“Características Clínico-patológicas e Expressão de Marcadores
de Proliferação Celular e de Miofibroblastos em Carcinomas
Espinocelulares de Língua”
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do Título de Doutor em Estomatopatologia, na área de concentração em Estomatologia.
Orientador: Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes
Piracicaba 2008
G934c
Gueiros, Luiz Alcino Monteiro.
Características clínico-patológicas e expressão de marcadores de proliferação celular e de miofibroblastos em carcinomas espinocelulares de língua. / Luiz Alcino Monteiro Gueiros. -- Piracicaba, SP: [s.n.], 2008.
Orientador: Márcio Ajudarte Lopes.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Neoplasias bucais. 2. Imunoistoquímica. 3. Prognóstico. I. Lopes, Márcio Ajudarte. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
(mg/fop)
Título em Inglês: Clinicopathologic characteristics, cell proliferation markers and myofibroblast expression in oral squamous cell carcinoma of the tongue
Palavras-chave em Inglês (Keywords): 1. Mouth Neoplasms. 2. Immunohistochemistry. 3. Prognosis
Área de Concentração: Estomatologia Titulação: Doutor em Estomatopatologia
Banca Examinadora: Márcio Ajudarte Lopes, Danyel Elias da Cruz Perez, Jair Carneiro Leão, Pablo Agustin Vargas, Oslei Paes de Almeida
Data da Defesa: 12-12-2008
A Deus, sempre presente na minha vida, ensinando-me que “se faz caminho ao andar”.
Aos meus pais, Márcio e Stela, por me estimularem a leitura quando eu era criança, a curiosidade quando adolescente e ao conhecimento quando jovem. Todos os meus passos foram e serão dados na terra que vocês semearam.
À Cecília, minha sempre amada, pelo apoio e estímulo em todos os anos que compartilhamos juntos. E também ao nosso filho que virá em breve, fruto maior deste amor.
Aos meus irmãos Flávio, Leandra e Antonio. Sempre contei com todos e pude me alegrar ao sentir o cuidado de vocês neste período distante. Sinto-me orgulhoso de ver quem vocês são.
Ao Prof. Dr. Jair Carneiro Leão, meu amigo, pela orientação constante desde os primeiros passos na Estomatologia, pelo estímulo em adquirir uma melhor formação e principalmente pela sólida amizade. Trabalho sempre na expectativa de corresponder à confiança que você depositou em mim.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.
Ao Prof. Dr. Jacks Jorge Júnior, coordenador da Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, pelos ensinamentos e discussões produtivas que estimularam em mim um espírito mais crítico frente às evidências científicas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Profissional de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio-pesquisa concedido (2006/06385-8).
Ao Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia do Hospital do Câncer A.C. Camargo pela colaboração com os casos.
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta, coordenador do Programa de Pós-graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, pela disponibilidade em ensinar e pela liberdade oferecida no laboratório de Biologia Molecular, além de todo auxílio na análise estatística deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes pela orientação presente e respeitosa que durante este período se tornou traduzida em amizade e admiração.
Ao Prof. Dr. Oslei Paes de Almeida pela atenção dispensada e interesse verdadeiro em meu crescimento profissional e pessoal. Tive o privilégio de ter sido contagiado pelo seu entusiasmo em ser professor.
Ao Prof. Dr. Pablo Agustín Vargas pela oportunidade de aprender a ser mais criterioso na elaboração dos meus trabalhos e na avaliação de trabalhos dos pares. Também pelo estímulo em estabelecer novas parcerias e criar novos grupos de pesquisa bem estabelecidos.
Ao Prof. Dr. Edgard Graner pela tranqüilidade e respeito com que orienta os alunos de doutorado durante o crédito de Genética, estimulando-nos a uma análise mais crítica e profunda da ciência praticada na fronteira do conhecimento.
Aos amigos Rogério de Andrade Elias, Valéria Totti, Aparecida Campion e Débora Gazola pela amizade e apoio durante o período em que estive no Orocentro.
Aos funcionários do Laboratório de Patologia, Adriano Luís Martins, João Carlos Gomes da Silva Júnior, Rosa Maria Fornasiari, Valéria Alessandra Franco e Fabiana Facco Casarotti pela disponibilidade e auxílio na concretização deste trabalho.
Ao Profs. Drs. Adonis Carvalho e Maria do Carmo Abreu e Lima pela disponibilidade e acesso ao arquivo do Serviço de Patologia do Hospital do Câncer de Pernambuco.
por muitos anos. A falta que vocês farão será compensada pela alegria de ver o sucesso dos seus trabalhos.
Aos amigos Marcelo Rocha e Jorge Leon, pelas frutíferas discussões sobre projetos científicos e pessoais, pelos momentos de descontração e principalmente, por ensinarem-me a importância do comprometimento em servir aos outros.
Às amigas Rebeca Azevedo, Adriele Vasconcelos, Carolina Bitu e Camila Ribeiro, pelos jantares, filmes e longas discussões sobre quase tudo. Esses momentos serão guardados com carinho.
Aos amigos de pós-graduação Lucielma Salmito Pinto, Andréia Aparecida Silva, Lília Alves Rocha, Patrícia Gemma Abrahão, Guillermo Martinez Mata, Ademar Takahama Júnior, Michele Gassen Kellermann, Lays Martin Sobral, Marco Antonio, Maria Fernanda Destro, Ana Terezinha Mesquita, Débora Bastos, Fabiana Seguin, Lívia Maris Paranaíba, Fernanda Viviane Mariano, Fernanda Basto, Victor Hugo Rizzo, Andréia Bufalino, Renato Hopp, Bruno, Patrícia Feio e Daniel Berreta pela amizade e ensinamentos diários.
Finalmente, a todos que me auxiliaram com atitudes, palavras ou simplesmente com a presença e tornaram este momento a concretização de um projeto rascunhado antes de iniciar a graduação.
"Caminhante, não há caminho. Faz-se caminho ao andar.”
O carcinoma espinocelular oral é a principal neoplasia maligna da boca, sendo a língua o local mais acometido. Recentemente tem sido relatado que tumores deste local apresentam características clínicas e comportamento biológico distintos dos demais tumores orais. O objetivo do presente trabalho foi avaliar as características clínicas, histopatológicas e expressão de marcadores de proliferação celular e actina de músculo liso (AML) em carcinomas espinocelulares (CECs) de língua. Para tanto, foram retrospectivamente analisados 63 casos de lesões de língua sem tratamento prévio e sem metástase à distância ao diagnóstico. As informações clínicas foram obtidas dos prontuários do Hospital do Câncer A.C. Camargo e as características histopatológicas observadas segundo os critérios de Anneroth e Bryne, sendo feitas reações imunoistoquímicas para Ki-67, mcm-2, geminina e AML. O tumor foi mais prevalente em homens, com 51 casos (80,95%) e apenas 12 em mulheres (19,05%), com idade variando de 31 a 92 anos, e média de 57,6 anos (dp = 11,81). Maior parte dos pacientes era fumante (85,7%) e consumia bebidas alcoólicas regularmente (82,5%). Com relação à gradação histológica, verificou-se que um escore de Anneroth maior que 15 esteve associado a etilismo (p=0,05), tipo de tratamento (p=0,05), tamanho do tumor (p=0,05), presença de êmbolos tumorais em vasos sanguíneos (p=0,003), comprometimento nodal (p=0,05), ruptura de cápsula nodal (p=0,016) e desenvolvimento de metástase à distância (p=0,002). Por outro lado, um escore maior que 12 segundo a gradação de Bryne apresentou associação com ruptura de cápsula (p=0,02) e desenvolvimento de metástase à distância (p=0,002), além de sobrevida global (p=0,03) e sobrevida livre de doença (p=0,05). O Ki-67 se mostrou capaz de prever metástase cervical (p=0,06). A expressão de mcm-2 correlacionou-se com idade (p=0,03) e metástase cervical (p=0,008) e a expressão de geminina com gênero feminino (p=0,02) e presença de invasão neural (p=0,05). Alta expressão de AML no estroma tumoral apresentou associação com estádio N maior ou igual a 1 (p=0,01), estadiamento clínico III e IV
marcadores de proliferação celular e de miofibroblastos, podem ser importantes na avaliação do comportamento biológico de CECs de língua.
