PAULO ROBERTO ADONA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2006
PAULO ROBERTO ADONA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO – 2006
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006
Adona, Paulo Roberto
Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos : efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática / Paulo Roberto Adona. – 2006.
78 f. il.
Orientador: Cláudia Lima Verde Leal
Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2006.
Bibliografia: f. 55-67.
1. Butirolactona I 2. Embrião 3. Maturação 4. Meiose 5. Ovócito bovino I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título.
CDD 636.2082
PAULO ROBERTO ADONA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Aprovado em 10 de março de 2006.
Comissão Examinadora:
___________________________________________________________________
Profª. Drª. Gisele Zoccal Mingoti (Doutorado em Fisiologia) UNESP
___________________________________________________________________
Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutorado em Fisiologia) UENF
___________________________________________________________________
Profº Dr. Reginaldo da Silva Fontes (Doutorado em Fisiologia) UENF
___________________________________________________________________
Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal (Doutorado Reprodução Animal) USP/FZEA (Orientador)
ii
AGRADECIMENTOS
Em especial à minha mãe, meu irmão e às minhas irmãs.
Gostaria de expressar minha profunda gratidão e carinho, em especial:
À Rosângela A. Queiroz;
À Cláudia L. V. Leal;
À Margot A. N. Dode;
À Maineide Z. Velasques.
À todos meus amigos pelo carinho e companheirismo. Sem cada um de vocês nada disso seria possível e a vida não teria sentido.
Alexandre Barreto; Aline S. M. César;
Amanda de A. Rocha; Aparecida Mandella;
Bethania Lopes; Bruno Fagundes;
Camila Cortez; Fabiana Bressan;
Felipe C. Braga; Fernando Biaze;
Flávio P. Júnior; Giovana K. F. Merighe;
Gustavo (Sancho); Hebinho (Baby Sauro) Isabele P. Emanuelli; Kátia L. Schwartz;
Kelen S. Viana; Lígia Garcia Mesquita;
Marcos R. Chiaratti; Mariene (Bitoca);
Moysés S. Miranda; Nilton P. dos Santos;
Norma Clea Rodovalho; Patrícia M. Porciúncula;
Paula Ripamonte; Pedro Ratto;
Roberto Carneiro; Rosemary Bastos;
Sílvia G. Matta; Sylvia S. Cortezzi;
Tiago H. C. De Bem; Vanessa G. Ueno;
iii
Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy R. (UENF/CCTA/LMGA);
À Universidade de São Paulo (USP/FZEA/ZAB);
À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa;
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo.
iv
BIOGRAFIA
PAULO ROBERTO ADONA, filho de Ivo Adona e Maria Boniatti Adona, nasceu em 26 de agosto de 1966, na cidade de Campinas do Sul – RS.
Em março de 1995, ingressou no curso de Biologia da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB), em Campo Grande – MS. Submeteu-se à apresentação de monografia para conclusão do curso em dezembro de 1998.
Foi selecionado em março de 1997 como estagiário do setor de Reprodução Animal da Embrapa – CNPGC, sob orientação da Pesquisadora Drª. Margot A. N.
Dode.
Foi aprovado em agosto de 2000 no curso de Pós-graduação em Produção Animal, a nível de mestrado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em abril de 2002.
Foi aprovado em março de 2002 no curso de Pós-graduação em Produção Animal, a nível de doutorado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em março de 2006.
v
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIATURAS--- viii
RESUMO --- x
ABSTRACT --- xii
1. INTRODUÇÃO --- 01
2. REVISÃO DE LITERATURA --- 03
2.1. Ovogênese e foliculogênese --- 03
2.2. Maturação ovocitária --- 04
2.2.1. Maturação nuclear --- 05
2.2.2. Maturação citoplasmática --- 06
2.2.3. Organização estrutural na maturação --- 07
2.2.3.1. Citoesqueleto --- 07
2.2.3.2. Organelas --- 08
2.2.3.2.1. Mitocôndrias --- 08
2.2.3.2.2. Grânulos corticais --- 09
2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas --- 10
2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs) --- 11
2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF) --- 12
2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) --- 13
2.3. Competência ovocitária --- 15
2.4. Bloqueio meiótico--- 17
3. OBJETIVOS --- 20
vi
4.2. Solução estoque do inibidor --- 22
4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I --- 22
4.4. Determinação do estádio da meiose --- 22
4.5. Maturação in vitro --- 23
4.6. Microtúbulos --- 24
4.7. Microfilamentos --- 24
4.8. Grânulos corticais --- 25
4.9. Mitocôndrias --- 25
4.10. Fecundação e cultivo in vitro --- 25
4.11. Delineamento experimental --- 27
4.11.1. Experimento 1. Avaliação de concentrações decrescentes de BL I em meio suplementado com BSA --- 27
4.11.2. Experimento 2. Avaliação de concentrações crescentes de BL I em meio sem suplementação de BSA --- 27
4.11.3. Experimento 3. Efeito do bloqueio da meiose na maturação nuclear --- 28
4.11.4. Experimento 4. Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio da meiose --- 29
4.11.5. Experimento 5. Efeito do bloqueio da meiose na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos --- 29
4.11.6. Experimento 6. Efeito do bloqueio da meiose na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias --- 30
4.11.7. Experimento 7. Efeito da BL I no desenvolvimento embrionário in vitro --- 31
4.12. Análise estatística --- 32
5. RESULTADOS --- 33
5.1. Experimento 1. --- 33
5.2. Experimento 2. --- 34
5.3. Experimento 3. --- 35
5.4. Experimento 4. --- 36
5.5. Experimento 5. --- 38
vii
6. DISCUSSÃO --- 45
7. CONCLUSÕES --- 54
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS --- 55
APÊNDICE --- 68
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
μg – micrograma;
μL – microlitro;
μM – micromolar;
AI – anáfase I;
AMPc – monofosfato de adenosina cíclica;
ATP – trifosfato de adenosina;
B199 – TCM-199, sais de Earle e 20 mM de bicarbonato de sódio;
BL I – butirolactona I;
BSA – albumina sérica bovina;
CDK – cinase dependente de ciclina;
CIV – cultivo in vitro;
CO2 – dióxido de carbono;
CSF – fator citostático;
DMSO – dimetilsulfóxido;
DNA – ácido desoxirribonucléico;
ERK – cinase regulada por sinal extracelular (MAPK);
FITC – isotiocianato de fluoresceína;
FIV – fecundação in vitro;
FSH – hormônio folículo estimulante;
ix
H199 – TCM -199, sais de Earle, 20 mM de bicarbonato de sódio e 25 mM de Hepes;
LH – hormônio luteinizante;
MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos;
MAP2K, MAP3K, MAP4K – cinases ativadoras de cinases ativadas por mitógenos MAT – metáfase I, anáfase I e telófase I;
MBP – proteína básica de mielina;
MEK – cinase regulada por sinal extracelular (MAP2K);
MI – metáfase I;
MII – metáfase II;
Miss – MAPK de interação e estabilização do fuso meiótico;
MIV – maturação in vitro;
mL – mililitro;
mos – oncogene c-mos;
MPF – fator promotor da maturação;
Myt1, Wee1 e CDC25 – proteínas cinases envolvidas na atividade do MPF;
P90RSK – proteína cinase ribossomo S6;
PBS – tampão fosfato salina;
PIV – produção in vitro;
PKA – proteína cinase A;
PKC – proteína cinase C;
PVA – álcool polivinílico;
Raf-1 – MAP3K;
Ras – MAP4K;
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro;
SFB – soro fetal bovino;
SOF – fluido de oviduto sintético;
TALP – meio tyrode’s com albumina, lactato e piruvato;
TCM-199 – meio de cultura de tecidos 199;
TI – telófase I;
VG – vesícula germinativa.
x
RESUMO
ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro: março de 2006; Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos: efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática; Orientador: Profª. Drª.
