Impacto da Diabetes na Indução da Transição de Permeabilidade Mitocondrial [53]

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R E S U M O A diabetes é uma das doenças metabólicas mais comuns nos dias de hoje. Alterações cardiovasculares estão associadas ao desenvolvimento das várias formas de diabetes. Existe uma grande controvérsia sobre a maior ou menor resistência do coração diabético à isquemia-reperfusão. A mitocôndria cardíaca poderá ser fundamental para a diferencial susceptibilidade do cardiomiócito a fenómenos patológicos, nomeadamente devido a um processo degenerativo denominado transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), induzido por acumulação excessiva de cálcio no interior da mitocôndria. Este fenómeno tem sido associado à disfunção celular decorrente da isquemia seguida de reperfusão.

Neste trabalho, utilizando um modelo animal para a diabetes tipo 2, o rato Goto-Kakizaki (GK), mostrámos que mitocôndrias cardíacas isoladas de ratos diabéticos têm um maior capacidade de acumulação de cálcio antes do desenvolvimento da transição de permeabilidade mitocondrial. Este facto traduziu-se numa maior capacidade para suster múltiplos pulsos de cálcio adicionados externamente, em simultâneo com manutenção do potencial eléctrico transmembranar e reduzida amplitude de entumescimento mitocondrial. Isto poderá significar que cardiomiócitos de corações diabéticos tenham menor propensão para sofrerem disfunções dependentes de fenómenos de isquemia-reperfusão, pelo menos em formas mais ligeiras de diabetes, o que explica muitos casos apresentados na literatura.

A RTIGO O RIGINAL C ONCISO

Impacto da Diabetes na Indução da Transição de Permeabilidade Mitocondrial

^[53]

PAULOJ. OLIVEIRA, ANABELAP. ROLO, RAQUELSEIÇA, VILMASARDÃO, PEDROMONTEIRO, LINOGONÇALVES, LUÍSPROVIDÊNCIA, CARLOSM. PALMEIRA, MARIAS. SANTOS, ANTÓNIOJ. M. MORENO

Centro de Neurociências de Coimbra, Unidade de Investigação Básica em Cardiologia, Universidade de Coimbra Centro de Neurociências de Coimbra, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra

Serviço de Cardiologia, Unidade de Investigação Básica em Cardiologia, Hospitais da Universidade de Coimbra

759

A B S T R A C T

Impact of Diabetes on Induction of the Mitochondrial Permeability Transition Diabetes is one of the most common metabolic diseases of our times. Specific cardiovascular alterations are often associated with the progression of this disease. Considerable controversy exists in the literature concerning the greater or lesser susceptibility of the diabetic heart to

ischemia and reperfusion. Cardiac mitochondria may be fundamental to the differential susceptibility of the

cardiomyocyte to pathologic phenomena, particularly those due to the induction of the degenerative process known as the

mitochondrial permeability transition (MPT), which is triggered by excessive

mitochondrial calcium accumulation. The MPT has been associated with cellular dysfunction resulting from ischemia and reperfusion.

The objective of this work was to examine the susceptibility of mitochondria isolated from diabetic rats to the MPT, in comparison to healthy control rats of the same age.

Cardiac mitochondria from the diabetic rats had higher calcium loading capacity before the development of the MPT, with a decreased incidence of MPTP-associated features. This was associated with a greater capacity to sustain multiple pulses of externally added calcium, simultaneously with maintenance of the transmembrane electrical potential and reduced swelling amplitude.

This could mean that cardiomyocytes from

Recebido para publicação: Novembro de 2001 • Aceite para publicação: Fevereiro de 2002 Received for publication: November 2001 • Accepted for publication: February 2002