The aim of this study was to evaluate the clinical and histopathological features as well as proliferation markers and smooth muscle actin (SMA) immunohistochemical expression in tongue squamous cell carcinomas. Sixty three cases of tongue lesions with no previous treatment and no distant metastasis were selected. Clinical informations were retrieved from the clinical files of A.C. Camargo Cancer Hospital and the tumors were graded according to Anneroth et al. (1987) and Bryne et al. (1992) grading systems. Immunohistochemical reactions to Ki-67, mcm-2, geminin and SMA were performed. A male predilection could be noted since the sample was composed by 51 men (80,95%) and 12 women (19,05%). Age ranged from 31 to 92 years, with a mean age of 57,6 years (sd=11,81) and a median age of 58 years. Most of the patients were smokers (85,7%) and regular consumers of alcoholic beverages (82,5%). A total Anneroth score was related to regular consumption of alcoholic beverages (p=0,05), treatment (p=0,05), tumor size (p=0,05), tumoral embolization of blood vessels (p=0,003), nodal metastasis (p=0,05), nodal capsule rupture (p=0,016) and distant metastasis (p=0,002). On the other hand, total Bryne score above 12 was related to nodal capsule rupture (p=0,02) and distant metastasis (p=0,002), as well as overall survival (p=0,03) and disease-specific survival (p=0,05). Ki-67 was capable of predicting nodal metastasis (p=0,06). Immunohistochemical evaluation of mcm-2 revealed a relation between expression and age (p=0,03) and nodal metastasis (p=0,008). Geminin expression was related to female gender (p=0,02) and neural invasion (p=0,05). High levels of SMA were related to N stage (p=0,01), clinical stage III and IV (p=0,03) and nodal metastasis after treatment (p=0,07). It could be concluded that Bryne score together with proliferation and myofibroblast markers expression can be useful for evaluating the biological behavior of tongue squamous cell carcinomas.
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA ... 3
2.1CARCINOMAESPINOCELULARORAL ... 3
2.1.1 Epidemiologia ... 3 2.1.2 Etiologia ... 5 2.1.2a.Tabaco e álcool ... 6 2.1.3 Aspectos Clínicos ... 9 2.1.3a Língua ... 10 2.1.4 Gradação histológica ... 12
2.2MARCADORESDEPROLIFERAÇÃOCELULAR ... 15
2.2.1 Ki-67 ... 16
2.2.2 Proteína de Manutenção de Minicromossomo 2 (mcm-2) ... 17
2.2.3 Geminina ... 19
2.3ACTINADEMÚSCULOLISO ... 21
3. PROPOSIÇÃO ... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 25
4.1APROVAÇÃODOCOMITÊDEÉTICAEMPESQUISA ... 25
4.2AMOSTRA ... 25
5. RESULTADOS ... 31
5.1CARACTERÍSTICASEPIDEMIOLÓGICASECLÍNICAS ... 31
5.2CARACTERÍSTICASHISTOPATOLÓGICAS ... 34 5.3CARACTERÍSTICASIMUNOISTOQUÍMICAS ... 51 6. DISCUSSÂO ... 59 7. CONCLUSÕES ... 71 REFERÊNCIAS ... 73 ANEXOS ... 91
1. INTRODUÇÃO
A despeito do avanço nas modalidades terapêuticas nos últimos 20 anos não se observou melhora nas taxas de sobrevida do câncer oral (50% a 55%), especificamente o de língua, principalmente devido à presença de complicações loco-regionais mesmo nos estágios iniciais da doença (Brenner, 2002; Shiboski et al., 2005; Sano & Meyres, 2007). O estadiamento pelo sistema TNM é a base da definição terapêutica e avaliação do prognóstico destes tumores, muito embora não seja sempre capaz de predizer seu comportamento biológico (Shah & Lydiatt, 1995; Lopes et al., 2002). Desse modo, recursos adicionais que possibilitem avaliações mais precisas das características tumorais tem sido alvo de diversos estudos, inicialmente realizados pela avaliação das características histopatológicas e evoluindo para a identificação de marcadores moleculares (Anneroth et al., 1987; Bryne et al., 1992, Lopes et al., 2002).
A gradação histológica dos CECs orais apresenta-se como um importante recurso disponível aos patologistas, clínicos e cirurgiões, podendo direcionar a definição terapêutica e avaliação do prognóstico. Dentre os diversos sistemas propostos o de Anneroth et al., 1987 e Bryne et al., 1992 são utilizados com maior freqüência por se apresentaram associados a dados clínico-patológicos significativos. O sistema mais antigo propõe a avaliação de todo parênquima do tumor enquanto o mais recente avalia apenas o front tumoral, sendo possivelmente capaz de prever o prognóstico de CECs orais.
Dentre os diversos marcadores utilizados para avaliar proliferação celular, o Ki-67 tem sido utilizado com maior freqüência em estudos de prognóstico de tumores de origens distintas e apresenta associação positiva com um pior prognóstico em vários destes (Alves et al., 2004, Silva et al., 2004, Ignatiadis & Sotiriou, 2008). Contudo, outros marcadores expressos durante o ciclo celular também têm sido utilizados, freqüentemente comparados à expressão de Ki-67. As proteínas de manutenção de minicromossomo (mcm) formam um
complexo de seis proteínas (mcm-2 a mcm-7) que atua como complexo pré-replicativo e possibilita a entrada do ciclo celular na fase S, sendo rapidamente dissociadas da cromatina após a replicação do DNA. Desse modo a ausência de expressão de mcm indica diferenciação celular ou quiescência (Scott et al., 2003). Semelhantemente ao Ki-67, sua maior expressão correlaciona-se a um pior prognóstico de diversos tumores (Freeman et al., 1999; Kato et al., 2003; Vargas
et al., 2008). Associado ao complexo mcm, a geminina atua na regulação do ciclo
celular impedindo a reduplicação do genoma e a formação de um novo complexo pré-replicativo antes que ocorra a mitose. Sua função está ligada à inibição da proteína Cdt1, que promove a ligação do complexo mcm à cromatina, atuando também como regulador da formação de centrossomos (Montanari et al., 2006). Entretanto, a geminina parece desempenhar um papel distinto em tumores malignos, de modo que é considerada um marcador de proliferação celular (Wharton et al., 2004).
A participação do estroma nos processos de invasão e metástase tem sido amplamente avaliada, tendo a ativação de fibroblastos o papel de orquestrar todo este processo (Zigrino et al., 2005; Baglole et al., 2006). Uma vez ativadas, estas células passam a se chamar miofibroblastos e adquirem funções metabólicas distintas, sendo caracterizadas pela expressão de actina de músculo liso (AML). Do mesmo modo, secretam citocinas, fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, mediadores inflamatórios, proteínas da adesão e proteínas da matriz extracelular que conferem um comportamento mais agressivo ao tumor (Orimo & Weinberg, 2006). Sendo assim, tumores com maior quantidade de miofibroblastos apresentam um pior prognóstico (Kellermann et al., 2007).
A avaliação de marcadores de proliferação celular e de miofibroblastos tem se apresentado como importante método de avaliação de prognóstico de diversas malignidades. Contudo, o papel de marcadores mais novos, como mcm-2 e geminina, precisa ser mais bem entendido nos tumores de cabeça e pescoço, em especial nos carcinomas espinocelulares (CECs) orais.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
2.1.1 Epidemiologia
Os últimos dados de estatística global da Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) estimaram 10,6 milhões de novos casos, 6,7 milhões de mortes e 24,6 milhões de pessoas vivendo com a doença no ano de 2002, sendo o câncer oral responsável por 274.000 novos casos em 2002, a 8ª incidência nos homens e 13ª nas mulheres. A Europa Ocidental, que compreende uma região bem desenvolvida deste continente, apresenta a maior incidência mundial de câncer de boca em homens (16,9/100.000 habitantes em 2002). No gênero feminino, a maior incidência apresenta-se na Melanésia com uma taxa de 12,1 novos casos por 100.000 habitantes no ano de 2002. Estes dados ilustram dois importantes aspectos da distribuição global de câncer: concentração de câncer de boca em países desenvolvidos e forte associação com hábitos e fatores ambientais (Parkin et al., 2005).
No Brasil, 14.160 novos casos de câncer da cavidade oral são esperados no ano de 2008, representando 4,4 % dos casos de neoplasias malignas em homens e 1,6% das malignidades em mulheres (Instituto Nacional do Câncer - INCA, 2007). A incidência esperada em 2008 é da ordem de 11 casos/100.000 habitantes, variando significativamente entre os estados e regiões. As estatísticas dos Estados Unidos projetam um total de 1.437.180 novos casos e 565.650 mortes por câncer apenas em 2008, sendo esperados 20.960 casos localizados na boca e 10.140 apenas na língua (Jemal et al., 2008). Estes dados mostram ainda uma estabilização na incidência de câncer em ambos os gêneros e
redução significativa na mortalidade pela doença, que variou de 18,4% no início dos anos 90 para 10,5% em 2004. Contudo, esta realidade não deve ser extrapolada para a população mundial, que segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) apresenta uma tendência de crescimento da incidência de câncer nas próximas décadas (Macfarlane et al., 1994).
