UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ Denise Leda Pedrini
AVALIAÇÃO DA ADRENALINA,
NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A FORMAÇÃO DO BIOFILME, PRODUÇÃO DE
ÁCIDO E EXPRESSÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA PELO Streptococcus mutans
Taubaté – SP
2012
UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ Denise Leda Pedrini
AVALIAÇÃO DA ADRENALINA,
NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A FORMAÇÃO DO BIOFILME, PRODUÇÃO DE
ÁCIDO E EXPRESSÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA PELO Streptococcus mutans
Dissertação apresentada para obtenção do Título de Mestre pelo Programa de Pós- graduação em Odontologia do Departamento de Odontologia da Universidade de Taubaté.
Área de concentração: Periodontia
Orientador: Prof. Dr. Gilson Cesar Nobre Franco
Taubaté – SP
2012
DENISE LEDA PEDRINI
Data: ________________________
Resultado:____________________
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dr. ______________________ Universidade de Taubaté Assinatura_____________________
Profa. Dra. _____________________ Universidade__________
Assinatura_____________________
Profa. Dra. ____________________ Universidade___________
Assinatura____________________
Dedico este trabalho aos meus pais Diomar e Lêda,
Anjos que Deus colocou em minha vida.
AGRADECIMENTOS
Aos meus amados pais, Diomar e Lêda, as pessoas mais importantes da minha vida. Obrigada pelo amor incondicional!
Aos meus irmãos Levi, Leomar, Laércio, Lívio e Luis e minhas irmãs Dalva e Dora. Sobrinhos e sobrinhas, cunhadas e cunhado, família linda que me faz acreditar nos verdadeiros valores da vida.
As minhas queridas amigas!
Alessandra!
Exemplo de garra e determinação. Você que me proporcionou conhecer a docência, acreditou e me incentivou sempre.
Suzane!
Minha parceira fiel desde o início desta caminhada. Obrigada pela paciência e compreensão nesses dois anos de feliz convivência!
Giseli!
Amiga querida! Obrigada pelo apoio e companheirismo nesta reta final.
Obrigada por estarem ao meu lado sempre e me fazerem mais completa. Esse trabalho também é mérito de vocês.
Ao Prof. Dr.Gilson Cesar Nobre Franco, meu orientador, por sua confiança e por toda ajuda e empenho para que a realização desse trabalho. Obrigada por não medir esforços para viabilizar meu aprendizado.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/16324-4) pelo auxílio concedido, permitindo assim a execução do trabalho.
À querida Prof. Dra. Karina Cogo Muller, obrigada pela simpatia, gentileza e disponibilidade em ajudar sempre.
Aos professores do Departamento de Periodontia, Prof. Dr. José Roberto Cortelli, Sheila Cavalca Cortelli, e Davi Romeiro Aquino. Obrigada pelo exemplo de profissionalismo e dedicação à pesquisa.
À Universidade de Taubaté, em nome do Reitor Prof. Dr. José Rui Camargo.
À Coordenadora do Programa de Mestrado e Doutorado em Odontologia Profa. Dra. Ana Christina Claro Neves. A todos os Professores que fizeram parte desta minha formação.
À Adriana Peloggia e a todo o pessoal da secretaria, bem como os funcionários da Faculdade, à Juliana Guimarães pelo apoio na parte laboratorial e à bibliotecária Regina pela atenção e disponibilidade em ajudar.
A todos os amigos da turma de mestrado e doutorado de 2010, pelo convívio divertido e prazeroso.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP. Departamento de Ciências Fisiológicas - Área de Farmacologia Anestesiologia e Terapêutica na pessoa do Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen, por permitir a utilização deste laboratório.
Às queridas Luciana Almeida, Luciana Berto e Myrella Castro e todos os alunos de pós-graduação em Farmacologia da FOP-UNICAMP, e a funcionária Eli, pela gentileza com que me acolheram. Obrigada a todos!
À UNIVAG – Centro Universitário de Várzea Grande – em nome do reitor Dr.
Dráuzio Antonio Medeiros.
À queridíssima Pró–reitora Acadêmica Profa. Ms. Elisabet Aguirre. Obrigada por me incentivar e apoiar nesta conquista.
Ao querido amigo Silas, que sempre com palavras de otimismo me ajudou a seguir em frente.
À coordenadora do curso de odontologia Prof. Dra. Giana da Silveira Lima e a todos os colegas professores das disciplinas de Periodontia, Prótese e Clínica integrada. Sou grata pela compreensão e auxílio que recebi de vocês neste período.
Aos alunos do curso de odontologia - UNIVAG, que me permitem como professora, renovar constantemente as esperanças e trabalhar em busca de uma odontologia de qualidade para todos.
Pedrini DL. Avaliação da adrenalina, noradrenalina e cortisol sobre a formação do biofilme, produção de ácido e expressão de fatores de virulência pelo Streptococcus mutans [Dissertação de mestrado]. Taubaté: Universidade de Taubaté, Departamento de Odontologia, 2012. 41p.
