CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA E CITOTÓXICA DE UMA FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE BOTHROPS PAULOSENSIS.

CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação

DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

2008 – UFU 30 anos

1 – Acadêmico do curso Ciências Biológicas; 2 - Acadêmico do curso Medicina Veterinária; 3 – Orientador(es). 1

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, ENZIMÁTICA E CITOTÓXICA DE UMA

FOSFOLIPASE A2 ÁCIDA ISOLADA DA PEÇONHA DE BOTHROPS

PAULOSENSIS

.

Francis Barbosa Ferreira1

Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Av. Pará, 1720, Uberlândia-MG, CEP: 38402-970

francisbbio@yahoo.com.br

Renata Santos Rodrigues3

Thomas Cardoso2

Veridiana de Melo Rodrigues Ávila3

veridiana@ingeb.ufu.br

Resumo: As fosfolipases A2 catalisam a hidrólise de fosfolipídeos, liberando como produtos ácidos

graxos livres e lisofosfolipídeos. As fosfolipases das peçonhas de serpentes são amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema,

convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras. Porém, nem todas as PLA2 induzem

todos esses efeitos. Este trabalho teve como objetivo a purificação e caracterização química e

enzimática de uma fosfolipase A2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como a avaliação

de sua ação bactericida sobre E. coli e citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). A

fosfolipase A2 isolada foi denominada de CM1b-F5. Esta enzima foi purificada por cromatografia

de troca iônica em CM-Sepharose Fast Flow seguido por filtração em Sephadex G-75 e finalizando em Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b-F5 apresentou uma massa molecular de 15.8kDa, atividade fosfolipásica de 289 U/MG. Não apresentou ação bactericida e baixa atividade citotóxica, no entanto outras linhagens celulares deverão ser utilizadas para uma análise mais criteriosa dessa ação. Novos estudos deverão ser realizados com a PLA2 ácida isolada da peçonha de Bothrops

pauloensis com intuito de obter parâmetros estruturais e funcionais que poderão contribuir para a utilização da mesma como modelo estrutural para a síntese de novos agentes terapêuticos.

Palavras-chave: fosfolipase A2; Bothrops pauloensis; citotoxicidade 1. INTRODUÇÃO

2

produzem fortes danos em tecidos biológicos, bem como a interferência em quase todas as fases da hemostase humana (Higuchi et all, 2007).

As enzimas PLA2 de peçonhas de serpentes vêm sendo amplamente estudadas devido à variedade de seus efeitos farmacológicos, como neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ativação e/ou inibição da agregação plaquetária, anticoagulação, edema, convulsão, hipotensão, hemorragia interna, dentre outras, porém, nem todas as PLA2 induzem todos esses efeitos (Francischetti et all, 1998; Kini, 2003 e Masuda et all, 2005).

As PLA2 catalisam a hidrólise especificamente na ligação 2-acil éster de fosfolipídios, liberando como produtos os lisofosfolipídios e ácidos graxos livres (Six e Dennis, 2000). Estas enzimas podem possuir um resíduo de aspartato na posição 49 (D49), ou um resíduo de lisina na mesma posição (K49). As D49 são enzimaticamente ativas e as k49 possuem baixa ou nenhuma atividade enzimática (Ownby et all, 1999 e Ketelhut et all, 2003). Existem variantes da subclasse Lys49, como Arg 49 e Ser 49 presentes em algumas PLA2s de peçonhas ofídicas já isoladas. Chijiwa et all (2006) isolaram duas PLA2s da peçonha de Protobothrops elegans que possuem um resíduo de Arg na posição 49 (Arg49), denominadas PeBP(R)-I e PeBP(R)-II, mas com alto grau de homologia com as K49 já isoladas.

As fosfolipases A2 podemser encontradas em diferentes organismos e tipos teciduais e exercerem diferentes funções. São divididas em cinco grupos principais: PLA2 secretórias (sPLA2), citosólicas (cPLA2), Ca2+ independentes, acetilhidrolases fator de agregação plaquetária (PAF-AH) e as lisossômicas, divididas de acordo com o mecanismo catalítico e suas características funcionais e estruturais. As PLA2 secretórias foram subdivididas em quatorze grupos, de acordo com o número de resíduos de aminoácidos e posição das ligações dissulfeto, sendo que as PLA2 das peçonhas de serpentes estão incluídas nos grupos I e II (Schaloske e Dennis, 2006). Essas enzimas são pequenas, com o peso molecular variando de 13 a 18 kDa, e causam destruição pela interferência nos processos fisiológicos normais da vítima (Kini, 2003).

