PRODUÇÃO DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO) POR Cupriavidus necator EM PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO COM PULSO DE GLICEROL
Bruna R. Sombrio, Tamiris Schoereder, Michele C.F. Garcia, Giannini P. Apati, Andréa L.S.
Schneider e Ana Paula T. Pezzin
Laboratório de Biopolímeros - Universidade da Região de Joiniville – UNIVILLE Rua Paulo Malschitski, 10 Joinville Bom Retiro - SC
*anapezzin@yahoo.com.br
RESUMO
O poli(3-hidroxibutirato), PHB, é um poliéster natural e biodegradável, produzido e acumulado como reserva energética por diversos micro-organismos. É considerado um atrativo substituto para os polímeros petroquímicos, devido a vantagem de ser degradado no solo em poucos meses pela ação de micro-organismos. Em decorrência da política nacional de adição de biodiesel nos combustíveis fósseis o glicerol, principal subproduto do biodiesel, está sendo produzido em larga escala, sendo necessário encontrar utilizações comerciais para essa produção. Uma delas é sua utilização como fonte de carbono no cultivo de micro-organismos. O objetivo deste trabalho foi sintetizar PHB a partir do cultivo da bactéria Cupriavidus necator tendo glicerol como cosubstrato. Após o cultivo, foram preparados filmes de PHB e caracterizados por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e análise termogravimétrica (TGA) e verificou-se que não houve modificação das propriedades dos filmes de PHB obtido em meio contendo glicerol.
Palavras-chave: P(3HB), Cupriavidus necator, glicerol.
INTRODUÇÃO
A elevada utilização de materiais poliméricos vem crescendo nos últimos anos devido às suas características, tais como, durabilidade, facilidade de processamento e resistência à biodegradação. No entanto, esse fato é preocupante, pois a maioria dos plásticos convencionais são produzidos a partir de derivados do petróleo, um recurso não renovável. O uso de polímeros biodegradáveis vem despertando interesse de pesquisadores de todas as áreas, devido à diversidade de suas aplicações nos campos da biotecnologia, medicina, farmácia e agricultura, em produtos de rápido descarte, como barbeadores, embalagens de cosméticos, copos e talheres plásticos [1, 2]. Os polímeros biodegradáveis possuem propriedades que se assemelham aos de origem petroquímica, além de serem degradados no solo pela ação de micro-organismos em poucos meses, sendo transformados em água e gás carbônico [3].
polihidroxialcanoatos (PHAs). O termo PHA constitui uma classe de poliésteres que são produzidos por diversas bactérias e acumulados na forma de grânulos intracelulares de reserva de carbono, energia e equivalentes redutores [4]. Cupriavidus necator é o micro-organismo mais atraente para a produção industrial por acumular mais de 80% de sua massa celular em P(3HB), poli(3-hidroxibutirato), com alta massa molar, utilizando diferentes substratos [5] como a glicose ou a frutose (espécie mutante), [6], glicerol [7], óleos vegetais [8], também a partir de um efluente rico em ácido graxo obtido da produção de azeite de oliva [9]. O acúmulo de PHA, na forma de grânulos, em C. necator geralmente ocorre quando existe excesso de fonte de carbono e limitação de algum nutriente essencial à multiplicação das bactérias.
Trata-se de uma síntese que ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, na maioria dos micro-organismos, procura-se favorecer ao máximo o crescimento celular e assegurar, ao mesmo tempo, que a síntese do polímero seja a menor possível.
Inversamente, na segunda etapa, interrompe-se o crescimento celular e estimula-se ao máximo o acúmulo de polímero nas células [10].
O P(3HB) possui propriedades que se assemelham às do polipropileno (poliéster de origem petroquímica). No entanto suas aplicações são limitadas, pois trata-se de um material rígido e quebradiço [1], que apresenta também maior grau de cristalinidade em relação aos copolímeros de PHAs. O alto custo de produção dos PHAs, também tem limitado seu uso para a grande maioria das aplicações.