RESUMO
Objetivos: Avaliar o efeito in vitro da adrenalina, noradrenalina e cortisol sobre a formação do biofilme, produção de ácido e expressão de fatores de virulência por S.
mutans. Método: Para a formação do biofilme foi realizada uma monocultura de S.
mutans (UA159) em discos de hidroxiapatita (HA) associados à adrenalina, noradrenalina e cortisol por cinco dias. Após esse período, foi realizada a contagem bacteriana (ufc/ml) para cada grupo experimental. A avaliação da queda do pH (produção de ácidos) foi realizada a cada 12 horas até o final do experimento (cinco dias). Para a avaliação da expressão de fatores de virulência, RNA total de biofilme maduro (cinco dias) foi extraído, e a análise da expressão de genes relacionados com a virulência do S. mutans (gtfB, gtfC, gtfD, brpA e ldh) foi realizada através de RT-qPCR. Resultados: As catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e também o cortisol aumentaram significativamente a formação de colônias de S. mutans em relação ao grupo controle. Uma queda no valor do pH foi observada nas 12 primeiras horas em todos os grupos. Após este período, os valores se mantiveram praticamente estáveis até o final do experimento (120h), não havendo diferença estatística entre o grupo controle e os grupos testes. Em relação ao efeito das catecolaminas/cortisol sobre a expressão de genes de virulência do S. mutans, não se observou diferença estatística significativa entre os diferentes grupos.
Conclusões: Os achados do presente estudo demonstraram que a adrenalina, noradrenalina e cortisol aumentam a formação do biofilme (in vitro), sem alterar o pH (produção de ácidos) e expressão dos genes de virulência avaliados.
Palavras-chave: Estresse; Adrenalina; Noradrenalina; Cortisol, S. mutans; Cárie.
Pedrini DL. Evaluation of adrenaline, noradrenaline and cortisol on biofilm formation, acid production and expression of virulence factors by Streptococcus mutans [Dissertação de mestrado]. Taubaté: Universidade de Taubaté, Departamento de Odontologia, 2012. 41p.
ABSTRACT
Aim: To evaluate the in vitro effect of adrenaline, noradrenaline and cortisol on biofilm formation, acid production and expression of virulence factors by S. mutans.
Methods: Biofilm formation was performed by a monoculture of S. mutans (UA159) in discs of hydroxyapatite (HA) associated with adrenaline, noradrenaline and cortisol for five days. Further, bacterial count was performed (cfu / ml) for each experimental group. Evaluation of the reduction in pH (acid production) was conducted then every 12 hours until the end of treatment (five days). For evaluation of the virulence factors of mature biofilm, total RNA (five days) was extracted and the analysis of expression of genes related to the virulence of S. mutans (gtfB, gtfC, gtfD, brpA and ldh) was performed by RT-qPCR. Results: Catecholamines (adrenaline and noradrenaline) and cortisol tested in this study significantly increased the formation of colonies of S.
mutans in the control group. In all groups (control, adrenaline, noradrenaline and cortisol) the highest reduction in pH was observed during the first 15 minutes, with no statistical difference between the control and test group. PH measurements were performed until the 5th day of the experiment at intervals of 12h. Continuous reduction was observed during the first 12 hours in all groups after this period, the values remained almost stable until the end of the experiment (120h). There was no statistical difference between the control and test groups. Regarding the effect of catecholamine / cortisol on the expression of virulence genes of the S. mutans, there was no statistically significant difference among the groups and the control group.
Conclusions: The findings of this study demonstrated that adrenaline, norepinephrine and cortisol increase the formation of biofilm (in vitro), without changing the pH (initial and in biofilm) and expression of genes evaluated.
Keywords: Stress; Adrenaline; Noradrenaline; Cortisol, S. mutans; Caries.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aparato específico utilizado para sustentar os discos
de HA na placa com 24 poços 24
Figura 2 - Efeito da adrenalina, noradrenalina e cortisol na formação (ufc/mL) de biofilme de
S. mutans (UA159)
29
Figura 3 - Variação do pH até o quinto dia (120 h) da avaliação
do contato do S. mutans com as substâncias testes 30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Primers empregados no estudo 27
Tabela 2 - Efeito da adrenalina, noradrenalina e cortisol na expressão dos genes gtfB, gtfC, gtfD, ldh e brpA em
S. mutans (UA 159)31
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO DA LITERATURA 16
3 MÉTODO 22
3.1 PREPARO DA SUSPENSÃO BACTERIANA E DO MEIO DE CULTURA, CÁLCULO DA QUANTIDADE DE SUBSTÂNCIA TESTE E PREPARO DOS
DISCOS DE HIDROXIAPATITA
22
3.1.1 Bactéria e condições de cultivo 22 3.1.2 Substâncias utilizadas e grupos
experimentais 23
3.2 TESTE DE FORMAÇÃO DO BIOFILME 23 3.3 TESTE DE QUEDA DE pH EM BIOFILME 25
3.3.1 Queda do pH em biofilme 25
3.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ADRENALINA, NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE
S. mutans EM BIOFILMEMADURO
25
3.4.1 Preparo da suspensão 25
3.4.2 Extração do RNA total 26
3.4.3 Síntese do cDNA e condições do RT-qPCR 26
4 RESULTADOS 28
4.1 TESTE DE FORMAÇÃO DO BIOFILME 28 4.2 TESTE DE QUEDA DO pH EM BIOFILME 29
4.2.1 Queda do pH em biofilme 29
4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ADRENALINA, NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE
S. mutansEM BIOFILME
30
MADURO
5 DISCUSSÃO 32
6 CONCLUSÃO 35
REFERÊNCIAS 36
1 INTRODUÇÃO
O estresse é o estado de tensão emocional, desencadeado por uma situação súbita ou por situações conflitantes contínuas, o qual inclui a resposta de componentes de ordem física, psíquica, infecciosa principalmente e que resultam em um estado psicológico desagradável caracterizado por irritabilidade, distúrbios do sono e do apetite, dificuldade de concentração e preocupação exagerada com relação a situações triviais. Ocasiona também queda no rendimento, diminuição da memória e mudanças comportamentais. Essa condição, capaz de quebrar a homeostase fisiológica é associada como um potencial fator de risco para diferentes patologias orais, incluindo a cárie dental (Shimura et al., 1983; Honkala et al., 1992;
Roberts et al., 2005; Suman et al., 2008).