As PLA2 e suas isoformas oferecem um grande desafio para os pesquisadores, no sentido de desvendar a sua estrutura e função. Pesquisas nesta área auxiliarão a determinar os mecanismos dos efeitos farmacológicos, bem como ampliar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação destas toxinas, seus efeitos deletérios, ou para efeitos contrários a algumas doenças importantes. Estes estudos são de extrema importância, pois podem subsidiar conhecimentos em áreas correlatas como o desenvolvimento de drogas para tratamento de vítimas de acidentes ofídicos, desordens hemostáticas, bem como para o desenvolvimento de novas drogas com ação bactericida e antitumorais. Além disso, estes estudos resultarão em inovadoras oportunidades e caminhos para encontrar respostas para a toxicidade das PLA2 e também para o desenvolvimento de proteínas com novas funções biológicas (Kini, 2003). Portanto, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar química e enzimaticamente uma fosfolipase A2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis, bem como avaliar a sua ação bactericida e citotóxica sobre a linhagem de células tumorais K-562 (leucemia).

2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material

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gel-filtração, espectrofotômetro e HPLC AKTA Prime Plus (GE Healthcare Life Science); Liofilizador (Edwards Lifesciences LLC); Coagulômetro Quick Timer (DRAKE); Plasma Bovino, obtido na fazenda experimental da Universidade Federal de Uberlândia. Os demais reagentes foram

de grau analítico.

2.3. Purificação da fosfolipase A2 ácida da peçonha de Bothrops pauloensis

A purificação da fosfolipase A2 ácida foi realizada de acordo com Rodrigues et al (2007), com modificações. Cerca de 180 mg da peçonha botrópica foram ressuspendidos em 2,0 ml de tampão bicarbonato de amônio 50 mM, pH 7.8. Em seguida a amostra foi centrifugada a 10.000xg por 10 min. a 4°C e o sobrenadante aplicado a uma coluna de troca iônica contendo a resina CM Sepharose Fast Flow (2,0 x 20,0 cm), previamente equilibrada com o mesmo tampão. A amostra foi eluída em temperatura ambiente pelo estabelecimento de um gradiente convexo de concentração usando o tampão bicarbonato de amônio nas concentrações de 0,05 a 0,5 M. Frações de 3 mL/tubo foram coletadas num fluxo de 20mL/hora. A fração com atividade fosfolipásica foi coletada e submetida em Sephadex G-75, equilibrada com um tampão AMBIC 0,05M pH 7.8. A fração ativa foi coletada e aplicada em Phenyl-Sepharose previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 10mM com 2M de NaCl, pH 8.5. A eluição procedeu à temperatura ambiente, seguido por tampão Tris-HCl 10mM, pH 8.5, com concentrações decrescentes de NaCl (1 e 0,5 M) até 10 mM de Tris-HCl pH 8.5, encerrando o processo de eluição com água.

2.4. Caracterização química

2.4.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com agente desnaturante:

As eletroforeses com agente desnaturante (SDS) foram realizadas segundo a técnica descrita por Laemmli (1970). Esta técnica foi realizada para a identificação, estimativa da massa molecular e análise do grau de pureza da toxina de interesse.

2.5. Ensaios Enzimáticos

2.5.1. Atividade Fosfolipásica (PLA2)

Essa atividade foi determinada por titulação potenciométrica segundo o método descrito por De Haas et all (1968). Como substrato foi utilizada uma emulsão de gema de ovo em presença de deoxicolato de sódio 0,03 M e CaCl2 a 0,6 M. Os ácidos graxos liberados enzimaticamente foram titulados com uma solução padrão de NaOH 0,1208N em pH 8,0 e temperatura ambiente. A atividade fosfolipásica foi expressa em microequivalentes de base consumida por minuto e a atividade específica pelo número de µequivalentes de base consumida por minuto, por mg de proteína. Para cada ensaio foram utilizados 10 µg de proteínas.

2.5.3. Atividade bactericida

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horas de incubação a 37oC sem agitação, a densidade óptica foi monitorada em espectrofotômetro (Leitor de microplacas Camberra-Packard) utilizando-se o filtro de interferência de 600nm.