Aproximadamente 45 % dos custos totais de produção podem ser atribuídos à matéria prima, na qual a fonte de carbono é a mais consumida, portanto torna-se interessante o desenvolvimento de processos de produção baseados em fontes de carbono residuais. Por outro lado, o crescimento da produção de biodiesel, na qual o principal coproduto é o glicerol, tem gerado um excedente deste composto levando, consequentemente, a um decréscimo no seu preço de venda.
Diante deste contexto, a presente proposta tem como objetivo a produção de poli(3-hidroxibutirato) a partir de Cupriavidus necator tendo açúcar invertido como fonte de carbono na concentração inicial de 30 g L-1 com pulso de glicerol em diferentes estratégias de cultivo, para em seguida avaliar as propriedades destes polímeros por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria diferencial exploratória (DSC).
MATERIAL E MÉTODOS
Foi utilizada a bactéria mutante Cupriavidus necator DSM 545 e meio mineral como meio de cultivo [1]. Todos os ensaios foram conduzidos com a mesma concentração de meio mineral e substrato (30 g L-1 de açúcar invertido). Foram realizados três experimentos diferentes nas seguintes condições: cultivo sem adição de glicerol (SG); cultivo com adição de 20 g L-1 de glicerol puro na fase de produção do polímero (AG-FP) e cultivo com adição de 20 g L-1 de glicerol puro no início do cultivo (AG-IC). Sempre que a concentração de substrato se aproximava de 10 g L-1, foi feito pulso de açúcar a partir de uma solução a 500 g L-1, de forma a permitir que a concentração de açúcar no meio retornasse ao valor inicial (30 g L-1). A extração de P3(HB) foi realizada usando-se um novo método adaptado por Garcia (2006) [11]. Após, o P3(HB) foi purificado em n-hexano. Filmes de P3(HB) foram preparados por casting e secos em estufa a vácuo por 24 h a 30 ºC. FTIR foi realizado em equipamento Perkin Elmer Frontier, entre 4000-650 cm-1, utilizando o método ATR.
As medidas no DSC foram realizadas em equipamento da TA Instruments. As amostras foram aquecidas, sob atmosfera de nitrogênio, de 25 a 190 °C a 10 °C min-
1, resfriadas a -100 °C e aquecidas de -100 a 190 °C a 10 °C min-1. As análises de TGA foram realizadas em um equipamento TA Instruments, aquecidas de 25 a 600
°C a 10 ° C min-1, sob atmosfera de nitrogênio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Calorimetria Exploratória Diferencial
Os dados obtidos das curvas de DSC em diferentes condições referentes ao primeiro e segundo aquecimentos estão sumarizados na Tab. 1. Observa-se que a temperatura de fusão (Tm) não sofreu alteração significativa em função da condição de cultivo testada. Os valores de Tm encontrados foram 171,8 °C para a amostra SG, 173,4 °C para AG-FP e 172,7 °C para AG-IC. Lima (2004) [12] relata que a Tm do P(3HB) geralmente oscila entre 170 e 180 °C, portanto todos os polímeros obtidos estão dentro da faixa esperada para o P(3HB). A temperatura de transição vítrea (Tg) obtida para as diferentes amostras de P(3HB) oscilaram de -13,9 a -7,6 °C,
polímero, que varia entre −5 e 5 ºC . O grau de cristalinidade (αc) para o P(3HB) foi calculado através da razão entre a variação do calor de fusão das misturas pela variação do calor de fusão dos polímeros 100% cristalinos, utilizando ΔHmº para o P(3HB) 100% cristalino igual a 146 J g-1. O grau de cristalinidade determinado para as três amostras foi 63,4 % para SG, 64,3 % para AG-FP e 59,9 % para AG-IC, valores que estão de acordo com a literatura especificada para o P(3HB). Segundo Khanna e Srivastava (2005) [14] o grau de cristalinidade do P(3HB) varia entre 60 e 80%.
Tabela 1. Dados de temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de fusão cristalina (Tm), entalpia de fusão (ΔHm) e grau de cristalinidade (αc) para os polímeros sintetizados sem glicerol (SG) e com adição de glicerol puro na fase de produção (AG-FP) e no início do cultivo celular (AG-IC).