Vários estudos têm evidenciado que o estresse psicológico pode diminuir a resposta imune celular por pelo menos três mecanismos. A primeira resposta, o estresse induzido é transmitida para o hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e promove a liberação de hormônio liberador de corticotropina da glândula pituitária e hormônios glicocorticóides pelo córtex da adrenal. Glicocorticóides liberados no córtex das supra-renais diminuem a produção de citocinas pró-inflamatórias (as interleucinas, prostaglandinas e fator de necrose tumoral). Em segundo lugar, a exposição a agentes estressores podem induzir o sistema nervoso simpático a liberação de adrenalina e noradrenalina pela medula da supra-renal e, portanto, pode exercer um efeito imunossupressor. Terceiro, o estresse pode induzir a liberação de neuropeptídeos de fibras nervosas sensoriais (inflamação neurogênica), e a presença de neuropeptídeos tem sido apontado como um promotor neurogênico
em diferentes processos inflamatórios, modular a atividade do sistema imunológico e a liberação de citocinas (Takada et al., 2004; Nakagima et al., 2006; Peruzzo et al., 2007).
A cárie dentária é uma doença infecto contagiosa, multifatorial, de caráter crônico, que se inicia com alterações microbiológicas dentro de um complexo biofilme e acomete os tecidos duros dentais causando um processo de desmineralização da superfície dental por ácidos orgânicos provenientes da fermentação dos carboidratos da dieta pelas bactérias. Este processo é afetado pela composição e fluxo salivar, exposição ao flúor, consumo de açúcares na dieta e medidas preventivas (Selwitz et al., 2007).
Clarke (1924) isolou um tipo específico de estreptococos das lesões, o qual denominou Streptococcus mutans, pois sua morfologia celular e da colônia em meio de cultura contendo sacarose, apresentava grande variabilidade em relação às demais espécies de estreptococos então conhecidos. A cárie, das doenças infecciosas que afetam os humanos, é uma das mais prevalentes. Tem sido reportado que as catecolaminas, cuja liberação está aumentada durante respostas do estresse, atuam no desenvolvimento de doenças infecciosas e no crescimento e expressão de virulência de alguns patógenos (Roberts et al., 2005). Sendo assim, substâncias liberadas durante períodos de estresse como adrenalina, noradrenalina e cortisol podem ser considerados fatores de influência no comportamento de S.
mutans e atuarem diretamente na doença cárie.
2 REVISÃO DA LITERATURA
A cárie dental é o resultado de um desequilíbrio ecológico entre minerais do dente e a microbiota do biofilme. Este desequilíbrio resulta na destruição localizada de tecidos duros dentais por ácidos, subprodutos de bactérias e fermentação dos carboidratos da dieta. A cárie é uma doença multifatorial, que se inicia com mudanças microbiológicas dentro de um complexo biofilme que sofre ação da composição salivar, exposição ao flúor e frequência do consumo de açúcares (Marsh, 1994).
Em países desenvolvidos houve um declínio na prevalência da cárie nas três últimas décadas do século XX e no início do século XXI. Contudo existem diferenças em termos de prevalência quando se compara diferentes grupos populacionais especialmente em cidades e regiões do interior destes países (Narvai et al., 2006).
O risco de uma pessoa ter cárie pode variar com o tempo, uma vez que muitos fatores de risco são modificáveis. Fatores de risco físicos e biológicos para cárie de esmalte ou raiz incluem inadequado fluxo salivar e composição da saliva, um elevado número de bactérias cariogênicas, a exposição ao flúor insuficiente, recessão gengival, componentes imunológicos, a necessidade de cuidados especiais de saúde e fatores genéticos (Featherstone et al., 2003; Fejerskov, 2004).
Os mecanismos do processo de cárie são similares em todos os tipos de cárie. Bactérias endógenas, principalmente Streptococcus mutans, além de outra espécies como, S. sobrinus e Lactobacillus spp, presente no biofilme, produzem ácidos orgânicos como um subproduto do metabolismo de carboidratos fermentáveis. Isso faz com que o pH diminua a valores críticos, resultando em desmineralização dos tecidos dentais (Selwitz et al., 2007).
