PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA
IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS DENGUE PRESENTE EM AMOSTRAS DE
MOSQUITOS DA ESPÉCIE Aedes aegypti PARA MONITORAMENTO DAS
ÁREAS DE INFESTAÇÃO DE UBERLÂNDIA-MG
Denis Prudencio Luiz1
Universidade Federal de Uberlândia/ Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, 38400-902, Uberlândia, MG, prudenis@yahoo.com.br
Edimar Olegário Campos Júnior1; Izabel Marques Rodrigues Amaral1; Boscolli Barbosa Pereira1; João Felipe Moreira Neto1; Warwick Estevam Kerr2
Universidade Federal de Uberlândia/ Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, 38400-902, Uberlândia, MG
Resumo: Ainda pouco se conhece sobre a predominância dos tipos virais em cada região brasileira em áreas urbanas e rurais. A proposta desse trabalho é identificar a espécie viral presente no vetor nos bairros da cidade de Uberlândia-MG no período compreendido entre outubro de 2008 a maio de 2009, através de técnica de captura do mosquito e identificação do vírus por RT-PCR. O vetor foi encontrado em todos os bairros analisados principalmente nos meses de fevereiro a abril de 2009, apresentando uma grande dispersão no município neste período. Os bairros Cazeca, região central, e Luizote de Freitas região periférica, ambos apresentaram positividade para dengue tipo 1, não foi encontrada amostras positivas para dengue tipo 3 neste período.
Palavras-chave: Dengue, RT-PCR, vírus, Aedes Aegypti, armadilha 1. INTRODUÇÃO
O vírus dengue é pertencente à família Flaviridae, do gênero Flavivírus, seu material genético é constituído de uma fita de RNA simples, não segmentada e positiva (Monath & Heinz, 1996; Isturiz, Gubler, Brea del Castillo, 2000; Schatzmayr, 2000; Lindbäck, 2003).
Medem de 40 a 50 nm, de forma esférica, seu envelope possui pequenas projeções na superfície e são sensíveis ao calor (56ºC por 10 min), detergentes, desinfetantes clorados, radiação ultra-violeta, formaldeído e digestão por tripsina e lipases (Westaway, 1980; Chen, Maguire, Marks, 1996; Chang, 1997)
O vírus possui 4 subtipos, DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4, a circulação destes quatro subtipos demonstra um quadro de hiperendemicidade, ou seja, aparecimento de todos os tipos em um país, atingindo principalmente aqueles com clima tropical (Gubler, 2002; Holmes, 2006).
Os mosquitos se tornam infectados pelo vírus da dengue após um repasto de sangue em pessoas com doença aguda. Do lúmen do intestino médio, os vírus infectam as células epiteliais e, após um período de 8 a 12 dias, dependendo da temperatura e de outros fatores, infectam outros tecidos do mosquito, incluindo as glândulas salivares (.
Quando essas estruturas são infectadas, o mosquito se torna um transmissor do vírus, O período de incubação do vírus no hospedeiro é de 3 a 14 dias após o mosquito te-lo picado, o paciente apresenta um início agudo de febre seguido por outros sintomas não específicos, podendo esse durar de 2 a 10 dias. Se ocorrer de um mosquito não infectado entrar em contato com este paciente infectato iniciará um quadro de transmição desta viremia atavés deste mosquito para outras pessoas, num período de 8 a 12 dias (Month, 1994; Gubler, 1998; Ministério da Saúde, 1998; Kow, Koon, Yin, 200l; Forattini, 2003; Reiter, 2007,).
Nas epidemias ocorridas no Sudeste Asiático e Ilhas do Oceano Pacífico, houve relatos que pacientes que apresentaram febre hemorrágica da dengue/síndrome de choque da dengue FHD/SCD, cujas infecções foram causadas pelos tipos 1, 3 ou 4, posteriormente, após intervalo de um (1) a cinco (5) anos, apresentaram infecção por dengue tipo 2. Em 1981, na epidemia de FHD/SCD, ocorrida em Cuba, isolou-se de pacientes o tipo 2, quatro anos após a ocorrência de uma epidemia benigna pelo tipo 1 (Kouri, 1986; Gubler, 1997, Guzman, 2002). Na ocasião, determinou-se que o risco de FHD/SCD, em infecção determinou-secundária, determinou-seria aproximadamente cem vezes maior do que em uma primoinfecção (Thein, 1997).
