INGRID VICENTE FARIAS
FLOROGLUCINOIS EXTRAÍDOS DOS FRUTOS DE Eugenia umbelliflora: CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA,
FÍSICO-QUÍMICA, ESTABILIDADE E POTENCIAL ANTIPARASITÁRIO
Itajaí (SC) 2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
INGRID VICENTE FARIAS
FLOROGLUCINOIS EXTRAÍDOS DOS FRUTOS DE Eugenia umbelliflora: CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA,
FÍSICO-QUÍMICA, ESTABILIDADE E POTENCIAL ANTIPARASITÁRIO
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt.
Co-orientadora: Profa. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin.
Itajaí (SC), Agosto 2017
F226f Farias, Ingrid Vicente
Floroglucinois extraídos dos frutos de Eugenia umbelliflora [manuscrito]: caracterização química, físico- química, estabilidade e potencial antiparasitário / Ingrid Vicente Farias. – 2017.
136 f.: il. ; 30 cm
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós- graduação, Extensão e Cultura, 2017.
“Orientadora: Profª. Drª. Christiane Meyre da Silva Bittencourt, coorientadora: Profª. Drª. Tania Mari Bellé Bresolin”.
Bibliografia: f.127-136.
1. Produtos naturais. 2. Substâncias sintéticas bioativas.
3. Planta medicinal. 4. Fitoterapia. 5. Chagas, Doença de. I.
Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
CDU: 615.32
Cristina Martins Viana – CRB 14/966
Dedico este trabalho a Deus que sempre me proporcionou as oportunidades e a força para
lutar pelos meus sonhos.
A meus pais, Romu e Leticia, pelo eterno apoio em todas as etapas da minha vida e por
estarem ao meu lado nos meus momentos de decisão me permitindo decidir e errar.
Ao meu irmão e eterno anjinho, Aldo, graças a Deus você nasceu, sem você meus dias seriam
menos felizes.
Aos meus antepassados que de alguma forma influenciaram no ponto que minha vida chegou
hoje, o que há 100 anos atrás nem se pensava, hoje estou eu aqui concluindo um mestrado.
Obrigada familia, essa vitoria é nossa!!!
AGRADECIMENTOS
Um agradecimento especial a quatro mulheres que eu admiro muito e me ajudaram muito nesta etapa: Prof Angela Malheiros, Prof Christiane Meyre, Prof Ruth Lucinda e Prof Tania Bresolin.
Angela: Você iniciou meus passos na pesquisa só tenho a agradecer, pela indicação á Chris e por toda a confiança ao longo destes anos. Obrigada!
Chris: Minha primeira e segunda orientadora. Palavras não descrevem a gratidão que tenho por você. Obrigada por confiar, apoiar, incentivar, brigar quando necessário e acreditar em mim quando eu já não conseguia. Onde estiver o que precisar, estarei lá.
Ruth: te admiro desde a graduação. Você sempre teve a capacidade de me tirar da zona de conforto e me fazer pensar além daquele momento. Obrigada por todas as reflexões e ajuda ao longo deste trabalho.
Tania: professora, posso dizer que foi uma surpresa como nos demos tão bem. Uma pessoa uma vez me disse “a Tania, não tem algo que ela não seja boa”. Confesso que tive receio no começo de trabalhar com a professora, mas hoje eu só agradeço. Obrigada por todas as conversas e conselhos assim como a Chris, a professora me deu forças quando eu já não acreditava mais.
Ao membro externo pela compreensão e disponibilidade para avaliar este trabalho. Suas colocações serão todas acatadas para o crescimento deste trabalho. Muito obrigada!
À CAPES pela bolsa concedida, a UNIVALI e CNPq por todo o apoio financeiro e institucional.
Agradeço aos professores, Fávero Reisdorfer (UNIPAMPA), Marco Steinder (UFSC), Luis Sandjo Pergaud (UFSC), Alexandre Bella Cruz (UNIVALI), José Roberto Santin (UNIVALI) e René (UNIVALI), por todo o apoio na realização de alguns ensaios deste trabalho.
