AÇÃO TÓXICO GENÉTICA DA ÁGUA DE SUPERFÍCIE E DE SEDIMENTOS DA MICROBACIA DO ARROIO ARAÇÁ, RS, BRASIL

UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

TOXICOLOGIA APLICADA

AÇÃO TÓXICO GENÉTICA DA ÁGUA DE SUPERFÍCIE E DE SEDIMENTOS DA MICROBACIA

DO ARROIO ARAÇÁ, RS, BRASIL

Dissertação para a obtenção do Título de Mestre em Genética e Toxicologia Aplicada

Laura Vicedo Jacociunas

Orientadora: Dra. Heloisa Helena Rodrigues De Andrade

CANOAS 2007

Livros Grátis

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Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório da Toxicidade Genética, TOXIGEN - do Programa de Pós Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA, subvencionada pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Dedico esta dissertação aos meus pais: Paulo e Cecília

Foram os olhos de vocês que me viram crescer e brilharam a cada conquista, bem como as mãos amigas que me ajudaram a levantar nas horas críticas.

Dedico este trabalho a vocês, que vêem com satisfação o final desta etapa, e que certamente estão tão felizes quanto eu.

Agradecimentos

À Drª. Heloisa Helena Rodrigues de Andrade - Helô!

Meu muito obrigada, especial pelo seu incentivo. Por ter me acolhido no laboratório. Por todas as horas de orientação e apoio dedicadas, abrindo os caminhos da genética, mostrando novos horizontes, me permitindo usufruir de seus conhecimentos e convívio. Obrigada por tudo!

Rafa e Vivi:

Obrigada por me darem as primeiras coordenadas – ou melhor, as primeiras lâminas de muitas que ainda estavam por vir, assim que cheguei ao TOXIGEN.

Agradeço por me acompanharem e ensinarem a cada etapa desta dissertação.

E você, Vivi?! Que mesmo de longe sempre foi atenciosa e me prestou apoio.

Muito obrigada!

Fê:

Tua dedicação foi além das atividades de secretaria. Te agradeço pela amizade e palavras sinceras.

À Biba:

Agradeço toda a paciência e compreensão com as revisões, minuciosa, impecável... Obrigada!

Ao Dr Maurício Lehmann:

Obrigada pela dedicação nas aulas, por todo o aprendizado e disponibilidade para ajudar sempre.

Aos colegas e amigos do TOXIGEN:

Alana, Amanda, Bruno, Guilherme, Judite, Juliana, Letícia, Nádia, Rafael, Samantha, Stela, Ronaldo: a ajuda e companhia de vocês foi preciosa em cada momento, muito obrigada!

À Drª Tânia Prochnow:

Agradeço toda disposição, boa vontade, paciência e carinho nas saídas de campo.

À Drª Helena Rosek – Diretora do IPB-Lacen/RS, as amigas - Carolina Alfama e Tatiana Tramontina e aos demais colegas de Lacen:

Meu muito obrigada pela flexibilidade e incentivo ao aperfeiçoamento.

À Drª Flávia Thiesen

Obrigada por ter me ensinado os primeiros passos da toxicologia aplicada, sempre me incentivando a seguir em frente com dedicação.

Aos meus avós

Agradeço todo carinho e incentivo ao estudo ao longo deste percurso.

Aos meus pais

Por terem me acompanhado a cada etapa do trabalho. Por confiarem em mim em todos os momentos. Pelo carinho, paciência, compreensão e dedicação ao meu crescimento profissional. Muito Obrigada!

Também agradeço ao meu namorado - Ricardo, por sua preocupação e compreensão nos momentos não partilhados.

SUMÁRIO

Resumo...

Abstract...

Capítulo I: Introdução Geral ...

1. Introdução...

1.1.Influência Industrial ...

1.2.Influência Rural...

1.3.Influência Urbana...

1.4. Caracterização do Local do Estudo – Microbacia do Arroio

Araçá...

1.5. O TesteSMART...

1.6. Objetivos...

Capítulo II: Recombinagenic activity of water and sediment from Araçá Stream (Canoas, Brazil), in the Drosophila wing-spot test.

Capítulo III: Discussão Geral ...

3. Discussão...

3.1 O Teste SMART...

Capítulo IV: Bibliografia Geral ...

4. Referências Bibliográficas ...

8 10 12 13 17 20 22

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66 67

ReRessuummoo

A atividade genotóxica da água superficial e do sedimento de amostras coletadas em 7 pontos ao longo do Arroio Araçá – localizado integralmente no município de Canoas, RS, Brasil - foi avaliada através do teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (SMART) em Drosophila melanogaster.

Os dados de genotoxicidade obtidos através desta metodologia foram associados a estudos prévios da região, que avaliaram a concentração de partículas aéreas e metais pesados. Estes sítios estão sob a influência de dejetos urbanos (sítios 1 a 7), pesticidas agrícolas (sítios 5 e 7), dejetos hospitalares (sítio 3), dejetos animais (5), pequenas indústrias (sítios 4, 5 e 6) e descargas de veículos (2, 4, 5 e 6). O cruzamento padrão (CP) - com nível basal de enzimas de metabolização do tipo P450 - assim como o cruzamento aprimorado (CA) – com alta atividade constitutiva de P450 – foram utilizados para a avaliação da toxicidade genética da água e do sedimento coletados na época das chuvas (Junho de 2006). As freqüências de manchas mutantes obtidas em ambos os cruzamentos - para as amostras de água e de sedimento - foram comparadas aos seus respectivos controles negativos. Em ambos os cruzamentos todas as amostras de água e de sedimento induziram eventos relacionados a recombinação mitótica, mas não mostraram ação mutagênica pontual ou cromossômica. No cruzamento padrão, as amostras de água provenientes do sítio 5 mostraram a maior freqüência de indução de clones mutantes - e conseqüentemente a maior potência genotóxica, seguida dos sítios 6 e 7. Estes três pontos foram cerca de 50 a 60% mais

recombinogênicos no CP do que no CA. Ao contrário, no cruzamento aprimorado as amostras que mostraram maior atividade em termos de recombinação mitótica foram as coletadas nos sítios 2 e 4. Os sítios 1, 2 e 4 induzem 30 a 35 % mais clones mutantes no cruzamento aprimorado em comparação ao padrão. Tais achados indicam que estes três sítios (1, 2 e 4) contém tanto genotoxinas de ação direta quanto genotoxinas que são ativadas pelos altos níveis de CYP6A2, presentes no CA. Todas as amostras de sedimento, em ambos os cruzamentos CP e CA mostraram valores de indução de recombinação bastante similares. O teste SMART de asa mostrou alta sensibilidade para detectar agentes genotóxicos presentes no ambiente aquático – o que o qualifica para o monitoramento de áreas que sofrem ação antropogênica de dejetos de diferentes origens.