Mais de 90% das malignidades orais compreendem CEC da mucosa de revestimento, e tumores malignos originados de glândula salivar menor e de origem mesenquimal são relativamente raros nesta localização (Johnson et al., 2005). O CEC oral é mais prevalente na quinta e sexta décadas de vida e apenas 4 a 6% dos casos ocorrem abaixo dos 40 anos (Iamaroon et al., 2004; Siriwardena
et al., 2006). Entretanto, um aumento significativo do número de casos em
pacientes jovens tem sido observado na última década, em especial nos homens de países da Europa Ocidental (Llewellyn et al., 2003). Também tem sido observado aumento importante da incidência de CEC oral na população abaixo de 20 anos, condição extremamente rara (Chow et al. 2007). Apesar de ter sido considerado que a doença apresentava progressão mais rápida em pacientes jovens, Ribeiro et al. (2008) observaram comportamento semelhante entre grupos etários distintos e concluíram que uma maior agressividade do tumor possivelmente está associada ao diagnóstico tardio. O papel da exposição a fatores de risco neste grupo de pacientes é controverso, excetuando-se crianças anteriormente submetidas à quimioterapia, radioterapia ou transplante de medula óssea, onde o CEC de cabeça e pescoço é a segunda neoplasia primária mais comum (Salum et al., 2006; Chow et al., 2007).
O CEC oral é mais freqüente em homens que em mulheres, principalmente por que um maior consumo de tabaco e álcool é observado em indivíduos do gênero masculino. Todavia, a razão mundial homem:mulher tem diminuído consideravelmente possivelmente devido a um aumento no consumo destas substâncias pelo gênero feminino (Iamaroon et al., 2004; Johnson et al., 2005). Suba (2007) realizou um estudo caso-controle para avaliar os fatores envolvidos na diferença de gênero observada no CEC oral. O consumo intenso de
álcool apresentou um alto risco para o desenvolvimento da doença em ambos os gêneros, embora o consumo moderado tenha mostrado um risco menor na população masculina e não se apresentou como fator de risco na população feminina. Os autores correlacionaram ainda níveis de estrógeno ao risco de CEC oral, e observaram que apenas mulheres pós-menopausa apresentaram a doença, propondo assim uma forte associação entre diminuição dos níveis de estrógeno e aumento do risco de CEC oral em mulheres. Porém, não parece haver correlação entre gênero e prognóstico. Wong et al. (2006) observaram uma diferença estatisticamente significante entre os gêneros na sobrevida em cinco anos de uma amostra composta por 1.010 pacientes, muito embora esta diferença não tenha sido mantida quando ajustada para o estadiamento clínico.
2.1.2 Etiologia
Os tumores são formados quando uma única célula, alterada pela inativação de um gene supressor de tumor ou ativação de um protooncogene, passa a ganhar vantagem metabólica e proliferativa e expande-se formando uma massa clonal. O conceito de clonalidade é a base da compreensão atual do câncer, de modo que as alterações genéticas são cumulativas, sucessivas e não letais (Fearon & Vogelstein, 1990). Portanto, o resultado destas alterações é a progressão de uma condição de benignidade para um processo potencialmente maligno e por fim, a formação de uma neoplasia maligna. Califano et al. (1996) tentaram, sem êxito, estabelecer quais etapas seriam fundamentais à formação de um clone maligno nos tumores de cabeça e pescoço, numa tentativa de propor um modelo semelhante ao que Fearon & Vogelstein (1990) formularam para os tumores colo-retais.
Contudo, outro conceito proposto em 1953 por Slaughter et al. (cancerização de campo), tornou-se bem aceito e estudado, uma vez que possui
implicações clínicas significativas. Os autores verificaram que os tecidos normais adjacentes ao tumor apresentavam alterações histopatológicas e que 88 casos de um total de 783 (11%) apresentavam mais de uma área tumoral independente. Concluíram que a mucosa adjacente ao tumor também é modificada devido à exposição a carcinógenos associados ao desenvolvimento tumoral e, portanto, torna-se mais susceptível ao desenvolvimento de novos focos independentes de malignização. Atualmente este conceito compreende basicamente três situações: doença potencialmente maligna que afeta área extensa da mucosa aero-digestiva, ocorrência freqüente de múltiplos tumores primários em áreas acometidas por lesão potencialmente maligna extensa e a possibilidade de tumores primários de trato aero-digestivo superior distantes e relacionados. Assim, a cancerização de campo podem representar eventos moleculares distintos que acometem múltiplas células separadamente ou evento em um único clone que inicia o processo por expansão e “espalhamento” clonal, possivelmente por disseminação lateral na mucosa aero-digestiva (Ha & Califano, 2003).
2.1.2a.Tabaco e álcool
Os principais fatores de risco independentes para o CEC oral são o tabaco e o álcool, que quando associados são responsáveis por 75% das neoplasias malignas orais e de orofaringe na Europa, Américas e Japão. Estudos caso-controle que avaliaram o risco de câncer associado ao uso combinado destas substâncias mostram efeito super-multiplicativo deste sinergismo na boca, de modo que o tabaco é a principal causa evitável de câncer (Franceschi et al., 1990; Johnson et al., 2005). Os riscos relativos observado em estudos caso-controle mostram um efeito multiplicativo na cavidade oral, possivelmente associado à intensidade de contato destes agentes com a mucosa (Johnson et al., 2005). Indivíduos que fumam mais de 20 cigarros/dia e usam mais de 100g de
álcool/ têm o risco de desenvolver um câncer de cabeça e pescoço aumentado em 200 vezes (Andre et al., 1995). Os padrões atuais de distribuição global da doença refletem a prevalência de fatores de risco específicos como hábito de fumar tabaco e consumo de bebidas alcoólicas na Europa Ocidental e hábito de mascar betel na Ásia Sul-central e Melanésia (Parkin et al., 2005). Entretanto, seus efeitos isolados também contribuem de forma significativa para um maior risco de desenvolver a doença. Pacientes fumantes não etilistas tem aumento significativo no risco de CEC oral, e pacientes etilistas graves e não fumantes possuem um aumento em menor proporção (Talamini et al., 1998).
Outros produtos do tabaco são amplamente utilizados em algumas regiões colocados na boca em contato com a mucosa jugal ou língua, sendo então sugados ou mastigados. Os principais componentes do tabaco são os alcalóides, dos quais a nicotina é o mais importante (90 a 95% do total), muito embora várias formas (puras ou misturadas a outras substâncias) sejam utilizadas (Rodu e Jansson, 2004). Rodu & Cole (2002) verificaram que o risco relativo associado ao hábito de mascar tabaco é reportado como baixo em vários estudos caso-controle e varia de acordo com o sítio anatômico e a forma de utilização. Todavia, o desenho da maioria destes estudos é inadequado uma vez que não ajustam os resultados para o consumo de fumo e álcool, dois importantes agentes de confusão para estas análises. Em julho do corrente ano, a IARC publicou uma revisão acerca deste tema, onde considera que usuários deste tipo de tabaco possuem um risco de desenvolver câncer de cabeça e pescoço menor que fumantes e maior que não usuários de tabaco. Os autores observaram que o risco relativo variou de 0,8 a 6,2 dependendo do tipo de tabaco utilizado e da localização geográfica. Concluem que seus efeitos sistêmicos necessitam melhor compreensão, e que o risco depende principalmente do tipo de produto consumido (Boffetta et al., 2008).
O consumo de Canabis também tem sido associado a um aumento do risco de câncer oral, muito embora alguns estudos caso-controle mostrem resultados conflitantes. Zhang et al. (1999), em um estudo caso-controle com 173
pacientes e 176 controles, relataram um risco relativo de 2,6 e reportaram uma possível interação entre o fumo de tabaco, e em menor grau, etilismo. Rosemblatt
et al. (2004), avaliaram 407 pacientes e 615 controles e não observaram aumento
do risco, mas ressaltam que poucos pacientes relatam uso continuado por vários anos, sendo necessário avaliar uma amostra maior. Contudo, um importante artigo de revisão avaliou dois estudos de coorte e 14 estudos caso-controle e concluiu que as limitações observadas nestes trabalhos impedem uma conclusão quanto ao risco de câncer associado a este hábito (Hashibea et al., 2005).