Cláudia Lima Verde Leal. Conselheiro: Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere.
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do uso da butirolactona I (BL I) na pré-maturação sobre a progressão da meiose, estruturas celulares e desenvolvimento de ovócitos bovinos cultivados in vitro. Ovários bovinos foram coletados em frigoríficos e os folículos de 2-6 mm de diâmetro foram aspirados para a obtenção dos ovócitos. Inicialmente, foram avaliadas diferentes concentrações de BL I em meio suplementado ou não com BSA. Houve diferença (P < 0,05) nas taxas de vesícula germinativa (VG) entre os grupos C/24 (0,0%), 25 (65,1%), 50 (84,4%) e 100 μM (97,4%) de BL I suplementados com BSA, mas não houve diferença (P >
0,05) entre os tratados com 10 (94,7%), 15 (97,2%), 20 (98,7%) e 25 μM (98,7%) de BL I em meio sem BSA. As taxas de maturação (MII) não diferiram (P > 0,05) entre o controle (91,1%) e os tratados com 10 (B10 = 91,5%) e 100 μM (B100 = 92,4%) de BL I. Em relação à cinética de MIV pós-bloqueio, observou-se que às 6h de MIV os grupos B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram taxas de VG inferiores (P < 0,05) ao controle (97,3%). Com 12h de MIV a maior parte dos ovócitos estava em estádios intermediários da meiose (MAT) (77,9; 83,1 e 86,4% para controle, B10 e B100, respectivamente, P > 0,05). Com 18h de MIV as taxas de MII não diferiram (P >
xi
organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos (controle, B10 e B100) e horários (0, 6, 12, 18 e 24h) avaliados. Também não foi observada nenhuma alteração no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos ovócitos avaliados nas mesmas condições. Em 100% dos ovócitos não maturados independente do grupo (C/0h, B10 e B100), os grânulos corticais apresentavam-se dispersos pelo citoplasma (P > 0,05) dos ovócitos. Após 24h de MIV, 98% dos ovócitos apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do citoplasma em todos os grupos (P > 0,05). As mitocôndrias nos ovócitos não maturados dos grupos tratados encontravam-se em sua maioria na periferia dos ovócitos (81,5 e 86,9%, P > 0,05), mas foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%).
Após 24h de MIV, as mitocôndrias migraram por todo o ovócito, sendo o grupo C/24 (81,5%) inferior (P < 0,05) aos grupos B10M (95,2) e B100M (98,2%) que não diferiram entre si (P > 0,05). As taxas de clivagem (81-87%) não diferiram (P > 0,05) para os ovócitos submetidos à FIV nos grupos controle, B10 e B100. Com relação à percentagem de blastocisto no D7, os grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos foram superiores (P < 0,05) ao grupo B100 (33,0%). A taxa de blastocisto eclodido foi similar (P > 0,05) entre os grupos controle (19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) no D8. Também não foi observada variação (P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos no D8, entre o controle (138), B10 (136) e B100 (150). A pré-maturação com BL I não aumentou os índices de desenvolvimento, porém também não induziu alterações estruturais e não comprometeu (B10) o desenvolvimento embrionário, sugerindo a possibilidade de sua aplicação em biotécnicas de PIV de embriões e de clonagem.
Palavras-chave: butirolactona I, embrião, maturação, meiose e ovócito bovino.
xii
ABSTRACT
ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro: março de 2006; Meiosis block using butyrolactone I in bovine oocytes:
Effects on nuclear and cytoplasmic maturation; Supervisor: Prof. Dr. Cláudia Lima Verde Leal. Counselor: Prof. Dr. Maria Clara Caldas Bussiere.
The present study aimed to assess the effects of butyrolactone I (BL I) in pre- maturation on meiosis progression, cellular structures and development of bovine oocytes cultured in vitro. Bovine ovaries were collected in abattoirs and 2-6mm follicles were aspirated to obtain oocytes. Initially, different BL I concentrations were evaluated in B199 medium supplemented or not with BSA. Germinal vesicle (GV) rates were different (P < 0.05) among the groups C/24 (0.0%) 25 (65.1%), 50 (84.4%) and 100 μM (97.4%) BL I in medium supplemented with BSA. However, no difference (P>0.05) was observed when oocytes were cultured with 10, 15, 20 and 25 μM BL I (94.7, 97.2, 98.7 and 98.7%, respectively) in medium without BSA.
Maturation rates (MII) were similar (P > 0.05) between controls (91.1%) and treated oocytes (91.5 and 92.4% for B10 and B100, respectively). Regarding maturation kinetics, VG rates at 6h IVM in controls (97.3%) were superior (P < 0.05) to treated oocytes (71.4 and 74.3% for B10 and B100, respectively). At 12h most of the oocytes were at intermediate stages of meiosis (77.9, 83.1 and 86.4%, for control, B10 and B100, respectively, P>0.05). After 18 h IVM, MII rates were similar (P > 0.05) among groups (72.0, 73.7 and 78,9% for control, B10 and B100, respectively). Regarding
xiii
periods (0, 6, 12, 18 and 24h). No alterations in microfilament arrangement were observed either under the same conditions. All immature oocytes (100%) presented cortical granules (CG) dispersed throughout the cytoplasm, irrespective of oocyte group (C/0h, B10 and B100, P > 0.05). After 24 h IVM, also irrespective of oocyte group, 98% of the oocytes had the CG migrated to the periphery of the cytoplasm (P
> 0.05). Immature oocytes in treated groups presented mitochondria mostly in the periphery of the oocytes (81.5 and 86.9%, P > 0,05), although at a lower rate than in control oocytes (100%, P < 0.05). After 24 h IVM, mitochondria migrated throughout the cytoplasm, but in both treated groups the migration rates were superior (95.2 and 98.2% for B10 and B100, P > 0.05) to controls (81.5%, P < 0.05). Cleavage rates were not affected (81-87%, P > 0.05) in oocytes fertilized in vitro. However, blastocyst rates in day 7 were reduced in the B100 group (33.0%, P < 0.05). Controls and B10 had similar rates (38.3 and 41.6%, respectively, P >0.05). Day 8 hatching rates (19.2, 17.7 and 11.0% for control, B10 and B100, P > 0.05) and blastocyst cell numbers (138, 136 and 150 B100 for control, B10 and B100, P > 0.05) were unaffected. Pre-maturation using BL I did not increase blastocyst rates, but also did not affect cell structures and development (B10), suggesting the possibility of its use for in vitro embryo production and cloning.
Palavras-chave: butyrolactone I, embryo, maturation, meiosis and oocyte bovine.
1. INTRODUÇÃO
Os mecanismos pelos quais os ovócitos adquirem a competência para desenvolverem-se até o estádio de blastocisto ainda não estão totalmente compreendidos. Há evidências de que a aquisição da competência está correlacionada com moléculas de RNAs e de proteínas estocadas e processadas durante as fases de crescimento, “capacitação” (pré-maturação) e maturação do ovócito. Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais da embriogênese até que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001).
Apesar dos muitos esforços para melhorar a produção in vitro (PIV) de embriões para fins científicos e/ou comerciais, a sua eficiência ainda é relativamente baixa. Apenas 35-40% dos ovócitos bovinos maturados in vitro (MIV) desenvolvem- se até o estádio de blastocisto (MAYES e SIRARD, 2001; SIRARD et al., 2006), e ainda desses, somente 30% chegam a termo após a transferência (WARD et al., 2002; PARK et al., 2005). Essas baixas taxas são determinadas por vários fatores decorrentes das etapas que constituem o sistema de PIV de embriões. As condições de cultura para maturação nuclear e citoplasmática do ovócito certamente têm um papel fundamental, e uma maturação completa é essencial para o desenvolvimento embrionário. Portanto, para a obtenção de um sistema que possibilite a produção de um maior número de embriões é necessária a compreensão dos mecanismos envolvidos na maturação.