2.6. Ensaios de Citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em colaboração com a Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Foram utilizadas células tumorais K-562 (leucemia), fornecidas pelo Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás UFG e células normais humanas Human foreskin fibroblasts HFF (fibroblasto), fornecidas pelo Laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Uberlândia.

2.7. Meio de cultura celular para células tumorais

Para a manutenção da linhagem de células tumorais, a dissolução da toxina testada e a realização dos ensaios de citotoxicidade, seguiram-se o protocolo do ATCC (American Type Culture Collection), utilizando meio RPMI 1640 suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB), 20 mM de L-glutamina, 7,5% de bicarbonato de sódio e 10µg/mL de gentamicina (meio completo). Este meio foi preparado na hora do uso e esterilizado por filtração em membranas de 0,22µm. Como controle negativo foi utilizado o meio RMPI 1640 com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino.

2.8. Atividade citotóxica

Como controle positivo, foi utilizada a droga ciclofosfamida, diluída em meio incompleto em concentração de 5mg/mL. A ciclofosfamida é um fármaco antineoplásico com amplo espectro de ação antitumoral, utilizada também como alternativa na supressão da rejeição imunológica dos órgãos transplantados (Craig e Stitzel, 1996).

Para avaliar a atividade citotóxica da toxina foi utilizado o método colorimétrico com 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio), o MTT. O princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Quando as células estão vivas as desidrogenases mitocondriais são capazes de agir sobre substratos como o MTT levando a quebra dessa molécula e a redução desta, formando assim o Azul de Formazan. Portanto, quanto maior a viabilidade celular em uma determinada amostra, mais Azul de Formazan é formado. O Azul de Formazan é solubilizado com Dodecilsulfato de Sódio (SDS) ou Isopropanol em meio ácido.

A leitura da quantidade de Azul de Formazan foi medida através de espectofotometria, utilizando-se filtro de interferência de 550 nm.

Para avaliar a ação da toxina, foram plaqueadas 2x105 células em microplacas de 96 poços. Após o plaqueamento, as células foram tratadas com 100 µL de toxinas nas concentrações descritas acima e incubadas por 24h em estufa a 37°C contendo 95% de ar e 5% CO2. Ao fim da incubação, foram adicionados aos poços de cultivo celular, 10 µL de MTT na concentração de 5mg.mL-1. A placa foi novamente incubada e após 3 horas foram adicionados 50 µL SDS 10% HCL 0,01 N.

A atividade citotóxica foi avaliada como a capacidade de inibir a proliferação das células.

3. RESULTADOS

3.1. Isolamento da PLA2 e Caracterização Química

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eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% com SDS foi realizada para verificar o grau de pureza das proteínas presentes em cada fração. A fração CM1 é constituída pela maioria dos componentes presentes no veneno total, já a fração CM4 e CM5 apresentam um bom grau de pureza, mas necessitam de novas etapas de purificação. A fração CM1 apresentou alta atividade fosfolipásica (Tabela 1) e foi recromatografada em uma coluna contendo a resina Sephadex G-75, resultando em 3 frações principais, denominadas CM1a, CM1b e CM1c (Figura 1b). A fração CM1b apresentou atividade PLA2 (Tabela 1) e foi aplicada em Phenyl-Sepharose CL-4B, resultando em 6 novas subfrações, denominadas CM1b-F1 a F5 (Figura 1c). A homogeneidade da fração CM1b-F5 foi mostrada por PAGE-SDS (Figura 5). A proteína purificada consiste em um polipepitídeo de cadeia única, com massa molecular de aproximadamente 15.800 Da.

A B

C D

Figura 1: Processos de purificação da PLA2 da peçonha de B. pauloensis. A) Cromatografia em

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Foi avaliada a recuperação protéica nos diferentes passos cromatográficos em relação à quantidade total de proteína aplicada em cada fracionamento, bem como a atividade fosfolipásica das mesmas (Tabela 1). No primeiro fracionamento, em CM-Sepharose, obteve-se um rendimento protéico de aproximadamente 22% para a fração CM1 e uma recuperação da atividade fosfolipásica de 45,15%, para a mesma fração. No segundo passo cromatográfico, Sephadex G-75, a fração com atividade fosfolipásica, CM1b, teve um rendimento protéico e recuperação da atividade fosfolipásica de 41% e 25,62%, respectivamente. No terceiro fracionamento, em Phenyl-Sepharose, o rendimento protéico foi de 1,82% e a recuperação da atividade fosfolipásica foi de 40,29% para a fração CM1b-F5 (PLA2 ácida).