Aos técnicos dos laboratórios do bloco da farmácia: Nubia, Bruna, Carla e Deivisson pela ajuda com os materiais e reagentes.
Às meninas do laboratório 208 de instrumentação analítica, técnica Clarissa Medeiros, Milena e Lidia. Por toda a ajuda com conversas e na parte prática desse trabalho.
Aos amigos: Aristóteles disse uma vez que um amigo é uma alma habitando dois corpos e durante estes dois anos posso dizer que pude compartilhar várias almas: Martina, Ana Flavia, Ivonilce, Fernanda, Eduarda, Sara, Greice, Anna, Pamela e Marcel.
Às primas e agregados: Gurias vocês foram as responsáveis por aliviar meu estresse e me fazer ter vida ao longo desse mestrado. Amo vocês: Jessica, Francielle, Evelyn, Maria Eduarda, Henriette, Vanesssa.
À minha melhor amiga, pelos nossos bons e curtos momentos, mas sempre intensos: Michelle.
À minha primeira orientanda e hoje amiga: Amanda.
Ao Laboratório Farmacêutico Elofar por ter disponibilizado equipamentos para realização de uma das etapas desse trabalho.
Aos meus amigos da época da Elofar, apesar de nossa curta convivência, a amizade permanece até hoje, e sempre que preciso sei onde encontrá-las: Cintia, Alessandra, Paula e Franciele.
Aos alunos de graduação, IC e mestrado que passaram em algum momento e influenciaram de alguma forma no meu crescimento profissional.
Aos demais professores do programa de pós-graduação e do curso de farmácia, por contribuírem de alguma forma no meu conhecimento ao longo destes anos.
As demais pessoas que de alguma forma contribuíram no meu crescimento pessoal e profissional. Obrigada.
Onde há um desejo, Há um caminho.
Provérbio Chinês
FLOROGLUCINOIS EXTRAÍDOS DOS FRUTOS DE Eugenia umbelliflora: CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA,
FÍSICO-QUÍMICA, ESTABILIDADE E POTENCIAL ANTIPARASITÁRIO
Ingrid Vicente Farias Agosto/2017
Orientadora: Christiane Meyre da Silva Bittencourt, Dra.
Co-orientadora: Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 136
A planta Eugenia umbelliflora, conhecida como baguaçu, apresenta como compostos majoritários dos frutos os floroglucinois identificados como eugenial A, eugenial B, eugenial C, eugenial D e EuFr910, sendo os três últimos relacionados com a atividade antimicrobiana e citotóxica, evidenciada em estudos anteriores. Considerando o potencial biológico do eugenial C, o objetivo deste trabalho foi realizar estudos de pré-formulação com este floroglucinol, contribuindo para a caracterização e elucidação de sua estabilidade, além de analisar o potencial antiparasitário do eugenial C e eugenial D. Os compostos foram isolados a partir do extrato de hexano dos frutos verdes através de diferentes técnicas cromatográficas como coluna aberta, Chromatotron® e coluna flash, empregando como fase móvel hexano, seguido pelo aumento de polaridade com diclorometano. As frações mais puras foram analisadas por RMN de ¹H e ¹³C e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Na CLAE utilizou-se coluna C8 (150 x 4,6 mm x 5 µm) e fase móvel composta por metanol:
água ultrapura acidificada: acetonitrila acidificada (pH = 3,0), a 1,2 mL/min, 45 ºC, detecção em 275 nm. A solubilidade do eugenial C foi avaliada em metanol, acetonitrila, água destilada e fluído gástrico simulado e o comportamento térmico por DSC e TGA. Realizou-se estudo de degradação in silico, utilizando o software Spartan® e estudo de degradação forçada frente à hidrólise ácida, oxidativa, estabilidade térmica (calor seco e úmido) e fotoestabilidade. A atividade antiparasitária frente a forma promastigota de Leishmania amazonensis e L.
brasiliensis e forma amastigota de L. amazonensis e Trypanosoma cruzi foi avaliada através da viabilidade celular usando método colorimétrico. A partir do extrato de hexano foram isolados o eugenial C e eugenial D com pureza > 90%. O eugenial C apresentou-se ligeiramente solúvel em metanol, pouco solúvel em acetonitrila e praticamente insolúvel em água e fluído gástrico, e sem evento característico de fusão.
