UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Dissertação
CLOSTRIDIOSES EM RUMINANTES NO SUL DO
RIO GRANDE DO SUL
Pedro de Souza Quevedo
Pelotas, 2010
PEDRO DE SOUZA QUEVEDO
CLOSTRIDIOSES EM RUMINANTES NO SUL DO RIO GRANDE DO SUL
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Dra.Ana Lucia Schild, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Veterinária, para a obtenção do título de Mestre em Ciências (M.Sc.).
Orientadora: Dra. Ana Lucia Schild
PELOTAS
Rio Grande do Sul - Brasil Dezembro de 2010
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
Q3c Quevedo, Pedro de Souza
Clostridioses em ruminantes no sul do Rio Grande do Sul / Pedro de Souza Quevedo. – Pelotas, 2010. – 65f. – Disserta-ção (Mestrado). Programa de Pós-GraduaDisserta-ção em Veterinária. Área de concentração: Patologia animal. Faculdade de Vete-rinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2010. - Ori-entador Ana Lucia Schild.
1.Veterinária. 2.Carbúnculo sintomático. 3.Botulismo. 4.Edema maligno. 5.Hemoglobinúria bacilar. 6.Tétano. 7.Enterotoxemia. 8.Clostridium spp. I.Schild, Ana Lucia.. I-I.Título.
Banca examinadora
Dra. Ana Lucia Schild
(Orientadora)
Prof. Dra. Glaucia Denise Kommers
Prof. Dr. Claudio Severo L. de Barros
RESUMO
QUEVEDO, Pedro de Souza. Clostridioses em ruminantes na região sul do Rio Grande do Sul. 2010.65f. Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Laboratório Regional de Diagnóstico, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas.
Foi realizado um estudo retrospectivo dos diagnósticos de clostridioses ocorridos na região sul do Rio Grande do Sul correspondente a área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas entre janeiro 1978 e janeiro de 2008 e acompanhados os casos de clostridioses diagnosticados nos anos 2009 e 2010. De um total de 5.446 materiais de bovinos provenientes de necropsias ou órgãos enviados 91 (1,67%) correspondiam a enfermidades causadas por bactérias do gênero Clostridium sendo 30 (0,55%) de carbúnculo sintomático, 15 (0,27%) de hemoglobinúria bacilar, 9 (0,16%) de botulismo, 9 (0,16%) de edema maligno e 28 (0,51%) de tétano. De 860 materiais de ovinos 49 (5,69%) diagnósticos corresponderam a doenças bacterianas e desses 14 (28,57%) foram de surtos de clostridioses. Dos 14 surtos de clostridioses observados em ovinos 10 (1,16%) foram de tétano, três (0,34%) de edema maligno e um (0,11%) de enterotoxemia. Concluiu-se que algumas clostridioses causam prejuízos econômicos à bovinocultura da região, principalmente o carbúnculo sintomático, recomendando-se a vacinação sistemática dos bovinos jovens contra esta clostridiose. Recomenda-se, também, a vacinação contra botulismo, em áreas de campo nativo onde ocorre carência de fósforo e contra hemoglobinúria bacilar em áreas de campos baixos onde ocorre infecção por
Fasciola hepatica. Em bovinos o tétano pode ocorrer como surtos com
prejuízos econômicos importantes, recomendando-se, também, a vacinação dos animais. Em ovinos as clostridioses têm pouca importância, sendo o tétano a mais frequente. Para a profilaxia desta doença em ovinos recomenda-se utilizar práticas de manejo, como descola e castração, em condições adequadas de higiene. Enterotoxemia é uma enfermidade rara na região por que a maioria dos ovinos permanece em campos nativos com limitada produção de foragem; recomenda-se a vacinação somente em animais em pastagens cultivadas ou suplementados com concentrados.
Palavras chave: Carbúnculo sintomático. Botulismo. Edema maligno. Hemoglobinúria bacilar. Tétano. Enterotoxemia. Clostridium spp.
ABSTRACT
QUEVEDO, Pedro de Souza. Clostridial diseases in ruminants in southern Rio Grande do Sul. 65f. Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Laboratório Regional de Diagnóstico, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas.
A retrospective study of clostridial diagnosed in ruminants from 1978-2008 in southern Rio Grande do Sul, was conducted in the influence area of the Regional Diagnostic Laboratory of the Federal University of Pelotas. Out of 5.446 bovine specimens sent by practitioners or from necropsies performed 91 (1,67%) were diagnosed as clostridiosis. Of those, 30 (0.55%) were diagnosed as by black leg, 15 (0.27%) as bacillary hemoglobinuria, 9 (0.16%) as botulism, 9 (0.16%) as malignant edema, and 28 (0.51%) as tetanus. Out of 860 sheep specimens 49 (5.69%) were bacterial diseases and 14 (28,57%) of those were diagnosed as clostridiosis, being 10 (1.16%) cases of tetanus, 3 (0.34%) of malignant edema, and 1 (0.11%) %) of enterotoxemia. It was concluded that some clostridiosis cause important losses in livestock in Rio Grande do Sul, mainly black leg. The vaccination of young stock against black leg is recommended in the whole state. Vaccination against botulism is recommended in areas of native pastures where phosphorus deficieny occurs, and vaccination against bacillary hemoglobinuria is recommended in low lands where fasciolosis is enzootic. In cattle, tetanus may occur as outbreaks with significant economic losses, recommending also the vaccination of animals. In sheep clostridioses are less important being tetanus the more frequent. Good hygienic practices, mainly during castration or tail are recommended to prevent the disease. Enterotoxemia is a rare disease in the region, because most sheep are raised in native pastures with limited grass production; vaccination is only recommended in sheep grazing in cultivate pastures or supplemented with concentrates.
KEY WORDS: Black leg. Botulism. Malignant edema. Bacillary hemoglobinúria. Tetanus. Enterotoxemia. Clostridium spp.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mapa com os municípios nos quais foram diagnosticados os casos de clostridioses no período entre 1978 e 2009. Pelotas (1), Capão do Leão (2), Pedro Osório (3), Arroio Grande (4), Rio Grande (5), Santa Vitória do Palmar (6), Jaguarão (7), Herval (8), Canguçú (9), São Lourenço do Sul (10), Camaquã (11), Piratini (12), Candiota (13), Rosário do Sul (14)... 38 Figura 2 Botulismo. Sinais clínicos. A. Animal com paralisia parcial dos
membros pélvicos. B. Animal com paralisia flácida da língua... 39 Figura 3 Distribuição sazonal dos casos de carbúnculo sintomático
diagnosticados na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico... 40 Figura 4 Carbúnculo sintomático. Bovino com aumento de volume na região
escapular esquerda... 40 Figura 5 Edema maligno. Bovino com aumento de volume no membro
posterior direito... 41 Figura 6 Tétano. Bovinos afetados nos diversos surtos diagnosticados em
decúbito lateral com os membros esticados, afastados do solo e opistótono (A, B, C e D). Observa-se timpanismo acentuado (D)... 42 Figura 7 Carbúnculo sintomático. Há necrose hemorrágica acentuada da
musculatura do membro anterior esquerdo... 42 Figura 8 Edema maligno. Observa-se edema hemorrágico subcutâneo
afetando também a superfície muscular... 43 Figura 9 Tétano. Bovino com lesão necrossupurativa e edema nos músculos
da tábua do pescoço... 43 Figura 10 Hemoglobinúria bacilar. Há icterícia da carcaça, os intestinos estão
avermelhados, embebidos por hemoglobina e há petequias e sufusões nas serosas...