AbAbssttrraacctt

The genotoxic activity of water and sediment samples collected in 7 different sites within the area of Araçá Stream, located integrally in the municipal district of Canoas, RS, Brazil was evaluated and related to previous data on the contents of airborne particulates as well as heavy metals concentrations. These sites are under the influence of untreated urban discharges (1-7), agricultural pesticide (5 and 7), hospital waste (3), animal dejects (5), small industries (4, 5 and 6) and vehicular discharges (2, 4, 5 and 6). The Somatic Mutation and Recombinations Test (SMART) in standard (ST) cross and high bioactivation (HB) cross flies was used to analyze water and sediment. Samples were collected in June (raining season) 2006. Mutant spot frequencies found in treatments with unprocessed water and sediment samples from the test sites were compared with the frequencies observed in negative controls. In both ST and HB crosses all the water and sediment samples from the seven sites displayed a massive recombinagenic response, but no mutagenic activity was ascribed for any of the sites investigated. In the ST cross the surface water sample from site 5 showed the highest induction of mutant clones, followed by sites 6 and 7 - sites 5, 6 and 7 displayed 50-60%

higher recombinagenic activity in relation to the HB cross. On the contrary, water samples that had the highest genotoxic potential in the HB were represented by sites 2 and 4 - sites 1, 2 and 4 induced about 30-35% more mutant clones in the HB cross when compared to the ST cross . These tree sites contain direct genotoxins and indirect ones that could be activated by the high

levels of CYP6A2 present in the HB strain. All the sediment samples showed genotoxicity when compared to the distilled water control, in both ST and HB crosses in a similar magnitude. The SMART wing test in Drosophila melanogaster was shown to be highly sensitive to detect genotoxic agents present in the aquatic environment, and should be better brought to use for monitoring areas under anthropogenic discharges.

Capítulo l

Introdução Geral

1. Introdução

Anualmente, milhares de toneladas de compostos químicos sintéticos são registrados para uso caseiro, industrial, assim como para a agricultura. Estima-se que aproximadamente 80.000 compostos químicos, estejam comercialmente disponíveis, dos quais cerca de 20% são comprovadamente mutagênicos (Ohe, 2004).

Ao longo das três últimas décadas, a comunidade científica e as agências de controle ambiental conscientizaram-se dos riscos que são impostos aos ecossistemas e à saúde humana, pela exposição, em longo prazo, aos agentes contaminantes. Mudanças climáticas, diminuição da camada de ozônio, eutrofização das águas, assim como acidentes químicos e radioativos foram alguns dos sinais de alerta, que incentivaram o desenvolvimento de programas voltados para o monitoramento ambiental da toxicidade genética associada aos sistemas biológicos.

Outro aspecto a ser considerado, dentro do contexto da poluição ambiental, relaciona-se com a diminuição da biodiversidade e da variabilidade genética das populações naturais em função das atividades humanas associadas à urbanização, agricultura e indústria. Embora diversos fatores estejam envolvidos na perda da diversidade genética, a contaminação química do ambiente - incluindo exposições crônicas das populações ou efeitos imediatos e agudos, como derramamentos de óleo - está estreitamente ligada ao declínio ou

A manutenção do equilíbrio de ecossistemas aquáticos e terrestres depende, fundamentalmente, da qualidade das suas fontes de água. Desta forma, a sobrevivência das suas populações pode ser seriamente comprometida em função do volume e da composição dos dejetos lançados, já que estes geralmente contêm substâncias tóxicas com potencial de acumulação na cadeia alimentar (Claxton et al., 1998). Estima-se que os compostos genotóxicos constituem pelo menos 5% dos poluentes derivados da ação antrópica, em qualquer ecossistema (Rajaguru et al., 2001). Dependendo da concentração, as toxinas lançadas no ambiente podem causar danos diversos na biota a ela exposta. Embora na maioria das vezes não sejam capazes de provocar efeitos agudos e imediatos, podem, por outro lado, reduzir a sobrevivência destes organismos através de lesões crônicas que se manifestam, a médio e em longo prazo, como desordens fisiológicas em diferentes tecidos e órgãos ou como alterações genéticas (White e Rasmussen, 1998). Enquanto mudanças no conteúdo informacional de células somáticas podem estar muitas vezes associadas à indução de câncer e a diversas doenças degenerativas (Bridges et al., 1990; Karsten e Krypsin-Sorensen, 1988; Kirkwood, 1989; Fearon e Vogelstein, 1990), em células germinativas tais eventos podem levar a alterações que aumentam significativamente a carga genética das futuras gerações (Bickham et al., 2000; De Wolf et al., 2004).

O crescimento populacional e a conseqüente necessidade de aumento da produção de alimentos, associado ao desenvolvimento industrial geram um dos principais desafios mundiais da atualidade - o atendimento à demanda por água

de boa qualidade. Devem ser repensados não apenas o aumento no seu consumo per capita - cada vez maior em regiões altamente industrializadas – mas também a manutenção da qualidade dos recursos hídricos - a oferta de água disponível para cada habitante do planeta diminuiu quase 40% (Nebel e Wright, 2000).

Esta meta torna-se ainda mais desafiadora quando se constata que após a sua utilização, nas mais diversas atividades, a água é comumente descartada para o corpo receptor mais próximo - sem que passe, na maioria das vezes, por qualquer tipo de tratamento.

Alguns poluentes, como metais pesados e compostos organoclorados, persistem no ambiente associados ao sedimento, podendo ter ação mutagênica, acumular-se em concentrações superiores àquelas encontradas no meio líquido e acarretar efeitos agudos e crônicos para as comunidades que vivem ou entram em contato com o sedimento (Araújo et al., 2006). O sedimento pode, então, ser considerado como um compartimento importante a ser estudado na avaliação do nível de contaminação dos ecossistemas aquáticos, dada a sua capacidade de acumular compostos orgânicos e inorgânicos, principalmente por processos de decantação. Muitos destes compostos podem estar presentes naturalmente em concentrações elevadas, mas, na maioria dos casos esses valores são devidos à atividade antropogênica. Uma vez no sedimento, os contaminantes podem se associar a certas partículas, sofrer transformações ou migrar do sedimento para a coluna d’água. Níveis elevados de contaminantes persistentes no sedimento podem acarretar efeitos para a biota aquática, dependendo de fatores que alteram a biodisponibilidade e a toxicidade (Araújo et al., 2006).

De fato, um dos pilares do desenvolvimento de nossa sociedade se vincula ao baixo custo de enormes quantidades de água. A agricultura é um dos beneficiários, já que, em média, é o maior consumidor de recursos hídricos - através do processo de irrigação, cerca de 69% da água de boa qualidade não retorna a sua fonte de origem. A indústria, por sua vez, devolve a água utilizada para sua procedência original - ainda que muitas vezes contaminada com determinados resíduos, já que algumas empresas não tratam os efluentes gerados pelos processos industriais (Nebel e Wright, 2000).