O estudo de degradação in silico demonstrou que o eugenial C é susceptível à hidrólise ácida, básica e oxidativa, o que ficou comprovado experimentalmente, sendo classificado como extremamente instável frente à hidrólise ácida e oxidativa. Eugenial C demostrou ser termolábil, especialmente frente ao calor úmido, além de fotoinstável. O método por CLAE-UV mostrou-se adequado para avaliação da estabilidade do eugenial C. A CI50 contra a forma promastigota de L. amazonensis e
L. brasiliensis, para o eugenial C, foi de 8,4 µM e de 9,31 µM, respectivamente e para o eugenial D de 17,27 µM e 5,9 µM, respectivamente. Ambos os compostos a 50 µM inibiram o crescimento da forma amastigota de T. cruzi e L. amazonensis. Este estudo revelou o potencial antiparasitário para os floroglucinois avaliados e a necessidade de proteção por um sistema de liberação que vise aumentar a solubilidade e estabilidade do eugenial C.
Palavras-chave: Caracterização físico-química. Eugenial C. Eugenial D.
Eugenia umbelliflora. Doença de Chagas. Estabilidade. Leishmaniose.
PHLOROGLUCINOLS EXTRACTED FROM FRUITS OF Eugenia umbelliflora: CHEMICAL, PHYSICAL- CHEMICAL CHARACTERIZATION, STABILITY AND
POTENTIAL ANTIPARASITIC ACTIVITY
Ingrid Vicente Farias August/2017
Supervisor: Christiane Meyre da Silva Bittencourt, Dr.
Co-supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr.
Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 136
The major compounds of the fruits of Eugenia umbelliflora, known in Brazil as baguaçu, are the phloroglucinols identified as eugenial A, eugenial B, eugenial C, eugenial D and EuFr910, with eugenial C, eugenial D and EuFr910 being related to the antimicrobial and cytotoxic activity evidenced in previous studies. Considering the biological potential of eugenial C, the objectives of this work were to carry out pre-formulation studies with this phloroglucinol, contributing to the characterization and elucidation of its stability, and to analyze the antiparasitic potential of eugenial C and eugenial D. The compounds were isolated from the hexane extract of the green fruits, and purified by different chromatographic techniques, including open column, Chromatotron® and flash column, using hexane followed by increasing polarity with dichloromethane. The purest fractions were analyzed by ¹H and ³³C NMR and High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC). In the HPLC, the C8 column (150 x 4.6 mm x 5 μm) was used and mobile phase were composed of methanol: acidified ultrapure water: acidified acetonitrile (pH= 3.0), 1.2 mL/min, 45 ºC, detection at 275 nm. The solubility of Eugenial C was evaluated in methanol, acetonitrile, distilled water and simulated gastric fluid, and the thermal behavior was determined by DSC and TGA. The in silico degradation study was performed using the software program Spartan® and forced degradation study against acid hydrolysis, oxidative, thermal stability (dry and wet heat) and photostability. Antiparasitic activity against the promastigote form of Leishmania amazonensis and L. brasiliensis and the amastigote form of L. amazonensis and Trypanosoma cruzi was analyzed through cell viability using the colorimetric method. From the hexane extract were isolated eugenial C and eugenial D with purity > 90%. The eugenial C was sparingly soluble in methanol, sligthtly soluble in acetonitrile, and practically insoluble in water and gastric fluid, without a characteristic melting event. The in silico degradation study demonstrated that eugenial C is susceptible to acidic, basic and oxidative hydrolysis, which has been proven experimentally, being classified as extremely unstable against acid and oxidative hydrolysis. Eugenial C also proved to be thermolabile, especially when submitted to damp (humid) heat, in addition to being photolabile. The HPLC-UV method proved to be adequate for evaluating the stability of eugenial C. The IC50
against the promastigote form of L. amazonensis and L. brasiliensis for eugenial C
was 8.4 μM and 9.31 μM, respectively and for the eugenial D, 17.27 μM and 5.9 μM, respectively. Both compounds at 50 μM inhibited the growth of the amastigote form of T. cruzi and L. amazonensis. This study reveals the antiparasitic potential of the evaluated floroglucinois, and the need for protection by a release system that aims to increase the solubility and stability of eugenial C.