44
Figura 11 Hemoglobinúria bacilar. A. Fígado de coloração alaranjada com foco necrótico característico. B. Urina avermelhada característica da enfermidade... 45 Figura 12 Tétano. Camundongo inoculadado com soro de bovino com tétano.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relação entre os cinco tipos de Clostridium perfringens (A-E) e as quatro principais exotoxinas (alfa, beta, épsilon e iota)... 47 Tabela 2 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de botulismo
diagnosticados em bovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 48 Tabela 3 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de carbúnculo
sintomático diagnosticados em bovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 49 Tabela 4 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de edema maligno
diagnosticados em bovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 51 Tabela 5 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de edema maligno
em ovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 52
Tabela 6 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de hemoglobinúria bacilar diagnosticados em bovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 53 Tabela 7 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de tétano
diagnosticados em ovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 55 Tabela 8 Aspectos epidemiológicos e clínicos dos surtos de tétano
diagnosticados em bovinos no sul do Rio Grande do Sul entre 1978-2009... 56
SUMÁRIO
RESUMO... IV ABSTRACT... V LISTA DE FIGURAS ... VI LISTA DE TABELAS... VII
1. INTRODUÇÃO ... 9
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 10
2.1 Gênero Clostridium ... 10
2.2.Principais clostridioses que afetam ruminantes ... 10
2.2.1. Botulismo ... 10
2.2.2. Tétano ... 13
2.2.3. Carbúnculo Sintomático ... 15
2.2.4. Gangrena gasosa ou Edema maligno ... 18
2.2.5. Hemoglobinúria Bacilar ... 21
2.2.6. Enterotoxemia ... 23
3. MATERIAL E MÉTODOS... 25
3.1. Estudo retrospectivo e prospectivo ... 25
3.2. Patologia... 25
3.3. Diagnóstico laboratorial... 26
4. RESULTADOS... 28
4.1. Epidemiologia e sinais clínicos ... 28
4.2. Patologia... 30 4.3. Diagnóstico laboratorial... 31 5. DISCUSSÃO ... 33 6. FIGURAS... 38 7. TABELAS... 47 8. CONCLUSÃO ... 60 9. REFERÊNCIAS ... 61
1. INTRODUÇÃO
O termo clostridiose é utilizado com frequência por veterinários e produtores rurais para designar genericamente algumas enfermidades causadas por microorganismos do gênero Clostridium (QUINN et al. 1994). Os clostrídios são bacilos gram-positivos, anaeróbios e microaerófilos, esporulados, fermentadores e catalase-negativo. São conhecidas mais de 100 espécies de clostrídios (CARTER et al. 1995). Os reservatórios naturais dos clostrídios são o solo e trato gastrintestinal dos mamíferos. Aproximadamente 10% das espécies do gênero são patogênicas. Estes agentes podem ser agrupados em neurotrópicos, C. botulinum e C. tetani; histotóxicos, C.
chauvoei, C. septicum, C. novyi tipos A, B e C, C. sordellii e C. haemolyticum;
e enterotoxêmicos, C. perfringens tipos A, B, C, D (QUINN et al. 1994). A maior parte das clostridioses é adquirida por ingestão das toxinas produzidas pelos clostridios ou pela contaminação de feridas (CARTER et al. 1995).
Na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD) da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) entre 1978 e 2009 de um total de 5.446 materiais de bovinos provenientes de necropsias realizadas ou órgãos enviados ao Laboratório, 91 (1,67%) corresponderam a enfermidades causadas por bactérias do gênero Clostridium.
Em ovinos de um total de 860 materiais provenientes de necropsias ou órgãos enviados ao Laboratório por veterinários e/ou produtores 14 (1,62%) tiveram diagnóstico de clostridiose.
O objetivo deste trabalho foi estudar a epidemiologia, a patologia e sugerir as possíveis formas de controle de enfermidades provocadas por bactérias do gênero Clostridium em ruminantes na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Gênero Clostridium
As bactérias do gênero Clostridium são responsáveis pela produção de diversas toxinas causando diferentes enfermidades de acordo com o efeito que cada uma produz sobre o organismo animal (CARTER et al. 1995). Desse modo, os clostrídios são divididos em três grupos. O primeiro é o grupo neurotóxico (tétano e botulismo) o segundo grupo consiste de clostridios com efeito histotóxico (carbúnculo sintomático, edema maligno e hemoglobinúria bacilar), e o terceiro é o enterotoxigênico (enterotoxemia) (QUINN et al. 1994).
2.2 Principais clostridioses que afetam ruminantes
2.2.1. Botulismo
Botulismo é uma enfermidade não febril (BARROS et al. 2006) causada pela ingestão de neurotoxinas produzidas pelo Clostridium botulinum (BARROS et al. 2006, COSTA et al. 2008, FERNANDES 2007), caracterizada
principalmente pela paralisia da musculatura esquelética. Afeta mamíferos, aves e peixes. O microrganismo é um bacilo gram-positivo, anaeróbio estrito, formador de esporos e putrefativo (BARROS et al. 2006, FERNANDES 2007, SILVA et al.1998). Os esporos podem estar presentes em água estagnada, solo ou trato digestivo e cadáveres de animais (BARROS et al. 2006, FERNANDES 2007). É relevante citar o risco à saúde pública, pois acomete
pessoas sendo os casos geralmente relacionados à produção e conservação de alimentos. Este risco é considerado devido a sua gravidade e alta letalidade. As neurotoxinas dos tipos A, B, E e F são patogênicas para o homem (FIGUEIREDO et al. 2006). A evolução do quadro clínico está relacionada com a quantidade de toxinas circulantes e a letalidade se relaciona ao período de incubação: quanto mais curto, maior o risco de morte. A toxina botulínica atua no sistema nervoso periférico bloqueando a transmissão neuromuscular, atingindo as membranas pré-sinápticas onde impede a liberação da acetilcolina nas terminações nervosas, ocasionando a paralisia. O soro antibotulínico deve ser administrado o mais rápido possível propiciando a eliminação da toxina circulante (FIGUEIREDO et al. 2006).
A ocorrência de surtos de botulismo em bovinos está intimamente relacionada à osteofagia, decorrente da deficiência de fósforo no solo e em forrageiras. Tem maior incidência em sistemas extensivos de criação sendo atualmente diagnosticado em quase todo o território nacional (COSTA et al.
2008). A prática de se deixar cadáver bovino em decomposição no campo, coloca em risco a saúde animal favorecendo e intensificando a contaminação ambiental (CURCI et al. 2007). Assim, o esporo se desenvolve produzindo toxinas que impregnam ossos porosos, tendões e ligamentos (FERNANDES 2007). Surtos ocorrem, também, pela ingestão de toxina via alimentos incorretamente armazenados (silagem, ração, feno), administração de cama de frango para os bovinos e ainda água contaminada (BARROS et al. 2006). Na região Centro-Oeste do Brasil, a enfermidade ocorre fundamentalmente entre os meses de outubro e maio, pois nesta época há maior oferta protéica nos campos e, portanto maior necessidade de fósforo (BARROS et al. 2006). Uma vez ingeridas as toxinas C e D, são absorvidas e transportadas via hematógena aos neurônios. Agem nas junções neuromusculares provocando paralisia flácida, sem alterar a função sensorial (BARROS et al. 2006). Afeta principalmente o sistema nervoso periférico, bloqueando a liberação de acetilcolina, desta maneira impedindo a chegada do impulso nervoso ao tecido muscular acarretando paralisia flácida (FERNANDES 2007).
Os sinais clínicos consistem em dificuldade na locomoção, paralisia flácida progressiva, acentuadamente dos membros pélvicos, decúbito external ou lateral, poliflexão dos membros e emboletamento, movimentos de pedalagem, diminuição do tônus da musculatura da língua e cauda, sialorreia nos casos superagudos (DUTRA et al. 2005), dificuldade respiratória, com inspiração bifásica predominantemente abdominal, bradicardia, posição de auto-auscultação com apoio do queixo ao solo e diminuição dos movimentos ruminais (BARROS et al. 2006, COSTA et al. 2008, DUTRA et al. 2005, FERNANDES 2007). O bom estado nutricional associado ao decúbito permanente e estado mental aparentemente normal mesmo após paralisia flácida muscular são característicos (FERNANDES 2007). Estes sinais clínicos são indícios claros do botulismo e auxiliam no diagnóstico clínico, diferenciando o botulismo de outras enfermidades do sistema nervoso dos bovinos (BARROS et al. 2006, DUTRA et al. 2005, FERNANDES 2007).