A desmineralização pode ser revertida em seu estágio inicial através da absorção de cálcio, fosfato e flúor pelos tecidos dentais. O processo de remineralização pode ocorrer de forma natural quando o pH do biofilme é restaurado pelos compostos presentes na saliva que atuam como um tampão. Porém, se uma cavidade for formada, o sítio se transforma em um ambiente favorável para o acúmulo de biofilme, pois se torna difícil o acesso de artifícios para a higienização realizada pelo paciente, ocasionando a evolução da lesão cariosa (Fejerskov, 2004).
Cerca de 60 a 80% das bactérias implantadas quatro horas após a escovação do dente são streptococos do grupo viridans, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonni e S.
mitis. O predomínio dessas espécies é explicado por propriedades que favorecem muito sua colonização, tais como altos graus de adesão ao dente, á glicoproteína salivar e a facilidade com que suas células coagregam homotipicamente. Existe evidência de que S. sanguinis e S. mutans apresentam maior facilidade de união a componentes salivares do que outros estreptococos (Kawashima et al., 2003).
Streptococcus mutans é uma espécie de bactéria anaeróbia facultativa, Gram-positiva, com morfologia de coco, pertencente ao gênero Streptococcus. Esta espécie bacteriana está diretamente associada ao desenvolvimento da doença cárie, principalmente por possuir propriedades acidúricas (manter a viabilidade, sobrevivendo assim em meio ácido) e acidogênicas (produção de ácidos) (Hamada
& Slade, 1980; Loesche, 1986; Fozo & Quivey, 2004).
S. mutans e S. sobrinus possuem como uma das principais características, a capacidade acidogênica que é a produção de ácido láctico fator determinante fundamental para a sua patogenicidade, sendo responsável pela desmineralização do esmalte na etapa inicial da cárie. É um pré-requisito essencial para que um microorganismo seja considerado cariogênico. E também a capacidade acidúrica,
um importante fator de virulência da bactéria, pois permite que ela sobreviva em pH ácido, proporcionando ao microorganismo desenvolver suas atividades metabólicas em ambientes de pH baixo, tais como sulcos e fissuras dos dentes (Hamada &
Slade, 1980).
A propriedade de sobreviver em meio ácido é associada com a atividade de uma importante enzima localizada na membrana celular, denominada F-ATPase, a qual é responsável pela atividade translocadora de prótons (H+) do meio intracelular para o extracelular em S. mutans, mantendo assim, os valores internos do pH. A produção de ácidos, principalmente o ácido lático através da ação da Desidrogenase Lática, acarreta uma redução do pH do biofilme bacteriano (valores menores do que 5,0) promovendo assim, uma desmineralização do esmalte dentário (Kobayashi, 1985; Bender et al., 1986; Loesche, 1986; Quivey et al., 2000).
Em acréscimo, S. mutans são capazes de metabolizar a sacarose em glucanos solúveis e insolúveis em água, pela ação de três subtipos da enzima glucosiltransferase [1- glucosiltransferase-B (gtfB, 162kDa): síntese de glucanos insolúveis; 2-glucosiltransferase-C (gtfC, 149kDa): síntese de glucanos insolúveis e solúveis; e 3- glucosiltransferase-D (gtfD, 155kDa): síntese de glucanos solúveis]. Os glucanos provenientes desta reação são descritos como os principais responsáveis pelo mecanismo de adesão bacteriana à estrutura dentária (Hanada & Kuramitsu, 1989; Matsumura et al., 2003).
Após a etapa de adesão, inicia-se o processo de formação de biofilme pelo S.
mutans, o qual é controlado por genes regulatórios essenciais para uma correta estruturação de um biofilme cariogênico (O’Toole et al., 2000). Nesta fase, o gene brpA, o qual codifica a Proteína reguladora de biofilme, tem se mostrado de extrema importância neste processo (Wen et al., 2006), uma vez que cepas mutantes de S.
mutans deficientes para o gene brpA mostraram-se deficientes na formação do biofilme (Wen & Burne, 2002).
Alterações psicológicas e/ou emocionais podem influenciar na incidência de doenças dentais. Um estado de tensão emocional crônico pode ocasionar mudanças químicas na saliva sendo assim, uma das possíveis causas da cárie dental. Em seu estudo experimental em ratos Reyna et al. (1966) afirmam que o estresse psicológico induzido influencia o crescimento e a extensão das lesões de cárie.
O estresse, definido como um conjunto de reações do organismo a agressões de ordem física, psíquica, infecciosa e outras, capazes de quebrar a homeostase fisiológica, é associado como um potencial fator de risco para diferentes patologias orais, incluindo a cárie (Shimura et al., 1983; Honkala et al., 1992; Suman et al., 2008).