Keywords: Physico-chemical characterization. Eugenial C. Eugenial D.
Eugenia umbelliflora. Chagas disease. Stability. Leishmaniasis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Partes aéreas de E. umbelliflora ... 31
Figura 2 - Compostos isolados de Eugenia umbelliflora ... 33
Figura 3 – Ciclo biológico da leishmaniose ... 37
Figura 4 – Ciclo biológico do Trypanossoma cruzi. ... 39
Figura 5 – Esquema sobre o estudo de pré-formulação. ... 41
Figura 6 – Esquema dos testes realizados no estudo de pré-formulação ... 41
Figura 7 – Esquema definindo o estudo de degradação forçada. ... 44
Figura 8 – Estudo do perfil de degradação. ... 45
Figura 9 – Fluxograma para realização dos estudos de degradação hidrolítica sob condições (A) ácidas e básicas; (B) oxidante. ... 52
Figura 10 - Fluxograma para realização dos estudos de degradação fotolítica. ... 55
Figura 11 – Perfil cromatográfico do extrato de hexano dos frutos de E. umbelliflora ... 68
Figura 12 - Esquema do procedimento de purificação do Eugenial C e D. ... 69
Figura 13 - Estrutura do eugenial D. ... 70
Figura 14 – Espectro de RMN de ¹H 300 MHz em CDCl3 ... 71
Figura 15 - Espectro de RMN de ¹³C 75,5 MHz em CDCl3 ... 72
Figura 16 - Cromatograma e perfil de UV por CLAE ... 73
Figura 17 - Estrutura quimica do eugenial C. ... 76
Figura 18 - Espectro de RMN de ¹H e ¹³C da fração 253-277 (CC2) em CDCl3. ... 77
Figura 19- Cromatograma e perfil de UV por CLAE da fração 253-277 ... 79
Figura 20 – Espectro de RMN de ¹H e ¹³C da Fr 23-40 (90%) em CDCl3 ... 81
Figura 21 – Perfil cromatográfico por CLAE do eugenial C. ... 82
Figura 22 – Cromatograma por CLUE-DAD-Qtof do eugenial C ... 82
Figura 23 - Cromatograma do íon extraído na faixa de massa de 439 (A) e o espectro de EM da energia de colisão dos picos mais intensos com tempo de retenção 12,97 min (B) e 14,96 min (C). ... 84
Figura 24 – Sugestão para o perfil de fragmentações do eugenial C. ... 84
Figura 25 – Cromatograma do íon extraído na faixa de massa de 369 (A) e o espectro de EM da energia de colisão do pico com tempo de retenção 6,77 min (B). ... 85
Figura 26 - Estrutura química do eugenial A e do eugenial B. ... 86
Figura 27 – Cromatograma do íon extraído na faixa de massa de 457 (A) e o espectro de EM da energia de colisão dos picos com tempo de retenção (B) 7, 17 min; (C) 7,58 min e (D) 10,58 min. ... 87
Figura 28 – Estrutura química do EuFr910. ... 87
Figura 29 - Espectro de RMN de ¹H e ¹³C da Fr 17-22 em CDCl3 ... 89
Figura 30 – Cromatograma obtido por CLAE-UV do eugenial D. ... 90
Figura 31 - Cromatograma por CLUE-DAD-Qtof do eugenial D. ... 91
Figura 32 - Cromatogarama do íon extraído na faixa de massa de 439 (A) e o espectro de EM da energia de colisão do pico com tempo de retenção 12,68 min (B). ... 91 Figura 33 – Sugestão para o perfil de fragmentações para o eugenial D. ... 92 Figura 34 – Cromatogramas dos diferentes métodos para quantificação do eugenial D por CLAE com coluna Kinetex® C18. ... 96 Figura 35 – Cromatogramas dos diferentes métodos para quantificação do eugenial D por CLAE com coluna Luna® C8. ... 98 Figura 36 – Análise térmica do eugenial C, curva do DSC (azul) e TGA (verde). 100 Figura 37 – Visualização em 3D 3-butiril-5-((deca-hidro-1,1,7-trimetil-4-metileno- 1H-cicloprop[e]azulen-7-il)metil)-2,4,6-tri-hidroxibanzaldeído ... 102 Figura 38 - Estrutura química do eugenial C com os sítios de degradação. ... 105 Figura 39 - Cromatograma do eugenial C (pico 4; 500 µg/mL) utilizado no estudo de degradação. ... 106 Figura 40 – Cromatogramas sobrepostos das amostras do estudo de degradação forçada na condição ácida a 0,05M HCl. ... 107 Figura 41 - Sobreposição dos cromatogramas das amostras do estudo de degradação forçada na condição ácida a 0,005M HCl. ... 