Não necropsias não são observadas lesões, uma vez que a toxina age nas junções neuromusculares provocando desordem neurotrópica (BARROS et al. 2006, DUTRA et al. 2005, FERNANDES 2007). Porções ósseas encontradas no rumem são indicativos de osteofagia e reforçam a suspeita de botulismo (FERNANDES 2007). Alterações inespecíficas incluem necrose de massas musculares devido ao decúbito, acúmulo de líquido no saco pericárdico e, em casos mais prolongados, degeneração gordurosa no fígado (BARROS et al. 2006). Para realização do diagnóstico considera-se: epidemiologia; histórico de vacinação, não suplementação com sal mineral e indícios de osteofagia; sinais clínicos de paralisia flácida com estado mental aparentemente normal e respiração bifásica; ausência de lesões macro e microscópicas (DUTRA et al. 2005). Isso permite diferenciar o botulismo de outras enfermidades do sistema nervoso central como raiva, listeriose, encefalite por herpes vírus bovino-5, intoxicação por cloreto de sódio e chumbo, e polioencefalomalacia (FERNANDES 2007). Enfermidades como miopatias nutricionais, intoxicação por Senna occidentalis e antibiótico ionóforo devem, também, ser diferenciadas de botulismo (BARROS et al. 2006).
Para a confirmação do diagnóstico clínico é necessária detecção das toxinas botulínicas, tipos C ou D, nas vísceras de animais que morreram com sintomatologia compatível a do botulismo (DUTRA et al. 2005). Quando a
toxina age na sinapse neuromuscular, perde a atividade biológica, dificultando consideravelmente sua detecção (BARROS et al. 2006). Mesmo assim, a inoculação intraperitoneal em camundongos (ensaio biológico) de extrato hepático, soro sanguíneo, conteúdo ruminal, conteúdo intestinal de animais com sinais clínicos evidentes é o teste mais específico (FERNANDES 2007). O material que deve ser enviado ao laboratório é composto por fígado (100g), conteúdos ruminal e intestinal (20 ml) e soro sanguíneo dos bovinos acometidos, sob refrigeração ou congelados (BARROS et al. 2006, FERNANDES 2007). Entretanto, considera-se o diagnóstico clínico eficiente. Em casos de dúvida podem ser utilizados outros métodos de diagnóstico, tais como o ensaio imunoenzimático (ELISA) (FERNANDES 2007). Tentativas de tratamento recomendam o fornecimento de solução saturada de hidróxido de magnésio aos bovinos expostos a toxina, cerca de dois litros por animal, via oral (COSTA et al. 2008). Por conseguinte, um quadro diarréico é induzido e desta forma minimiza-se a absorção intestinal da toxina. Além disso, pode-se realizar a aplicação de antitoxina botulínica. Com essa medida, alguns casos clínicos mais amenos podem ser estabilizados e os animais recuperados, no entanto a letalidade em geral chega a 100% (COSTA et al. 2008).
Medidas de controle e profilaxia compreendem a suplementação mineral do rebanho com níveis adequados de fósforo, eliminação de maneira correta das carcaças (incinerar) e a vacinação (BARROS et al. 2006, FERNANDES 2007). A vacina contém toxóide botulínico bivalente C e D e deve ser utilizada em bovinos a partir dos 120 dias, com reforço em 42 dias (BARROS et al. 2006, FERNANDES 2007, SILVA et al.1998).
2.2.2. Tétano
Tétano é uma doença infecciosa não contagiosa de etiologia conhecida desde o século XIX, quando foi experimentalmente reproduzida (SARAIVA et al.1984). É altamente letal e acomete todos os mamíferos (LOBATO & ASSIS 2005, LOBATO et al. 2007), porém os equinos são mais sensíveis (LOBATO & ASSIS 2005). Em ovinos, o tétano é mais frequente que em bovinos, ocorrendo
em consequência da castração, assinalação ou por feridas de tosquia (RIET-CORREA et al.1998).
O agente é comumente encontrado em solos contaminados por fezes de animais (TORTORA et al. 2000b). É um bacilo gram-positivo, anaeróbico estrito formador de esporos terminais arredondados até ovais (CARTER 1995, SARAIVA et al.1984). A patogenia da doença envolve a penetração de esporos de C. tetani (LOBATO & ASSIS 2005) ou bacilo de Nicolaier (LOBATO & ASSIS 2005, LOBATO et al. 2007) em feridas, com consequente multiplicação e produção de uma potente neurotoxina, a tetanospasmina (LOBATO et al. 2007). Para a manifestação clínica do tétano é necessário ferimento ou solução de continuidade que possibilite a introdução da bactéria em ambiente anaeróbio (RAPOSO 2007). O clostrídio em ambiente favorável produz três exotoxinas conhecidas: toxina não espasmogênica, tetanolisina, que promove necrose tissular, e tetanoespasmina que produz os sinais clínicos do tétano (BARROS et al. 2006). A tetanoespasmina liga-se às terminações nervosas e segue em fluxo retrógrado do sistema nervoso periférico (local do ferimento) ao sistema nervoso central (RAPOSO 2007). Por fim, a toxina chega ao interior de neurônios inibidores, impedindo a liberação dos neurotransmissores: ácido gama amino butírico (GABA) e glicina (BARROS et al. 2006). A capacidade de inibir informações indesejáveis que partem do sistema nervoso rumo à musculatura é perdida. Devido à falta de inibição dos neurônios motores ocorre rigidez muscular (BARROS et al. 2006).
O período de incubação varia de 7 a 21 dias para a maioria das espécies susceptíveis. Em bovinos, no entanto o período de incubação pode variar de 18 horas a quatro semanas (BARROS et al. 2006). Os sinais clínicos iniciam em geral em 7 a 15 dias após a contaminação do animal (BARROS et al. 2006). Trismo mandibular, marcha trôpega, prolapso de terceira pálpebra, orelhas eretas, timpanismo e rigidez dos membros são comumente manifestados (BARBOSA et al. 2009).
A necropsia não revela lesões macroscópicas, exceto eventuais áreas de necrose no local onde o clostrídio teve condições de proliferar (BARBOSA et
al. 2009). Não existem lesões histológicas específicas da doença (BARROS et al. 2006). A ocorrência desta enfermidade em geral é esporádica, mas surtos têm ocorrido em bovinos após práticas zootécnicas como, por exemplo,
aplicação de vermífugos ou vacinas com o uso de equipamentos não higienizados devidamente ou através da contaminação da pele por poeira ou
lama durante tais práticas (DUTRA et al. 2001).
O diagnóstico é geralmente baseado nos sinais clínicos. A tentativa de isolamento do organismo geralmente não é realizada, por ser de difícil obtenção (CARTER et al.1995). Para o diagnóstico laboratorial de tétano preconiza-se a utilização do bioensaio em camundongos (SARAIVA et al.1984).
O tratamento visa neutralizar a toxina circulante, cessar a sua produção e ainda promover o relaxamento muscular do animal (BARROS et al. 2006, RAPOSO 2007). Para tanto, a associação de penicilina com soro antitetânico é o recomendado. Em situações que permitam a identificação do local da lesão, onde o agente foi inoculado, o debridamento e higienização devem ser realizados com o devido cuidado (BARROS et al. 2006).
Como medida profilática preconiza-se a vacinação e a adoção de medidas de assepsia e anti-sepsia na realização de práticas de manejo (BARROS et al. 2006).
2.2.3. Carbúnculo sintomático
Carbúnculo sintomático, também chamado manqueira, mal-de-ano, é uma infecção endógena, não contagiosa, altamente fatal causada por C.
chauvoei que afeta bovinos, ovinos e caprinos (ASSIS et al. 2005, LOBATO et al. 2005, GREGORY et al. 2006). O agente está amplamente distribuído no ambiente (solo, poeira, água e parte da flora bacteriana (GREGORY et al. 2006). O microorganismo tem a capacidade de esporular e produzir, assim como os demais clostrídios, mais toxinas protéicas do que qualquer outro gênero bacteriano (GREGORY et al. 2006). Na forma de esporo pode manter-se potencialmente infectante no solo por longos períodos, manter-sendo resistente ao calor, o que é um fator de extrema relevância na epidemiologia (GREGORY et al. 2006), representando um risco significativo para a população animal e humana (LOBATO et al. 2005). Os esporos se mantem viáveis diante da presença de matéria orgânica e umidade (LOBATO et al. 2005). A doença
ocorre geralmente em campos com histórico, ou seja, contaminados (RIET-CORREA 2007a).