Até pouco tempo o álcool era considerado co-carcinógeno, atuando apenas quando associado com o tabaco. Em 2007, um grupo de trabalho da IARC classificou o álcool como “carcinogênico aos humanos”, e confirmou um efeito causal entre consumo de álcool e desenvolvimento de câncer de boca, faringe, laringe, esôfago, fígado, cólon e reto e mama feminina (Baan et al., 2007). O consumo de 50g diárias de álcool aumenta em 2 a 3 vezes o risco de câncer de boca, faringe, laringe e esôfago, que associado à deficiência da enzima aldeído desidrogenase, envolvida no metabolismo do etanol, aumentam consideravelmente o risco de neoplasias malignas de esôfago (Yokoyama & Omori, 2005).
Uma pequena população de pacientes apresenta malignidades de cabeça e pescoço não associadas a fatores de risco, sendo considerada um subgrupo específico. De um total de 4.404 pacientes com câncer de cabeça e pescoço Farshadpour et al. (2007) avaliaram uma amostra de 195 pacientes sem hábitos de tabagismo e etilismo e observaram que os tumores ocorreram em pacientes mais idosos, na oitava década de vida, com predileção pelo gênero feminino e taxa de segundos tumores primários semelhante ao grupo associado aos fatores de risco.
2.1.3 Aspectos Clínicos
Um recente workshop coordenado pela OMS concluiu que no presente é difícil determinar qual lesão potencialmente maligna efetivamente irá sofrer malignização. Espera-se que lesões não homogêneas, localizadas em borda lateral e ventre de língua, assoalho bucal e trígono retromolar possuam um maior risco de transformação maligna, assim lesões em pacientes não fumantes (Napier & Speight, 2008). Lesões malignas iniciais são normalmente assintomáticas e possuem grande variação na apresentação clínica, desde discreta mancha branca a lesões extensas exofíticas com bordas elevadas. A progressão da doença promove necrose central da lesão, que evolui com odor fétido, dor, odinofagia, disfonia, sangramento, perda de peso, trismo e metástases regionais e à distância (Pinto, 2007).
A presença de metástases cervicais é o principal fator de prognóstico de pacientes com CEC oral, presente em 30% dos pacientes com CEC oral. Contudo, observa-se uma alta taxa de metástases cervicais ocultas (20%), não observadas ao exame clínico nem por avaliação de exames de imagem (Sano & Myers, 2007). As metástases regionais apresentam um padrão previsível de disseminação linfática. Em 1972, Lindberg avaliou 2.044 pacientes portadores de CEC de cabeça e pescoço não tratados e propôs um padrão de disseminação baseado na localização do tumor primário. Mais recentemente este padrão foi revisto com bases em novos estudos e exames de imagem que possibilitam uma avaliação mais precisa da presença e localização de linfonodos metastáticos. Do mesmo modo, os critérios do sistema TNM foram modificados neste período, o que torna a redefinição mais significativa. Mukherji et al. (2001) estabeleceram um modelo baseado nos achados de Lindberg (1972) e nos padrões de drenagem linfática, propondo os sítios esperados de metástase de acordo com o órgão afetado.
Com um melhor controle loco-regional da doença, as recidivas têm ocorrido na forma de metástases à distância, sendo a disseminação extracapsular do tumor importante na avaliação de deste aspecto, além de correlacionar-se com morte pela doença (Sano & Myers, 2007). O principal preditor clínico de doença metastática à distância é o envolvimento cervical em múltiplos níveis, uma vez que o tamanho do tumor não tem associação com este processo, sugerindo que a disseminação hematogênica é possivelmente um efeito terciário do avanço da doença, ocorrendo após ruptura capsular dos linfonodos cervicais (Johnson et al., 2005). A incidência desta condição varia de 5 a 24% em estudos clínicos e chega a 40% em estudos realizados por autópsia (Merino et al., 1977; Zbaren & Lehmannn, 1987), e a grande maioria dos casos (83,4%) ocorre em pulmão, sendo menos freqüente a disseminação hepática e óssea (Som et al., 1999). O risco de metástase à distância varia de acordo com o estadiamento cervical, sendo menor que 10% nos casos N0–N1 e aumentando até 30% nos pacientes com pescoço N2 e N3 (Sano & Myers, 2007).
2.1.3a Língua
A língua é um órgão complexo formado principalmente por músculo estriado esquelético em que os dois terços anteriores está na boca e o terço posterior na orofaringe. Apóia-se no assoalho bucal (músculos milo-hióide e osso hióide) e é conectada ao osso hióide (hioglosso), palato (palatoglosso) e processo estilóide (estiloglosso), de modo a aumentar sua mobilidade (Prince & Bailey, 1999). A língua é comumente acometida por tumores malignos, e CECs assintomáticos são freqüentemente observados em assoalho bucal, borda lateral de língua e palato mole, muito embora lesões avançadas iniciadas em assoalho bucal possam acometer também a língua e dificultar o reconhecimento do sítio primário (Johnson et al., 2005). Entretanto, raramente estes tumores são observados em dorso lingual (Coombes et al., 2008).
Os CECs de língua apresentam características biológicas e epidemiológicas distintas dos demais carcinomas da boca, com uma grande proporção acometendo mulheres, pacientes abaixo de 40 e indivíduos sem hábitos de tabagismo e/ou etilismo (Rusthoven, et al., 2008). Bell et al. (2007) avaliaram a influência do local do tumor primário no prognóstico em uma amostra de 215 pacientes com diagnóstico de CEC oral. A amostra foi dividida de acordo com o sítio anatômico em: língua (73 pacientes) e outras localizações (142 pacientes). Não foi verificada diferença na sobrevida de pacientes com CEC de língua, e os autores sugerem que um maior risco associado a estes pacientes se deve possivelmente à extensão de um tumor de base de língua. Contudo, este estudo não foi tinha uma amostra controle pareada, limitando assim a aplicação das conclusões.
Recentemente foram avaliados os casos da base de dados de câncer dos EUA e os resultados mostraram um pior prognóstico associado ao CEC de língua iniciais (T1 e T2, N0, M0), com maior propensão de recorrência loco-regional (Rusthoven, et al., 2008). Tumores T1 maiores que 1cm e T2 de língua possuem taxas de sobrevida semelhantes ou menores que tumores com estádio III e IV de outras localizações da boca e orofaringe. Desse modo, os autores sugerem que tumores iniciais de língua sejam tratados por esquema multimodal e não apenas por terapia de modalidade única. Porém, tumores de língua com profundidade maior que 5mm apresentam uma taxa de metástase cervical da ordem de 64%, sendo esta 16% nos tumores de menor profundidade. Este padrão de tumor confere desvantagem no prognóstico dos pacientes e pode ser utilizado como indicador de tratamento multimodal (O-charoenrat et al., 2003). A distância tumor-margem de ressecção também é um importante indicador de prognóstico de pacientes com tumores iniciais de língua, sendo 5mm um importante ponto de corte (Al-Rajhi et al., 2000).
O risco de metástases nodais em pacientes com CEC oral varia com a localização do tumor primário, aumentando no sentido lábio – orofaringe. Neste cenário, os tumores de língua têm mostrado maiores taxas de complicação local e
menor sobrevida que lesões de outros sítios anatômicos da boca (Bell et al., 2007). A taxa de metástases regionais oculta varia de 20 a 40% neste grupo de tumores, sendo esta atribuída a limitações dos exames complementares (Ferlito et
al., 2001). Uma vez que o envolvimento nodal ocorre independente do tamanho do
tumor, tumores primários pequenos podem ocasionar metástases cervicais enquanto tumores maiores podem não fazê-lo (Sano & Myers, 2007). Assim, a determinação de métodos capazes de predizer envolvimento nodal são cada vez mais estudados. Wangsa et al. (2008) verificaram que o Ki-67 é um importante marcador de prognóstico de tumores T1 de língua, observando uma recorrência loco-regional de 78% nos pacientes com IM (índice de marcação) maior que 50%. No entanto, este marcador não apresentou correlação com prognóstico e sobrevida nos demais estágios. A tomografia por emissão de pósitrons (PET) também tem sido descrita como uma importante ferramenta no estadiamento e avaliação de prognóstico de pacientes com malignidade de cabeça e pescoço, podendo ser considerada o exame de escolha para avaliação de falha a distância (Ferlito et al., 2001). Contudo, pacientes com pescoço clinicamente negativo e com um teste negativo não deverão ter o planejamento terapêutico alterado uma vez que a taxa de falso-negativos ainda é considerável, muito embora um teste positivo seja um parâmetro confiável no diagnóstico de depósitos metastáticos, possuindo um alto valor preditivo (Nahmias et al., 2007).