Observou-se que in vivo, os ovócitos, ao final de seu período de crescimento,
mas antes do período de maturação propriamente dito, passam por um período chamado de “capacitação”, o qual parece ser importante para o desenvolvimento pleno de sua competência. Nesse período ocorrem modificações estruturais e moleculares que são importantes para o desenvolvimento embrionário (HYTTEL et al., 1997, DIELEMAN et al., 2002).
Os ovócitos utilizados no sistema de PIV de embriões normalmente já concluíram sua fase de crescimento e entraram no período de “capacitação”
ovocitária (HYTTEL et al., 1997). Porém, ao serem removidos do ambiente folicular reiniciam a meiose (KUBELKA et al., 2000) e uma parte dessa população ainda não concluiu a “capacitação” ovocitária.
Uma das alternativas que vários pesquisadores vêm analisando para estudar a competência de desenvolvimento dos ovócitos in vitro é o bloqueio da retomada da meiose antes da maturação. No entanto, pouco se sabe do que ocorre nesse período. De toda forma, o bloqueio da meiose serviria como ferramenta para estudar os possíveis fatores envolvidos na indução da “capacitação” após a remoção dos ovócitos do ambiente folicular, e que poderiam ter efeitos positivos sobre o desenvolvimento embrionário subseqüente. A obtenção de conhecimento nesse sentido, por sua vez, poderá contribuir para um melhor embasamento no desenvolvimento de procedimentos mais eficientes para a PIV de embriões bovinos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Ovogênese e foliculogênese
A ovogênese refere-se à seqüência de eventos em que as células germinativas primordiais diferenciam-se em ovogônias, ovócitos primários e secundários, findando com a fecundação do ovócito maturo (GONSALVES et al., 2002; VAN DEN HURK e ZHAO, 2005). Já a foliculogênese inicia-se com a formação dos folículos
primordiais,
progredindo para folículos primários, secundários e terciários, finalizando
com a ovulação de um
ovócito maturo (GONSALVES et al.,
2002; VAN DEN
HURK e ZHAO, 2005) (Figura 1). A diferenciação das células da linhagem
germinativa feminina ocorre totalmente ou quase totalmente na fase embrionária/fetal dependendo da espécie (MOORE e PERSAUD, 2000;
GONSALVES et al., 2002) (Tabela 1). Estudos recentes, porém, sugerem que possa
Figura 1. Diagrama simplificado da ovogênese e foliculogênese.
Fonte: adaptado de Gonsalves et al., (2002) e Van den Hurk e Zhao (2005).
C. germinativas primordiais
Endoderma
Ovogônia Ovócito 1°
Folículo primordial Folículo 1º
Folículo 2º
Folículo ovulatório
Meiose II Ovulação
Fecundação Zigoto
Mitose F
O L I C U L O G Ê N E S E
Blastocisto
O V O G Ê N E S
Dictióteno
Início da meiose I Prófase I
Prófase I Folículo 3º Folículos
pré-antrais
Folículos antrais
E
Ovócito2°
Término da meiose I
Término da meiose II
haver diferenciação dessas células também em adultos, embora a maior parte das evidências ainda indique que folículos primários sejam formados apenas na vida fetal (BUKOVSKY et al., 2005).
Ao nascer, os bovinos dispõem de um número determinado de ovócitos primários, cada um dos quais com o material genético duplicado (GONSALVES et al., 2002). O processo de
diferenciação dos ovócitos primários (imaturo) para secundários (maturo) é iniciado na maturidade sexual quando, a intervalos médios de 21 dias (bovinos), um ovócito (2n) conclui a primeira meiose
iniciada na fase fetal. Agora, o ovócito secundário ou maturado (n) encontra-se apto para a fecundação. Com a fusão do espermatozóide, o ovócito finaliza sua segunda divisão meiótica (extrusão do segundo corpúsculo polar). Desse modo o material genético do ovócito é reduzido à metade por meio de duas divisões meióticas sucessivas. A ploidia retorna à sua conformação original (2n) com a interação (singamia) do material genético do espermatozóide com o do ovócito, formando assim o zigoto, que originará o embrião (MOORE e PERSAUD, 2000; GONSALVES et al., 2002; HAFEZ, 2002).
Tabela 1. Cronologia da ovogênese e foliculogênese em bovinos e ovinos.
Eventos Dias de gestação Bovinos Ovinos Células germinativas primordiais 35 23
Ovogônias 60 48
Ovócitos primários 75-80 55
Folículo primordial 90-130 90
Folículos primários 140 95
Folículos secundários 210 103 Folículos terciários 230-250 150
Nascimento 280 150
Fonte: McNatty et al., 2000; Gonsalves et al., 2002; Fair, 2003
2.2 . Maturação ovocitária
Durante todo o período do desenvolvimento, desde a formação e crescimento dos ovócitos e dos folículos, até após o período da dominância folicular, os ovócitos bovinos permanecem em estádio de prófase da primeira meiose. In vivo, o reinício da meiose ocorre com o surgimento do pico pré-ovulatório de LH (hormônio luteinizante) e se dá somente nos ovócitos inteiramente crescidos e meioticamente competentes dos folículos pré-ovulatórios (FAIR, 2003; RODRIGUEZ e FARIN, 2004). A competência dos ovócitos tem uma estreita relação com as multicamadas de células do cumulus que os cercam, mantendo uma importante via de
comunicação através das junções comunicantes (gap), antes e durante o pico pré- ovulatório de LH (RODRIGUEZ e FARIN, 2004; GILCHRIST et al., 2004). Logo após o pico de LH, começa a ocorrer o desaparecimento dessas vias de comunicação entre o ovócito e as células do cumulus (HYTTEL et al., 1997).
A progressão do ciclo celular do ovócito até o estádio de metáfase da segunda meiose (metáfase II), tanto in vivo quanto in vitro, é marcada por uma série de transformações bioquímicas e estruturais no núcleo e no citoplasma do ovócito, eventos esses que caracterizam a maturação ovocitária (MACHATKOVA et al., 2004; DE SOUSA et al., 2004). Na transição da prófase I à metáfase II, estabelece- se uma complexa cascata de fosforilações e desfosforilações de uma série de proteínas envolvidas no reinício e na regulação da meiose (DEKEL, 2005; DUMONT et al., 2005). Entre as proteínas que mais se destacam no período da maturação estão as proteínas do complexo MPF (fator promotor da maturação) e da família MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos). Para efeito de estudo, a maturação será dividida em maturação nuclear e citoplasmática, apesar desses eventos ocorrerem concomitantemente.
2.2.1. Maturação nuclear
A diferenciação do ovócito imaturo em maturo envolve uma série de alterações que são estimuladas principalmente por hormônios gonadotróficos (MERTON et al., 2003). Sob a influência dos hormônios, o ovócito recomeça seu ciclo celular progredindo da fase de diplóteno da prófase da primeira meiose (prófase I), passando pelos estádios de metáfase I, anáfase I, telófase I (término da primeira divisão meiótica) e progredindo até o estádio de metáfase da segunda divisão meiótica (MEINECKE et al., 2001). No intervalo que compreende os estádios de prófase I a metáfase II, os cromossomos condensam e o envelope nuclear é desfeito marcando o início da maturação nuclear (MEINECKE et al., 2001; JONES, 2004). Dando seqüência, os cromossomos homólogos são divididos em dois grupos, com a metade do número original de cromossomos. Ao término da primeira divisão meiótica o citoplasma é dividido assimetricamente (CAN et al., 2003), gerando duas células de tamanhos diferentes: uma pequena chamada de corpúsculo polar e outra
grande, o ovócito secundário. Ao término da maturação nuclear o ovócito permanece nesse estádio do ciclo celular (metáfase II) até a fecundação (MAYES e SIRARD, 2001) ou ativação partenogenética (YI e PARK, 2005).