107 Figura 42- Perfil de UV por CLAE do Eugenial C e dos tempos de degradação por hidrólise ácida. ... 108 Figura 43 - Sobreposição dos cromatogramas das amostras do estudo de degradação forçada na condição oxidante a 1,5% H2O2. ... 109 Figura 44 - Sobreposição dos cromatogramas das amostras do estudo de degradação forçada na condição oxidante a 0,5% H2O2. ... 110 Figura 45 - Perfil de UV por CLAE do Eugenial C e dos tempos de degradação por hidrólise oxidativa. ... 111 Figura 46 - Sobreposição dos cromatogramas dos diferentes de tempos do calor seco.
... 112 Figura 47 - Perfil de absorção por UV da estabilidade térmica: calor seco... 113 Figura 48 – Cromatograma por CLUE-Qtof da degradação térmica calor seco... 114 Figura 49 – Sobreposição dos cromatogramas dos diferentes de tempos da estabilidade térmica: calor úmido. ... 115 Figura 50 – Perfil de absorção do UV da estabilidade térmica: calor úmido. ... 116 Figura 51 – Perfil cromatográfico por CLUE-Qtof da degradação térmica calor úmido.
... 117 Figura 52 – Análise térmica por DSC (A) e TGA (B) das amostras do calor úmido do eugenial C. ... 118 Figura 53 - Sobreposição dos cromatogramas do estudo de fotoestabilidade. ... 119 Figura 54 - Perfil de absorção por UV da degradação fotolítica do eugenial C. .... 120
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Atividade biológica dos extratos e compostos de E. umbelliflora. ... 34
Quadro 2 – Testes de rastreio da atividade antiparasitária... 40
Quadro 3 - Termos descritivos da solubilidade segundo a farmacopeia. ... 42
Quadro 4 – Classe biofarmacêutica segundo o SCB ... 43
Quadro 5 - Condições mais utilizadas nos estudos de degradação ... 46
Quadro 6 - Sistema de classificação para hidrólise ácida e básica. ... 46
Quadro 7 - Sistema de classificação para hidrólise oxidativa. ... 47
Quadro 8 - Sistema de classificação para degradação fotolítica. ... 47
Quadro 9 - Degradação de grupos funcionais (continua). ... 49
Quadro 10 – Sistema gradiente da fase móvel por CLUE-DAD-Qtof. ... 59
Quadro 11 - Composição da fase móvel nos diferentes métodos para quantificação do eugenial D por CLAE com coluna Kinetex® C18 ... 94
Quadro 12 - Composição da fase móvel nos diferentes métodos para quantificação do eugenial D por CLAE com coluna Luna® C8. ... 97
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores de deslocamentos químicos (δ, ppm) de RMN ¹H e ¹³C ... 75 Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos (δ, ppm) de RMN ¹H e ¹³C ... 79 Tabela 3- Principais parâmetros observados nos cromatogramas e espectros de massa por CLUE-Qtof para amostra do eugenial C ... 88 Tabela 4 - Valores das análises (neutras, positiva e negativas) da função de Fukui condensadas eletrofílica f− e nucleofílicas f+, e Δf(r) considerando o átomo da estrutura do eugenial C calculado com o DFT B3LYP e o 6.311G* (d, f), considerando as equações 1, 2 e 3. ... 103 Tabela 5 – Valores da função de Fukui para o ataque do radical e a energia de dissociação da ligação (hidrogênio removido) do hidrogênio da estrutura química do eugenial C. ... 104 Tabela 6 – Comparação das áreas do dos picos 1-5 presentes no eugenial C e dos diferentes tempos da condição ácida HCl 0,005 M. ... 109 Tabela 7 - Comparação das áreas do eugenial C e dos diferentes tempos da condição ácida a 0,5% H2O2. ... 111 Tabela 8 – Percentual de degradação na estabilidade térmica: calor seco. ... 114 Tabela 9 - Percentual de degradação na estabilidade térmica: calor úmido. ... 116 Tabela 10 – Análise do TGA da degradação térmica calor úmido do eugenial C. . 119 Tabela 11 – Dados do % de degradação fotolítica. ... 121 Tabela 12 – CI50 (µM) do eugenial C e eugenial D contra a forma promastigota de L.