O carbúnculo sintomático afeta bovinos de seis meses a três anos de idade, em geral em bom estado nutricional. O microrganismo é carreado via circulação sanguínea para o tecido muscular, onde se multiplica se as condições forem favoráveis (ASSIS et al. 2005, GREGORY et al. 2006).
Nos bovinos, a patogenia do carbúnculo sintomático é ainda incerta. Entretanto, conforme a hipótese mais aceita, a infecção é de origem endógena associada à ingestão de esporos presentes em pastos contaminados (ASSIS et al. 2005). Estes, uma vez no intestino, são veiculados por macrófagos até a musculatura esquelética onde permanecem em latência. Traumas nas grandes massas musculares criam um ambiente de baixo potencial de óxido-redução e atmosfera de anaerobiose, desencadeando a germinação dos esporos e a consequente produção de toxinas alfa (hemolítica, necrótica e letal), beta (Dnase), gama (hialuronidase), delta (hemolisina) e neuraminidase (GREGORY et al. 2006, LOBATO et al. 2005). Um aspecto intrigante é que os valores da creatina cinase e a aspartato aminotransferase estão por vezes apenas levemente elevados. De fato, as enzimas liberadas dos músculos de uma região miosite profunda não podem ter acesso ao sangue periférico devido à trombose vascular e destruição criadas pelas endotoxinas dos clostrídios (DIVERS 2008). A evolução para morte ocorre geralmente em até 72 horas (ASSIS et al. 2005).
Sinais clínicos comumente observados consistem em hipertermia, anorexia, depressão e manqueira quando um membro é atingido (ASSIS et al. 2005, GREGORY et al. 2006, RIET-CORREA 2007a). O local afetado apresenta aumento de sensibilidade, inchaço, além de se tornar frio e edematoso com crepitação ao toque (GREGORY et al. 2006). Alguns animais têm morte súbita (RIET-CORREA 2007a).
As lesões macroscópicas estão localizadas principalmente nas regiões de maior massa muscular (quarto traseiro, diafragma, coração, pescoço e região escapular (GREGORY et al. 2006; LOBATO et al. 2005). Alterações nos órgãos internos não são marcantes, exceto hemorragias no pulmão e ligeira congestão hepática. As cavidades pleural e peritoneal frequentemente contém fluido sanguinolento (LOBATO et al. 2005). O tecido muscular afetado torna-se
edematoso com acentuado odor rançoso, de coloração vermelho-enegrecida e crepitante à palpação, presença de bolhas de gás, áreas de enfisema produzidas pela multiplicação da bactéria (ASSIS et al. 2005).
Microscopicamente, o exame histopatológico revela a presença de moderado infiltrado inflamatório mononuclear, além de focos de degeneração vacuolar e hialina das fibras musculares. Estas alterações são acompanhadas de áreas de hemorragia e edema intersticial (ASSIS et al. 2005).
O diagnóstico clínico é baseado na anamnese (mortes súbitas em rebanho não vacinado contra clostridioses), epidemiologia (região ou potreiro com histórico de mortes súbitas em animais com no máximo 36 meses), eventual observação de sinais clínicos (manqueira) e alterações características visualizadas na necropsia (musculatura crepitante e edemaciada com hemorragia e necrose). Para confirmação laboratorial é necessário isolamento do C. chauvoei, a partir de fragmentos de músculos da região afetada que devem ser remetidos sob refrigeração ou em condições de anaerobiose (ASSIS et al. 2005, RIET-CORREA 2007a). Alternativamente, pode-se enviar ao laboratório um osso longo (metacarpo ou metatarso) do animal para isolamento ou realização de prova biológica (inoculação em cobaio). Há, também, a possibilidade de realização de imuno-histoquímica (RIET-CORREA 2007a), imunofluorescência direta (GREGORY et al. 2006) e reação em cadeia da polimerase (PCR) (ASSIS et al. 2005).
Tentativas de tratamento em geral são infrutíferas e economicamente inviáveis sendo que a mortalidade é em torno de 100%. Entretanto, pode-se utilizar a terapia com antibiótico de largo espectro. C. chauvoei é sensível às penicilinas que podem ser utilizadas, assim como o soro hiperimune no local da lesão. Tetraciclinas e cloranfenicol podem ser empregados nos estágios iniciais da doença. Porém o tratamento para as infecções por clostrídios é, de maneira geral, considerado inútil, pois quando os animais estão clinicamente afetados a morte é iminente (GREGORY et al. 2006).
A erradicação da enfermidade é praticamente impossível. O controle e profilaxia devem ser feitos a partir de medidas adequadas de manejo e com vacinações sistemáticas de todo o rebanho, já que os animais estão em permanente contato com o agente e com os fatores que poderão desencadear a enfermidade (LOBATO et al. 2005). O emprego de vacinas não confere
proteção total aos animais, pois ocorre mutação rápida do agente dependendo das condições ambientais. Pode haver, ainda, a presença de diferentes cepas, de acordo com a região (GREGORY et al. 2006).
Em surtos a medida a ser adotada consiste em imunização e reforço, após 15–21 dias, de todos os animais com a opção de utilizar a aplicação de penicilina de ação retardada (RIET-CORREA 2007a). No entanto, sabe-se que o custo é relativamente alto e os resultados são duvidosos, tornando o tratamento economicamente inviável. Por esta razão preconiza-se utilização de programas de imunização preventiva dos animais, evitando o aparecimento de carbúnculo sintomático e sua repercussão econômica (GREGORY et al. 2006, RIET-CORREA 2007a).
As vacinas (toxóides) são cultivos inativados (GREGORY et al. 2006). A imunização de bovinos inicia aos 3-6 meses e depois anualmente. É aconselhável a revacinação 15-21 dias após a primeira dose (RIET-CORREA 2007a).
2.2.4. Gangrena gasosa ou edema maligno
Gangrena gasosa é uma infecção exógena que causa necrose de tecidos moles em consequência da proliferação de bactérias do gênero
Clostridium quando há lesões traumáticas nestes tecidos (PACHECO 1954). A
gangrena gasosa é também chamada de edema maligno e tem ampla distribuição mundial (ASSIS et al. 2002, LOBATO & ASSIS 2005, LOBATO et al. 2008). Alguns autores preferem distinguir as duas denominações conforme suas apresentações morfológicas; edema maligno como uma forma de celulite (inflamação do tecido celular subcutâneo com edema) e gangrena gasosa para casos de miosite com formação de bolhas gasosas no músculo. A qualidade do suprimento sangüíneo ao músculo é um fator importante em determinar se a inflamação ficará confinada ao tecido celular subcutâneo (edema maligno) ou envolverá o músculo com formação de bolhas de gás (gangrena gasosa) (VLEET & VALENTINE 2007)
São susceptíveis equinos, ovinos, bovinos e muitas outras espécies, inclusive humanos (JONES et al. 2000, PINTO et al. 2005). A enfermidade é
causada por C. septicum, C. chauvoei, C. novyi tipo A, C. sordellii e C.
perfringens tipo A, associados ou isoladamente (ASSIS et al. 2002, LOBATO &
ASSIS 2005, LOBATO et al. 2008, PINTO et al. 2005). Estes microorganismos são encontrados no solo e também habitam o trato digestivo dos animais (LOBATO et al. 2008, JONES et al. 2000). Por estarem intimamente relacionados à presença de animais, os clostrídios penetram facilmente no organismo através da pele ou membranas mucosas feridas (ASSIS et al. 2002, PINTO et al. 2005, TORTORA et al. 2000a). Alguns procedimentos, tais como castrações, tosquias, partos e punções venosas, contaminação de feridas decorrentes de práticas cirúrgicas e/ou de manejo sem cuidados assépticos ou ainda através do cordão umbilical, podem ser porta de entrada para a contaminação bacteriana (LOBATO et al. 2008, PINTO et al. 2005, RIET-CORREA 2007b, TORTORA et al. 2000a). A partir destas lesões teciduais contaminadas com o clostrídio ocorre proliferação do microorganismo com consequente diminuição do oxigênio molecular, acarretando em um baixo potencial de óxido-redução, promovendo a germinação dos esporos dos clostrídios (LOBATO et al. 2008). Uma vez instaurada, a infecção promove fermentação dos carboidratos nos tecidos, produzindo dióxido de carbono e hidrogênio. Estes gases produzem o efeito de crepitação (TORTORA et al. 2000a). Este ambiente propicia a produção de toxinas que transitam ao longo dos feixes musculares, produzindo a morte celular e, promovendo necrose que favorece o crescimento subsequente da população contaminante (LOBATO et al. 2008, TORTORA et al. 2000a).