O forte impacto gerado pelo desenvolvimento urbano no contexto da poluição ambiental deve-se basicamente ao crescimento acelerado e ao não planejado assentamento das populações urbanas. No Brasil, o intenso êxodo rural, a migração das populações de baixa renda, que vivem nos arredores das grandes cidades para as capitais, a ocupação de locais públicos, assim como o assentamento sobre áreas de mananciais de abastecimento de água potável compromete a sustentação hídrica das cidades. Esta tendência dificulta o controle da poluição nestes ambientes, já que à medida que a cidade cresce, as saídas do esgoto das propriedades são ligadas às redes de esgoto pluvial sem nenhum tratamento prévio - convergindo para os rios e ocasionando um significativo impacto sobre a qualidade da água. Ainda que as empresas de saneamento tenham investido em redes de coleta de esgoto e estações de tratamento, é ainda muito pequena a parcela efetivamente tratada dos dejetos urbanos gerados pelas cidades brasileiras (SEMA, 2002).

Como conseqüência, às estratégias utilizadas pelas entidades de controle ambiental buscam o emprego de uma bateria de testes biológicos – composta por diversos ensaios selecionados – para detalhar a ação tóxico genética de uma determinada amostra. De fato, estudos recentes - utilizando diferentes bioensaios - revelam que as águas dos rios, de diversos países, vêm sendo constantemente contaminadas por uma gama de genotoxinas provenientes das descargas de origem antropogênica (Kataoka et al., 2000; Ono et al., 2000; Watanabe et al., 2002; Carabias-Martinez et al., 2003).

1.1. Influência Industrial

O lançamento de efluentes industriais nos corpos hídricos impõe um significativo risco aos ecossistemas, não apenas pelo volume de descarga dos dejetos, mas principalmente pela sua composição química. Esta situação agrava- se no momento em que são lançados resíduos contendo diferentes toxinas, que interagem entre si formando misturas complexas com características específicas, que podem aumentar sinergisticamente o potencial genotóxico (Vargas et al., 2001). Em razão da natureza complexa destas misturas, diferentes bioensaios in vitro, in vivo e in situ - que detectam mutações gênicas, mutações cromossômicas e recombinação mitótica, assim como reparo induzido por danos no DNA - vem sendo utilizados como ferramentas para o monitoramento do risco imposto pelos dejetos industriais, permitindo um diagnóstico mais amplo da qualidade dos corpos d’água associados a estes despejos (Ohe et al., 2004).

Dentre os ensaios mais empregados para a avaliação da genotoxicidade associada a dejetos de origem industrial destaca-se o teste de Ames em Salmonella typhimurium (McGeorge et al., 1985; Houk, 1992; Vargas et al., 1993; Vargas et al., 2001). A utilização deste bioensaio, em diferentes abordagens experimentais, evidenciou que despejos oriundos de diferentes tipos de indústrias apresentam um espectro de resposta mutagênica variável, dependente do tipo de produto processado. Quando se consideram todos os tipos de efluentes industriais avaliados, as potências mutagênicas distribuem-se dentro do intervalo compreendido entre 10² a 10¹² revertentes por litro de amostra. De fato, dejetos que induzem valores iguais ou superiores a 10¹² revertentes por litro impõem um grave risco aos ecossistemas. Entretanto, os incluídos no extremo inferior do espectro (10² revertentes/l), são considerados como tendo um baixo risco como indutores de mutações gênicas. Ao mesmo tempo, a associação entre potência mutagênica e composição dos efluentes originados por cada indústria revela que as empresas responsáveis pela produção de furazolidona e nitrofurfural são as que contribuem com os maiores índices de potência mutagênica, seguidas das refinarias de petróleo, indústrias de forja, de produção de compostos orgânicos e de resíduos gerados por fornalhas de coque (Ohe et al., 2004).

Outro ponto relevante a ser considerado relaciona-se com a avaliação da toxicidade genética associada a diferentes categorias de efluentes industriais, onde são incluídas indústrias de corantes, resinas, compostos orgânicos e petróleo. De fato, observou-se que as empresas produtoras de corantes e de

compostos orgânicos – a despeito de estarem incluídas na categoria moderadamente mutagênica - são as principais responsáveis pela emissão de efluentes genotóxicos, contribuindo com, respectivamente, 84% e 72% das respostas positivas obtidas através do teste de Ames (McGeorge et al., 1985;

Claxton et al., 1998).

Este padrão de resposta não parece estar restrito a um único tipo de bioensaio, uma vez que a avaliação da genotoxicidade de 42 efluentes de uma série de indústrias não afins, evidenciou que as empresas produtoras de corantes e compostos orgânicos foram as que mais contribuíram para a genotoxicidade associada à indução de reparo indutor de erro, evidenciada pelo Cromoteste SOS (White et al., 1996; Claxton et al., 1998).

Adicionalmente, testes especialmente delineados para a detecção de eventos associados com perda de cromossomos inteiros ou deleções de fragmentos cromossômicos, foram aplicados para a avaliação da ação genotóxica de amostras de corpos d’água sob a influência de despejos industriais. De fato, independente do tipo de organismo experimental empregado, Allium cepa, Rana clamitan, Bufo americanus ou Pimephales promelas - os efluentes provenientes das indústrias químicas, metalúrgicas, petroquímicas, têxteis e de celulose induziram aumentos significativos nas freqüências de eventos associados à clastogênese e à aneugênese (Ralph e Petras, 1998, Lemos et al., 2007). Quando um parâmetro adicional, que detecta a indução de trocas entre cromátides-irmãs (SCE), foi incluído na avaliação de áreas que estão sob impacto de dejetos industriais - que recebem efluentes de indústrias petroquímicas, de papel e de

alumínio os dados obtidos revelaram que o teste para detecção de SCEs é o melhor indicador da genotoxicidade de dejetos de origem industrial, seguido pelo de micronúcleos e de aberrações cromossômicas, que mostraram uma sensibilidade similar. O conjunto destas observações enfatiza a importância de que sejam avaliados diferentes parâmetros genéticos, para que possa ser traçado um quadro completo sobre a toxicidade genética, já que as respostas obtidas estão diretamente vinculadas à composição química das amostras ambientais sob a influência de despejos industriais.