O primeiro relato de dengue no Brasil ocorreu no século XIX, e seu primeiro caso foi registrado no Rio de Janeiro, posteriormente no Nordeste e no Sul do país. (Figueiredo & Fonseca, 1996) Devido o vetor do Vírus da febre amarela ser o mesmo da dengue, o Aedes aegypti, houve entre os anos de 1923 a 1981 o extermínio deste mosquito (Figueiredo, 2000).
A primeira epidemia de dengue documentada clinicamente e por exames laboratoriais data de 1981 a 1982 no estado de Roraima (Nogueira, Miagostovich, Schatzmayr, 2000), registrando assim mais de 95.000 casos, seguindo para região Nordeste e Centro-Oeste do país (Dantas & Passoni, 2003).
A dengue é uma das mais graves doenças que acomete os brasileiros. A infecção pelo vírus leva às mais variadas doenças, de acordo com os quadros clínicos podemos descrever como dengue clássica, FHD/SCD ou dengue com complicações (Ministério da Saúde, 1998).
No Brasil, ocorre a circulação simultânea dos vírus dengue tipo 1 e 2, os doentes são predominantemente indivíduos adultos de ambos os sexos (Sangkawibha, 1984; Kouri, 1986; Thein, 1997, Teixeira, 1999). Uma seqüência de infecções por tipo diferentes de vírus dengue é claramente definida como importante fator de risco para FHD/SCD (Sangkawibha, 1984). Houve o aparecimento do tipo 3 no Rio de Janeiro, aumentando o risco de FHD/SCD nas metrópoles que apresentam mais de um tipo do vírus, este foi identificado em mais 15 países. O tipo 4, em 10 países, incluindo Brasil, Venezuela, Peru e Equador (Ministério da Saúde, 1999; Nogueira et al. 2001).
Embora cerca de 40% da população mundia estar sob o risco de contrair dengue, não existem, ainda, vacinas ou mesmo tratamentos específicos para a doença, fazendo com que o controle do vetor e a disponibilidade de serviços diagnóticos nas áreas de transmissão sejam fundamentais para o controle efetivo da enfermidade (Who, 2006)
Em Minas Gerais os primeiros registros de dengue tiveram início em 1987, na região da Zona da Mata, Em 1993 a dengue se expandiu atingindo o Triângulo Mineiro sendo incidente nos municípios de Uberlândia, Ituiutaba e Araguari (Santos, Marçal Júnior, Victoriano, 2002.).
Em Uberlândia a ocorrência notificada do mosquito Aedes aegypti teve início em 1986, sendo os primeiros casos da doença relatados em 1993, houve 3.728 casos diagnosticados com dengue clássica causados pelo tipo 1 (Silveira et al., 1994).
2. OBJETIVO
Isolar e identificar o vírus dengue tipo 1 e tipo 3 através do método de RT-PCR.
Fornecer subsídios para o monitoramento de Dengue vírus circulante nas diferentes regiões da cidade de Uberlândia-MG, diretamente das amostras de mosquitos.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Obtenção das amostras de Dengue vírus
As amostras dos mosquitos adultos de Aedes aegypti foram coletadas com armadilhas do tipo Adultrap (Donatti & Gomes, 2007).
Estas armadilhas foram expostas em residências em diferentes bairros de Uberlândia de acordo com Levantamento de Índice Rápido (LIRAa) realizado pelo Programa de Controle de Febre Amarela e Dengue do Centro de Controle de Zoonose.