Os fatores da ativação (natural ou artificial) dos ovócitos maturos vão promover o término da segunda divisão meiótica, que se caracteriza pela progressão da metáfase II até a telófase II com a liberação do segundo corpúsculo polar. Após a ativação, o futuro embrião prossegue seu ciclo celular por divisão mitótica. In vitro, a maturação nuclear de ovócitos bovinos de folículos > 2 mm de diâmetro em condições apropriadas requer de 18 a 24 horas de cultivo (KHATIR et al., 1998;
DODE e ADONA, 2001; ADONA e LEAL, 2004).
2.2.2. Maturação citoplasmática
A competência de desenvolvimento do ovócito em embrião em estádio adiantado de desenvolvimento é basicamente dependente das modificações bioquímicas, moleculares e estruturais do citoplasma. Essas alterações na maturação do ovócito são processos altamente complexos que envolvem vários eventos simultâneos como síntese de proteínas (KHATIR et al., 1997; SIRARD et al., 1998), modificações moleculares (KUBELKA et al., 2000) e migração e reorganização de organelas no citoplasma (STOJKOVIC et al., 2001). Se compararmos as taxas de
maturação (Tabela 2), observaremos que a maturação citoplasmática (taxa de blastocistos) in vitro está aquém da maturação nuclear (taxa de
metáfase II) (HASHIMOTO et al., 2002; OYAMADA et al., 2004; ADONA e LEAL 2004). Por outro lado, in vivo, as taxas de blastocistos são de aproximadamente 80%
(RIZOS et al., 2002).
Tabela 2. Comparação entre maturação nuclear e citoplasmática.
Nuclear1 Citoplasmática2
81,0% 33,5%
81,4% 22,2%
90,9% 34,8%
1 Taxa de ovócitos em estádio de metáfase II; 2 Taxa de embriões em estádio de blastocisto, após sete dias de cultivo in vitro. Fonte:
Hashimoto et al., 2002; Oyamada et al., 2004; Adona e Leal, 2004
2.2.3. Organização estrutural na maturação
2.2.3.1. Citoesqueleto
Microtúbulos, um dos componentes do citoesqueleto, são filamentos altamente dinâmicos e sua dinâmica se dá pela adição (polimerização) ou remoção (despolimerização) constante de novas unidades de tubulina α e β. Na transição do ciclo celular durante a maturação de ovócitos de mamíferos ocorre uma intensa reorganização dos microtúbulos (KIM et al., 2000).
Durante a maturação meiótica, duas populações de centrossomos regulam coordenadamente o conjunto de microtúbulos nos eventos nucleares e citoplasmáticos, tais como formação do eixo meiótico orientado assimetricamente, segregação dos cromossomos durante a meiose, a extrusão do primeiro corpúsculo polar e a formação da segunda placa metafásica (ALBERTS et al., 1997; KIM et al., 2000; CAN et al., 2003; SUN et al., 2004).
Os erros de segregação dos cromossomos durante uma ou outra divisão meiótica podem resultar em embrião aneuplóide após a fecundação, o que por sua vez pode ter grave conseqüência para o desenvolvimento (BRUNET et al., 2003;
SUN et al., 2004). Especificamente nos mamíferos, a perda ou ganho de um cromossomo autossômico resulta em distúrbios fisiológicos e de desenvolvimento (ABRUZZO e HASSOLD, 1995).
Para o sucesso da fecundação, o fuso meiótico no ovócito deve permanecer estável e corretamente organizado durante o
bloqueio do ovócito em metáfase II (TERRET et al., 2003). Há evidências de que as proteínas da família MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos) e a PKC (proteína cinase C) são responsáveis pela estabilidade dos microtúbulos mantendo o fuso meiótico estável em ovócitos de ratos (HORNE et al., 2003; TONG et al., 2003).
Os substratos da MAPK (Figura 2), tais como a p90rsk (proteína cinase ribossomo S6) e a MISS (MAPK de interação e estabilização do fuso)
Figura 2. Proteínas envolvidas na estabilidade do fuso meiótico e na atividade do CSF em camundongos.
Fonte: Lefebvre et al., (2002).
mos
MAPKK
MAPK
Miss P90RSK
Estabilidade do fuso MII ? CSF bloqueio
parecem participar dessa estabilidade via proteínas mos/.../MAPK (LEFEBVRE et al., 2002; TERRET et al., 2003).
A rede de microtúbulos é usada por proteínas motoras (famílias das cinesinas e dineínas) para gerar movimentos periódicos das organelas no interior da célula. As proteínas motoras dependentes de microtúbulos desempenham uma função importante no posicionamento das organelas (ALBERTS et al., 1997).
Os microfilamentos são os maiores componentes do citoesqueleto em ovócitos de mamíferos e fornecem a estrutura para divisão celular (KIM et al., 2000).
Ficam situados principalmente no córtex celular (camada situada logo abaixo da membrana plasmática rica em actina e uma variedade de proteínas) de ovócitos em estádio VG (vesícula germinativa) e no eixo meiótico da célula depois do rompimento da VG (desestruturação da membrana nuclear) (ALBERTS et al., 1997; KIM et al., 2000). Estão envolvidos na incorporação do espermatozóide, na extrusão do corpúsculo polar e na migração dos grânulos corticais para o córtex celular durante a maturação ovocitária em diferentes espécies de mamíferos (CONNORS et al., 1998;
KIM et al., 2000; SUN et al., 2001a).
2.2.3.2. Organelas
2.2.3.2.1. Mitocôndrias
As mitocôndrias são a central bioenergética da célula com função claramente essencial que define a competência funcional dos ovócitos. São organelas especializadas que ocupam uma porção substancial do volume citoplasmático das células de origem materna. São responsáveis pela produção da maior parte da energia celular em forma de ATP (trifosfato de adenosina), por fosforilação oxidativa através do metabolismo dos carboidratos e dos ácidos graxos contidos no citoplasma provenientes do meio interno e externo (WILDING et al., 2001;
CUMMINS, 2004). Nos ovócitos em geral, há uma grande concentração de mitocôndrias para suportar uma taxa mais elevada de síntese de moléculas dos processos fisiológicos envolvidos no desenvolvimento. A eficiência da matriz mitocondrial na conversão do piruvato em ATP é requerida para o processo de maturação e divisão celular (WILDING et al., 2001). A inabilidade das mitocôndrias
de aumentarem e/ou acumularem ATP tem sido ligada ao desenvolvimento anormal ou ao bloqueio do desenvolvimento embrionário (STEUERWALD et al., 2000).
Durante a mitose, as mitocôndrias são distribuídas aleatoriamente entre as células filhas e no decorrer da ovogênese há um aumento substancial no número de mitocôndrias (6000 para 193.000 mitocôndrias no ovócito em humanos) com uma variação expressiva entre ovócitos do mesmo estádio de desenvolvimento (REYNIER et al., 2001; CUMMINS, 2004). Porém, se os blastômeros embrionários não receberem uma população suficiente de mitocôndrias para produção de ATP podem tornare-se disfuncionais e fragmentados (CUMMINS, 2004). Há uma correlação similar entre o potencial para o desenvolvimento, índice de ATP e função mitocondrial tanto nos ovócitos quanto nos embriões bovinos (STOJKOVIC et al., 2001).