Com o objetivo de estimar o risco genético imposto ao ambiente pelos poluentes industriais, diversos sistemas de detecção de genotoxicidade, baseados na resposta de vegetais, estão sendo empregados para a avaliação de misturas complexas - incluindo o teste de micronúcleos (MN) e o ensaio de aberração cromossômica em ponta de raiz de Allium cepa, Vicia faba e Tradescantia paludosa (Duan et al., 1999; Júnior et al., 2007). A principal vantagem, em comparação com os testes citogenéticos em culturas de células de mamíferos e os ensaios de mutagenicidade em bactérias, reside no fato de que as plantas podem ser expostas diretamente às amostras, sem envolver qualquer processo de filtração ou de concentração.

1.2. Influência Rural

Também, a agricultura contribui significativamente para o impacto ambiental dos ecossistemas aquáticos, através do uso de pesticidas nas lavouras.

Estes compostos não apenas alteram a composição e a qualidade dos solos como,

inevitavelmente, acabam por comprometer os corpos d’água adjacentes, expondo perigosamente os ecossistemas a diferentes contaminantes, muitos dos quais com propriedades genotóxicas (Ralph e Petras, 1997; Kaya et al., 2000;

Bolognesi e Morasso, 2000). De fato, a intoxicação por resíduos de pesticidas não apenas é uma das principais causas de mudanças nos ambientes naturais (Kendall, 1992), como também um risco para as populações humanas - uma vez que pode causar uma ampla gama de desordens que incluem desde alterações no sistema nervoso central (Mearns et al., 1994), até indução de tumores malignos (Osaba et al., 1999).

Na busca da identificação dos riscos impostos ao ambiente por herbicidas, inseticidas e fungicidas, um número razoável de bioensaios já foi utilizado. Tais estudos mostraram que grande parte destes produtos apresenta um alto grau de citotoxicidade, bem como uma alta efetividade genotóxica e, como conseqüência, impõem uma significativa carga genética para os ecossistemas associados às atividades rurais (Ma et al., 2003; Aleem et al., 2005).

Ainda dentro do contexto rural, outra fonte de toxinas é o lodo, produzido a partir do tratamento de esgotos municipais e aplicado como fertilizante nas lavouras. Sabe-se que tais processos nem sempre mostram uma grande efetividade, no que diz respeito à eliminação de poluentes, o que leva a um risco toxicológico adicional para os ecossistemas (Ralph et al., 1996). Nesta perspectiva, Rank e Nielsen (1998), através do teste de aberrações cromossômicas em Allium cepa, evidenciaram genotoxicidade associada a

amostras do lodo, obtido de três estações municipais de tratamento de esgoto e comercializado como fertilizante.

1.3. Influência Urbana

Os resíduos lançados pelos centros urbanos apresentam uma natureza ainda mais complexa, já que são formados tanto pelos dejetos de origem doméstica como pelos de indústrias de pequeno porte. Desta forma, a sua constituição vai depender tanto do número de habitantes, como da quantidade e tipo de pequenas indústrias presentes no município, fazendo com que cada um apresente efluentes de composições distintas e particulares. Outro ponto a ser considerado é a presença ou não de algum tipo de tratamento, não só dos esgotos domésticos, mas também dos resíduos industriais, antes de seu despejo final nos corpos d’água. De fato, na grande maioria das vezes, indústrias de pequeno porte não apresentam qualquer estratégia de tratamento de seus efluentes, enquanto que, dependendo do centro urbano, dejetos domésticos podem estar sujeitos a diferentes estratégias de tratamento, que vão desde a total recuperação até o lançamento direto nos sistemas aquáticos (White e Rasmussen, 1998).

A idéia de que dejetos de origem industrial e/ou rural impõem um maior risco, quando comparados àqueles de origem urbana, tem sido enfatizada em diversos estudos sobre a genotoxicidade de amostras ambientais. No entanto, a medida que novos dados são obtidos, torna-se cada vez mais claro que a maior contribuição para a carga genotóxica total, imposta aos ecossistemas, deriva,

principalmente, de dejetos urbanos (White et al.,1996; White e Rasmussen, 1998; Cardozo et al., 2006; Ergene et al., 2007). Mesmo assim, os resultados dos diversos estudos de amostras ambientais que sofrem influência urbana, costumam ser muito variados e, algumas vezes, contraditórios.

De fato, os primeiros trabalhos realizados dentro desta abordagem preocuparam-se em avaliar – tanto através de análises químicas, como por meio de diferentes bioensaios – o potencial genotóxico dos esgotos ou dos efluentes líquidos urbanos antes de serem lançados nos sistemas aquáticos. Assim, White e colaboradores (1996), analisaram a genotoxicidade de efluentes de diferentes indústrias e de esgotos municipais, através do Cromoteste SOS. A comparação dos dados obtidos mostrou que as amostras de origem urbana apresentaram valores de carga genotóxica muito superiores às de origem industrial, que incluíam uma ampla gama de linhas de produção: refinação de metais e de petróleo, manufaturação de compostos orgânicos, inorgânicos e de papel. Em função da carga genotóxica ser calculada pela multiplicação entre o volume de lançamentos por minuto e a potência genotóxica da amostra, o grande volume de despejos domésticos – mensurado em 1122 m³/min, comparados ao valor máximo industrial de 125 m³ /min – pode explicar o maior risco por eles imposto.

O lançamento de efluentes industriais nos corpos hídricos impõe um significativo risco aos ecossistemas, não apenas pelo volume de descarga dos dejetos, mas principalmente pela sua composição química. Esta situação agrava- se no momento em que são lançados resíduos contendo diferentes toxinas, que interagem entre si formando misturas complexas com características específicas

– uma vez que estas interações podem aumentar de forma sinérgica o potencial genotóxico (Vargas et al., 2001; Villela et al., 2007).

1.4 Caracterização do Local do Estudo - Microbacia do Arroio Araçá

O Arroio Araçá, integrante da Bacia Hidrográfica do Rio dos Sinos, estende sua microbacia no sentido leste-oeste do município de Canoas. Sua nascente principal está localizada em local conhecido como Banhado do Biassus, a leste da cidade, passando pelo perímetro urbano e lançando suas águas, no final do seu curso, no Arroio das Garças, em área do Parque Estadual do Delta do Jacuí. É o único arroio que tem sua microbacia integralmente localizada no município, sendo que, na maior parte do seu curso, passa por área urbana, onde são realizadas as mais diversas atividades que caracterizam este tipo de ocupação - gerando uma grande diversidade de poluentes, como emissões aéreas, efluentes líquidos e resíduos sólidos que contaminam suas águas e áreas contíguas.