Tabela 1: Rendimento protéico do fracionamento da peçonha bruta de Bothrops pauloensis e atividade fosfolipásica.

3.2. Caracterização Enzimática

3.2.1. Comparação da atividade fosfolipásica durante as etapas de purificação

A atividade fosfolipásica foi determinada em triplicata por titulação potenciométrica. Podemos observar que houve uma queda de atividade da fração CM1 para a CM1b, porém, em comparação com a fração CM1b-F5, esta atividade aumentou satisfatoriamente (Figura 2). A atividade da fração CM1b-F5 é quase 5 vezes maior do que a atividade da peçonha bruta.

7 0.001 0.01 0.1 1.0 10.0 100.0 C+ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 PLA2 (mg.ml-1) In ib iç ã o d e P ro li fe ra ç ã o ( % ) C- 0.001 0.01 0.1 1.0 10.0 100.0 C+ -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 PLA2 (mg;mL-1) In ib iç ã o d e P ro li fe ra ç ã o ( % ) 3.3. Atividade Citototóxica

A figura 3a apresenta a atividade citotóxica da PLA2 ácida sobre células tumorais K-562 (leucemia). Como pode ser observado a PLA2 apresentou baixa citotoxicidade quando comparado com o controle positivo ciclofosfamida. Surpreendentemente, nas concentrações extremas testadas (0,001mg/mL e 100mg/mL) essa inibição foi mais satisfatória, cerca de 20% de inibição da proliferação. Quando testada sobre células normais HLL (fibroblastos) a PLA2 foi capaz de induzir a proliferação celular de uma forma dose dependente (Figura 3b).

A B

Figura 3: Atividade antitumoral: A) Inibição da proliferação de células K562 induzida por diferentes concentrações da PLA2 ácida de B. pauloensis. B) : Inibição da proliferação de fibroblastos (Human foreskin fibroblasts HFF) induzida por diferentes concentrações da PLA2 ácida

de B. pauloensis.

4. DISCUSSÃO

As PLA2s representam uma classe de enzimas versáteis, considerando sua função, localização, regulação, mecanismo de ação, seqüência, estrutura e papel dos íons metálicos bivalentes. Durante os últimos 20 anos houve um grande interesse em se estudar estas toxinas, resultando no isolamento e caracterização estrutural e funcional de várias PLA2.

A grande maioria das PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes botrópicas, descritas até agora, são proteínas de caráter básico, ponto isoelétrico variando entre 7.0 e 10.0, que possuem atividade catalítica ou “não”, sobre substratos artificiais. As análises da composição em aminoácidos indicaram que essas toxinas são ricas em aminoácidos básicos e hidrofóbicos (Homsi-Brandeburgo et all, 1988; Selistre et all, 1990; Lomonte et all, 1990 ; Mancuso et all, 1995 e Angulo et all, 1997). Apresentam também um alto número de resíduos de meia-cistina, o que sugere a presença de várias pontes dissulfeto intracadeia. As PLA2s tóxicas são muito estáveis, provavelmente como resultado da extensa ligação cruzada, tornando-as ativas em uma ampla faixa de pH e temperatura. Entretanto, várias PLA2s ácidas também já foram isoladas das peçonhas botrópicas, como por exemplo: SIIISPIIA, SIIISPIIB, SIIISPIIIA e SIIISPIIIB por Ketelhut et al. (2003); P1, P2 e P3 por Daniele et all (1995). Da peçonha de B. pauloensis já foram isoladas várias PLA2s. Duas fosfolipases A2 Asp-49 (Rodrigues et all, 2004), duas miotoxinas Lys-49, BnSP-6 e BnSP-7 (Rodrigues et all, 1998) e uma fosfolipase A2 ácida (Rodrigues et all, 2007).

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utilização deste método, que combina cromatografias de troca iônica, gel-filtração e interação hidrofóbica, conseguimos um alto grau de pureza da PLA2 (CM1b-F5) de interesse (figura 7). No entanto, comparando nossos resultados com Rodrigues et all (2007) concluímos que o rendimento protéico não foi tão satisfatório, mas a recuperação da atividade PLA2 foi maior (Tabela 1).