2.1.4 Gradação histológica
Na tentativa de correlacionar características morfológicas dos tumores aos seus parâmetros clínicos, diversos sistemas de gradação histológica têm sido propostos e alguns são utilizados na avaliação de tumores de órgãos como próstata (Gleason & Mellinger, 1974), mama (Tsuda et al., 1998) e melanomas de pele (Garbe et al., 2007) e representam um método importante de avaliação de prognóstico. Apesar dos esforços na tentativa de avaliação sistematizada dos
CECs de boca ainda não existe um modelo universalmente aceito e utilizado rotineiramente na prática da histopatologia. Contudo, dois sistemas de gradação (Anneroth et al., 1987; Bryne et al., 1992) tem sido amplamente utilizados em estudos clínico-patológicos, sendo ambos baseados em critérios semelhantes (Tabela 1).
No seu estudo, Anneroth et al. (1987) revisaram exaustivamente a literatura, e propuseram um novo sistema de gradação histológica. Os autores ponderaram que taxas de sobrevida, sito anatômico do tumor primário, presença de margens histológicas positivas, estadiamento clínico e tratamento inicial devem ser considerados em estudos de prognóstico, e somente por meio de uma seleção criteriosa da amostra é que dados confiáveis serão gerados. Desse modo propõem um sistema que avalia dois parâmetros: população de células tumorais e relação tumor-hospedeiro. O primeiro aspecto considera o grau de queratinização, pleomorfismo nuclear e número de mitoses enquanto o segundo avalia padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório, sendo os critérios gradados de 1 a 4.
Logo em seguida, Bryne et al. (1989) utilizaram o sistema de Anneroth nas células mais anaplásicas da porção mais invasiva do tumor, excluindo o critério estágio de invasão de modo a possibilitar a utilização de material proveniente de biópsia. Tumores menos diferenciados apresentaram pior prognóstico segundo estes critérios. Em 1991 este mesmo grupo sugere uma nova modificação nos critérios de Anneroth na tentativa de diminuir o número de graus e aumentar a concordância interexaminador (Bryne et al., 1991). Contudo, apenas em 1992 foi feita a modificação final do que viria a ser chamado sistema de gradação de Bryne et al. (1992). Neste modelo, os autores diminuíram os critérios morfológicos, removendo a avaliação do número de mitoses, e continuaram a avaliar apenas o front tumoral. Observou-se uma maior concordância geral e uma correlação do escore geral mais elevado com um pior prognóstico.
Desde então vários estudos têm utilizado estes sistemas de gradação histopatológica ou os seus parâmetros individualmente, avaliando a associação destes com eventos clínicos desfavoráveis ou com um pior prognóstico (Bryne et
al., 1995; Spiro et al., 1999; Sawair et al., 2003; Kurokawa et al., 2005, Pinto,
2008). Quando os parâmetros são analisados individualmente, a queratinização e o padrão de invasão das células no front tumoral destacam-se dos demais e se mostram como os mais importantes na avaliação do prognóstico, podendo ser mais significativos que a soma dos escores (Odell et al., 1994; Bryne et al., 1995; Bundgaard et al., 2002; Sawair, 2003).
Alguns estudos compararam os sistemas de Anneroth e Bryne e relataram resultados distintos. Kurokawa et al. (2005) avaliaram 124 pacientes portadores de CEC de língua e concluíram que tumores com escore total de Bryne maior que 8 apresentaram menores taxas de SLD, e escores maiores que 11 foram preditivos para metástases nodais, enquanto que o escore total de Anneroth não apresentou correlação com prognóstico ou com eventos clínicos importantes. Pinto (2008) verificou que o sistema de Anneroth é mais adequado que o de Bryne para análise de carcinomas de mucosa oral, e escores maiores que 15 foram associados a um pior prognóstico. Desse modo, apesar do esforço em estabelecer um critério com maior aceitação e utilidade na prática da histopatologia, as divergências observadas e a pouca familiaridade dos patologistas com os sistemas disponíveis adiam esta realidade.
Tabela 1. Critérios de gradação histológica de Anneroth e Bryne. Parâmetro morfológico Escore 1 2 3 4 Grau de queratinização Alto (>50% das células) Moderado (20-50% das células) Mínimo (5-20% das células) Ausência de queratinização (0-5% das células) Pleomorfismo nuclear Discreto (>75% de células maduras) Moderado (50-75% de células maduras) Significativo (25-50% de células maduras) Predominante (0-25% células maduras) Número de mitoses*# 0 a 1 2 a 3 4 a 5 >5 Padrão de invasão Bordas bem delineadas Ilhas ou cordões infiltrantes Grupos ou cordões de células (n>15) Células soltas ou pequenos grupos (n<15) Estágio de invasão* Carcinoma in situ Invasão apenas da lâmina própria Tumor adjacente à músculo, glândula ou periósteo Tumor profundamente no estroma; invasão óssea Infiltrado
linfoplasmocitário Abundante Moderado Discreto Ausente * Critérios excluídos do sistema de Bryne.
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Avaliado em aumento original de 400x.
2.2 MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR
Por definição, um marcador de proliferação celular deve ser um indicador da fração de células em estado proliferativo e para tanto dois requisitos básicos são necessários: (1) expressão contínua durante o ciclo celular de todos os tipos celulares e (2) mudança para um estado “não proliferativo” ser acompanhada por rápido desaparecimento da proteína (van Dierendonck et al., 1989). Desse modo, um marcador ideal deverá ser expresso nas fases ativas do ciclo celular, ou seja, nas células em entrarão em mitose. Todavia, a opção pela
divisão celular será feita apenas por algumas células, enquanto algumas outras podem iniciar o ciclo e entrar em G0 ou seguir a via de diferenciação terminal. Desse modo, um marcador de proliferação celular é capaz de indicar apenas o potencial de divisão de uma célula sem predizer se a mesma efetivamente finalizará este processo (Scholzen & Gerdes, 2000). Contudo, considerando a aplicação na patologia, os marcadores de proliferação celular podem ser classificados em três grupos principais: marcadores de fração de proliferação celular, marcadores de fases específicas do ciclo celular e marcadores do tempo do ciclo celular (Pich et al., 2004).
2.2.1 Ki-67
A proteína Ki-67 foi originalmente identificada pelo protótipo do anticorpo monoclonal Ki-67 gerado por ratos imunizados com células de linfoma de Hodgkin da linhagem L428. Seu nome é derivado da cidade de origem (Kiel - Alemanha) e do número do clone original em uma placa de 96 wells. A proteína manteve o nome original, pois não foi encontrada homologia com nenhum polipeptídio conhecido (Scholzen & Gerdes, 2000). A proteína Ki-67 tem expressão exclusivamente no núcleo de células em fase ativa de ciclo celular, que inclui G1, S, G2 e mitose, e não é observada em células em G0 (Gerdes et al., 1984). Inicialmente sua natureza era desconhecida, e foi reconhecida como proteína somente quando Gerdes et al. (1991) identificaram o cDNA correspondente em uma biblioteca genômica. Foram descritas originalmente 2 isoformas da proteína, com pesos moleculares de 320 e 359 kD, geradas a partir de splicing alternativo de um transcrito de um mesmo gene. A proteína Ki-67 é expressa por todas as populações celulares em proliferação, muito embora a positividade para este antígeno não signifique que a célula irá completar o ciclo celular (Scholzen & Gerdes, 2000).
A avaliação da expressão de Ki-67 como fator prognóstico foi inicialmente realizada em tumores de mama e próstata, onde foi observada uma alta expressão estava associada a um pior prognóstico (Gerdes et al., 1986; Raymond et al., 1988; Pierga et al., 1996). Nas neoplasias de cabeça e pescoço também foi observado que uma alta taxa de proliferação celular mensurada pela expressão de Ki-67 está associada a um pior prognóstico de CECs orais, tumores de glândula salivar e carcinomas de laringe. Wangsa et al. (2008) verificaram que uma alta atividade proliferativa está associada a um alto risco de recorrência loco-regional de CECs T1 de língua tratados por cirurgia exclusiva, e concluem que o Ki-67 é um potencial marcador de indicação de tratamento adicional à cirurgia. Silva et al. (2004) observaram que pacientes com CEC oral mostrando expressão de Ki-67 maior que a mediana possuíam uma sobrevida em 3 anos menor que 32%, contrastando com uma taxa de 50,8% nos demais pacientes. A expressão de Ki-67 nos tumores de glândula salivar também possui importante correlação com prognóstico, sendo esta observada em diversos tipos tumorais (Skalova et al., 1994a; Skalova et al., 1994b; Nordgård et al., 1997). Contudo, alguns resultados conflitantes podem ser observados. Davies et al. (2006) verificaram que a marcação de Ki-67 menor que 33% em tumores N0 de língua tinha um alto valor preditivo de recorrência. Apesar destes achados, o Ki-67 é o principal marcador de proliferação celular utilizado na prática da histopatologia.