Durante a maturação ovocitária as mitocôndrias modificam sua disposição dentro do citoplasma celular. Elas são localizadas próximas às gotas de lipídios que por sua vez aumentam de tamanho com a progressão da maturação (HYTTEL et al., 1997). Em ovócitos de mamíferos em estádio de VG, as mitocôndrias são encontradas em maior quantidade na periferia do citoplasma, e com pequenos grupos dispersos mais ao centro do ovócito (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b). Já nos ovócitos em estádio metáfase II, as mitocôndrias estão mais centralizadas no citoplasma (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b).
2.2.3.2.2. Grânulos Corticais
Os grânulos corticais (GC) são organelas produzidas a partir do complexo de Golgi e estão presentes apenas nos gametas femininos de todos os mamíferos, na maioria dos vertebrados e em muitos invertebrados (WESSEL et al., 2001; MAYES, 2002). São possuidores de uma população de moléculas que incluem proteases, glicosidases, enzimas e proteínas estruturais que contribuem para a barreira física e bioquímica que bloqueia a polispermia (WESSEL et al., 2001).
Os GC são vesículas secretoras não renováveis e com advento da fecundação o seu conteúdo não é mais sintetizado. Os RNAs que codificam as diversas moléculas do conteúdo dos GC são degradados seletivamente no período
da maturação do ovócito e só voltam a ser transcritos e codificados nos novos ovócitos do ciclo reprodutivo (WESSEL et al., 2001).
A principal função do conteúdo presente nos GC é de construir (equinodermos – Ex.: ouriço-do-mar) ou de modificar (mamíferos – Ex.: bovinos) a matriz extracelular (zona pelúcida) existente nos ovócitos para oferecer uma barreira bioquímica e mecânica que impede a entrada de mais de um espermatozóide no ovócito (WESSEL et al., 2001). Os GC são formados nos ovócitos em crescimento, mas sua redistribuição ocorre no período da maturação (DUCIBELLA et al., 1994;
HYTTEL et al., 1997). Primeiramente, os GC podem ser identificados em pequenos grupos pelo citoplasma dos ovócitos em estádio de VG. Sua migração para a periferia do ovócito vai ocorrendo com o avanço da maturação. Em estádio de metáfase II, os GC estão distribuídos no córtex próximo à membrana plasmática (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELILLA et al., 2004).
2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas
Durante o crescimento, a “capacitação” e a maturação do ovócito, diversas moléculas são sintetizadas e armazenadas. Essas moléculas vão dar suporte à maturação e ao desenvolvimento após a fecundação, até que o genoma do embrião se torne transcricionalmente ativo e as mensagens derivadas do embrião comecem a regular a embriogênese (CHA e CHIAN, 1998; MERMILLOD et al., 2000;
MEIRELLES et al., 2004). A maioria dos RNAm (ácido ribonucléico mensageiro) no ovócito é sintetizada e acumulada durante o período de crescimento do ovócito (DE SOUSA et al., 1998). Esse metabolismo no ovócito é caracterizado pela transcrição e pela tradução ativa durante o período pré-ovulatório. Entretanto, a transcrição gênica bovina cessa antes da ovulação, assim, o ovócito, o zigoto e o embrião com menos de 16 blastômeros são dependentes do “pool” dos RNAs e das proteínas acumuladas durante o período de crescimento e de maturação do ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; MEMILI e FIRST 2000; LONERGAN et al., 2003).
Ovócitos de muitas espécies dependem da síntese e da ativação de uma variedade de proteínas para que possam ingressar e prosseguir no processo de maturação ovocitária. Entre as proteínas mais importantes que regulam o
mecanismo da maturação ovocitária estão as proteínas do complexo MPF e as proteínas da família MAPK (SHENG et al., 2002; TIAN et al., 2002; JONES, 2004).
2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs)
As CDKs são uma família de serina/treonina cinases envolvidas na regulação do ciclo celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 e 7), na transcrição (CDK7, 8 e 9) ou na função neuronal (CDK5) (SCHANG, 2004; MAPELLI et al., 2005). A atividade da CDK é dependente da interação com uma ciclina, cujos níveis são regulados seqüencialmente para assegurar que as fases do ciclo celular prossigam na ordem correta (ARRIS et al., 2000). Por exemplo, as ciclinas D interagem com as CDKs 4 e 6 durante a fase G1, a ciclina E com a CDK2 no final da fase G1, a ciclina A com a CDK2 na fase S/G2 e a ciclina B com a CDK1 na fase G2/M (Figuras 3 e 4) (KNOCKAERT et al., 2002; ARRIS et al., 2000). A falha no controle das CDKs e a conseqüente perda da função do ponto de verificação do ciclo celular têm sido relacionadas diretamente à patologia
molecular do câncer (ARRIS et al.,2000).
Figura 3. Diagrama simplificado da atividade das CDKs/ciclinas na regulação do ciclo celular.
Fonte: Knockaert et al., (2002) e Arris et al., (2000) CDK 2
Ciclina E
CDK 1 Ciclina B
CDK 4/6 Ciclina D CDK 2
Ciclina A
Mitose
Meiose ovócito
Figura 4. CDKs envolvidas na regulação do ciclo celular, na transcrição e na função neuronal. Fonte: Knockaert et al., (2002)
CDK1
Ciclina B Ringo
Transição de prófase I para metáfase II Regulação da topoisomerase II
Transição das fases G1/S e S/G2 Duplicação do centrossomo.
Transição dasfasesG1/S Fase G1
Apoptose
Migração dos neurônios Envolvida em outros eventos celular
Sinal de tradução e transcrição Fase G1, morte de células neurais.
Ativação da CDK1 e CDK2 Regulação da DK7/ciclina H
Processamento de RNA ou transcrição Apoptose
CDK2
CDK3 Ciclina E?
Ciclina E Ciclina A
Ciclina D
P35, P25 P39, P29
Ciclina D
Ciclina H
Ciclina C
Ciclina K Ciclina T
Ciclina L CDK4
CDK5
CDK6 CDK7 CDK8
CDK9
CDK11 Fase G1
F a s e S
Fase G2
F a s e M
2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF)
O MPF é um heterodímero composto por uma cinase catalítica (p34cdc2 ou CDK1) e uma subunidade de ciclina B regulatória (ABRIEU et al., 2001; JONES, 2004). Há ao menos três tipos de ciclinas B (B1, B2 e B3), e nos mamíferos parece que a ciclina B1 é a principal responsável pela atividade do complexo MPF. Embora a ligação da CDK1 com a ciclina B1 seja necessária, não é o suficiente para desencadear a atividade do complexo MPF (CASTRO et al., 2001; JONES, 2004), que é dependente dos mecanismos subseqüentes: fosforilação da CDK1 nos resíduos de tirosina 15 (Y15),
treonina 14 (T14), treonina 161 (T161) e a posterior desfosforilação dos resíduos Y15 e T14 (KIKUCHI et al., 2000; VAILLANT et al., 2001;
JOSEFSBERG e DEKEL, 2002). Em termos gerais a CDK1 é fosforilada em Y15 e T14 pelas proteínas cinases Myt1 e Wee1, que causam uma fosforilação inibitória da CDK1.
Nesse estádio o complexo MPF está formado (pré-MPF), mas ainda está inativo (Figura 5). A ativação do MPF depende da desfosforilação em Y15 e T14 pela proteína fosfatase CDC25
(MPF – ativo) (KIKUCHI et al., 2000; JONES, 2004). O aumento da atividade da proteína CDC25 e a baixa atividade das proteínas cinases Myt1 e Wee1 são necessários para a ativação completa do complexo MPF (JONES, 2004).
Figura 5. Diagrama simplificado do mecanismo de ativação do MPF.