O controle das armadilhas, assim como, transferência dos mosquitos das armadilhas para o laboratório, troca semanal de isca (água), foram realizadas pelos pesquisadores do próprio laboratório. Insetos não pertencente a família Culicidae foram retirados das armadilhas e não foram contados e nem transportados para o laboratório.
Os índices de infestação foram estipulados por bairro de 20/10/2008 a 22/10/2008, destes, 10 bairros foram selecionados que possuíam diferentes índices de infestação: Cazeca 4,16%, Tabajaras 3,63%, Tubalina 2,13%, Jardim Patrícia 1,41%, Centro 1,29%, Santa Mônica 1,03%, Luizote de Freitas 0,80%, Jaraguá 0,68%, Planalto 0,38% e Umuarama 0% , com um Índice de Infestação Predial da cidade de 0,8%, posteriormente foram classificadas e agrupadas por armadilha, mês e sexo.
3.2. Coleta do material biológico
As armadilhas têm como finalidade a captura do inseto vivo, na maioria fêmea, no período de ovoposição, possuindo uma tela de biossegurança para que não ocorra o contato direto da larva com a água.
Com a ovoposição ocorrendo após o período de repasto, há uma maior chance dos indivíduos capturados serem identificados como positivo para vírus Dengue. (Dontatti & Gomes, 2007).
3.3. Classificação dos indivíduos adultos
A única espécie de mosquitos pertencentes ao gênero Aedes sp., foram os da espécie Aedes aegypti, na mesma armadilha foram encontrados outros insetos não pertencentes a esta espécie. Os mosquitos vivos foram retirados das armadilhas e levados ao laboratório, foram atordoados à temperatura de -20ºC, e posteriormente armazenados em microtubo para a identificação da espécie e do sexo. Após serem classificados foram armazenados em ultrafreezer -70ºC, para processamentos posteriores.
3.4. Processamento dos espécimes e extração de RNA
Os mosquitos foram mantidos em freezer a – 70ºC e macerados utilizando nitrogênio líquido. A extração do RNA foi realizada de acordo com as etapas descritas a seguir.
Em um microtubo de 1,5 ml foi colocada a seguinte mistura: 860 µl de tampão de lise (L6) (24 g de Isotiocianato de Guanidina, 20 ml de Tris-HCl 0.1 M pH 6.4, 4.4 ml de EDTA 0.2 M pH 8.0 e 520 µl de Triton X-100), 40 µl de sílica e 100 µl da amostra (inóculo preparado a partir dos pools de mosquitos). A mistura foi homogeneizada rapidamente e, em seguida, colocada em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Durante o repouso, esta mistura foi homogeneizada a cada 2 ou 3 minutos.
A etapa seguinte consistiu na lavagem do pellet: duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem L2 (48 g de Isotiocianato de Guanidina e 40 ml de Tris-HCl 0.1 M pH 6.4), duas vezes com 1 ml de etanol 70% e uma vez com 1 ml de acetona PA. Após cada lavagem com o tampão L2, etanol e acetona, a mistura foi homogeneizada rapidamente, centrifugada por 10 s e o sobrenadante descartado na solução de NaOH 10N.
Após as etapas de lavagem, o pellet foi seco a 56ºC (termobloco), com as tampas abertas, por 10 min. Preparou-se uma mistura de 60 µl de água (Milli-Q estéril) e 1 µl de RNAsin (estoque contendo 1U/µl) (Invitrogen) para cada amostra e adicionada em cada microtubo de 1.5 ml. A mistura foi homogeneizada e incubada novamente a 56ºC, com as tampas fechadas, por 10 min.
Após a incubação, a mistura foi homogeneizada rapidamente e centrifugada em uma centrífuga refrigerada por 2 min a 14000 RPM. O sobrenadante foi retirado e transferido, usando ponteiras com barreira, para um novo microtubo de 1.5 ml devidamente registrado.
Os RNAs extraídos, antes de serem utilizados na RT-PCR, foram tratados com a enzima DNAse I, Recombinant (Invitrogen). Esta etapa consistiu em evitar a contaminação das amostras com o DNA do mosquito eliminando, assim, os falsos positivos do diagnóstico.