No Brasil, surtos de edema maligno desencadeados por traumatismos são eventuais, mas quando ocorre um surto o número de animais afetados é elevado (LOBATO et al. 2004, RIET-CORREA 2007b). Os sinais clínicos caracterizam-se por febre, anorexia, taquicardia e depressão. O tecido subcutâneo torna-se edematoso e/ou crepitante (LOBATO & ASSIS 2005). O aumento de volume tende a ocorrer nas áreas baixas do corpo do animal, acumulando gás e transudato no ventre e membros inferiores (LOBATO & ASSIS 2005, PINTO et al. 2005). Dependendo da localização da lesão, observa-se claudicação severa (RIET-CORREA 2007b). A pele frequentemente apresenta áreas com intenso inchaço e coloração violácea (PINTO et al. 2005). A doença tem curso rápido. Os animais morrem em decorrência de toxemia em
algumas horas ou geralmente de um a três dias após o início dos sinais clínicos (LOBATO & ASSIS 2005, PINTO et al. 2005, RIET-CORREA 2007b).
O diagnóstico do edema maligno é realizado rotineiramente a campo apenas com base nos dados clínicos e/ou lesões de necropsia (ASSIS et al. 2002, LOBATO et al. 2004, PINTO et al. 2005, RIET-CORREA 2007b). Para confirmação do diagnóstico deve-se levar sempre em consideração a epidemiologia, os sinais clínicos, os achados de necropsia e histopatológicos e o isolamento e identificação do(s) agente(s) envolvido(s). Os métodos auxiliares de diagnóstico compreendem a imunofluorescência direta (IFD), a imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) (ASSIS et al. 2005, PINTO et al. 2005). Destas, a prova de IFD é mais frequentemente empregada para diagnóstico do edema maligno. O material utilizado consiste em impressões de tecidos lesados. A IHQ e a PCR permitem o diagnóstico a partir de material incluído em parafina ou formolizado, possibilitando a realização de estudos retrospectivos (PINTO et al. 2005).
Nos animais necropsiados observa-se tumefação das grandes massas musculares, com crepitação à palpação. Edema hemorrágico no tecido subcutâneo e entre as fibras musculares que exalam acentuado odor rançoso, também é constatado (LOBATO & ASSIS 2005, RIET-CORREA 2007b). Quando há acometimento de fibras musculares, estas apresentam coloração vermelho enegrecida, com desorganização estrutural e aparência desvitalizada. Os achados histológicos revelam a presença de infiltrado inflamatório composto de células mononucleares entre as fibras musculares. Pode ser observada, também, degeneração vacuolar e hialina de fibras musculares, embora a celulite seja mais característica e típica que a miosite (LOBATO & ASSIS 2005, PINTO et al. 2005, RIET-CORREA 2007b).
Para tratar animais afetados, o debridamento do tecido necrótico conjuntamente com altas doses de penicilinas ou antibióticos de amplo espectro, é o recomendado (RIET-CORREA 2007b, TORTORA et al. 2000a).
Como medida profilática é necessário evitar a contaminação, principalmente com terra, de instrumentos e seringas utilizados em procedimentos que geram ferimentos nos animais (RIET-CORREA 2007b). Como forma de controle os animais devem ser vacinados anualmente, com
vacinas que contenham principalmente C. septicum, C. chauvoei, C. novyi, C.
sordellii (ASSIS et al. 2002, RIET-CORREA 2007b).
2.2.5. Hemoglobinúria Bacilar
Hemoglobinúria bacilar (HB) é uma doença infecciosa de evolução aguda caracterizada por necrose hepática. É conhecida há cerca de um século como importante causa de perdas para a pecuária no oeste dos Estados Unidos, onde é enzoótica (OLANDERJ et al.1966). Acomete bovinos e, esporadicamente, ovinos, suínos e equinos (LINDSAY et al. 1997, LOBATO et al. 2008). Uma condição semelhante à HB, com necrose hepática aguda, é provocada pelo C. piliforme em animais domésticos, selvagens e de laboratório (doença de Tyzzer). Apesar de ser rara em bovinos esta enfermidade foi observada no Japão nesta espécie animal (IKEGAMI et al. 1999).
O C. haemolyticum produz as toxinas β e fosfolipase C (CARTER 1995). A doença parece ser desencadeada pela toxina fosfolipase C que causa necrose e lise de eritrócitos (CARTER 1995, VAN KAMPEN & KENNEDY 1969). A toxina é ávida pelo complexo protéico contendo lecitina na superfície dos eritrócitos (VAN KAMPEN & KENNEDY 1969). A morte dos animais ocorre provavelmente por anóxia devido à hemólise provocada pela toxina (CARTER 1995).
A doença é descrita em regiões úmidas, de campos baixos ou drenagem insuficiente e é precedida de injúria hepática. A bactéria é propagada por inundações, fenos contaminados, fezes de animais portadores e transporte de restos de carcaças por carnívoros (SCHILD 2007). Os esporos do C.
haemolyticum são ingeridos e atingem a circulação chegando ao fígado
(CARTER et al.1995, LOBATO et al. 2008). Para a germinação dos esporos é necessária a condição de anaerobiose. O principal fator desencadeador está relacionado à migração de vermes trematódeos pelo parênquima hepático (LOBATO et al. 2008). No Rio Grande do Sul a relação da HB com campos baixos é estabelecida pela ocorrência de Fasciola hepatica, incitante da condição de anaerobiose necessária à proliferação do clostrídio. Como resultado desta migração ocorre à condição de anaerobiose, favorável à
germinação dos esporos e consequente proliferação do agente com produção de toxinas que provocam destruição dos eritrócitos com liberação de hemoglobina (LOBATO et al. 2008, SCHILD 2007). Animais em boas condições corporais são mais susceptíveis (SCHILD 2007).
Os sinais clínicos precedem a morte dos animais em aproximadamente 24 horas (SCHILD 2007). A hemoglobinúria é o sinal clínico mais característico, ocorrendo, também, depressão, anorexia, icterícia e dores abdominais (LOBATO et al. 2008, SCHILD 2007).
A necropsia revela icterícia na carcaça, edema gelatinoso, hemorragia generalizada, peritonite fibrinosa, esplenomegalia, e, nas cavidades, há presença de líquido serossanguinolento (LINDSAY et al.1997, SCHILD 2007). No entanto, a lesão macroscópica característica da hemoglobinúria bacilar é uma extensa área de necrose circular (até 10 cm de diâmetro), de odor fétido, coloração amarelada, circundada por uma linha hiperêmica na superfície de corte do fígado (SCHILD 2007, VAN KAMPEN & KENNEDY 1969).
O exame histológico do fígado revela áreas de necrose de coagulação aguda, bem demarcadas, margeadas por uma linha hemorrágica. No centro das áreas necróticas há uma grande coleção de neutrófilos degenerados e bacilos gram-positivos. Outra alteração encontrada é a eritrofagocitose por células de Kupffer (LINDSAY et al. 1997). Necrose de coagulação do epitélio tubular, hemorragia e edema na pelve renal podem ser também observados (OLANDERJ et al.1966).
A enfermidade é diagnosticada em municípios de baixo relevo e campos planos, comumente cultivados com arroz e consorciados com pecuária. A característica geográfica destes campos é propícia à ocorrência de caramujos do gênero Lymnea, hospedeiro intermediário da F. hepatica. Além dos prejuízos em virtude da ocorrência da fasciolose, a presença do platelminto provoca lesões que determinam uma condição de anaerobiose, favorável à ocorrência do C. haemolyticum (SCHILD 2007). O diagnóstico é possibilitado pelos dados epidemiológicos somados aos sinais clínicos e, principalmente, achados de necropsia. Para confirmação laboratorial é necessária detecção da toxina ou imunofluorescência (LINDSAY et al. 1997). O diagnóstico diferencial de HB inclui a babesiose que frequentemente apresenta-se com hemoglobinúria (SCHILD 2007).