Fonte: Dekel (2005).
Wee1 Myt1
AMPc PKC Síntese
Ovócito em VG
Condensação dos cromossomos Rompimento da VG
Mos -RMAm poliadenilação Mos síntese, MEK MAPK ativação.
Formação do fuso
Extrusão do 1ª corpúsculo polar
CSF estável Metáfase II bloqueada
Fecundação ou ativação artif.
CSF instável M
E I O S E A T I V A D A
n
Ciclina B
Ê Ê Ê
A variação da atividade do MPF pode ser detectada nos ovócitos bovinos durante a maturação. Sua atividade é baixa em VG passando a ser observada no início do rompimento da VG. Alcança um pico no estádio de metáfase I e declina sua
MPF
Ê
MPF Ativo
Ê
MPF Ativo
Ê
MPF Ativo
Ê
CDK1 M CDK1 E
I O S E B L O Q U E A D A
Ativação CDC25
atividade durante a transição entre os estádios de metáfase I e metáfase II (KUBELKA et al., 2000), reativando para entrada do ovócito em metáfase II. Sua inativação nos ovócitos em estádio de metáfase II é induzida pela fecundação ou pela ativação paternogenética (NEBREDA e FERBY, 2000; KUBELKA et al., 2000;
KIKUCHI et al., 2000; ABRIEU et al., 2001; LEDAN et al., 2001). A inativação abrupta do MPF é considerada como um disparador necessário para o escape da meiose bloqueada em metáfase II (TAIEB et al., 1997).
O processo de desorganização do heterodimero do complexo MPF independe da sua ativação catalítica, que é causada geralmente pela proteólise da ciclina B.
Em ovócitos fecundados de camundongos e de suínos, a degradação da ciclina B foi claramente relacionada com a inativação do complexo MPF (WINSTON, 1997;
KIKUCHI et al., 1999).
O MPF é um dos principais reguladores das alterações morfológicas durante a maturação ovocitária, regulando a condensação dos cromossomos, o rompimento do envelope nuclear, a reorganização dos microtúbulos e outras organelas citoplasmáticas com a participação de outras proteínas (KIM et al., 2000; KANO et al., 2000; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; KUBELKA et al., 2002; LEFEBVRE et al., 2002).
2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK)
Um segundo grupo importante de proteínas que estão envolvidas na progressão da meiose pertencem à família das serina/treonina cinases, as proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK) (KUBELKA et al., 2000). Essas proteínas são ativadas dentro de vias específicas de transdução de sinais (Figura 6), por sinais extracelulares (NEBREDA e FERBY, 2000). Por esta razão, a MAPK também é chamada de ERK (cinase regulada por sinal extracelular – suas variantes, ERK1/2 – p44/p42 kDa) (KRISCHEK e MEINECKE, 2002). A via intracelular de transdução de sinal consiste na proteína mos (do oncogene c-mos) que ativa a MEK (MAPKK) que fosforila a ERK (MAPK) (CHA e CHIAN, 1998; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; SUN et al., 2002).
A ampla faixa de atuação das MAPKs é mediada pela fosforilação de diversos substratos, incluindo fosfolipases, fatores de transcrição e proteínas do citoesqueleto. As MAPKs também catalisam fosforilação e a ativação de diversas proteínas cinases, denominadas de proteínas cinases ativadas pelas MAPKs, que representam um adicional enzimático de vários espectros em diferentes células (ROUX e BLENIS, 2004).
As MAPKs são amplamente ativadas por fatores de crescimento e por soro, com uma ativação menor pelo
estresse, efeito osmótico e pela desorganização dos microtúbulos.
Uma variedade de estímulos diferentes pode ativá-las, mas no geral a ERK1 e ERK2 são ativadas preferencialmente em resposta aos fatores de crescimento, enquanto as cinases JNK (c-jun amino terminal cinase) e p38 cinase são
mais responsivas aos estímulos de estresse e efeitos osmóticos (CHEN et al., 2001;
ROUX e BLENIS, 2004).
MAP4K
GDP GTP
A via MAPK é ativada universalmente durante a maturação meiótica em ovócitos de vertebrados. Entretanto, o tempo requerido para sua ativação é díspar nas diferentes espécies (NEBREDA e FERBY, 2000). A ativação da MAPK em ovócitos bovinos ocorre após 8 horas de cultivo in vitro e apresenta um aumento gradual até 12–14 horas e se mantém estável até o final da maturação (KUBELKA et al., 2000).
As duas principais isoformas (ERK1/2) da MAPK são ativadas com a proximidade do rompimento da VG em ovócito bovinos (KUBELKA et al., 2000). Isso sugere que a MAPK não é requerida para o reinício da meiose, mas é essencial em eventos pós-rompimento da VG (KANO et al., 2000; LEFEBVRE et al., 2002).
Porém, a injeção de MAPK ativa em ovócitos de suíno ou de bovino induz o rompimento da VG, indicando que essa proteína promove o reinício da meiose em condições especiais (FISSORE et al., 1996; INOUE et al., 1998).
MAP3K
MAPKK
MAPK
Figura 6. Diagrama simplificado das vias de ativação das MAPKs.
Fonte: Cha e Chian 1998; Nebreda e Ferby, 2000; Kubelka et al., 2000;
Krischek e Meinecke, 2002; Sun et al., 2002.
GTP
Raf-1
MEK
ERK
CSF GDP
mos AMPc ⇓
PKA ⇓
Ras
2.3. Competência ovocitária
A competência para a progressão da maturação meiótica em ovócitos de mamíferos é adquirida durante o crescimento folicular (PAVLOK et al., 2000;
MIYANO, 2003). Nesse contexto, para que o ovócito tenha competência para a maturação tanto nuclear como citoplasmática esse deve completar sua fase de crescimento. Em bovinos foi demonstrado que folículos de diâmetro acima de 3 mm de diâmetro contêm ovócitos (110-120 μm de diâmetro) com potencial de desenvolvimento mais elevado que os de folículos menores (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001). Ovócitos obtidos de folículos maiores de 3 mm de diâmetro resultam em blastocistos com maior número de células nucleadas, comparados com os ovócitos obtidos de folículos menores que 3 mm (AVELINO et al., 1998).
Ainda não está totalmente compreendido como os ovócitos adquirem a competência meiótica durante sua fase de crescimento e se tornam competentes para reiniciar e terminar a meiose. Há evidências de que a aquisição da competência meiótica nos ovócitos está correlacionada com as moléculas de RNAs e de proteínas estocadas durante a fase de crescimento e maturação do ovócito e com o aumento da funcionalidade das mitocôndrias (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001; STOJKOVIC et al., 2001; TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003).
Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais do desenvolvimento embrionário antes que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001). Os padrões de síntese protéica aumentam antes do rompimento da vesícula germinativa em ovócitos durante o cultivo de maturação, sugerindo que essa síntese de proteínas possa ser importante para o subseqüente desenvolvimento embrionário (TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003). Isso faz do ovócito uma célula muito especial, completamente diferente das células somáticas, onde os RNAs e as proteínas se submetem geralmente a uma rápida rotação de estoque. Para permitir o estoque e o uso oportuno de tais moléculas armazenadas, vários mecanismos necessitam ser eficaz nesse controle no ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; TOMEK et al., 2002).
Em bovinos, os RNAs e as proteínas do ovócito conduzem o desenvolvimento embrionário inicial após a fecundação até o 4º ciclo celular quando o controle genômico (estádio de 8 a 16 células) do embrião torna-se evidente. Muitos dos
produtos derivados dos transcritos maternos são necessários para preparar o maquinário biológico do embrião (SIRARD, 2001; DIELEMAN et al., 2002; KAÑKA, 2003).