3.5. RT-PCR (PCR por Transcriptase Reversa)
Esta reação foi realizada em dois ciclos distintos. Em um primeiro ciclo da PCR foi usado um par de primers consenso (Tabela 1) para o grupo Flavivírus que amplificou um fragmento de 511 pb.
As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 50µl, usando a seguinte mistura: 5 µl de tampão contendo Tris-HCl 200 mM pH 8.4 e KCl 200 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.20 mM de cada dNTP, 50 mM de DTT, 25 pmol de cada primer (Dcon 1 e Dcon 2), 1U de RNAsin (Invitrogen), 1.0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), 1.0 U de RT-AMV (Invitrogen) e 5 µl do RNA extraído.
A mistura foi amplificada em um termociclador (PTC-100 Programmable Thermal Controller) programado para 1 ciclo a 42ºC por 1 h; 30 ciclos a 94ºC por 35 s, 55ºC por 1 min, 72ºC por 2 min e um ciclo final a 72ºC por 10 min.
Posteriormente, foi realizado um segundo ciclo com primers específicos para cada sorotipo viral (TS1 e TS3) que amplificou fragmentos de 489 pb e 290 pb para os sorotipos DENV-1 e DENV-3, respectivamente (Tabela 1).
As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 50 µl, usando a seguinte mistura: 5 µl de tampão contendo Tris-HCl 200 mM pH 8.4 e KCl 200 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.20 mM de cada dNTP, 25 pmol do primer Dcon 1, 12.5 pmoles de cada primer específico (TS1 e TS3), 1.0 U de Taq DNA Polimerase, 5 µl do produto do primeiro ciclo (diluído dez vezes).
A mistura foi amplificada em um termociclador (PTC-100 Programmable Thermal Controller) programado para 18 ciclos a 94ºC por 35 s, 55ºC por 1 min, 72ºC por 2 min e um ciclo final a 72ºC por 10 min. Os produtos da RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2,0% em tampão TBE (Tris 0,089 M; ácido bórico 0,0089 M e EDTA 0,002M, pH 8,3) e corado com brometo de etídeo.
Após a eletroforese de 40 min a 120 V, os géis foram fotografados em um transiluminador de ultravioleta. Tabela 1 Primers Seqüência 5’ →3’ Dcon 5’TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG3’ 3’AGTTATACGACTTTGCGCGCTCTTTGGC5’ Dcon 2 5’TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC3’ 3’AACGTGGTTGTCAGTTACAGAAGTCCAAG5’ TS1 5’CGTCTCAGTGATCCGGGGG3’ 3’GCAGAGTCACTAGGCCCCC5’ TS3 5’TAACATCATCATGAGACAGAGC3’ 3’ATTGTAGTAGTACTCTGTCTCG5’ 4. RESULTADOS
De outubro de 2008 a maio de 2009 foram coletados um total de 1287 mosquitos da espécie Aedes aegypti, destes 960 eram fêmeas (tabela 2), e 327 machos eram machos no município de Uberlândia-MG (tabela 3), essa coleta foi realizada através de captura por armadilhas, as quais foram classificadas por letras dependente do bairro em que ficaram expostas (tabela 2 e 3), estes bairros possuiam diferentes índices de infestação de mosquito dessa espécie. Um total de 11 mosquitos em outubro, 12 em novembro, 21 dezembro, 142 janeiro, 307 fevereiro, 275 março, 276 abril, 223 maio. Sendo o maior período de infestação de mosquito entre os meses de fevereiro a abril de 2009,
O bairro onde foi encontrada uma presença maior de mosquitos tanto macho quanto fêmea foi o bairro Jaraguá, com um total de 189, seguido do bairro Cazeca com 183, tubalina 149, Centro 131, Luizote de Freitas 121, Planalto 120, Santa Mônica 86, Tabajaras 77, Jardim Patrícia 69 e Umuarama 43 (gráfico 2).