O primeiro fracionamento, em CM-Sepharose, indica que a PLA2 é uma proteína ácida, pois estava presente na primeira fração denominada CM1. Esta fração continha as enzimas com carga negativa, ou seja, que não interagiam com a resina. Rodrigues et all (2007) determinou o pI da PLA2 ácida de B. pauloensis em torno de 4,34. A massa molecular da PLA2 estimada por SDS-PAGE é aproximadamente 15.800 Da, valor também encontrado por Rodrigues et all (2007). Este valor está dentro da faixa de massa molecular (13.000 a 18.000) encontrada para as fosfolipases A2 já purificadas e caracterizadas (Kini, 2003).

A atividade específica aumentou significativamente da peçonha bruta para a fração CM1b-F5, 63 U/mg e 289 U/mg, respectivamente. Porém, pode-se observar que a atividade caiu, quando comparadas as atividade das frações CM1 e CM1b.

De acordo com Villalobos et all (2007), algumas fosfolipases A2 são capazes de induzir a citotoxicidade, bem como o rompimento de membranas bacterianas. Neste trabalho foi avaliada a atividade bactericida sobre Escherichia coli e citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia) e fibroblastos (Human foreskin fibroblasts - HFF). Esta enzima não foi capaz de induzir atividade bactericida (resultados não apresentados) e induziu uma baixa atividade antitumoral (Figura 8).

A ação antitumoral de venenos de serpentes tem sido alvo de várias pesquisas atualmente. Muitos desses efeitos são induzidos por PLA2s básicas cuja ação citotóxica independe da atividade catalítica dessas enzimas (Stabeli et all, 2006). A ação antitumoral de PLA2s ácidas isoladas de venenos de serpentes ainda não foi demonstrado, embora no presente estudo verificamos uma discreta ação citotóxica sobre células tumorais K-562 (leucemia). Novos estudos com outras linhagens celulares deverão ser realizados para se verificar o potencial antitumoral dessa toxina.

Estudos na área de purificação e caracterização funcional de toxinas animais abrem perspectivas para a utilização das mesmas como modelos moleculares para a síntese de novos agentes terapêuticos que poderão ser utilizados na terapia do câncer.

5. AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Nós agradecemos ao Prof. Dr. Luís Ricardo Goulart (INGEB-UFU) e a Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda (UFG) pela colaboração nos ensaios de atividade citotóxica.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CHEMICAL, ENZIMATIC AND CITOTOXIC CHARACTERIZATION OF A

ACID PHOSPHOLIPASE A2 ISOLATED FROM BOTHROPS PAULOENSIS

SNAKE VENOM.

Federal University of Uberlândia, Institute of Genétic and Biochemistry, Av. Pará, 1720, CEP: 38402-970, Uberlândia-MG, Brazil.

francisbbio@yahoo.com.br

Renata Santos Rodrigues3

Thomas Cardoso2

Veridiana de Melo Rodrigues Ávila3

veridiana@ingeb.ufu.br

Abstract: The phospholipases A2 catalyse the phospholipids hydrolysis, releasing free fat acids and

lisophospholipids. The snake venom phospholipases are widely studied due to the variety of their pharmacological effects as neurotoxicity, miotoxicity, cardiotoxicity, activation or inhibition of the platelet aggregation, anti-coagulation, edema, convulsion, hypotension, interns hemorrhage, among other. However, nor all of PLA2 induce all those effects. This work had as objective the

purification and chemical and enzymatic characterization of an acid phospholipase A2 of Bothrops

pauloensis snake venom, as well as to evaluate its bacteriolytic and cytotoxic action on E. coli and

K-562 (Leukemic) tumor cells, respectively. The isolated phospholipase A2 was denominated

CM1b-F5. This enzyme was purified by CM-Sepharose Fast Flow ionic exchange chromatography following by filtration on Sephadex G-75 and finally on Phenyl Sepharose CL-4B. CM1b-F5 showed molecular mass of 15.8kDa, phospholipasic activity of 289 U/mg and indirect hemolytic activity. It did not showed bactericidal effect and induced little antitumor effect on K-562 cells. However other cellular lineages should be used for a more discerning analysis of this action. New

studies should be carried out with isolated acid PLA2 of the Bothrops pauloensis snake venom with

intention of obtaining new structural and functional parameters that will can be able to contribute to the use of the same ones as structural model for the synthesis of new therapeutic agents.