braziliensis (Lb) e L. amazonensis (La). ... 122 Tabela 13 – Resultados dos compostos contra a forma amastigota de T. cruzi e L.
amazonensis. ... 122
LISTA DE SIGLAS
ANVISA - Agência de vigilância sanitária CC – Cromatografia em coluna
CCD - Cromatografia em camada delgada CI50 – Concentração inibitória em 50%
CIM – Concentração inibitória mínima
CLAE/UV - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de UV
CLUE/PDA/Qtof - Cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada ao detector de matriz de fotodiodo e ao analisador de massas de alta resolução
DCM – Diclorometano DMSO – dimetilsulfoxido EM – Espectro de massa
ICH - International conference of harmonization MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina.
MTT - [Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]
MeOH - Metanol
RMN - Ressonância magnética nuclear RDC - Resolução da diretoria colegiada RE - Resolução
Rf – Fator de retenção
RMN ¹³C – Ressonância magnética nuclear de carbono 13 RMN ¹H – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio TMS – Tetrametilsilano
UV – Ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 25
2 OBJETIVOS ... 27
2.1 Objetivo geral ... 27
2.2 Objetivos Específicos ... 27
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 29
3.1 Produtos Naturais ... 29
3.2 Eugenia umbelliflora ... 31
3.3 Doenças Parasitárias ... 35
3.4 Estudos de pré-formulação ... 40
3.4.1 Estudo de estabilidade: perfil de degradação ... 43
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 57
4.1 Materiais e Reagentes... 57
4.2 Obtenção do extrato ... 57
4.3 Obtenção e caracterização química do eugenial C e eugenial D . 58 4.4 Desenvolvimento de metodologia por CLAE ... 59
4.5 Estudos de pré-formulação ... 60
4.5.1 Grau de pureza por CLAE... 60
4.5.2 Solubilidade ... 60
4.5.3 Análise térmica ... 61
4.5.4 Estudo de degradação forçada in silico ... 61
4.5.5 Estudo de degradação forçada ... 62
4.6 Atividade antiparasitária ... 64
4.6.1 Forma promastigota: Leishmania ... 65
4.6.2 Forma amastigota: Leishmania e Trypanossoma ... 65
5 RESULTADO E DISCUSSÃO ... 67
5.1 Obtenção do extrato ... 67
5.2 Obtenção do eugenial C e eugenial D ... 68
5.3 Desenvolvimento de metodologia por CLAE ... 93
5.4 Estudos de pré-formulação ... 99
5.4.1 Solubilidade ... 99
5.4.2 Análise térmica ... 100
5.4.3 Estudo de degradação forçada in silico do eugenial C ... 101
5.4.4 Estudo de degradação forçada: hidrólise ácida ... 105
5.4.5 Estudo de degradação forçada: hidrólise oxidativa ... 109
5.4.6 Degradação térmica – Calor Seco ... 112
5.4.7 Degradação térmica – Calor Úmido ... 115
5.4.8 Degradação fotolítica ... 119
5.5 Atividade Antiparasitária ... 121
6 CONCLUSÕES ... 123
REFERÊNCIA... 125