Essa resposta está intimamente ligada à ativação do sistema nervoso simpático que resulta em liberação de neurotransmissores como a noradrenalina (ou noreprinefrina) (Natelson et al., 1988; Schommer et al., 2003) bem como a ativação do sistema hipotálamo-hipófise-supra-renal, que, por sua vez, resulta na liberação de adrenalina (ou epinefrina) e de glicorticóides, representados principalmente pelo cortisol (Axelrod & Reisine, 1984; Schommer et al., 2003). Durante o estresse, a liberação de catecolaminas pode aumentar em até dez vezes (Cryer, 1980). É essa reação que torna possível a sobrevivência e a adaptação dos seres vivos aos inúmeros estímulos ambientais, nocivos ou não, a que estão constantemente expostos. Porém, quando esse estímulo é mantido por muito tempo ou é muito intenso, o processo de adaptação pode não ocorrer. Neste momento, desenvolve-se a fase de exaustão da reação de estresse em que o organismo se torna susceptível a distúrbios e patologias (Selye, 1998).
Atualmente, os principais mecanismos biológicos atribuídos para que o estresse se constitua um fator de risco para as doenças orais são: (1) imunodepressão, em decorrência dos altos níveis de cortisol, a qual prejudicaria a resposta do hospedeiro frente a uma infecção; (2) alteração no padrão comportamental, a qual refletiria em um déficit na higiene bucal (Rosania et al., 2009).
A partir da análise salivar de crianças com cáries rampantes, foram encontrados níveis elevados de cortisol, substância liberada em períodos de estresse e ansiedade, e que reduziu após o tratamento odontológico (Rai et al., 2010).
Tem sido reportado que as catecolaminas, cuja liberação está aumentada durante respostas ao estresse, têm profundos efeitos no desenvolvimento de doenças infecciosas e no crescimento e expressão de virulência de alguns patógenos. Quanto ao crescimento bacteriano, a noradrenalina e a adrenalina podem induzir o crescimento de microrganismos entéricos como E. coli (Lyte &
Ernst, 1992; Lyte, 1993) e Campylobacter jejuni (Cogan et al., 2007).
Em relação a bactérias presentes na cavidade oral, Roberts et al. (2005) determinaram (in vitro) os efeitos da adrenalina e noradrenalina no crescimento de 43 microrganismos normalmente encontrados em biofilmes orais, incluindo o S.
mutans. Os resultados mostraram que as catecolaminas exerceram um efeito indutor de crescimento na maioria das espécies estudadas. Para S. mutans, o aumento foi de 13,1% e 16,7% (adrenalina e noradrenalina, respectivamente) quando comparado ao grupo controle.
Além de interferir no crescimento bacteriano, a adrenalina e a noradrenalina podem produzir alterações na expressão gênica e na virulência. A noradrenalina
pode afetar a transcrição gênica do patógeno entérico Salmonella enterica serovar typhimurium, induzindo a expressão de genes relacionados ao transporte de metais e também do gene oxyR, responsável pela regulação da resposta ao estresse oxidativo (Karavolos et al., 2008). Essas catecolaminas também já mostraram efeitos sobre a motilidade, formação de biofilme, expressão gênica e colonização de células HeLa por E. coli (Bansal et al., 2007). Além disso, a noradrenalina é capaz de induzir genes responsáveis pela expressão de toxinas (stx1, stx2) e de proteínas de aderência bacteriana (eae) dessa mesma espécie bacteriana (Dowd, 2007). A motilidade e capacidade de invasão às células epiteliais de C. jejuni também são aumentados na presença de noradrenalina (Cogan et al., 2007). Dessa forma, esses estudos mostram que essas substâncias podem causar alterações significantes no desenvolvimento, na colonização e no potencial patogênico bacteriano. Porém, até o momento não há dados na literatura sobre o efeito das catecolaminas em fatores de virulência de S. mutans. Diante disso o presente estudo se propõe a avaliar in vitro o comportamento de S. mutans na presença das principais substâncias liberadas no estresse (adrenalina, noradrenalina e cortisol).
3 MÉTODO
3.1 PREPARO DA SUSPENSÃO BACTERIANA E DO MEIO DE CULTURA, CÁLCULO DA QUANTIDADE DE SUBSTÂNCIA TESTE E PREPARO DOS DISCOS DE HIDROXIAPATITA
3.1.1 Bactéria e condições de cultivo
O microrganismo Streptococcus mutans (UA159) foi inicialmente reativado a partir da cultura original, cultivado em placas de “Brain Heart Infusion” (BHI) ágar, e incubado a 370C, em atmosfera de 10% CO2, por 18-24 horas.
Os componentes Bacto Tryptone e Extrato de Levedura foram diluídos em água destilada e glicose a 10%, devidamente preparados, homogeneizados e esterilizados em autoclave.
Após a esterilização colocou-se 9mL de meio de cultura em um tubo Falcon e 1mL de glicose. Foram coletadas das placas contendo as colônias de S. mutans, entre cinco a dez unidades formadoras de colônia (ufc) utilizando alça de platina e colocadas no tubo. O tubo foi tampado a meia rosca e levado à estufa à temperatura de 370 C, em atmosfera de 10% CO2, por 18h.