O tratamento desta clostridiose deve ser efetuado imediatamente após o início das manifestações clínicas e, consiste na administração de penicilinas de amplo espectro (CARTER 1995). Como medida profilática, a vacinação, contra HB deve ser preconizada, principalmente em regiões onde a incidência de F.
hepatica é alta (SCHILD 2007).
2.2.4. Enterotoxemia
Enterotoxemia é o nome dado a enfermidade provocada por toxinas produzidas pelo C. perfringens no trato intestinal e veiculadas pelo sangue até local de ação. As diversas toxinas produzidas são o que determina a classificação do C. perfringens em tipo A, B, C, D ou E. Este microorganismo é comensal do trato intestinal dos ruminantes (CARTER 1995). Os tipos de C.
perfringens são diferenciados de acordo com a produção de toxinas (Tabela1).
A toxina épsilon, responsável pela manifestação da enfermidade, é produzida em maior quantidade pelo C. perfringens tipo D (NIILO et al.1974). Esta toxina é ativada em contato com enzimas proteolíticas, tripsina e pepsina, no intestino delgado, adquirindo um caráter necrosante e altamente letal (CARTER 1995). Bovinos, ovinos, caprinos, equinos e o homem são susceptíveis aos efeitos das toxinas produzidas por Clostridium perfringens (COLODEL et al. 2003, LOBATO et al. 2006, UZAL et al. 2004).
É uma doença de animais jovens. Ovinos acometidos têm entre três e 10 semanas de vida (RIET-CORREA 2007c). Alguns fatores que resultam em alterações do ambiente intestinal predispõem a ocorrência da enfermidade e entre eles ressalta-se a administração de elevados níveis de carboidratos, proteínas e pastagens luxuriantes (COLODEL et al. 2003). Estas condições, em conjunto com alterações da flora ruminal e passagem de alimentos não digeridos para o intestino delgado propiciam um meio favorável para a multiplicação do clostrídio e consequente produção de toxina (LOBATO et al. 2006). Comumente os animais afetados apresentam bom escore corporal e desenvolvimento (COLODEL et al. 2003).
Por ser uma enfermidade de curso clínico agudo, a observação de sinais clínicos pode ser difícil (RIET-CORREA 2007c). Em condições experimentais,
ovinos apresentam dispnéia, depressão, opistótono, convulsões, coma e morte em até nove horas (UZAL et al. 2004). Outra alteração constatada é a glicosúria (UZAL et al. 2004).
Na necropsia em geral os animais estão em bom estado corporal (COLODEL et al. 2003). Um indicativo da enfermidade pode ser a presença de leite coagulado no interior do abomaso (NIILO et al.1974). Os rins estão congestos e de consistência amolecida, com aspecto autolítico, ainda que a necropsia seja realizada imediatamente após a morte do animal. A esta condição atribui-se o termo rim polposo (RIET-CORREA 2007c). As lesões observadas no cólon e ceco consistem em avermelhamento da serosa que, por vezes, está edematosa e com conteúdo líquido de coloração verde-escuro ou avermelhado (COLODEL et al. 2003). Os linfonodos mesentéricos podem estar aumentados de volume e hemorrágicos (NIILO et al. 1974). Pode haver líquido nas cavidades e hemorragia nas serosas endocárdica e pericárdica (RIET-CORREA 2007c). Pode haver, ainda, edema e congestão pulmonar, congestão hepática com vesícula biliar espessa e repleta por conteúdo líquido, com grumos de fibrina. Observam-se, também, petéquias e equimoses em vários órgãos (COLODEL et al. 2003).
O exame histológico revela congestão e hemorragia com inflamação fibrinosa e descamação do epitélio do ceco e cólon. Há grande concentração de bactérias bacilares basofílicas na luz intestinal (COLODEL et al. 2003). Os rins apresentam eosinofilia e tumefação do epitélio tubular, cariólise e cariorrexia nuclear (UZAL et al. 2004). Quando afetado, o cérebro dos ovinos apresenta edema e acúmulo perivascular de material proteináceo eosinofílico, principalmente na região do tálamo, cápsula interna, pedúnculos cerebelares e cerebelo (UZAL et al. 2004).
O diagnóstico clínico da enterotoxemia em geral é realizado com base nos dados epidemiológicos e sinais clínicos. Coloração de gram do conteúdo intestinal, buscando grande quantidade de clostrídio, achados de necropsia e histopatologia podem, também, auxiliar no diagnóstico. No entanto, para confirmá-lo é necessária a detecção de toxina épsilon em quantidade superior as demais, do conteúdo intestinal de animais acometidos através das técnicas de PCR e ELISA (UZAL et al. 2004). Como medida de controle eficiente, a vacinação dos animais é o mais indicado (RIET-CORREA 2007c).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Estudo retrospectivo e prospectivo
Foi realizado um estudo retrospectivo dos casos de clostridioses diagnosticados em ruminantes na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da UFPel entre 1978 e 2008. Foram revisados os protocolos de necropsia resgatando-se os dados epidemiológicos, sinais clínicos, patologia e bacteriologia, quando estes dados estavam disponíveis nos mesmos.
A partir do ano 2009 foram acompanhados surtos ou casos esporádicos de clostridioses diagnosticados, tanto por visitas às propriedades afetadas como por exame de vísceras ou cadáveres que chegaram ao LRD.
3.2 Patologia
Nos casos de carbúnculo sintomático, edema maligno e hemoglobinúria bacilar, além da observação das lesões macroscópicas nos músculos, tecido subcutâneo e fígado, respectivamente, foi realizado estudo histológico dos órgãos afetados para observação das lesões características. O diagnóstico histológico de enterotoxemia foi baseado em lesões características no encéfalo. Em todos os casos de botulismo foi realizado estudo histológico do encéfalo para constatar ausência de lesões. Os diagnósticos de tétano foram feitos pela epidemiologia, sinais clínicos e ausência de lesões macroscópicas e histológicas no sistema nervoso central.
3.3 Diagnóstico laboratorial
Para a confirmação dos diagnósticos foram remetidos ao laboratório de bacteriologia do LRD fragmentos de músculo no caso de suspeita de carbúnculo sintomático e tecido subcutâneo para edema maligno, conteúdo intestinal e/ou ruminal para botulismo e enterotoxemia, e fragmentos de fígado para hemoglobinúria bacilar. Esses materiais foram semeados em meio CMM e incubados a 37º C por 48-72 horas. De acordo com a clostridiose suspeita o material foi filtrado e inoculado em camundongos por diferentes vias. No caso de carbúnculo sintomático a cultura acrescida de cloreto de cálcio 3,3% era inoculada por via intramuscular. No caso de suspeita de botulismo o soro, macerado de fígado, e conteúdo do rúmen e intestino do animal afetado, quando possível, foi inoculado por via intraperitoneal em camundongos (QUINN et al. 1994).
Dos surtos de tétano ocorridos no ano 2009 coletou-se sangue para obtenção de soro e fragmentos musculares com lesões suspeitas de serem a porta de entrada do agente. A partir do soro e do exsudato seroso das lesões, foi realizado estudo comparativo quanto à eficiência no diagnóstico utilizando a técnica de bioensaio em camundongos. As lesões musculares foram utilizadas na tentativa de isolamento do C. tetani e impressões dessas lesões foram corados pelo método de gram. O material foi dividido em duas partes. Uma foi semeada em Agar sangue ovino a 5% e colocada em jarra com sistema de anaerobiose (ANAEROBAC - PROBAC DO BRASIL), outra foi semeada em meio de Robertson. As culturas foram incubadas a 37º C por 48 a 72 horas.
As amostras em meio de Robertson que apresentaram crescimento bacteriano, com turvação do meio e presença de gás, foram semeadas em Agar sangue ovino 5%, para a observação das colônias. Uma alíquota do mesmo meio de Robertson foi utilizada para inoculação em camundongos.