Rev Port Cardiol 2002; 21 (6) : 759-766

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INTRODUÇÃO

A

diabetes é uma desordem metabólica ca- racterizada por níveis elevados de glicose no sangue. Na prática clínica, dois tipos de diabetes estão caracterizados: os pacientes com diabetes tipo 1 estão totalmente dependentes de insulina externa, enquanto que os pacientes portadores de diabetes tipo 2 habitualmente não têm essa dependência. Várias alterações cardiovasculares foram já descritas durante o curso da doença. Ao nível metabólico, a prin- cipal consequência é um incremento na oxida- ção de ácidos gordos. Alterações vasculares re- sultantes da diabetes poderão resultar no desenvolvimento de placas ateroscleróticas. No que concerne à resistência do coração diabé- tico à isquémia seguida de reperfusão do mio- cárdio, as opiniões dividem-se. Provas existem de que o miocárdio diabético é mais sensível aos danos induzidos por isquémia-reperfusão⁽¹⁾. No entanto, outros trabalhos existem demons- trando precisamente o contrário⁽²⁾. Os motivos para tais diferenças ainda não foram explora- dos. A mitocôndria cardíaca, como fonte prin- cipal da energia utilizado pelo coração, poderá desempenhar um papel importante, não só na sobrevivência do cardiomiócito à isquémia seguida de reperfusão⁽³⁾, como também na maior ou menor sensibilidade do coração diabético a essa condição. Neste capítulo particular, toma especial importância um fenómeno conhecido por transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), causada pela formação e abertura de poros proteicos na membrana interna mitocondrial, os poros transitórios de permeabilidade mitocondrial (PTPM). Apesar de ainda ser um assunto muito discutido na literatura, existe algum consenso sobre o que poderá iniciar essa condição. Sabe-se que a entrada maciça de cálcio para o interior da mitocôndria, associada a um incremento da geração de espécies reactivas de oxigénio no interior daquele organelo pode levar à formação dos PTPM, rom-

760

INTRODUCTION

D

iabetes mellitus is a metabolic disorder characterized by high blood glucose levels.

There are two types distinguished in clinical practice: patients with type 1 diabetes are completely dependent on exogenous insulin, while those with type 2 do not have such a de- pendence. Various cardiovascular alterations that occur during the course of the disease have been described. At the metabolic level, the main consequence is increased oxidation of fatty acids. The vascular repercussions of diabetes may result in the development of athe- rosclerotic plaques. Opinions are divided concerning the resistance of the diabetic heart to myocardial ischemia followed by reperfusion.

There is evidence that diabetic myocardium is more sensitive to injury caused by ischemia and perfusion⁽¹⁾; however, other studies have shown precisely the opposite⁽²⁾. The reasons for such different findings have yet to be investi- gated. Cardiac mitochondria, as the major source of energy used by the heart, may play an important part not only in the survival of cardiomyocytes undergoing ischemia and reperfusion⁽³⁾, but also in the greater or lesser sensitivity of the cardiomyocytes from the diabetic heart to this condition. On this subject, of particular importance is the phenomenon known as the mitochondrial permeability transition (MPT), which is caused by the formation and opening of protein pores, the so-called mitochondrial permeability transition pores (MPTPs), in the inner membrane of the mitochondrion. While this issue is still a subject of debate in the literature, there is some agreement on what might trigger this condition. It is known that a massive influx of calcium into the mitochondrion, together with increased generation of reactive oxygen species in the interior of the organelle, can lead to the formation of MPTPs, disrupting the normal (and neces- sary) impermeability barrier of the mitochon-

diabetic hearts may indeed be less prone to dysfunctions resulting from ischemia and reperfusion, at least in milder diabetic conditions, thus explaining many reports in the literature.

Palavras-Chave Mitocôndria; Diabetes; Rato Goto-Kakizaki;

Isquemia-reperfusão

Key words

Diabetes; Mitochondria;

Mitochondrial permeability transition; Ischemia/reperfusion

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pendo a barreira de impermeabilidade caracte- rística (e necessária) da membrana interna mitocondrial (para uma revisão, ver⁽⁴⁾). Algum consenso existe também sobre as possíveis consequências para o cardiomiócito da TPM. A abertura dos PTPM provoca a despolarização mitocondrial, perdendo este organelo a capacidade de produção de energia e a capacidade de tomada de cálcio. Muito frequentemente, a TPM está também associada a um aumento de volume mitocondrial, causando um rompimento da membrana externa e podendo mesmo levar à apoptose (ou, em última análise, a necrose) do cardiomiócito, por libertação de factores apoptóticos, como o citocromo c⁽⁵⁾. A susceptibilidade à TPM já foi relacionada com a maior ou menor susceptibilidade do tecido cardíaco à isquémia-reperfusão⁽⁶⁾.