Desde sua nascente até o trecho mais central, o arroio foi desviado de seu curso normal e corre em grande parte por galerias cobertas. Seguindo o curso, após a área urbana, o Arroio Araçá percorre a pequena área agrícola do município, que abastece com seus produtos parte da Grande Porto Alegre. No seu trecho final, houve um aproveitamento do arroio como canal externo de macro drenagem do Dique Araçá e seu leito sofreu alterações com as freqüentes dragagens realizadas para sua limpeza. Também nesta área, o Arroio Araçá está

sendo utilizado como via de esgoto natural, sem tratamento, carregando consigo uma grande quantidade de detritos sólidos e poluentes diversos, como esgoto doméstico, industrial, agrícola e resíduo animal. Neste trecho, na área do Parque Estadual do Delta do Jacuí, localiza-se uma população invasora, que vive principalmente do aproveitamento do lixo urbano e da criação clandestina de animais.

Com este elevado grau de contaminação, o Arroio Araçá lança suas águas no Arroio das Garças, formando uma espuma negra, alterando a qualidade das águas do mais importante manancial para o município de Canoas, também utilizado para abastecer parcialmente o vizinho município de Alvorada. No seu curso, o Arroio das Garças carrega os poluentes lançados pelo Arroio Araçá até o Guaíba. A foz do Arroio Araçá chega aproximadamente 400m a montante do ponto de captação de águas da Companhia Riograndense de Saneamento (CORSAN). Também deve ser levado em conta que as águas do arroio são utilizadas para a irrigação de algumas culturas e para a criação irregular de animais pela população invasora na área do Delta do Jacuí. É igualmente significativa a degradação visual da paisagem, com formação acentuada de ambientes de acúmulo de detritos, que propiciam o desenvolvimento de micro e meso fauna nociva à saúde da população humana e a dos animais por ela manejados. Parte destes detritos é arrastada à calha do arroio pelas águas da chuva ou atirados pela população, causando assoreamento e problemas de cheias nas épocas mais chuvosas (Prochnow et al., 2006).

A investigação do grau de contaminação e o enquadramento das águas para os diversos usos, segundo as resoluções do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) é uma necessidade básica - se levarmos em conta a qualidade ambiental e de vida da população não apenas do Município de Canoas como também da Grande Porto Alegre, pois os alimentos produzidos nesta área agrícola são ali distribuídos.

Por outro lado, a qualidade das águas dos rios e arroios é extremamente influenciada pela presença de poluição ao longo de seus cursos, devido à urbanização, indústria e prática agrícola. O impacto ambiental urbano pode ser medido pela qualidade da água dos arroios que atravessam as cidades (Pelczar et al., 1997). Nesta região, as principais fontes para as emissões aéreas são o intenso tráfego e as indústrias localizadas em sua região metropolitana e o esgoto. Apesar disto, a poluição atmosférica e a dos arroios que atravessam esta região, não foi ainda devidamente caracterizada.

1.4 O Teste SMART

Dentre os bioensaios ainda pouco utilizados para avaliação do potencial genotóxico de amostras ambientais, encontra-se o teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática - SMART - em células somáticas de Drosophila melanogaster. O SMART, além de utilizar um organismo experimental eucarioto, com estreita similaridade genética e bioquímica quando comparado aos mamíferos (St. John e Xu, 1997), possibilita a detecção simultânea de mutação gênica, aberrações cromossômicas – representadas por eventos aneugênicos e

clastogênicos – e/ou recombinação somática (Graf et al., 1984; Würgler e Vogel, 1986; Vogel e Zijlstra, 1987). Permite, também, a detecção de genotoxinas de ação direta, assim como daquelas que, somente quando metabolizadas exercem sua atividade genotóxica (Graf e Singer, 1989; Frölich e Würgler, 1990; Graf e van Schaik, 1992; Delgado-Rodriguez et al., 1995).

Neste ensaio genético, a amostra a ser analisada entra em contato com as células dos discos imaginais presentes na larva, que proliferam até se diferenciarem, durante a metamorfose, em estruturas das asas da mosca adulta.

A análise dos possíveis danos causados é feita pela observação de grupos celulares (manchas) com fenótipo marcador específico (flr³ ou mwh), que se manifesta visualmente na forma de tricomas mutantes. Estes fenótipos expressam-se devido à perda da heterozigose, induzida pelos diferentes tipos de eventos genotóxicos acima referidos. Enquanto o número de manchas fornece resultados quantitativos sobre os danos induzidos, os tipos de manchas dão informações sobre a natureza da lesão que os originou. Manchas simples – que expressam apenas um dos fenótipos mutantes, flr³ ou mwh – indicam a ocorrência de mutação gênica e/ou cromossômica, assim como de eventos recombinogênicos. Por outro lado, manchas gêmeas – formadas por clones flr³ e mwh adjacentes – são originadas exclusivamente por recombinação somática (Graf et al., 1984). Também o tamanho das manchas pode nos fornecer informações valiosas, já que está correlacionado com o tempo de atuação da genotoxina ao longo da embriogênese e, desta forma, com o momento da indução do dano genético (Graf, 1995).

Aproximadamente 400 compostos – documentados em aproximadamente 100 publicações - já foram analisados através do teste SMART de asa, sendo, na sua maioria, produtos puros. Da mesma forma, misturas complexas também já foram testadas, dentre elas algumas bebidas – alcoólicas ou não – extratos de chás, diferentes tipos de cafés, vinhos e conhaque (Van Schaik et al., 1984; Graf e Würgler, 1986; Graf et al., 1992; Andrade et al., 2004). Este bioensaio foi ainda aplicado para investigar o potencial genotóxico de partículas aéreas (Graf e Singer, 1989; Delgado-Rodriguez et al., 1995; 1999). Os resultados destes estudos – que apresentaram uma boa correlação com aqueles obtidos através do Teste de Ames - demonstraram a sensibilidade do teste SMART em relação à fração orgânica de amostras ambientais (Delgado-Rodriguez et al., 1995).

O teste SMART em D. melanogaster também foi utilizado por Amaral e colaboradores (2005) para avaliar a genotoxicidade da água de superfície do Rio Caí (RS), que sofre influência urbana e industrial. O teste mostrou alta sensibilidade para detectar agentes genotóxicos presentes no ambiente aquático, apontando para respostas associadas à mutação e recombinação, devendo ser ainda melhor explorado para monitorar áreas de descarga antropogênica. O mesmo teste foi utilizado para avaliar a atividade mutagênica e recombinante da água de superfície da Região Hidrográfica do Guaíba, evidenciando que todas as respostas positivas observadas estavam relacionadas principalmente a recombinação mitótica (Amaral et al., 2006). Entretanto, pode-se dizer que o Teste SMART de asa tem sido ainda muito pouco utilizado para avaliação da genotoxicidade de amostras ambientais e, desta forma, pouco explorado como

uma ferramenta para o diagnóstico da toxicidade genética associada ao meio ambiente. Portanto, tanto sua adequação como sua sensibilidade para este fim são ainda pouco conhecidas.

1.6 Objetivos

Avaliar, através do teste SMART de asa, amostras de água superficial e de sedimento de sete pontos do Arroio Araçá que estão sob influência direta de atividade urbana, hospitalar e agrícola.

