporte com as secções lavadas num instrumento Dako Autostainer Link. Iniciar imediatamente o processo de coloração previamente programado.
NOTA: Quando utilizada nos frascos Coplin para o procedimento HIER, a solução EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution diluída e o EnVision™ FLEX Wash Buffer diluído só podem ser utilizados 1 vez (utilização única).
Alguns epítopos não toleram a HIER e alguns requerem um pré-tratamento enzimático. Consultar o folheto informativo do cocktail de anticorpos primários Dako individual para obter mais informações.
As secções de tecido não devem secar durante o tratamento ou durante o processo de coloração imuno-histoquímica seguinte. Para uma maior aderência das secções de tecido às lâminas de vidro, recomenda-se a utilização de Dako FLEX IHC Microscope Slides (Referência K8020).
Incubação com o cocktail de anticorpos primários:
O cocktail de anticorpos prontos a utilizar Dako DuoFLEX pode ser utilizado com o Dako EnVision™ DuoFLEX Doublestain system, sendo aplicado em secções fixadas em formol e impregnadas em parafina.
As etapas de coloração e os tempos de incubação são pré-programados no software Autostainer Link como o protocolo DuoFLEX. Se os protocolos não estiverem disponíveis no instrumento Autostainer Link utilizado, contactar o Serviço Técnico da Dako.
Os tempos de incubação ideais do cocktail de anticorpos primários, do EnVision™ DuoFLEX/HRP e EnVision™ DuoFLEX /AP dependem do cocktail de anticorpos primários aplicado. Consultar o folheto informativo do cocktail de anticorpos primários Dako individual para obter mais informações. O utilizador deve verificar o protocolo aplicado.
Após a coloração, as lâminas devem ser montadas. Para uma montagem aquosa, são recomendados meios de montagem como, por exemplo, Dako Glycergel™ Mounting Medium, Referência C0563 ou Faramount Aqueous Mounting Medium, Referência S3025.
Para uma montagem não aquosa, permanente, é recomendado que as lâminas sequem completamente ao ar à temperatura ambiente ou sequem ao ar durante 1 hora a 60 ºC e, em seguida, devem ser incubadas em xileno ou um substituto de xileno durante 5 minutos.
Tenha em atenção que em certos casos poderão ser observados artefactos pequenos e pontuados com as lâminas sujeitas a uma secagem ao ar antes da aplicação das lamelas. Isto é possível solucionar ao tratar as lâminas de acordo com um dos seguintes procedimentos:
Opção 1: Transferência directa de lâminas de tecido do instrumento Autostainer Link para álcool, que pode ser composto por:
a) Álcool a 99% com incubação durante, no máximo, 2 minutos, ou
b) Três banhos sucessivos de álcool a 100%, mergulhando 10 vezes em cada.
Em seguida, as lâminas devem ser mergulhadas 10 vezes em cada um dos dois banhos sucessivos de xileno seguido de montagem permanente.
Opção 2: Transferência directa das lâminas de tecido do instrumento Autostainer Link para uma série de concentrações de álcool, mas apenas durante 30 segundos em cada passo e sem exposição ao xileno, seguido de montagem permanente.
Exposições ao álcool e/ou xileno mais longas podem resultar na extracção de cromogénio e, por conseguinte, numa coloração inferior.
Refere-se que estes procedimentos não foram testados em todos os anticorpos primários e, por conseguinte, devem ser interpretados apenas como linhas de orientação. Por consequência, o desempenho do protocolo de desidratação ajustado seguido de montagem permanente tem de ser verificado para garantir que continua a ser válido relativamente ao anticorpo primário em questão. Cada anticorpo primário utilizado deve ser avaliado com o protocolo de desidratação ajustado para confirmar que o padrão de coloração é idêntico ao padrão de coloração descrito em “Características do desempenho” do anticorpo primário.
Controlo de qualidade
Cada processo de coloração deverá incluir uma amostra de controlo positivo conhecida para confirmar um desempenho adequado de todos os reagentes aplicados. Caso a amostra de controlo positivo não demonstre uma coloração positiva apropriada, devem considerar-se inválidas as marcações das amostras de teste.
Interpretação dos resultados
O antigénio reconhecido pelo anticorpo do ratinho é corado de castanho com o cromogénio DAB+. O antigénio reconhecido pelo anticorpo do coelho é corado de vermelho com o cromogénio Permanent Red. Ambas as cores permitem a visualização contra um contrastante de hematoxilina.
Em caso de presença de coloração não específica, tal será reconhecido através de uma coloração castanha ou vermelha difusa. Os núcleos serão coloridos de azul pelo contrastante de hematoxilina.
Poderá observar-se uma coloração de fundo associada a determinados tecidos durante processamentos pequenos com o Autostainer Link (ou seja, aproximadamente, nove lâminas ou menos). Esta coloração de fundo pode ser resolvida aumentando o tempo de lavagem no protocolo de coloração. Para mais informações, contacte o Serviço técnico da Dako.
Referências
1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; 1980
Produzido por:
Dako North America, Inc. 6392 Via Real
Carpinteria, CA 93013, EUA