Tabela 2. Amostragem de fêmeas de Aedes aegypti capturadas. ARMADILHA MES A B C D E F G H I J TOTAL OUTUBRO 2 1 - - - - 2 2 1 2 10 NOVEMBRO 1 - 1 1 1 - 2 1 1 - 8 DEZEMBRO 3 2 2 1 2 - 2 3 1 - 16 JANEIRO 23 11 15 9 10 9 8 16 10 7 118 FEVEREIRO 24 10 24 10 15 10 12 18 12 8 254 MARÇO 32 9 26 12 20 15 25 35 20 6 200 ABRIL 30 10 24 8 19 16 23 32 22 7 191 MAIO 25 7 20 8 20 12 22 22 20 7 163 TOTAL 142 50 112 49 87 62 96 129 87 37 960
Letras referentes às armadilha presente no bairro onde foram realizadas as coletas dos mosquitos; A - Cazeca, B – Tabajaras, C - Tubalina, D - Jardim Patrícia, E - Centro, F - Santa Mônica, G -
Luizote de Freitas, H – Jaraguá, I – Planalto, J – Umuarama.
Tabela 3. Amostragem de machos de Aedes aegypti capturados. ARMADILHA MES A B C D E F G H I J TOTAL OUTUBRO - 1 - - - 1 NOVEMBRO 1 - 1 1 - 1 - - - - 4 DEZEMBRO 1 - 1 - - - 1 - 1 1 5 JANEIRO 4 6 4 2 1 - - 5 - 2 24 FEVEREIRO 3 7 6 7 10 4 3 8 5 - 53 MARÇO 10 5 11 5 11 2 5 15 10 1 75 ABRIL 12 6 9 2 12 11 4 21 8 - 85 MAIO 10 2 5 3 10 6 12 11 9 2 70 TOTAL 41 27 37 20 44 24 25 60 33 6 327
Letras referentes às armadilha presente no bairro onde foram realizadas as coletas dos mosquitos; A - Cazeca, B – Tabajaras, C - Tubalina, D - Jardim Patrícia, E - Centro, F - Santa Mônica, G -
0 5 10 15 20 25 30
Out No v Dez Jan Fev Mar Abr Mai
Gráfico 1. Porcentagem de mosquitos capturados mensalmente por todas as armadilhas, pelo o total de todas as capturas durante o período compreendido de outubro 2008 a maio 2009.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 A B C D E F G H I J Macho Fêmea
Grafico 2 - A - Cazeca, B – Tabajaras, C - Tubalina, D - Jardim Patrícia, E - Centro, F - Santa Mônica, G - Luizote de Freitas, H – Jaraguá, I – Planalto, J – Umuarama.
5. Discussão
No período compreendido entre os meses de outubro e dezembro não foram capturadas amostras do mosquito adulto Aedes aegypti significantes, relativo ao esperado pelo índice de infestação predial (tabelas 2 e 3; gráfico 1), um total de 44 mosquitos. Este fato ocorreu, pois os meses de coleta foram referentes aos meses de estação seca da cidade de Uberlândia, não havendo formado reservatórios propícios para a procriação de mosquitos (Ribeiro, et al. 2006).
O mês de janeiro já em estação chuvosa demonstrou um crescente número na quantidade de mosquitos por armadilhas (gráfico 1), demonstrando assim a possível formação de reservatório de água nos bairros analisados (Santos, Marçal Júnior, Victoriano, 1999; Ribeiro, et al. 2006).
O período com maior infestação de mosquito ocorreu entre os meses de fevereiro a abril de 2009, um total de 858, ou seja, 66,7% do total de mosquitos entre outubro de 2008 a maio de 2009; neste período de maior infestação 75,3% eram fêmeas. Sendo precedido por uma crescente taxa no
A pequena quantidade de mosquitos machos de Aedes Aegipty capturados se deve pela especificidade da armadilha, já que após o repasto a fêmea do mosquito procura um local de ovoposição (Marquardt & Beaty, 1996; Lenzi et al., 2000). Podemos notar juntamente com um aumento da quantidade de fêmeas no período compreendido entre feveireiro de 2009 a abril de 2009 um aumento significante da quantidade de machos capturados.