Estimar a sensibilidade e a adequação deste bioensaio como uma ferramenta para o controle da qualidade ambiental.

Capítulo ll

RECOMBINAGENIC ACTIVITY OF WATER AND SEDIMENT FROM ARAÇÁ STREAM (CANOAS, BRAZIL), IN THE Drosophila WING-SPOT TEST.

Environmental Molecular Mutagenesis, enviado

para publicação

Manuscript for Environmental Molecular Mutagenesis

RECOMBINAGENIC ACTIVITY OF WATER AND SEDIMENT FROM ARAÇÁ STREAM (CANOAS,BRAZIL), IN THE Drosophila WING-SPOT TEST.

Laura Vicedo Jacociunas¹, Rafael Rodrigues Dihl¹, Maurício Lehmann¹, Maria Luiza Reguly¹ and Heloísa Helena Rodrigues de Andrade¹.

1Laboratório da Toxicidade Genética (TOXIGEN), Programa de Pós Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada (PPGGTA) Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil.

*Correspondence: Heloísa H. R. de Andrade, Laboratório da Toxicidade Genética – ULBRA, Prédio 22, 4º andar, Avenida Farroupilha, 8001, 92420-280, Canoas, RS, Brazil.Tel/Fax: + 55 51 34779214.

E-mail:heloisa@ulbra.br

Abstract

The genotoxic activity of water and sediment samples collected in 7 different sites within the area of Araçá Stream, Canoas, RS, Brazil was evaluated in the Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) - in standard (ST) cross and high bioactivation (HB) cross flies. These sites are under the influence of untreated urban discharges (1-7), agricultural pesticide (5 and 7), hospital waste (3), animal dejects (5), small industries (4, 5 and 6) and vehicular discharges (2, 4, 5 and 6). In both ST and HB crosses all the water and sediment samples from the seven sites displayed a massive recombinagenic response, but no mutagenic activity was ascribed for any of the sites investigated. In the ST cross the surface water sample from site 5 showed the highest induction of mutant clones, followed by sites 6 and 7 - sites 5, 6 and 7 displayed 50-60% higher recombinagenic activity in relation to the HB cross. On the contrary, water samples that had the highest genotoxic potential in the HB were represented by sites 2 and 4 - sites 1, 2 and 4 induced about 30-35% more mutant clones in the HB cross when compared to the ST cross.

These three sites contain direct genotoxins and indirect ones that could be activated by the high levels of CYP6A2 present in the HB strain. All the sediment samples showed genotoxicity when compared to the distilled water control, in both ST and HB crosses in a similar magnitude.

Key Words: SMART, water, sediment, recombinagenic action

1. Introduction

Water pollution poses relevant environmental hazards, and can represent serious public health issues as well as aquatic ecosystem problem (Houk, 1992;

White et al., 1996; Claxton et al., 1998; White and Rasmussen, 1998; White and Côté, 1998). In managing river quality, not only surface water but also sediments are an important part of the ecosystem and play a key role in the distribution of contaminants in the aquatic environment. In this scenario, the study of the quality of both water and sediments provides valuable information about the ecosystem’s health.

Araçá is a small-sized river basin located integrally in the municipal district of Canoas, RS, Brazil (Figure 1). Its course is located mainly in the urban area, which includes an invading population that makes a living mainly out of urban garbage scavenging and clandestine animal breeding. The stream has been used as an open, untreated sewage canal that carries along a large amount of solid waste and diverse pollutants, such as domestic, cloacal human and animal sewages, as well as hospitalar waste and vehicular discharges. Along its course and beyond the urban area it bathes, Araçá Stream runs across a small agricultural zone in the municipality, a site in which a considerable part of the produce consumed in the Greater Porto Alegre area is grown. The highly contaminated waters of Araçá Stream flow into another water course, Garças Stream, there forming a black froth and thus altering the quality of the waters of the most important water source in the municipality of Canoas, also used as water supply to the neighboring town of Alvorada. Along its course, Garças

Stream carries the pollutants brought in by Araçá Stream upon its mouth, on Guaíba River. The Araçá Stream mouth is located approximately 400 m upstream the water pump station of Companhia Riograndense de Saneamento (CORSAN), which supplies water for more than 6 million of people (www.corsan.br).

In the current study we used the wing Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) in Drosophila melanogaster to evaluate the genotoxicity of surface waters and sediment samples from Araçá Stream. The SMART bioassay provides a means to assess the potential of complex mixtures to induce loss of heterozygosity of suitable marker genes in somatic cells, which are related to mutation and mitotic recombination. The use of two genetic markers, multiple wing hair (mwh) and flare (flr) in the third chromosome, makes it possible to discern local recombinogenic effects on two intervals: the major one linked to euchromatin and the other related to heterochromatin centromeric region. Using strains with high capacity for transforming some carcinogens into their active metabolites, SMART also detects promutagen activity. More recently, the assay was also applied to monitor the genetic toxicity of surface waters and sediments under the influence of urban and industrial discharges, allowing fast and reliable quantification of potential ability of these wastewater samples to disturb the Drosophila somatic genome (Amaral et al., 2005, 2006).

2. Material and Methods

2.1 Collection sites and sampling

In order to assess the genotoxicity of the Araçá Stream, Canoas, RS, Brazil seven monitoring sites were chosen (Figure 1). The antropogenic influence for each site is especifed in Table I.

Water and sediment samples were collected from seven different points in the course of Araçá Stream in Winter 2006. About one liter of surface water was colledted in each point, according to the recommended in Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (1985). Next, water samples were transported to the laboratory, divided into aliquots and stored at –20ºC in a freezer (Vargas et al., 1993). Sediment was collected with an appropriate collector and transported to the laboratory. Then, sediment samples were air- dried for long–term storage in opaque container at environment temperature, divided into aliquots and stored at 4ºC (Vargas et al., 2001). Fine materials were separated by sieving to guarantee similar particle size. The tests were conducted on these whole sediment, which was mixed to dry Drosophila Instant Medium (Carolina Biological Supply, Burlington, NC). Physical-chemical analysis, such as temperature, pH, conductivity, dissolved oxygen, organic mater and total solids were performed during water sampling.