2.2.2 Proteína de Manutenção de Minicromossomo 2 (mcm-2)
A replicação cromossômica de células eucarióticas normais é regulada rigorosamente e está associada com a progressão do ciclo celular (Reid et al., 1987). Durante o primeiro passo da replicação na transição M/G1, as proteínas Cdc6 e Cdt1 se associam com o complexo de reconhecimento de origem (ORC) para facilitar o carregamento dos complexos protéicos mcm 2-7 e da helicase
replicativa sobre a cromatina. Notavelmente, o carregamento do complexo Mcm estabelece uma licença de replicação para a cromatina. No segundo passo, outros componentes estabelecem as forquilhas de replicação bi-direcionais para controlar a entrada na fase S. A ativação da quinase Cdc7 dependente de Dbf4 e das quinases dependentes de ciclinas na transição das fases G1/S resulta na alteração conformacional do complexo mcm que passa de uma estrutura globular para uma estrutura plana (dependente de fosforilação), concomitante ao desenrolamento local de um pequeno segmento de DNA, e a interação do complexo mcm com Cdc45. A duplicação de DNA é iniciada quando a proteína A (RPA) e a DNA polimerase α-primase são recrutadas para esta região já desenrolada do DNA. De forma significativa, o desmonte do complexo pré-replicativo previne o início da replicação ou re-replicação durante o mesmo ciclo celular, de modo que os cromossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular.
As proteínas mcm estão presentes em todas as fases do ciclo celular proliferativo, mas estão ausentes na fase quiescente e desta forma têm sido consideradas uma nova classe de marcadores de proliferação celular (Stoeber et al., 2001). A expressão das proteínas mcm está desregulada em um grande número de lesões neoplásicas e pre-neoplásicas, e representam potenciais marcadores tumorais em vários órgãos como cérvice uterino, esôfago, bexiga, próstata e cérebro (Williams et al., 1998; Freeman et al., 1999; Stoeber et al., 1999; Going et al, 2000; Meng et al., 2001). Deste grupo, tem sido demonstrado que as proteínas 2 e 5 podem ser importantes na identificação de lesões malignas e pré-malignas (Freeman et al., 1999). Altos índices de mcm-2, por exemplo, têm sido considerados marcadores de prognóstico de carcinomas renais, além de ser um método de screening de carcinomas colo-retais (Kodani et al., 2003). Além disso, níveis elevados de mcm-5 em sedimentos de urina são altamente preditivos de câncer do trato genito-urinário (Stoeber et al., 1999; Meng et al., 2001; Stoeber et al., 2002). Estes novos biomarcadores de progressão de câncer têm sido usados para o desenvolvimento de um exame imunofluorométrico automático
objetivando a detecção inicial não-invasiva de câncer do trato genito-urinário. Um estudo clínico cego de 355 pacientes demonstrou alta especificidade e sensibilidade (95%) na avaliação de lesões prostáticas, e estes achados sugerem que é um método simples, não-invasivo, altamente sensível e específico para detectar o câncer do trato genito urinário e podendo afetar fortemente seu tratamento (Meng et al., 2001). Ele diminuirá a morbidade, aumentará a qualidade de vida do paciente, melhorará o prognóstico dos pacientes com doenças potencialmente invasivas e diminuirá os custos do tratamento (Meng et al., 2001). Portanto, alguns autores sugerem que mcm-2 é um importante marcador de prognóstico de diversos tipos tumorais, contudo a regulação da via que permite a replicação do DNA, e especialmente o papel das proteínas da família mcm em câncer de cabeça e pescoço, precisam ser mais bem investigados. (Freeman et al., 1999; Kato et al., 2003; Vargas et al., 2008).
2.2.3 Geminina
Ao final da mitose e início da interfase há requisição de diversas proteínas para preparar a célula para a rodada seguinte de replicação do material genético. Antes da ligação do complexo mcm ao genoma, diversos fatores de iniciação possibilitam o licenciamento do DNA para a replicação, envolvendo mecanismos críticos ao impedimento da re-replicação (Gonzalez et al., 2003). A geminina é uma proteína fundamental ao controle da replicação do genoma, sendo expressa durante a fase S, após o início da duplicação do DNA, quando irá impedir a ligação da Cdt1 à origem de replicação. Desse modo, previne a ligação do complexo mcm e inibe a re-replicação (Wohlschlegel et al., 2000). A geminina é mantida durante as fases G2 e M, até a transição anáfase-telófase, quando é degradada pelo complexo promotor de anáfase (APC) (McGarry & Kirschner, 1998). Num ciclo celular normal, não é expressa em G1 e, portanto não impede a
formação do complexo pré-replicativo (Wohlschlegel et al., 2002). Sua degradação também é um processo crítico uma vez que promove liberação da Cdt1 e permite a próxima rodada de licenciamento replicativo (Luo & Kessel, 2004).
Apesar de ser um importante regulador do ciclo celular, atuando como fator de inibição da replicação do DNA, a geminina é super expressa em diversos tumores, sendo o número de células positivas diretamente proporcional ao índice de proliferação celular mensurado pela expressão de Ki-67. Ao se comparar a expressão de geminina em diferentes tipos de tecidos normais e neoplásicos, Wohlschlegel et al. (2002) observaram que tecidos normais mostram uma expressão da proteína limitada às células em proliferação, e tumores mostram up
regulation considerável da mesma (Wohlschlegel et al., 2002). Gonzalez et al.
(2004) verificaram uma alta expressão de geminina em carcinomas não-familiares de mama, que se mostrou um marcador independente de desfecho clínico adverso. Os autores não observaram mutações ou deleções neste gene, o que fala contra sua possível ação como supressor tumoral. Ainda, a maior expressão da proteína não foi relacionada à amplificação do gene, possibilitando concluir que a expressão de geminina é associada à proliferação celular. Uma vez que a expressão de geminina ocorre durante a fase S até início da mitose, esta pode ser considerada um marcador de progressão do ciclo celular. Contraditoriamente, nos astrocitomas de alto grau a alta expressão de geminina esteve correlacionada a um melhor prognóstico (Shrestha et al., 2007). Vargas et al. (2008), realizaram o único estudo que avalia a expressão de geminina em tumores de cabeça e pescoço (glândulas salivares) e não observaram relação entre expressão e prognóstico. Portanto o papel da geminina como marcador de proliferação celular, e possível indicador de pior prognóstico deve ser mais bem analisado.
2.3 ACTINA DE MÚSCULO LISO
A actina de músculo liso é uma proteína de diferenciação de musculatura lisa que melhor caracteriza os miofibroblastos, células que possuem características intermediárias entre o fibroblasto e a célula muscular lisa (Powell et
al., 2005). Sua morfologia assemelha-se a de fibroblastos, mostrando-se
alongados, fusiformes ou estrelados com núcleo central (Mike & Östman, 2004). Entretanto, são capazes de secretar citocinas, fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, mediadores inflamatórios, proteínas da adesão e proteínas da matriz extracelular (Orimo & Weinberg, 2006).
A transformação maligna de células epiteliais promove modificações em todo estroma tumoral, que passa a influenciar o comportamento das células neoplásicas (Kellerman et al., 2007). O estroma tumoral é composto por componentes da matriz extracelular, células inflamatórias, células endoteliais, fibroblastos e miofibroblastos, sendo responsável principalmente pela sustentação e aporte sanguíneo das células neoplásicas (Zigrino et al., 2005; Baglole et al., 2006). Ao tornar-se ativado, promove a transdiferenciação de fibroblastos em miofibroblatos, num processo independente do pleomorfismo do tumor. Desse modo, os miofibroblastos não são vistos no estroma de lesões potencialmente malignas nem em áreas livres de tumor, o que sugere que um contato próximo ao tumor é necessário à indução da transdiferenciação (Kellerman et al., 2008).