O método de RT-PCR foi realizado para o vírus dengue tipo 1 (DENV-1) e para o tipo 3 (DENV-3), nossos resultados demonstraram a presença do vírus DENV-1 nas amostras dos bairros Cazeca (A), e Luizote de Freitas (G) no mês de maio de 2009. Podemos observar que o número de mosquitos fêmeas em A (25) e G (22), e machos em A (10) e G (10) embora elevados, não representaram a maior quantidade de mosquitos coletados, sugerindo não haver uma total dependência de número de indivíduos para positividade de vírus nestes bairros, não houve a identificação do DENV-3 em nenhuma amostra.
Padrão A B C D E F G H I J Controle (-)
482bp 290bp
Figura 1. RT-PCR de vírus dengue tipo 1 e 3. Amostras dos referentes bairros; A - Cazeca, B – Tabajaras, C - Tubalina, D - Jardim Patrícia, E Centro, F – Santa Mônica, G - Luizote
de Freitas, H – Jaraguá, I – Planalto, J – Umuarama, maio de 2009.
6. CONCLUSÃO
Os mosquitos Aedes aegypti mantiveram seu ciclo ativo em todo período de maio de 2008 a julho de 2009, demonstrando uma baixa desse número de indivíduos nos primeiros meses deste estudo e uma queda no final do mesmo estudo, podendo assim notificar uma maior atividade de vida durante o período compreendido entre janeiro de 2009 a maio de 2009, mês o qual já foi possível notar uma significante queda desse número.
O bairro com maior presença de mosquito da espécie Aede aegypti foi o bairro Jaraguá, podendo ser devido a uma maior quantidade de materiais que propiciem o acúmulo de água na região do bairro.
Embora notarmos um alto número de indivíduos, tanto fêmea quanto macho de fevereiro a abril de 2009, só foi possível identificar o vírus dengue tipo 1 (figura 1) nas amostras presentes no mês de maio, demonstrando assim uma correlação negativa entre alto número de indivíduos para positividade de vírus na população de mosquitos. Ao contrário do que poderia ocorrer não foi encontrado positividade para DENV-3 (figura 1) em nenhuma amostra coletada.
Agradecemos à UFU e ao CNPq pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho e pela contemplação da bolsa de pesquisa, ao João Edson Donatti por fornecer as armadilhas para a execução da captura dos mosquitos, ao meu orientador Dr. Warwick Estevam Kerr, e a todos os demais pesquisadores que me ajudaram na execução desse projeto.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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IDENTIFICATION OF DENGUE VIRUS IN SAMPLES OF THIS SPECIES
MOSQUITOES Aedes aegypti FOR MONITORING OF AREAS OF
INFESTATION Uberlândia-MG
Denis Prudencio Luiz1
Universidade Federal de Uberlândia/ Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, 38400-902, Uberlândia, MG, prudenis@yahoo.com.br
Edimar Olegário Campos Júnior1; Izabel Marques Rodrigues Amaral1; Boscolli Barbosa Pereira1; João Felipe Moreira Neto1; Warwick Estevam Kerr2
Universidade Federal de Uberlândia/ Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, 38400-902, Uberlândia, MG
Abstract: Although little is known about the prevalence of viral types in each region in Brazil in urban and rural areas. The purpose of this study is to identify the species present in the viral vector in the neighborhoods of the city of Uberlândia-MG in the period October 2008 to May 2009, through the technique of catching mosquito and virus identification by RT-PCR. The vector was found in all districts studied mainly in the months February to April of 2009, showing a large dispersion in the city in this period. Cazeca neighborhoods, central region and peripheral region Luizote de Freitas, both were positive for dengue type 1, no samples were found positive for dengue type 3 in this period.