Em um tubo de ensaio de vidro com tampa adicionou-se 9,5mL de meio de cultura (BactoTryptone e Extrato de Levedura mais glicose) e 0,5mL do inoculo e inicial. O tubo foi recolocado na estufa a uma temperatura de 370C a 10% e sua absorbância foi avaliada no espectofotômetro (660nm) em intervalos de 1h até a obtenção de um de valor 0,5. Outro tubo contendo 10mL de meio de cultura foi
preparado simultaneamente para ser utilizado como controle (Blank) nos momentos de verificação no espectrofotômetro.
3.1.2 Substâncias utilizadas e grupos experimentais
As seguintes concentrações das soluções testes foram utilizadas:
- Noradrenalina (Sigma®) – 50µM (Roberts et al., 2002) ; - Adrenalina (Sigma®) – 100µM (Roberts et al., 2002);
- Cortisol (Sigma®) – 100µM;
- Grupo controle (controle veículo).
Todas as soluções foram filtradas através de membrana filtrante 0,2µm GV Millex estéril (Millipore-Bedford®, MA, USA).
3.2 TESTE DE FORMAÇÃO DO BIOFILME
Biofilmes de monocultura de S. mutans (UA159) foram formados sobre discos de hidroxiapatita (HA) (.38" X .06" Thick) – “Clarkson Calcium Phosphates”, Williamsport, PA, USA. Para o crescimento inicial e a formação do biofilme, os discos de HA foram inseridos em placas com 24 poços (Figura 1) utilizando um aparato específico, contendo o meio de cultura “Tryptone Yeast Extract” ultrafiltrado (membrana de 10KDa – Millipore Co., MA, USA) com 1% de sacarose, e a
substância teste e incubados a 37ºC, 5% de CO2, por cinco dias. Os meios de cultura (com os respectivos tratamentos) foram trocados a cada 12 horas (Koo et al., 2002) por um período de cinco dias.
Ao término do quinto dia de formação do biofilme, estes foram colocados em um tubo de ensaio com 1mL de NaCl 0,9% e raspados com uma espátula 24 (Duflex) sonicados, diluídos e plaqueados, para o procedimento de contagem microbiana (contagem das ufc/mL).
Todos os procedimentos foram realizados em triplicata e em três experimentos distintos.
Figura 1 – Aparato específico utilizado para sustentar os discos de HA na placa com 24 poços
3.3 TESTE DE QUEDA DE pH EM BIOFILME
3.3.1 Queda do pH em biofilme
Durante todo o período experimental de formação do biofilme (cinco dias), o pH foi mensurado antes de cada troca de meio (12/12h).
3.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ADRENALINA, NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE S. mutans EM BIOFILME MADURO
A amplificação, a detecção e a análise do mRNA para os genes: (1-Adesão)- Glucosiltransferase-B (gtfB), Glucosiltransferase-C (gtfC) e Glucosiltransferase-D (gtfD); (2-Formação de biofilme)- Proteína A reguladora de biofilme (brpA) e (3- Formação de ácido lático)- Desidrogenase Lática (ldh) foram realizadas empregando-se RT-PCR em tempo real (RT-qPCR).
3.4.1 Preparo da suspensão
O preparo da suspensão e os tratamentos (Adrenalina – 100µM;
Noradrenalina – 50µM; Cortisol - 100µM) foram realizados conforme descrito nos itens 3.1.1 e 3.1.2. Após o procedimento de sonicação dos discos de HA para
desprendimento dos microrganismos, foi realizada uma centrifugação a 12.000rpm (três minutos, 4ºC). A partir do pellet formado, o RNA total foi extraído para análise.
3.4.2 Extração do RNA total
A extração do RNA total foi realizada através do kit PureLink™ RNA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Durante a extração de RNA, a DNase (DNase I amp grade – Invitrogen®) foi utilizada para eliminar qualquer contaminação por DNA. As concentrações e a pureza do RNA foram determinadas por espectrofotometria (relação 260/280nm), e sua integridade confirmada através da visualização em géis corados com SYBR safe (Invitrogen®).
3.4.3 Síntese do cDNA e condições do RT-qPCR
A síntese do cDNA foi realizada através da mistura (20µl) contendo 50ng de primers randômicos (Chia et al., 2001), 10mM de dNTP (A, C, G, T) e 1µg de RNA total. Esta solução foi incubada a 65ºC, por cinco minutos. Após este procedimento, 10x RT-PCR buffer, 25mM de MgCl2, 0,1M DTT, 40U de RNAseOUT (inibidor de RNAse) e 50U de Transcriptase reversa (Super Script III®, Invitrogen) foram adicionados ao microtubo e incubados a 25ºC, por dez minutos, seguido de uma nova incubação a 42ºC por cinquenta minutos. O término da síntese do cDNA se deu a 70ºC por 15 minutos. O cDNA foi armazenado a - 20ºC até a análise.
O processo de amplificação do cDNA foi realizado através de uma mistura (25 µl) contendo 1x SYBR Green PCR Master Mix, 1µl de cDNA e 0,5µM de cada conjunto específico de primer (Tabela 1).