Os miofibroblastos promovem ainda maior deposição de colágeno, expressão de formas variantes de fibronectina e maiores taxas de proliferação celular, sendo a expressão de AML o marco do fenótipo miofibroblástico (Lewis et
al., 2004). A ativação destas células é dependente de TGF-β1 expresso por
diversos tumores, que promove também a secreção de proteases e proteínas da matriz (Wakefield & Roberts, 2002). Apesar do TGF-β1 possuir propriedades antiproliferativas, as células tumorais tornam-se refratárias a este efeito, de modo
que esta citocina promove ativação do estroma tumoral e transdiferenciação de fibroblastos, cujos efeitos são, em última análise, aumento da colagenização estromal, maior proliferação de células tumorais e maior capacidade de invasão, ou seja, aumento da agressividade do tumor (Lewis et al., 2004, Kellerman et al., 2008; Nielsen et al., 2008).
3. PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste estudo foram:
• Classificar os tumores de acordo com a gradação histológica segundo os critérios de Anneroth et al. (1987) e Bryne et al. (1992).
• Avaliar a expressão imunoistoquímica das proteínas mcm-2, geminina, Ki-67 e actina de músculo liso em carcinomas espinocelulares de língua e comparar os índices de marcação das mesmas.
• Avaliar a correlação das características histológicas com a expressão imunoistoquímica dos marcadores acima e verificar possíveis associações com o prognóstico.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas relativas à ética em pesquisa com seres humanos e satisfazem as exigências do Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde, de acordo com o parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas (nº 62/2006 – Anexo 1).
4.2 AMOSTRA
Foram retrospectivamente analisados 63 casos de CEC de língua tratados no Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia do Hospital do Câncer A.C. Camargo, São Paulo – SP, no período de 1989 a 1996. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos à cirurgia como primeiro tratamento, estadiados de acordo com o sistema TNM e classificados como M0 no momento do diagnóstico. Parte dos casos utilizados foram publicados previamente (Kellerman et al., 2007).
Os critérios de inclusão dos pacientes na amostra foram lesões de língua com biópsia prévia ao tratamento e diagnóstico histopatológico de CEC, paciente virgem de tratamento do tumor primário e cirurgia como tratamento inicial no Hospital do Câncer A.C. Camargo. Os casos com menos de 5 anos de seguimento clínico (excetuando-se os casos de morte pela doença) foram excluídos da avaliação.
4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Um fragmento representativo da peça cirúrgica foi obtido e histologicamente processado. Foram realizados cortes histológicos com 5 μm de espessura dos blocos contendo um fragmento da peça cirúrgica contendo o front de invasão de 63 CECs de língua, que foram corados em H&E de acordo com o protocolo utilizado no Laboratório de Patologia da FOP-UNICAMP. Procedeu-se a gradação histológica dos tumores de acordo com os critérios descritos por Anneroth et al. (1987), que considera o grau de queratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses em aumento de 400X, padrão de invasão, estágio de invasão (profundidade do tumor) e grau do infiltrado linfomonoplasmocitário. Utilizaram-se também os critérios propostos por Bryne et al. (1992), que modifica a gradação proposta por Anneroth et al. (1987) excluindo os critérios número de mitoses e estágio de invasão e avaliando os demais critérios no front invasivo do tumor, que foi considerado como a porção do tumor em contato com o tecido conjuntivo adjacente. Os dados sobre presença embolização sanguínea e linfática, invasão perineural, espessura do tumor e presença metástases cervical foram obtidos do prontuário.
A análise dos cortes foi realizada em microscopia de luz por meio de microscópico binocular (Nikon YS 100, Japão) adaptado com ocular WSCF 10X/18 e objetivas NIKON 4X/0,10, 10X/0,25, 40X/0,65 e 100X/1,25. Todos os casos foram seqüencialmente numerados e a identificação do registro original foi omitida. A leitura das lâminas foi realizada de modo independente por 2 avaliadores (LAMG e MAL). Nos casos onde houve discordância a lâmina foi reavaliada a fim de obter-se um consenso.
4.4 REAÇÕES IMUNOISTOQUÍMICAS
Para as reações imunoistoquímicas foram realizados cortes de 3 μm de espessura nos blocos de parafina. Os cortes foram fixados em lâminas previamente silanizadas, diafanizados em xilol e hidratados em concentrações decrescentes de álcool. Após lavagem com água corrente e destilada, procedeu-se o bloqueio da peroxidaprocedeu-se endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes em 5 banhos de 5 minutos cada. A recuperação antigênica e as soluções de tampão, bem como a concentração dos anticorpos primários, estão listados na tabela 2. Após esta etapa, as lâminas foram então deixadas a temperatura ambiente para resfriar e lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH=7,4.
Posteriormente, os cortes foram tratados com 1% albumina sérica bovina (BSA) em PBS e incubado com o anticorpo primário em câmara úmida por 18 horas a 4ºC, seguido então por 3 lavagens em solução de PBS. Ao término deste período as lâminas foram lavadas em solução PBS por três vezes, e foram então expostas ao anticorpo secundário de acordo com a tabela 2. Para o LSAB™
foi adicionada inicialmente a biotina e as lâminas colocadas em estufa à 37ºC por 30 minutos e posteriormente lavadas em três banhos de PBS. Em seguida foi adicionada a streptavidina e as lâminas igualmente levadas a estufas à 37ºC por 30 minutos e lavadas com três banhos de PBS. Após o descarte do PBS, as lâminas foram incubadas com o cromógeno diamino-benzidina (DAB) ativado e levadas à estufa a 37ºC por 5 minutos. Para o Advance™ HRP também são realizadas 2 incubações em estufa a 37ºC por 30 minutos, a primeira com o Advance™ HRP Link e, após três lavagens em PBS, a segunda incubação foi realizada com a enzima Advance™ HRP. Todas as lâminas foram contra-coradas por 3 minutos com hematoxilina de Carazzi, lavadas em água corrente e destilada, desitratadas, diafanizadas em xilol e montadas em Bálsamo do Canadá. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações.
Tabela 2. Anticorpos primários e dados da metodologia utilizada. Anticorpo
primário Clone
Diluição, recuperação, anticorpo
secundário Fabricante
AML 1A4 1:400, ácido cítrico 0,01M pH=6,0,
microondas 24 min, LSAB™ Dako
Ki-67 MIB-1 1:200, ácido cítrico 0,01M pH=6,0,
microondas 24 min, LSAB™ Dako
Mcm2
NCL-MCM2
1:50, ácido cítrico 0,01M pH=6,0, panela de
pressão 3 min, Advance™ Novocastra
Geminina NCL-geminin
1:50, ácido cítrico 0,01M pH=6,0, panela de
pressão 3 min, Advance™ Novocastra
A porcentagem de células positivas para Ki-67, mcm-2 e geminina foi determinada após contagem de 1000 células de cada lâmina, em aumento de 400X, realizada no sistema de análise de imagem KONTRON KS400 (Carl Zeiss, Alemanha). Foram consideradas positivas as células com marcação nuclear independente da intensidade. A avaliação dos marcadores de proliferação celular considerou o índice de marcação (IM) como o percentual de células positivas, e este foi utilizado como variável contínua. Os marcadores também foram categorizados pela mediana em dois grupos, igual ou menor que a média e maior que a média, semelhantemente ao realizado por outros autores (Davies et al., 2006; Wangsa et al., 2008). A avaliação da porcentagem de células positivas para AML foi determinada de forma quantitativa por 2 observadores independentes (LAMG e MAL). Estabeleceu-se uma classificação em 3 graus: negativo, quando menos de 5% das células do estroma e front foram marcadas, escasso, quando menos de 50% das células do estroma e front foram positivas, e abundante, quando mais de 50% das células do estroma e front foram positivas para este marcador (Tabela 3), de acordo com os critérios utilizados por Kellermann (2007). Avaliou-se 2 áreas do tumor: o estroma tumoral, representado pela área de tecido
conjuntivo que permeia as células tumorais, e o fronte invasivo, considerado como a porção de tecido conjuntivo entre as células tumorais mais invasivas e o tecido normal adjacente. Os casos foram revistos conjuntamente e quando houve discordância na classificação foram discutidos individualmente.
Tabela 3 – Descrição dos critérios de avaliação da marcação com actina de músculo liso.
Padrão da reação Estroma tumoral Fronte invasivo
Negativa (<5%) 0 0
Escassa (5%<n<50%) 1 1
Abundante (>50%) 2 2
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística os dados foram trabalhados no programa NCSS 2000 (NCSS, Kaysville – EUA) por meio de testes paramétricos e não-paramétricos. A relação entre os fatores clínicos (como gênero, idade, tabagismo, consumo regular de álcool, tamanho do tumor, comprometimento linfonodal e recorrência), critérios histopatológicos e imunoistoquímicos foi realizada por meio do teste exato de Fischer em tabelas de contingência. O teste paramétrico utilizado foi a análise de variância (ANOVA), que comparou as médias dos índices de marcação e dos escores totais de Anneroth e Bryne.