A competência meiótica em ovócitos de Xenopus sp está correlacionada com as mudanças no acúmulo e na ativação de moléculas do ciclo celular (JESSUS e OZON, 2004). Esses mesmos
mecanismos foram observados em ovócitos em crescimento de suínos que começam a acumular moléculas CDK1. Já a ciclina B foi observada em ovócitos de folículos antrais pequenos quando cultivados em meio de maturação (Figura 8), mas a CDK1 foi negativamente fosforilada e assim inativada, talvez
pela proteína Myt1 (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Nos folículos de 1,0- 1,5 mm de diâmetro, os ovócitos iniciam a meiose, mas param em metáfase I. Eles são capazes de ativar o MPF, mas não estabelecem a cascata de proteínas da via MAPK (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Os ovócitos em crescimento desenvolvem primeiramente a habilidade de ativar CDK1 e posteriormente de ativar a via MAPK. Somente os ovócitos com o crescimento completo possuem competência para ativar efetivamente as duas vias do ciclo celular.
Folículos 0,5-0,7mm 1,0-1,5 mm 4,0-6,0 mm Ovócitos 104 μm 109 μm 122μm
0 27 42 0 27 42 0 27 42h histona H1
MBP
Cultivo (h)
Figura 8. Mudanças nas atividades da CDK1 e da MAPK durante a maturação de ovócitos de suínos em vários estádios do crescimento folicular. As atividades da CDK1 e da MAPK foram detectadas pela fosforilação de histona H1 e da proteína básica de mielina (MBP), respectivamente. Adaptado a partir de Miyano, 2003.
Na produção de embriões in vitro, a maioria dos ovócitos bovinos são provenientes de folículos de 2 a 6 mm de diâmetro (ADONA e LEAL, 2004; DALVIT et al., 2005). A remoção dos ovócitos dos folículos antes de eles finalizarem a foliculogênese é, provavelmente, um dos fatores envolvidos na baixa produção de embriões in vitro. Assim sendo, a interrupção da foliculogênese seria um fator responsável pela redução da competência ovocitária. Para contornar a foliculogênese interrompida a que os ovócitos são submetidos, uma alternativa seria mantê-los por um determinado período com a mesma configuração nuclear daquela encontrada nos folículos. Para tal, os ovócitos seriam submetidos ao bloqueio meiótico, evitando a retomada da meiose logo após a sua remoção dos folículos, para que tenham o tempo necessário para sofrerem as mudanças necessárias antes de serem submetidos à maturação in vitro.
2.4. Bloqueio meiótico
A maturação espontânea em ovócitos de bovinos ocorre in vitro após sua retirada do ambiente folicular, o que se deve, provavelmente, à remoção do sinal inibidor proveniente do folículo. Estudos sugerem que o fator inibidor que controla a retomada da meiose seja produzido pelas células da teca e/ou granulosa (células foliculares) (FOOTE e THIBAULT, 1969; SIRARD et al., 1998). KOTSUJI et al.
(1994) demonstraram que o fator inibidor da meiose em ovócitos bovinos seria sintetizado pelas células da granulosa, mas que as células da teca contribuiriam na amplificação desse sinal. O mecanismo que envolve o reinício da meiose também está associado a redução nas concentrações de AMPc (monofosfato de adenosina cíclica) (CONTI et al., 1998).
O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que exerce um importante controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados (BILODEAU- GOESEELS, 2003). A redução do AMPc no interior do ovócito parece estar envolvida com a ruptura da vesícula germinativa, ao menos in vitro. Assim, os níveis elevados da AMPc dentro do ovócito mantêm o bloqueio meiótico, visto que a redução do AMPc é um sinal necessário para a maturação ovocitária (CONTI et al., 1998; EYERS et al., 2005).
A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas cinases e fosfatases controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Dessa forma, a meiose pode ser bloqueada por inibidores que mantenham altas concentrações de AMPc no interior do ovócito (BILODEAU-GOESEELS, 2003), por inibidores não específicos da síntese protéica (MEINECKE et al., 2001), de proteínas cinases (ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001) e por inibidores específicos da fosforilação de proteínas CDKs (ADONA e LEAL, 2004).
In vitro, o reinício da meiose ocorre porque o ovócito é liberado da influência dos inibidores provenientes do folículo (KOTSUJI et al., 1994). No entanto, a maturação in vitro resulta em uma redução na produção de embriões, sugerindo que nem todos os ovócitos conseguem maturar adequadamente (maturação citoplasmática). Portanto, diferentes protocolos estão sendo usados in vitro para permitir que todos (ou a maioria) os ovócitos coletados terminem a maturação nuclear sem afetar a qualidade dos mesmos, a fim de maximizar a produção de
embriões (ADONA e LEAL, 2004; SCHOEVERS et al., 2005). O uso de inibidores fisiológicos ou farmacológicos pode ser uma alternativa in vitro para um cultivo de pré-maturação antes de submeter os ovócitos à maturação, fecundação e ao desenvolvimento embrionário.
A ativação das cinases dependentes de ciclinas (CDKs - MPF) é um ponto chave no reinício da meiose em ovócitos. Na tentativa de sincronizar o desenvolvimento nuclear nos ovócitos in vitro, alguns estudos demonstraram a inibição da ativação do MPF pelo aumento de níveis intracelulares de AMPc com dbcAMP ou hipoxantina (SUN et al., 1999; MA et al., 2003), pela inibição não específica da síntese protéica com cicloheximida (MEINECKE et al., 2001) ou pela inibição não específica de proteínas cinases com 6-dimetilaminopurina (ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001). Embora a inibição da ativação do MPF seja bem sucedida com o uso dessas drogas, os efeitos não específicos desses inibidores são prejudiciais para o desenvolvimento subseqüente do ovócito.
As CDKs desempenham um papel central na regulação do ciclo da divisão celular, o que lhes faz um alvo promissor para o desenvolvimento de agentes terapêuticos do câncer. Um grande esforço foi feito nos últimos anos na busca de inibidores específicos de CDKs de baixo peso molecular (BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I é um inibidor natural isolado do fungo Aspergillus terreus, que exibe atividade antiproliferativa, inibindo seletivamente em mamíferos as cinases CDK2 e CDK1, que executam um importante papel na progressão do ciclo celular nas fases G1/S e G2/M, respectivamente (SCHIMMEL et al., 1998; SCHANG, 2004).
Entretanto, tem pouco efeito nas proteínas cinases ativadas por mitógenos, proteína cinase C, cinases dependentes de AMPc, caseína cinase I e II e no receptor tirosina cinase do fator de crescimento epidermal (SCHIMMEL et al., 1998; SAX et al., 2002;
BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I comporta-se como um inibidor competitivo pelo local de ligação do ATP na CDK1 (SAX et al., 2002; BRAÑA et al., 2004).
É possível manter os ovócitos bovinos em estádio de vesícula germinativa in vitro por um determinado período de tempo com o uso de inibidores específicos ou não de CDKs (butirolactona I, roscovitina, cicloheximida e 6-dimetilaminopurina).
Essas informações são importantes, pois tornam possível fazer um cultivo de pré- maturação para, posteriormente, induzir a maturação final. Assim, permite ao ovócito um tempo maior para sofrer as mudanças necessárias à aquisição da competência meiótica, visto que estes são submetidos a uma foliculogênese interrompida, sendo
removidos precocemente dos folículos e ocorrendo a retomada espontânea da meiose. Entretanto, convém ressaltar que nesse tipo de estudo é importante verificar não só a efetividade das substâncias em inibir o reinício da meiose, mas também sua eficiência na reversibilidade e ausência de efeitos negativos sobre o desenvolvimento embrionário.