2.2 Wing Somatic Mutation and Recombination Teste (SMART)

2.2.1 Strains

Parental flies used for the crosses were (i) flr³/In(3LR)TM3, ri p^p sep l(3)89Aa bx^34e e Bd^s, (ii) ORR/ORR, flr³/In(3LR)TM3, ri p^p sep l(3)89Aa bx^34e e

Bd^s, and (iii) mwh/mwh. Eggs derived from the standard (ST) cross (flr³/In(3LR)TM3, ri p^p sep l(3)89Aa bx^34e e Bd^s virgin females crossed with mhw/mwh males) and the high bioactivation (HB) cross (ORR/ORR, flr³/In(3LR)TM3, ri p^p sep l(3)89Aa bx^34e e Bd^s virgin females crossed with mwh/mwh males) were collected for 8 h on standard medium enriched with baker’s yeast. Three days later, the larvae from both the crosses were transferred to vials containing 1.5 g of dry Drosophila Instant Medium (Carolina Biological Supply, Burlington, NC) rehydrated with 5 ml of the test solutions or distilled water. The larvae were allowed to feed on these media until pupation (Andrade et al., 2004).

2.2.2. Preparation and microscopic analyses of wing

After metamorphosis, all surviving flies were stored in a 70% ethanol solution. For observation of mutant spots, the wings were removed and mounted on slides using Faure’s solution (gum arabic 30 g, glycerol 20 ml, chloral hydrate 50 g, water 50 ml). Both dorsal and ventral surfaces of the wings were analyzed under a optic microscope at 400X magnification for the occurrence of single and twin spots. Mutant clones were classified into three types: (1) small single spots, consisting of 1 or 2 mwh or flr³ cells; (2) large single spots, consisting of three or more cells; and (3) twin spots consisting of adjacent mwh and flr³ cells. This classification has been reported biologically meaningful (Graf et al., 1984). The wing spot test assays genetic changes induced in somatic cells of the wing imaginal discs lead to the formation of

mutant clones on the wing blade. Single spots are produced by somatic point and chromosomal mutation, as well as mitotic recombination occurring between the two markers. Twin spots are produced exclusively by mitotic recombination occurring between the proximal marker flr and the centromere of chromosome 3.

2.2.3 Statistical analysis

The data were evaluated according to the multiple-decision procedure described by Frei and Würgler (1988,1995). The frequencies of each type of mutant clone per fly were compared to the concurrent negative control series using the binomial test of Kastenbaum and Bowman (1970), with significance levels set at α =β = 0.05.

3.3. RReessuullttss aanndd DDiissccuussssiioonn

3.1 Physical chemical analyses

Dissolved oxygen figures were not constant along the sampling sites. The lowest value for dissolved oxygen was detected in site 1 – 1.9 mgO2/l , although at sites 4, 5, 6 and 7 lower dissolved values were also observed, being around 4 mgO2/l. Air and water temperatures were relatively constant along sites. For site 1 the pH value for water and sediment were acid, but all the other sites had values near pH 6. High levels of total solids were observed in the site 2 (305

mg/l), that can lead to eutrophication and to decrease in stream water quality (Table II).

3.2 Genetic Toxicity

In order to assess the potential hazards to human health and aquatic ecosystem, we examined the genotoxic activity of waters and sediments collected in Araçá Stream, Canoas, Rio Grande do Sul, Brazil. We monitored quantitatively the mutagenic and/or recombinagenic potency of water and sediment samples collected at seven sites, in the Drosophila SMART assay using ST cross (Table III) and HB cross (Table IV). Responses for both crosses were evaluated in the same experiment – therefore the larvae derived from both crosses were treated under identical conditions. As no water and sediment samples presented any significant differences in the responses in two experiments, the data were pooled. Whenever positive response were obtained in marker-heterozygous progeny, the balancer-heterozygous progeny was also analyzed.

In marker-heterozygous flies from the ST cross the water samples from sited 1 to 7 were genotoxic, while all these samples were negative in the balancer-heterozygous flies (Table III). Considering that the single spots detected on balancer-heterozygous progeny reflects predominantly somatic point mutation and chromosome aberration the genetic toxicity of all samples could be associated to their ability to induce mitotic recombination - since products of mitotic recombination involving the multiple inverted balancer

chromosome (TM3) and its structurally normal homologue are non-viable (Andrade et al., 2004). As seen in Table IV sites 1 to 7 displayed a significant genotoxic effect in the marker-heterozygous genotype from the HB cross. The main difference between ST and HB lies on the higher level of CYP6A2 expressed in the HB cross, which is similar to the CYP3A subfamily of humans (Ayoma et al., 1989; Campesato et al., 1997). Similarly to the ST cross, no positive data were obtained in the HB cross for the balancer-heterozygous genotype – confirming the genetic toxicity observed for all simples were not related to mutational events, but are restrict to the induction of homologous recombination in somatic cells. The Araçá Stream receives untreated urban discharges (sites 1 - 7), hospitalar waste (site 3) , animal dejects (site 5), agricultural pesticide runoffs (sites 5 and 7), small industries (sites 4, 5 and 6) – while sites 2, 4, 5 and 6 were also exposed to vehicular discharges (Figure 1).

Although all the raw water samples showed statistically significant genotoxicity results when compared to the distilled water control, in ST cross the water from site 5 - exposed to untreated urban discharges and animal dejects, agricultural pesticide runoffs, small industries and vehicular discharges – was the most damaging, as evidenced by its capacity to induce the higher frequency of mutant clones – followed by sites 6 and 7. In turn, sites 5, 6 and 7 displayed 50-60% more recombinagenic activity in relation to HB cross (Table III). In the HB cross, which preferentially detected indirect genotoxins, the highest mutant clone frequency was detected in the site 2 and 4, followed by sites 1 and 5.

The positive response produced in ST and HB crosses were similar for samples

3, 6 and 7, although the sites 1, 2 and 4 induced about 30-35% more mutant clones in the HB cross when compared to the ST cross. So, besides contaning direct genotoxins, these three sites also have indirect ones that may be activated by the high levels of CYP6A2 present in the HB strain.

The results of chronic exposure of larvae to sediment samples are summarized for ST cross in Table V and for HB cross in Table VI. A massive recombinagenic response was observed for the seven sites analyzed in both ST and HB crosses, but no mutagenic activity was ascribed for any of the sites analyzed. All the sediment samples showed genotoxicity when compared to the distilled water control, in both ST and HB crosses in a similar magnitude.

Collectively, mutagenicity evaluations of river waters provide an indication of the potential mutagenic hazard in the absence of a priori knowledge about the identity of the putative toxicants (Ohe et al., 2003).

Several studies of large rivers flowing through metropolitan areas have detected significant levels of surface water mutagenicity (Ohe et al., 2003; Isidori et al., 2004; Ohe et al., 2004). It is always debatable whether the nature of chemicals or their hazardous effects are more important in risk assessment studies. The complexity of pollutants in natural samples like ours, however, provides an edge for hazardous effects over chemical analysis. The compounds present in the river waters and sediment were not directly identified in this study, but were assessed in the study by Prochnow et al. (2006). Sites 4 ( 280 µg/m³ ) and 5 ( 70 µg/m³ ) showed high levels of total particulates, which were above those permitted by the Brazilian National Environment Council (Conselho

Nacional do Meio Ambiente – CONAMA 03/09). Statutory Instrument 357/2005 (http://www.mma.gov.br/conama). In particular, high concentrations of potentially toxic metals as mercury in air were detected in the sites 1 and 5.