O valor de Ct foi definido como o ciclo no qual a fluorescência se tornou detectável acima fluorescência de fundo (background), e é inversamente proporcional ao logaritmo do número de moléculas iniciais alvo.
O nível de expressão de cada gene teste (gtfB, gtfC, gtfD, brpA e ldh) foi normalizado em função da expressão do gene 16s rRNA. A avaliação da expressão gênica foi realizada pelo método 2-ΔΔCT, em duplicata de cinco experimentos distintos.
Tabela 1 – Primers empregados no estudo
Gene Primer (5’- 3’) Referência
gtfB F: 5’-AGCAATGCAGCCAATCTACAAAT-3’
R: 5’-ACGAACTTTGCCGTTATTGTCA-3’
Shemesh et al.
(2007) gtfC F: 5-GGTTTAACGTCAAAATTAGCTGTATTAGC-3'
R: 5’-CTCAACCAACCGCCACTGTT-3’
Shemesh et al.
(2007) gtfD F: 5’-CACAGGCAAAAGCTGAATTAACA-3’
R: 5’-GAATGGCCGCTAAGTCAACAG-3’
Fujiwara et al.
(2002) brpA F: 5’- GGAGGAGCTGCATCAGGATTC-3’
R: 5’- AACTCCAGCACATCCAGCAAG-3’
Shemesh et al.
(2007) Ldh F: 5’- CTTGATACTGCTCGTTTCCGTC-3’
R: 5’- GAGTCACCATGTTCACCCAT-3’
Mattos-Graner et al.
(2006) 16s
rRNA
F: 5’-CCTACGGGAGGCAGCAGTAG-3' R: 5’-CAACAGAGCTTTACGATCCGAAA-3’
Shemesh et al.
(2007)
4 RESULTADOS
4.1 TESTE DE FORMAÇÃO DO BIOFILME
Devido à característica não paramétrica da amostra, os resultados obtidos em ufc/mL foram inicialmente convertidos em log10 para a análise dos resultados. Após este procedimento, e conferência da característica paramétrica do resultado, os dados obtidos foram tratados com teste estatístico de ANOVA (Pós-teste: Tukey). O nível de significância adotado para este estudo foi de 5% (p<0,05) (Bioestat 5.0 Maringá, PR, Brasil).
As catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e também o cortisol testados no presente estudo aumentaram significativamente (p<0,05) a formação de colônias de S. mutans em relação ao grupo controle. Os resultados obtidos podem ser observados na figura 2.
Figura 2 – Efeito da adrenalina, noradrenalina e cortisol na formação (ufc/mL) de biofilme de S.
mutans. Letras diferentes significam diferença estatística – Anova (Post-test: Turkey, p<0,05)
4.2 TESTE DE QUEDA DO pH EM BIOFILME
4.2.1 Queda do pH em biofilme
Mensurações foram realizadas até o quinto dia do experimento em intervalos de 12h. Uma queda contínua foi observada nas 12 primeiras horas em todos os grupos, após, os valores se mantiveram praticamente estáveis até o final do experimento (120h). Não houve diferença estatística entre o grupo controle e os grupos testes (ANOVA, p>0,05). Os resultados obtidos de queda de pH inicial podem ser observados na figura 3.
Figura 3 – Variação de pH até o quinto dia (120 h) da avaliação do contato do S. mutans com as substâncias testes (ANOVA, p>0,05)
4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ADRENALINA, NORADRENALINA E CORTISOL SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE S. MUTANS EM BIOFILME MADURO
A avaliação da expressão dos genes de virulência incluídos no presente estudo (gtfB, gtfC, gtfD, ldh e brpa) não demonstrou diferença estatísticamente significante (ANOVA, p>0,05) entre os grupos testes (Adrenalina, Noradrenalina e Cortisol) e o grupo controle (Tabela 2).
Tabela 2 – Efeito da adrenalina, noradrenalina e cortisol na expressão dos genes gtfB, gtfC, gtfD, ldh e brpA em S. mutans
Gene Grupos
(Quantificação relativa - média±dp)
p Controle Adrenalina Noradrenalina Cortisol
gtfB 1 1,07±0,61 0,85±0,42 0,59±0,25 ns
gtfC 1 1,15±0,46 0,81±0,41 0,75±0,27 ns
gtfD 1 1,20±0,59 0,86±0,39 1,11±0,60 ns
Ldh 1 1,14±0,44 1,25±0,47 0,99±0,42 ns
brpA 1 1,25±0,42 0,84±0,22 1,36±0,46 ns
-Os níveis de expressão dos genes testados foram normalizados em função da expressão do gene 16S rRNA. Os valores representam a média (±dp) de cinco experimentos independentes realizados em duplicata. A quantificação relativa foi estimada pela equação RQ = 2-ΔΔCT
- ns - Diferença não estatisticamente significante (p>0,05, t-Student) em relação ao grupo controle.
5 DISCUSSÃO
Hoje, a cada três habitantes, pelo menos um sofre de estresse. Com o estilo de vida que levamos e a correria para dar conta das diversas atividades nos mais variados âmbitos, o estresse atinge cada vez mais pessoas, sejam elas adultas, idosas ou até mesmo crianças (International Stress Management Association, 2001).