3. OBJETIVOS
O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da butirolactona I no cultivo de pré-maturação sobre a meiose, estruturas celulares e desenvolvimento dos ovócitos bovinos cultivados in vitro.
Mais especificamente foram avaliados:
1) as condições de redução da concentração de BL I para indução de bloqueio meiótico e sua reversão (maturação in vitro);
2) a cinética de maturação pós-bloqueio;
3) a organização do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) após o bloqueio meiótico e sua reversão;
4) a distribuição de organelas (grânulos corticais e mitocôndrias) após o bloqueio meiótico e sua reversão;
5) o efeito do bloqueio meiótico sobre o desenvolvimento embrionário.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta de ovários e ovócitos
Ovários de fêmeas bovinas foram coletados em frigoríficos logo após o abate e transportados em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9% – Sigma, S9625) acrescida de antibióticos (100 UI/mL de penicilina – Sigma, P7794 e 100 ug/mL de estreptomicina – Sigma, S9137) a uma temperatura de 30º C. No laboratório, os ovários foram lavados em NaCl 0,9% e os folículos com diâmetro de 2 – 6 mm foram aspirados com auxílio de uma agulha de 18 “G” (1,20 X 40 mm) conectada a uma seringa descartável de 10 mL. O líquido folicular contendo os ovócitos foi depositado em tubos cônicos de 50 mL (Cellstar, 227261) e mantido em repouso para decantação por 5 minutos. A porção superior do líquido foi retirada e na porção restante foram adicionados 3-5 mL de meio H199 (TCM199 com 25 mM de Hepes – Gibco, 12340030) acrescido de 100 UI/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina; suplementado com 1% de soro fetal bovino – Gibco, 26140-079).
Posteriormente, o material do tubo foi transferido para uma placa de Petri (60 x 15 mm – Falcon, 353002), onde foi feita a busca dos ovócitos sob estereomicroscópio para avaliação e classificação dos mesmos. Somente ovócitos classificados como graus I e II (DE LOOS et al., 1991), contendo três ou mais camadas de células do cumulus oophorus e citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos.
4.2. Solução estoque do inibidor
O inibidor de cinases dependentes de ciclinas (CDKs) butirolactona I (Biomol, 87414-49-1) foi preparado em solução estoque de 50 mM em dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma, D5879) e rediluído para 5 mM com B199 [TCM199 com sais de Earle e com 20 mM de bicarbonato de sódio (Gibco-11150-067) suplementado com 10 μg/mL de gentamicina (Sigma, G1272)], aliquotado em tubos para microcentrífuga e conservado no freezer a -20º C.
4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I
Para o bloqueio da meiose os ovócitos bovinos foram cultivados in vitro com butirolactona I (BL I) diluída em meio B199 (suplementado com 0,2 mM de piruvato – Sigma, P5280) na concentração apropriada do experimento (descrita posteriormente). O cultivo foi feito em gotas de 100 µl de meio de bloqueio (±20 ovócitos por gota), sob óleo mineral (Sigma, M8410) a 38,5º C em atmosfera de 5%
de CO2em ar.
4.4. Determinação do estádio da meiose
Para determinação do estádio da meiose, os ovócitos foram desnudados (remoção das células do cumulus oophorus) em tubo de 5 mL com 0,3 mL de PBS acrescida de 1% de SFB (soro fetal bovino) e agitados no “vortex” por 4 minutos (Figura 9). Os ovócitos desnudos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 horas em etanol (Synth, A1084.01.BJ) e ácido acético (Synth, A1019.01.BJ) 3:1. Após a fixação, foram corados com lacmóide 0,004% (Aldrich, 274720) e observados em microscópio de contraste de fase para determinação dos estádios da meiose. Os ovócitos foram classificados de acordo com a configuração nuclear em vesícula germinativa (VG), metáfase I (M I), anáfase I (A I), telófase I (T I) e metáfase II (M II)
(Figura 10). A taxa de bloqueio foi avaliada como a percentagem de ovócitos em VG e a de reversão como a percentagem de ovócitos em M II.
Figura 9. Procedimentos para fixação e coloração de ovócitos.
3) Pressionar a lamínula sobre a lâmina suavemente até fazer uma pressão nos ovócitos – pouca pressão os ovócitos ficam soltos entre a lâmina/lamínula; o inverso os ovócitos rompem.
4) Colocar a lâmina no fixador 3:1 (álcool etílico e ácido acético).
5) Deixar fixando por no mínimo 24 h.
6) coloração com lacmóide ou orceina acética
a) Colocar a lâmina em um ângulo de 45°, adicionar o corante na parte superior da lâmina; b) Corar por ±5 minutos; c) se for necessário remover o excesso de corante com o próprio fixador; d) Não deixar secar a lâmina – vedar com esmalte.
(corante: 40 mL ácido acético, 60 mL água + 0,004%
do corante – aquecer para dissolver melhor e filtrar) 2) Preparação das lâminas para fixação dos ovócitos
Lâmina:
Fazer uma gota de ±4μL com ± 25 ovócitos.
Lamínula:
Colocar pequenas gotas de cola (silicone) nas
bordas.
1) Procedimento para desnudar os ovócitos
Em um tubo de 5 mL adicionar 0,3 mL de PBS e os ovócitos. Agitar no vortex (velocidade 6- 7) por 4 minutos; lavar a parede do tubo com 2 mL de meio; transferir o conteúdo para uma placa de Petri para seleção dos ovócitos.
P B S
A B C D
400X 400X 200X 200X
Figura 10. Classificação da meiose de ovócitos bovinos. A) vesícula germinativa; B) metáfase I; C) anáfase I/telófase I; D) metáfase II. Seta vermelha: placa metafásica e seta azul: 1° corpúsculo polar.
4.5. Maturação in vitro
Após o período de bloqueio, os ovócitos foram lavados três vezes em meio livre de inibidor e transferidos para o meio de maturação [B199 suplementado com 10% de SFB (soro fetal bovino), 5,0 µg/mL de LH (hormônio luteinizante, Bioniche – Lutropin-v), 0,5 µg/mL de FSH (hormônio folículo estimulante, Bioniche – Folltropin- v), 0,2 mM de piruvato e 10 μg/mL de gentamicina]. Como controle, um grupo de ovócitos foi submetido à maturação sem sofrer cultivo prévio de bloqueio. O cultivo
de maturação in vitro (MIV) foi feito em gotas de 100 µl de meio de maturação (±20 ovócitos por gota), sob óleo mineral a 38,5 º C e atmosfera de 5% de CO2em ar.
4.6. Microtúbulos
Para avaliação dos microtúbulos os ovócitos foram desnudados e fixados em 3,7% de paraformaldeído (Sigma, P6148) acrescido de 0,6% Triton X-100 (USB, 9002-93-1) em PBS (livre de cálcio e magnésio) com 0,1% de PVA (álcool polivinílico - Sigma, P8136) por 30 minutos; lavados três vezes em PBS com 0,1% de PVA (PP); bloqueados com 3% de soro de cabra (Invitrogen, 16210-064) em PP por 45 minutos; corados com anticorpo anti-alfa tubulina conjugada com FITC (Sigma, F23168) (1:100) em PP por uma hora; lavados por três vezes em PP; corados com 10 μg/mL de iodeto de propídio (Sigma, P4170) em PP por 15 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol (USB, 56-81-5) para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.
4.7. Microfilamentos
Para avaliação dos microfilamentos os ovócitos foram desnudados e fixados em 3,7% de paraformaldeído mais 0,6% Triton X-100 em PP por 30 minutos; lavados três vezes em PP; colorados com 1 μg/mL de faloidina conjugada com FITC (P5282) mais 10 μg/mL de iodeto de propídio em PP por 30 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.
