VIRULÊNCIA DE S. MUTANS EM BIOFILME MADURO
A avaliação da expressão dos genes de virulência incluídos no presente estudo (gtfB, gtfC, gtfD, ldh e brpa) não demonstrou diferença estatísticamente significante (ANOVA, p>0,05) entre os grupos testes (Adrenalina, Noradrenalina e Cortisol) e o grupo controle (Tabela 2).
Tabela 2 – Efeito da adrenalina, noradrenalina e cortisol na expressão dos genes gtfB, gtfC, gtfD, ldh e brpA em S. mutans
Gene Grupos
(Quantificação relativa - média±dp)
p
Controle Adrenalina Noradrenalina Cortisol
gtfB 1 1,07±0,61 0,85±0,42 0,59±0,25 ns gtfC 1 1,15±0,46 0,81±0,41 0,75±0,27 ns gtfD 1 1,20±0,59 0,86±0,39 1,11±0,60 ns Ldh 1 1,14±0,44 1,25±0,47 0,99±0,42 ns brpA 1 1,25±0,42 0,84±0,22 1,36±0,46 ns
-Os níveis de expressão dos genes testados foram normalizados em função da expressão do gene 16S rRNA. Os valores representam a média (±dp) de cinco experimentos independentes realizados em duplicata. A quantificação relativa foi estimada pela equação RQ = 2-ΔΔCT
- ns - Diferença não estatisticamente significante (p>0,05, t-Student) em relação ao grupo controle.
5 DISCUSSÃO
Hoje, a cada três habitantes, pelo menos um sofre de estresse. Com o estilo de vida que levamos e a correria para dar conta das diversas atividades nos mais variados âmbitos, o estresse atinge cada vez mais pessoas, sejam elas adultas, idosas ou até mesmo crianças (International Stress Management Association, 2001).
Esta patologia é caracterizada por um aumento na produção/liberação de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e cortisol, sendo o estresse considerado um importante fator de risco para o desenvolvimento de diferentes doenças da cavidade bucal, dentre elas a doença periodontal e a cárie (Borysenko et al., 1980; Peruzzo et al., 2007; Rosania et al., 2009).
A cárie, das doenças infecciosas que afetam os humanos, é uma das mais prevalentes sendo Streptococcus mutans um dos principais microrganismos responsáveis pela doença (Takahashi & Nyvad, 2008).
Roberts et al. (2002) demonstraram, em um experimento in vitro, que a adrenalina e noradrenalina foram capazes de alterar o perfil de crescimento de diferentes bactérias orais na forma planctônica – 24 horas (43 microrganismos avaliados), dentre elas S. mutans (aumento de 13,1% com a adição de adrenalina e 16,7% com a adição de noradrenalina). A semelhança destes achados, o presente estudo demonstrou que estas catecolaminas também foram capazes de alterar o perfil de virulência de S. mutans, representado por um aumento na contagem do número de colônias formadas sobre discos de hidroxiapatita após cinco dias de crescimento. Em acréscimo aos dados encontrados até o presente momento na literatura, em nosso estudo, constatamos que o cortisol (hormônio liberado no
estresse juntamente com as catecolaminas) também foi capaz de aumentar a formação do biofilme de S. mutans.
A opção pela utilização de discos de hidroxiapatita (Zezhang et al., 2006) simulam o processo inicial da doença cárie (adesão das bactérias e formação do biofilme) na superfície do dente. Bactérias encontradas na cavidade oral, principalmente S. mutans, presentes no biofilme produzem ácidos orgânicos como um subproduto do metabolismo de carboidratos fermentáveis. Isso faz com que o pH caia a valores críticos (valores menores do que 5,0), resultando em desmineralização dos tecidos dentais (Selwitz et al., 2007). Portanto, a produção de ácidos, principalmente o ácido lático através da ação da enzima Desidrogenase Lática (LDH), é considerado um fator determinante para a patogenicidade da bactéria e responsável pela desmineralização do esmalte na etapa inicial da cárie (Kobayashi, 1985; Bender et al., 1986; Loesche, 1986; Quivey et al., 2000). Desta forma, em nosso trabalho buscamos a avaliar o efeito das catecolaminas/cortisol sobre a produção de ácido pelo S. mutans.
A análise do pH durante todo o processo de formação do biofilme maduro (cinco dias) permitiu a avaliação do comportamento do S. mutans na presença das catecolaminas e do cortisol quanto à possibilidade de alteração na produção de ácidos pela bactéria. Foi possível confirmar a significativa queda dos valores iniciais chegando próximo a quatro em todos os grupos avaliados (adrenalina, noradrenalina e cortisol) e grupo controle. A maior queda do pH foi observada nos primeiros 15 minutos seguido de uma queda mais discreta durante a primeira hora e este valor praticamente se manteve constante até o final da avaliação, indicando que não houve alteração na produção de ácidos por S. mutans na presença das substâncias citadas.
Na tentativa de uma melhor compreensão dos resultados obtidos de contagem bacteriana e produção de ácidos foi realizada a avaliação da expressão de genes relacionados com os processos mencionados. Neste sentido, a expressão
de gtfB, gtfC, gtfD e brpA (relacionados formação do biofilme), e ldh (relacionado
com a produção de ácido) foram avaliados por RT-qPCR. Estudos apresentados na literatura sugerem que S. mutans mutantes que sofreram inibição dos genes relacionados (gtfB, gtfC, gtfD e brpA) apresentam uma diminuição na formação do biofilme (Koo et al., 2010).
Yamashita et al. (1993), em experimento com ratos mutantes para os genes gtfB e gtfC, exibiram marcadamente níveis reduzidos de lesões de superfície lisa de cárie. Porém, nenhuma destas mutações alterou significativamente a taxa de indução de cárie em sulco, sugerindo que estes genes são importantes para a formação de cáries de superfície lisa.
Em estudo int vitro, Zezhang et al. (2006), utilizando uma estirpe de S.mutans brpa deficiente, observaram defeito na formação de biofilme sobre discos de hidroxiapatita que também foi facilmente perceptível na análise por microscopia de varredura e laser confocal.
Em nosso estudo, os resultados não mostraram diferença estatísticamente significativa para genes avaliados na presença das substâncias teste (adrenalina, noradrenalina e cortisol) e grupo controle. A ausência de alteração quanto ao gene ldh que também foi avaliado em nosso experimento, confirmam os resultados obtidos quanto a análise dos valores do pH verificados nos testes de queda de pH em biofilme.
6 CONCLUSÃO
Os achados do presente estudo demonstram que a adrenalina a noradrenalina e o cortisol contribuem para um aumento na formação de colônias de
S. mutans sobre a superfície de discos de hidroxiapatita. Porém não alteram os
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Denise Leda Pedrini