Esta patologia é caracterizada por um aumento na produção/liberação de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e cortisol, sendo o estresse considerado um importante fator de risco para o desenvolvimento de diferentes doenças da cavidade bucal, dentre elas a doença periodontal e a cárie (Borysenko et al., 1980;
Peruzzo et al., 2007; Rosania et al., 2009).
A cárie, das doenças infecciosas que afetam os humanos, é uma das mais prevalentes sendo Streptococcus mutans um dos principais microrganismos responsáveis pela doença (Takahashi & Nyvad, 2008).
Roberts et al. (2002) demonstraram, em um experimento in vitro, que a adrenalina e noradrenalina foram capazes de alterar o perfil de crescimento de diferentes bactérias orais na forma planctônica – 24 horas (43 microrganismos avaliados), dentre elas S. mutans (aumento de 13,1% com a adição de adrenalina e 16,7% com a adição de noradrenalina). A semelhança destes achados, o presente estudo demonstrou que estas catecolaminas também foram capazes de alterar o perfil de virulência de S. mutans, representado por um aumento na contagem do número de colônias formadas sobre discos de hidroxiapatita após cinco dias de crescimento. Em acréscimo aos dados encontrados até o presente momento na literatura, em nosso estudo, constatamos que o cortisol (hormônio liberado no
estresse juntamente com as catecolaminas) também foi capaz de aumentar a formação do biofilme de S. mutans.
A opção pela utilização de discos de hidroxiapatita (Zezhang et al., 2006) simulam o processo inicial da doença cárie (adesão das bactérias e formação do biofilme) na superfície do dente. Bactérias encontradas na cavidade oral, principalmente S. mutans, presentes no biofilme produzem ácidos orgânicos como um subproduto do metabolismo de carboidratos fermentáveis. Isso faz com que o pH caia a valores críticos (valores menores do que 5,0), resultando em desmineralização dos tecidos dentais (Selwitz et al., 2007). Portanto, a produção de ácidos, principalmente o ácido lático através da ação da enzima Desidrogenase Lática (LDH), é considerado um fator determinante para a patogenicidade da bactéria e responsável pela desmineralização do esmalte na etapa inicial da cárie (Kobayashi, 1985; Bender et al., 1986; Loesche, 1986; Quivey et al., 2000). Desta forma, em nosso trabalho buscamos a avaliar o efeito das catecolaminas/cortisol sobre a produção de ácido pelo S. mutans.
A análise do pH durante todo o processo de formação do biofilme maduro (cinco dias) permitiu a avaliação do comportamento do S. mutans na presença das catecolaminas e do cortisol quanto à possibilidade de alteração na produção de ácidos pela bactéria. Foi possível confirmar a significativa queda dos valores iniciais chegando próximo a quatro em todos os grupos avaliados (adrenalina, noradrenalina e cortisol) e grupo controle. A maior queda do pH foi observada nos primeiros 15 minutos seguido de uma queda mais discreta durante a primeira hora e este valor praticamente se manteve constante até o final da avaliação, indicando que não houve alteração na produção de ácidos por S. mutans na presença das substâncias citadas.
Na tentativa de uma melhor compreensão dos resultados obtidos de contagem bacteriana e produção de ácidos foi realizada a avaliação da expressão de genes relacionados com os processos mencionados. Neste sentido, a expressão de gtfB, gtfC, gtfD e brpA (relacionados formação do biofilme), e ldh (relacionado com a produção de ácido) foram avaliados por RT-qPCR. Estudos apresentados na literatura sugerem que S. mutans mutantes que sofreram inibição dos genes relacionados (gtfB, gtfC, gtfD e brpA) apresentam uma diminuição na formação do biofilme (Koo et al., 2010).
Yamashita et al. (1993), em experimento com ratos mutantes para os genes gtfB e gtfC, exibiram marcadamente níveis reduzidos de lesões de superfície lisa de cárie. Porém, nenhuma destas mutações alterou significativamente a taxa de indução de cárie em sulco, sugerindo que estes genes são importantes para a formação de cáries de superfície lisa.
Em estudo int vitro, Zezhang et al. (2006), utilizando uma estirpe de S.mutans brpa deficiente, observaram defeito na formação de biofilme sobre discos de hidroxiapatita que também foi facilmente perceptível na análise por microscopia de varredura e laser confocal.
Em nosso estudo, os resultados não mostraram diferença estatísticamente significativa para genes avaliados na presença das substâncias teste (adrenalina, noradrenalina e cortisol) e grupo controle. A ausência de alteração quanto ao gene ldh que também foi avaliado em nosso experimento, confirmam os resultados obtidos quanto a análise dos valores do pH verificados nos testes de queda de pH em biofilme.
6 CONCLUSÃO
Os achados do presente estudo demonstram que a adrenalina a noradrenalina e o cortisol contribuem para um aumento na formação de colônias de S. mutans sobre a superfície de discos de hidroxiapatita. Porém não alteram os valores do pH e a expressão dos genes de virulência avaliados.
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial desta obra, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte
Denise Leda Pedrini
Taubaté – SP, Abril de 2012