For site 5, the manganese concentration has also increased anthropogenically in air and sediment exceedig the limit permitted by CONAMA - Statutory Instrument 357/2005 (http://www.mma.gov.br/conama) Considering the other sites no increases in the concentrations of these metals was observed in air, water and sediment collections. The analytical data demonstrated an alteration in the environment quality along the course of Araçá Stream, indicating a degraded environment. However, the most significant impact was ascribed to the particulate suspended in the air, specially in sites 2, 4 and 5. Site 3 is located near a hospital waste disposal area, and the sites 2, 4, 5 and 6 are located along the BR 116 highway. BR 116 is a major transportation route in the region, with a circulation of over 100,000 vehicles daily, of which 40% are trucks and buses (Prochnow et al., 2006).

Potentially toxic metals, resulting from some human activities are one the most common environmental contaminants of which several may be toxic, mutagenic, carcinogenic, and/or teratogenic agents. Metal such Mn induces mutations in bacteria, yeast , as well as transitions and transversions in random PCR mutagenesis analysis (Zakour and Glickman, 1984; Kamiya et al., 2007).

Diverse mutagenic and carcinogenic chemicals are released from anthropogenic sources as motor vehicles in the air. There are volatile organic compounds, described in the literature as characteristic contaminants of urban

areas, soils and atmospheric compartment (Imai et al., 2003; Claxton et al., 2004; White and Claxton, 2004; Petry et al., 2005). Mutagenic products can be produced from simple, non-mutagenic hydrocarbons (e.g., toluene) or combustion emission (e.g., diesel exhaust) commonly found in urban atmospheres, after exposure to reactive gases, like NO2 and O3, under photoactive conditions (Claxton et al., 2004). These derived products can be carried into the water in two ways: directly from air to water or from soil by surface runoff (Lemos et al., 2007). Chemical compounds of urban origin provide a significant contribution to the contamination of river water resulting in a potential ecotoxicological risk. Several studies have reported the presence of xenobiotics in the aquatic environment including compounds of urban origin with genotoxic activity (Vargas et al., 2001; Ohe et al., 2004; FEPAM, 2004; Tagliari et al., 2004). A previously report using the SMART assay indicated the major effect of urban discharges manifested as an increased frequency of homologous recombination (HR) (Amaral et al., 2005, 2006). The overall data suggest that the Araçá Stream waters and sediments flowing to the metropolitan region of Canoas city are contamined with direct- and indirect-acting recombinagenic toxicants, which may be related to two major environmental impacts: the domestic sewage and cloacal urban dejects, as well as airborne gases from combustion.

Published accounts of soil and water genotoxicity assessment have employed more than 30 assays to assess DNA damaging ability, mutagenicity, or clastogenicity (Ohe et al., 2004; White and Claxton, 2004). Although

much published information about surface water mutagenicity/genotoxicity were available, literature data concerning SMART as a reliable tool in the detection of toxic genetic activity in aquatic environment are scarse. The response of Drosophila melanogaster SMART strains that are sensitive to different chemical classes, coupled to its unique ability to distinguish homologous recombination (HR), and point and chromosomal mutations in proliferative somatic cells can help in the identification of the classes of genotoxicants present in surface and sediment waters.

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Figure 1: Geographic location of Araçá Stream and the diagram of the collection sites.

Table I: Contribution from the sampling sites: urban, hospitalar and vehicular emission

Sampling Site Main contamination sources

1 2 3 4

5

6

7

untreated urban discharges

untreated urban discharges and vehicular discharges*

untreated urban discharges and hospitalar dejects

untreated urban discharges, small industries and vehicular discharges *

untreated urban discharges and animal dejects, agricultural pesticide, small industries and vehicular discharges*

untreated urban discharges, small industries and vehicular discharges*

untreated urban discharges and agricultural pesticide

* from a major transportation route in the region, with a circulation of over 100,000 vehicles daily, of which 40% are trucks and buses.

Table II: Physicochemical analyses in situ.

Parameter Site 1 Site 2 Site 3 Site 4 Site 5 Site 6 Site 7 T air (°C) 13.4 12.4 12.1 11.5 10.1 8.4 10.1 T water (°C) 14.3 16.7 16.3 16.4 13.5 14.6 15.9 Dissolved Oxygen

(mgO2/l)

1.9 5.3 6.7 4.3 4.2 4.0 4.3

pH water 4.6 5.5 5.6 6.0 5.9 5.3 5.6

Organic Mater (mg/l)

32.4 17.3 17.2 16.7 17.2 12.3 15.9

Solids Total (mg/l)

237.0 305.0 199.5 229.5 208.5 131.0 112.5

pH sediment 4.5 6.5 6.5 6.2 6.7 6.2 5.7

Table III. Genotoxicity of Araçá stream water samples in the D. melanogaster wing spot test using the standard cross (ST).

Spots per fly (no. of spots)/statistical diagnosis ^a Crosses and

Genotypes

Sample Sites No. of flies (N)

Small single spots^b (1-2 cells) (m = 2)

Large single spots^b (>2 cells) (m = 5)

Twin spots (m = 5)

Total spots (m = 2)

Total mwh clones ^c (n)

Mean mwh clone size class^c,d

Clone induction frequencies (per 10⁵ cells per cell division) ^e (n/NC)^d,f

ST Cross

mwh / flr³ NC 30 0.33 (10) 0.00 (00) 0.03 (01) 0.37 (11) 11 1.27 0.82

1 1 30 0.67 (20) + 0.03 (01) i 0.03 (01) i 0.73 (22) + 22 1.45 [1.64] 1.50 [0.75]

2 2 30 0.77 (23) + 0.03 (01) i 0.03 (01) i 0.83 (25) + 25 1.40 [1.50] 1.71 [0.96]

3

3 30 0.70 (21) + 0.23 (07) + 0.03 (01) i 0.97 (29) + 29 2.21 [2.78] 1.98 [1.23]

4 4 30 0.70 (21) + 0.17 (05) + 0.00 (00) i 0.87 (26) + 26 1.65 [1.93] 1.78 [1.02]

5 5 30 1.17 (35) + 0.20 (06) + 0.10 (03) i 1.47 (44) + 44 1.70 [1.84] 2.94 [2.19]

6

6 30 1.00 (30) + 0.07 (02) i 0.00 (00) i 1.07 (32) + 32 1.31 [1.33] 2.19 [1.43]

7

7 30 0.87 (26) + 0.17 (05) + 0.00 (00) i 1.03 (31) + 31 1.68 [1.90] 2.12 [1.37]