Amostra Tg (°C) Tm (°C) ΔHm (J g-1) αc (%)
SG -13,9 171,8 90,2 63,4
AG-FP -7,6 173,4 91,3 64,3
AG-IC -8,7 172,7 85,1 59,9
Espectroscopia no Infravermelho
Os espectros de FTIR dos polímeros em diferentes condições estão apresentados na Fig. 1. Todas as amostras apresentaram os mesmos picos, característicos do P(3HB): deformações axiais simétrica e assimétrica da ligação C- H em 2976 e 2934-2935 cm-1, deformações axiais da carbonila (C=O) em 1719 cm-1, pico atribuído à vibração da carbonila do grupo éster no estado cristalino (XU et al., 2002) [15] e deformação angular simétrica no plano dos grupos CH3 em 1379 cm-1. Foram observados ainda picos em 1275 e 1053-1054 cm-1, atribuídos aos estiramentos simétricos e assimétricos, respectivamente, do grupo C-O-C. Estes picos também foram observados por Apati (2012) [16] e Garcia (2006) [11].
Figura 1. Espectros de FTIR para os filmes de P(3HB) para as amostras SG; AG-FP e AG-IC.
Análise Termogravimétrica
A Tabela 2 mostra os dados obtidos das curvas TG e DTG. Pode-se observar que todos os polímeros sintetizados apresentaram apenas um estágio de perda de massa, atribuído à decomposição do P(3HB), com valores de 91,2 % para SG, 96,9
% para AG-FP e 100 % para AG-IC. Os polímeros apresentaram Tonset de 211,5 °C para a amostra SG; 222,2 °C para AG-FP e 218,9 °C para AG-IC, evidenciando menor estabilidade térmica em relação ao valor encontrado por Vogelsanger et al.
(2004) [17] para P(3HB) industrial que foi de 264,7 °C. A temperatura de degradação máxima apresentada pelas amostras foi de 234,6 °C para SG, 246,9 °C para AG-FP e 243 °C para AG-IC. Estes valores também foram inferiores aos encontrado por Duarte (2004) [18] para o P(3HB) com massa molar igual a 240.000 g mol-1, que apresentou Tonset = 269,6 °C e Tmáx = 288,1 °C. No entanto, Apati (2012)
[15] já havia observado valores inferiores de estabilidade térmica tanto para P(3HB) sintetizado tendo apenas açúcar invertido como fonte de carbono (Tonset = 242,8 °C e Tmáx = 256,3 °C), quanto para o polímero sintetizado com açúcar invertido e 15 g L-1 de glicerol puro adicionado como cosubstrato (Tonset = 242,7 °C e Tmáx = 254, 2 °C).
Amostra % perda de massa Tonset (°C) Tmáx (°C)
SG 91,2 211,5 234,6
AG-FP 96,9 222,3 246,9
AG-IC 100 218,8 243,0
CONCLUSÃO
Neste trabalho P(3HB) foi sintetizado em diferentes condições de cultivo com o objetivo de avaliar as propriedades do polímero obtido. Os resultados demonstraram que as condições de cultivo com e sem adição de glicerol favoreceram a biossíntese de P(3HB) com temperatura de fusão muito próxima à reportada na literatura e temperatura de transição vítrea um pouco abaixo da faixa especificada para o P(3HB). As amostras também apresentaram temperatura máxima de degradação e estabilidade térmica um pouco inferior ao resultado encontrado por outros autores, fato que pode limitar suas aplicações industriais.
AGRADECIMENTOS
À CAPES e ao Fundo de Apoio a Pesquisa/UNIVILLE pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
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TÍTULO EM INGLÊS
ABSTRACT
Plastics develop an important role in society and a part of this material is rapidly dropped, but the degradation is slower. The use of biodegradable polymers has attracted interest from researchers in all areas due to the diversity of its applications. In this context, Cupriavidus necator was cultivated in a batch process in a bioreactor fed with 30 g L-1 invert sugar as the carbon source and the addition of glycerol as a co-substrate in the concentration of 20 g L-1. After culture, films were prepared from P
Keywords: P(3HB), Cupriavidus necator, glycerol.