A sobrevida global foi avaliada a partir da data do diagnóstico até a data da última visita ou óbito do paciente. A sobrevida livre de doença foi avaliada a partir da data do início do tratamento até a data do diagnóstico da recorrência ou data da última visita de acompanhamento. A análise de sobrevida global e livre de doença foi realizada por meio do método de Kaplan-Meier. As curvas de sobrevida foram determinadas de acordo com as variáveis estudadas (clínico-patológico e
expressão dos marcadores) por meio do teste de log-rank. A significância estatística foi definida por erro alfa menor que 5% (p<0,05). Também foi aceito como segundo nível de significância um erro alfa menor que 10% devido ao tamanho da amostra e à utilização de testes não paramétricos.
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS E CLÍNICAS
A amostra estudada foi composta por 63 pacientes com CEC de língua e apresentou uma forte predileção pelo gênero masculino, com 51 casos (80,95%) ocorrendo em homens e 12 em mulheres (19,05%). A idade dos pacientes variou de 31 a 92 anos, com média de 57,6 anos (dp = 11,81) e mediana de 58 anos. Com relação ao hábito de fumar, observou-se que 54 pacientes (85,72%) eram fumantes e apenas sete (11,11%) não fumavam. Do mesmo modo, 52 pacientes (82,54%) relataram consumo regular de bebidas alcoólicas enquanto 10 (15,87%) não consumiam este tipo de produto. Não foi possível recuperar do prontuário a informação de hábito de tabagismo de 2 pacientes e consumo regular de bebidas alcoólicas de 1 paciente (Tabela 4).
Com relação ao tamanho do tumor, observou-se que 11 casos (17,46%) foram classificados como T1, 21 casos (33,33%) como T2, 23 casos (36,51%) como T3 e 8 casos (12,7%) como T4, mostrando maior prevalência de tumores T2 e T3 (69,84%). A maioria da amostra não apresentou linfonodos metastáticos ao diagnóstico (63,49%). Por outro lado, 36,51% dos pacientes apresentaram metástase regional, e destes a maioria (17 casos – 26,98%) foi classificada como N1. A maioria dos pacientes apresentou estádio clínicos III (41,27%) e IV (19,05%), e apenas 25 pacientes apresentaram estádios I (15,87%) e II (23,81%). Todos os pacientes tiveram o tumor primário tratado por cirurgia, de modo que 31 pacientes (49,2%) receberam cirurgia exclusiva, 31 (49,2%) receberam associação de cirurgia e radioterapia e apenas 1 paciente (1,59%) foi tratado pela associação cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Observou-se uma alta taxa de recorrência, sendo esta presente em 32 casos (50,79%), na forma de recorrência local em 20 pacientes (31,75%), metástase regional em 12 pacientes (19,05%) e metástase à distância em 13 pacientes (20,63%) (Gráfico 2). De acordo com a última informação obtida, 38 pacientes (60,32%) estavam mortos enquanto 25
(39,68) estavam vivos. A sobrevida em cinco anos foi de 47,62% e em 10 anos de 14,29%.
Tabela 4a. Características clínicas da amostra.
Variáveis Pacientes % Idade Variação 31 – 92 Média 57,6 Mediana 58 Gênero Masculino 51 80,95 Feminino 12 19,05 Hábito de fumar Não 7 11,11 Sim 54 85,72 Não informado 2 3,17 Hábito de beber Não 10 15,87 Sim 52 82,54 Não informado 1 1,59 Estádio T T1 11 17,46 T2 21 33,33 T3 23 36,51 T4 8 12,70 Estádio N N0 40 63,49 N1 17 26,98 N2 5 7,94 N3 1 1,59 Estadiamento Estádio I 10 15,87 Estádio II 15 23,81 Estádio III 26 41,27 Estádio IV 12 19,05 Tratamento Cirurgia 31 49,20 Cirurgia+radioterapia 30 47,62 Cirurgia+radioterapia+quimioterapia 1 1,59 Radioterapia+cirurgia 1 1,59
Tabela 4b. Características clínicas da amostra. Variáveis Pacientes % Recorrência Não 31 49,21 Sim 32 50,79 Local 20 31,75 Metástase regional 12 19,05 Metástase distância 13 20,63 Status atual Vivo 25 39,68 Morto 38 60,32 Sobrevida 5 anos 30 47,62 10 anos 9 14,29
Gráfico 2. Relação dos casos de recidiva local, metástase cervical e metástase à distância.
5.2 CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS
A maior parte dos casos (53 – 84,13%) apresentou margens cirúrgicas livres, muito embora 4 casos (6,35%) mostraram margens exíguas e 6 casos (9,52%) margens comprometidas. A presença de êmbolos tumorais em vasos sanguíneos foi observada em 8 tumores (12,7%), enquanto ocorrência em vasos linfáticos foi bem maior (26 casos – 41,27%). Ainda, a presença de invasão perineural foi observada em 17 espécimes (26,98%). A espessura do tumor variou de 4mm a 93mm, com uma média de 26,03mm (dp = 19,44) e mediana de 21mm (Tabela 5).
Cinqüenta pacientes (79,36%) foram submetidos a esvaziamento cervical e apenas 13 pacientes (20,64%) não foram submetidos este procedimento. Os pacientes com pescoço esvaziado tiveram de 10 a 114 linfonodos avaliados, com média de 41,36 e mediana de 35. Vinte e dois pacientes (34,92%) não mostravam presença de metástase. Dos pacientes com metástase cervical, dez (15,87%) apresentaram ruptura de cápsula (Tabela 5).
Os tumores foram classificados de acordo com suas características histopatológicas com base nos critérios de Anneroth et al. (1987) e Bryne et al. (1992). As figuras 1 a 6 ilustram os critérios histopatológicos considerados.
De acordo com o sistema de gradação de Anneroth et al. (1987) observou-se que grande parte dos casos apresentou mais de 50% de áreas queratinizadas (44 – 69,84%), correspondendo ao escore 1 de queratinização. Os escores 2, 3 e 4 foram observados em 19 casos (30,16%). O pleomorfismo nuclear apresentou grande concentração nos escores 1 e 2, correspondendo a escores mais leves de pleomorfismo (47 casos, 74,61%). Poucos casos (5 – 7,93%) apresentaram escore máximo de pleomorfismo. O número de mitoses apresentou pouca variação, de modo que 55 casos (87,31%) apresentaram 0 ou 1 mitose por campo de maior aumento (escore 1). Nenhum caso apresentou o
escore máximo de mitoses (mais de 5 mitoses por campo de maior aumento). Por outro lado, o padrão de invasão e estágio de invasão foram quase semelhantes,
Tabela 5. Características histopatológicas da amostra.
Variáveis Pacientes (%) Margens Livres 53 84,13 Exíguas 4 6,35 Comprometidas 6 9,52 Êmbolos sanguíneos Não 55 87,30 Sim 8 12,70 Êmbolos linfáticos Não 37 58,73 Sim 26 41,27 Invasão perineural Não 46 73,02 Sim 17 26,98 Espessura do tumor Variação 4 – 93 Média 26,03 Mediana 21 Esvaziamento cervical Não 13 20,64 Sim 50 79,36 Avaliados Variação 10 – 114 Média 41,36 Mediana 35 Comprometidos Não 22 34,92 Sim 28 44,44 Variação 1 – 22 Média 3,28 Mediana 2 Ruptura de cápsula Não 18 28,57 Sim 10 15,87
Figura 1 – Tumores classificados de acordo com o escore de queratinização. A. Escore 1, tumor altamente queratinizado (mais de 50% de células) H&E, aumento original, x100; B. Escore 2, tumor moderadamente queratinizado (entre 20 e 50% das células). H&E, aumento original, x100; C. Escore 3, tumor com queratinização mínima (entre 5 e 20% das células). H&E, aumento original, x100; D. Escore 4, tumor sem queratinização (menos de 5% das células). H&E, aumento original, x100.
Figura 2 – Tumores classificados de acordo com o escore de pleomorfismo. H&E, aumento original, x100. A. Escore 1, pouco pleomorfismo nuclear (mais de 75% de células bem diferenciadas); B. Escore 2, pleomorfismo nuclear moderado (entre 50 e 75% das células bem diferenciadas); C. Escore 3, pleomorfismo nuclear significativo (entre 25 e 50% das células bem diferenciadas); D. Escore 4, pleomorfismo nuclear predominante (menos de 25% das células bem diferenciadas).