Os cultivos semeados, primeiramente em Agar sangue ovino a 5%, que apresentaram colônias típicas de Clostridium sp foram submetidos à coloração de gram e posteriormente foram semeados em meio de Robertson para produção de toxina e inoculação em camundongo.
Para a inoculação foram utilizados 48 camundongos divididos em grupos de quatro, os quais foram inoculados com soro sanguíneo de bovinos afetados. Dois camundongos de cada grupo foram protegidos com 0,5 ml de soro antitetânico com título em torno de 100 a 200 UI/ml 2 horas antes da inoculação (CARTER et al. 1995, SARAIVA et al. 1984). Outros 24 camundongos foram inoculados com 0,2 - 0,5 ml do sobrenadante do meio de Robertson, sendo que metade era protegida com soro antitetânico nas mesmas condições descritas anteriormente. Mais 24 camundongos foram inoculados com o exsudado coletado nas lesões musculares utilizando a mesma metodologia de proteção em metade dos animais. Os camundongos ficaram aos pares em caixas com ração, água e cama de serragem.
Nas propriedades, onde ocorreram surtos no ano 2009, foram recolhidos 38 frascos lacrados ou abertos dos medicamentos utilizados até 30 dias antes dos animais adoecerem. Estes medicamentos foram inoculados em 38 bovinos.
4. RESULTADOS
4.1 Epidemiologia e sinais clínicos
Mediante a revisão dos protocolos de necropsia do LRD, de 1978 a 2008 e somando-se a estes os casos ocorridos no ano 2009 foi constatado que de um total de 5.446 materiais de bovinos provenientes de necropsias realizadas ou órgãos enviados ao laboratório 1.049 (19,26%) tiveram diagnóstico de doenças bacterianas. Desses casos, 91 (8,67%) ocorreram em consequência de alguma clostridiose, sendo 30 surtos de carbúnculo sintomático, 15 de hemoglobinúria bacilar, nove de botulismo, nove de edema maligno e 28 de tétano. De 860 materiais de ovinos, 49 (5,69%) diagnósticos corresponderam a doenças bacterianas e desses, 14 (28,57%) foram de surtos de clostridioses. Dos 14 surtos de clostridioses observados em ovinos, 10 foram de tétano, três de edema maligno e um de enterotoxemia.
Os dados epidemiológicos relativos aos surtos de cada uma das enfermidades, bem como os sinais clínicos são apresentados nas Tabelas 1-7. Na Figura 1 é apresentado um mapa com os municípios nos quais foram diagnosticados os casos de clostridioses no período estudado.
Em todos os nove surtos ou casos esporádicos de botulismo os bovinos estavam em campo nativo, em somente um dos surtos os animais eram suplementados com sal mineral. Os sinais clínicos observados foram paralisia parcial dos membros pélvicos e paralisia flácida da língua (Figura 2.). A maioria dos casos (5/9) ocorreu no município de Rio Grande em áreas alagadiças as quais não são utilizadas para culturas por ficarem submersas boa parte do ano. Em três dos nove surtos foi relatada a presença de cadáveres de animais no
pasto, incluindo cascos de tartarugas. Dos nove surtos, sete ocorreram nos meses de verão (janeiro, fevereiro e março). Os dois restantes ocorreram um em novembro e o outro em maio (Tabela 1).
Dos 30 surtos ou casos esporádicos de carbúnculo sintomático diagnosticados, oito ocorreram na primavera, 13 no inverno, seis no outono e três no verão (Figura 3). A idade dos animais afetados variou de quatro meses a dois anos, sendo que um surto ocorreu em animais de quatro anos (Tabela 2). Em 17 surtos a maioria dos animais morreu após um curso clínico hiperagudo ou foi encontrada morta. Em alguns casos os sinais clínicos apresentados foram claudicação, aumento de volume dos membros (Figura 4) e crepitação dos músculos afetados que evoluía rapidamente para decúbito e morte em no máximo 24 horas.
Em oito dos nove surtos de edema maligno diagnosticados em bovinos, havia histórico de traumatismo coletivo seja pela utilização de vacinas ou medicamentos em um período que variou de 24 horas a 10 dias antes de ocorrerem às mortes (Tabela 3). Os sinais clínicos observados foram aumento de volume e crepitação ao toque das regiões afetadas (Figura 5). Em dois dos três surtos de edema maligno observados em ovinos havia, também, histórico de vacinação e tosquia entre 3-5 dias antes das mortes dos animais (Tabela 4). Hemoglobinúria bacilar ocorreu em todas as épocas do ano (Tabela 5). Todos os surtos foram observados em municípios de Rio Grande, Santa Vitória do Palmar e Arroio Grande, formados por terrenos baixos utilizados principalmente para plantio de arroz. O principal sinal clínico observado foi a coloração vermelho-escura da urina.
Um surto de enterotoxemia foi diagnosticado em ovinos no município de Rio Grande. Um total de 23 cordeiros, com aproximadamente 40 dias de idade, morreram subitamente em um lote de 127 nascidos. Os animais estavam em bom estado corporal e em regime de campo nativo de boa qualidade.
Tétano em ovinos foi diagnosticado em 10 oportunidades tendo um surto ocorrido fora da área do LRD (Tabela 6). Em bovinos foram observados 28 surtos (Tabela 7). No ano de 2009, 25 surtos de tétano foram diagnosticados, entre abril e dezembro. Estes surtos aconteceram em 11 municípios e foram precedidos de oito a 25 dias por vacinações e/ou everminações. Nos 25 surtos de tétano diagnosticados no ano 2009, morreram 248 bovinos de um total de
15.726 sob risco, em 11 municípios da área de influência do LRD. A morbidade variou de 0,2% a 39,4% e a letalidade de 88,8% a 100%.
Em todos os casos foi mencionada a aplicação de vacinas ou vermífugos nos animais, pelo menos 25 dias antes da manifestação clínica do tétano. O período de incubação nos 25 surtos variou de 8 a 25 dias. Em todos os surtos, os bovinos afetados apresentavam timpanismo leve a moderado, rigidez muscular, tremores, trismo mandibular, andar com os membros rígidos, prolapso de terceira pálpebra e orelhas eretas. Com a evolução do quadro os bovinos permaneciam em decúbito lateral com opistótono, em alguns casos, com os membros esticados e afastados do solo (Figura 6). Alguns apresentavam timpanismo (Figura 6D).
4.2 Patologia
Nos casos de botulismo não foram observadas lesões macroscópicas ou histológicas no sistema nervoso central e demais órgãos das cavidades torácicas e abdominais, nos animais submetidos à necropsia.
As lesões observadas nos animais afetados por carbúnculo sintomático caracterizavam-se por miosite hemorrágica em grandes massas musculares, principalmente nas regiões superiores dos membros (Figura 7) com presença de gás. As lesões encontradas nos bovinos afetados por edema maligno caracterizaram-se por edema hemorrágico subcutâneo e entre as fibras musculares superficiais que apresentam coloração vermelho-enegrecida (Figura 8).
Nos casos de tétano, macroscopicamente os animais não apresentavam lesões no sistema nervoso central ou nos demais órgãos. Em 12 necropsias realizadas havia lesão de necrose muscular em alguns casos com presença de edema e pus (Figura 9) na tábua do pescoço, onde havia sido realizada aplicação de medicamentos ou vacinas. Histologicamente não foram observadas lesões no sistema nervoso central e órgãos das cavidades torácicas e abdominais.
Nos casos de hemoglobinúria bacilar as lesões caracterizaram-se por icterícia generalizada, presença de hemorragias, principalmente nas serosas, coloração avermelhada das serosas devido embebição pela hemoglobina, alteração que começa antes mesmo do animal morrer (Figura 10). O fígado era avermelhado ou amarelado com presença de foco necrótico bem demarcado (Figura 11A), em alguns casos rodeado por um halo hiperêmico, e a urina em todos os casos apresentava cor avermelhada (Figura 11B). No surto de enterotoxemia os ovinos necropsiados apresentavam intestino vazio, estrias hemorrágicas na aorta e consistência gelatinosa dos rins e do fígado. Microscopicamente foi observado edema eosinofílico perivascular no sistema nervoso central.
4.3. Diagnóstico laboratorial
Em oito casos suspeitos de botulismo o diagnóstico foi realizado pelas evidências epidemiológicas, sinais clínicos e ausência de lesões. Em um caso o diagnóstico foi confirmado pela soroneutralização realizada em camundongos. Em sete casos de carbúnculo sintomático foi isolado das lesões musculares C. chauvoei e nos demais o diagnóstico foi realizado presuntivamente pelas lesões observadas nas necropsias. Em um caso de edema maligno em bovinos foi isolado Clostridium sp.. C. haemolyticum foi isolado das lesões hepáticas em três casos de hemoglobinúria bacilar, nos demais o diagnóstico foi realizado pelas lesões características observadas nas necropsias.
No diagnóstico laboratorial do tétano, dos 24 camundongos não protegidos, inoculados com soro de animais doentes, provenientes de 12 surtos, seis manifestaram os sinais clínicos e cinco morreram. Dos 12 camundongos inoculados com líquido seroso, associado a regiões de necrose muscular, dois morreram. Dos 12 camundongos inoculados com o sobrenadante das três amostras do meio de Robertson que produziram gás e turvação do meio, dois morreram. Os sinais clínicos iniciaram de 12 a 72 horas após a inoculação nos camundongos. Foi observada rigidez muscular (Figura 9), xifose, hiperexcitabilidade e morte. Não foi possível isolar o C. tetani em
nenhuma amostra semeada em Agar sangue. Das colorações realizadas, a partir do exsudato seroso, foi possível identificar em duas oportunidades C.
tetani. Nenhum dos bovinos inoculados com os medicamentos e/ou vacinas
recolhidos nas propriedades em que ocorreram surtos de tétano apresentou sinais clínicos da doença.
5. DISCUSSÃO
De acordo com os resultados obtidos observou-se que as doenças bacterianas representaram 19,26% dos diagnósticos realizados no LRD em um período de 31 anos e 8,57% dessas doenças foram causadas por bactérias do gênero Clostridium, representando 1,65% do total de diagnósticos realizados no LRD entre 1978-2009. Dados de prevalência das clostridioses no Brasil, com exceção de botulismo são escassos. Em um levantamento de prevalência das clostridioses na região de Botucatu, São Paulo, por um período de 10 anos carbúnculo sintomático, tétano, gangrena gasosa e enterotoxemia foram as mais frequentemente observadas (CORREA et al. 1980). Esses autores consideraram gangrena gasosa e edema maligno como doenças diferentes. Por outro lado, de todas as clostridioses diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) no período entre 1996-2010 as mais importantes foram tétano, botulismo e enterotoxemia (RAYMUNDO 2010).
Em todas as enfermidades causadas por bactérias do gênero
Clostridium observou-se taxa de letalidade em torno de 100%, o que demonstra
sua importância como causa de morte em ruminantes quando ocorre um surto. Entretanto, ficou evidenciado que algumas clostridioses são pouco importantes na região de influência do LRD pelo pequeno número de surtos observados. Enterotoxemia não foi diagnosticada em bovinos na região. Em ovinos a enterotoxemia é frequente em animais bem alimentados, em geral criados em pastagens ou que recebem suplementação com rações comerciais com alto teor de proteína, fato que não é prática comum na região sul do Estado, na qual os ovinos são criados em campo nativo. Na região Central do Estado são descritos cinco surtos de enterotoxemia em caprinos, porém em todos os casos
os animais eram confinados ou semiconfinados e recebiam ração com 20% ou mais de proteína (COLODEL et al. 2003).
A despeito dessas observações, muitos são os materiais que chegam ao laboratório com essa suspeita. Aparentemente, isso se deve a crença de que animais que morrem subitamente estão afetados por clostridiose, termo utilizado com frequência por veterinários e produtores sem estabelecer uma suspeita que esteja de acordo com a epidemiologia, sinais clínicos ou lesões observadas em cada uma dessas enfermidades. Dentre as clostridioses, apenas carbúnculo sintomático e edema maligno tem lesões similares e podem ser causadas por agentes idênticos, embora possam ser diferenciadas epidemiologicamente.
Carbúnculo sintomático é a clostridiose mais importante que ocorre em bovinos na região de influência do LRD, correspondendo a um terço dos casos de clostridioses observados. A distribuição sazonal dos casos de carbúnculo sintomático diagnosticados na área de influência LRD revela que a doença foi mais frequente no inverno seguido da primavera. É conhecido que carbúnculo sintomático afeta principalmente animais em bom estado nutricional e a maior ocorrência dos surtos nos meses de inverno parece contradizer esta observação, já que no Rio Grande do Sul nesta época do ano, de modo geral, há escassez de forragem. Por outro lado, nos protocolos de necropsia resgatados, uma observação frequente era o bom estado corporal dos animais afetados. Em alguns casos os bovinos eram mantidos em pastagens cultivadas de inverno como azevém (Lolium multiflorum) e aveia (Avena sativa), ou eram suplementados com rações concentradas o que poderia explicar a ocorrência da doença mais frequentemente nesta época do ano.
Com relação ao tétano em bovinos, chama a atenção que 25 surtos ocorreram no ano 2009. No ano 2001 ocorreram, também, diversos surtos de tétano em bovinos e ovinos no Rio Grande do Sul, incluindo o surto em Rosário do Sul (Tabela 7) e foi demonstrado que estes surtos ocorreram em consequência da contaminação de um anti-helmíntico utilizado em várias propriedades do Estado naquele ano (DRIEMEIER et al, 2007). Apesar de que o tétano aparentemente não é uma clostridiose importante em bovinos na área de influência do LRD, já que entre 1978-2008 foram observados três surtos, mortalidades altas podem ocorrer em determinadas circunstâncias causando
prejuízos econômicos importantes como os que ocorreram no ano 2001 e no ano 2009. A vacinação dos animais parece não ser eficiente para proteção dos mesmos já que alguns surtos ocorreram em animais vacinados com vacinas polivalentes que incluíam o C. tetani.
Chama a atenção que a maioria dos surtos de botulismo ocorreu em uma região de campos planos e alagadiços, com pastagens nativas, que por permanecerem boa parte do ano submersos não são utilizados para culturas, não havendo adubação e/ou correção do solo. O surto observado no município de São Lourenço do Sul ocorreu em uma propriedade às margens da Lagoa dos Patos onde havia cascos de tartarugas mortas, dos quais foi isolado C.
botulinum. A carência de fósforo que ocorre nos campos nativos do sul do Rio
Grande do Sul (TOKARNIA et al. 2000) associada à presença de cadáveres nos campos aparentemente favoreceu a ocorrência da doença. A utilização de vacinas contendo toxóide botulínico diminuiu consideravelmente a ocorrência de surtos da doença na região, especialmente no município de Rio Grande onde era mais significativa.
Hemoglobinúria bacilar foi observada em três municípios da zona sul, todos eles com solos baixos e planos, frequentemente utilizados para o plantio de arroz. Estas regiões são caracterizadas pela presença de caramujos do gênero Lymnea que são hospedeiros intermediários da Fasciola hepatica, parasita importante na espécie ovina (SCHILD 2007). Em bovinos, apesar da pouca importância, este parasito pode causar lesões que determinam um ambiente de anaerobiose favorável à multiplicação de C. haemolyticum. Surtos de hemoglobinúria bacilar também foram relatados em Santa Catarina, na região do litoral onde a fasciolose também ocorre (GAVA 1998).
Em cinco surtos de carbúnculo sintomático os bovinos estavam vacinados contra a doença há pelo menos um mês, tempo suficiente para o estabelecimento da proteção adequada, o que sugere que as vacinas não seriam totalmente eficientes. As vacinas polivalentes produzidas no Brasil contêm de cinco a 11 antígenos, sendo que apenas C. chauvoei e o toxóide botulínico são testados oficialmente quanto à esterilidade, inocuidade e potência pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), ficando os demais antígenos a critério dos laboratórios produtores das vacinas (LOBATO et al. 2004). Em um trabalho de teste de vacinas comercializadas no