Desta forma, utilizámos um modelo animal para a diabetes tipo 2, o rato Goto-Kakizaki (GK), comparando a susceptibilidade à TPM de mitocôndrias cardíacas isoladas destes ratos com mitocôndrias cardíacas de ratos Wistar controlo da mesma idade. O objectivo deste trabalho foi o de verificar qual dos dois tipos de mitocôndrias possuía uma maior resistência à TPM cardíaca, extrapolando esse resultado para uma maior ou menor resistência do tecido cardíaco diabético aos danos por isquémia-reperfusão.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos GK (26 semanas) foram obtidos na nossa colónia a partir da colónia original da Tohoku University School of Medicine (Sendai, Japão). Como controlo utilizaram-se ratos Wis- tar da mesma idade. À altura do sacrifício, os ratos GK possuíam hiperglicémia (277,4±15,8 mg/dl), quando comparados com ratos Wistar (105,4±3,0 mg/dl) (n=5 em cada grupo, p<0,001). Mitocôndrias cardíacas de ratos de ambos os grupos foram isoladas por centrifuga- ção diferencial, como descrito previamente⁽⁷⁾. O potencial eléctrico transmembranar (∆Ψ) mitocondrial é utilizado pela mitocôndria não só para a síntese de energia, como para a acu- mulação activa de cálcio, entre outras funções.

O decréscimo do ∆Ψ associado à abertura do PTPM foi seguido como um eléctrodo selectivo a TPP⁺, um catião muito utilizado neste tipo de medições⁽⁷⁾. O aumento de volume da mito- côndria que normalmente segue a indução da TPM foi seguido espectrofotometricamente pela monitorização da turbidez (a 540 nm) de uma suspensão mitocondrial. Um aumento de vo-

lume mitocondrial provoca uma diminuição da 761

drial inner membrane (for a review, see⁽⁴⁾).

There is also a certain amount of consensus on the possible consequences of the MPT for cardiomyocytes. The opening of MPTPs causes mitochondrial depolarization, and the organelle loses the ability to produce energy and to take up calcium. In many cases, the MPT is also associated with an increase in mitochondrial volume, which leads to rupture of the outer membrane and even to apoptosis (and, ultima- tely, to necrosis) of the cardiomyocyte, through release of apoptotic factors such as cytochrome c⁽⁵⁾. Susceptibility to the MPT has been linked to greater or lesser susceptibility of cardiac tissue to ischemia and reperfusion⁽⁶⁾.

We accordingly used an animal model for type 2 diabetes, the Goto-Kakizaki rat (GK), to compare the susceptibility to the MPT of isolated cardiac mitochondria from these rats with cardiac mitochondria from control Wistar rats of the same age. The objective of this work was to discover which of the two types of mitochondria had greater resistance to the MPT in the heart, and to extrapolate this result to a greater or lesser resistance of diabetic cardiac tissue to injury resulting from ischemia and reperfusion.

METHODS

GK rats, 26 weeks old, were obtained from our colony, bred from the original colony from Tohoku University School of Medicine (Sendai, Japan). Wistar rats of the same age were used as controls. At the time of sacrifice, the GK rats had hyperglycemia (277.4±15.8 mg/dl), compared to the Wistar rats (105.4±3.0 mg/dl) (n=5 in each group, p<0.001). Cardiac mitochondria from rats from each group were isolated by differential centrifugation, as described previously⁽⁷⁾. The mitochondrial transmembrane potential (∆Ψ) is used by mitochondria not only for producing energy but also for the active accumulation of calcium, among other functions. ∆Ψ decays associated with MPTP opening were monitored using an electrode selective for TPP⁺, a cation frequently used for this type of measurement⁽⁷⁾. The rise in mitochondrial volume that normally follows the induction of the MTP was observed spectropho- tometrically by monitoring the turbidity (at 540 nm) of the mitochondrial suspension. Increased mitochondrial volume reduces the turbidity of the suspension. Induction of the MPT is associated with the loss of the mitochondrion’s ability to take up and retain calcium, leading to

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turbidez da suspensão. A indução da TPM está associada à perda de capacidade mitocondrial de tomada e retenção de cálcio, podendo mesmo levar à libertação de todo o cálcio previamente acumulado. Para esta monitorização, utilizou-se uma sonda fluorescente específica para o cálcio extra-mitocondrial, o Calcium Green 5-N (excitação 506 nm, emissão 531 nm). Pulsos de cálcio foram adicionados de modo a verificar a capacidade limite de acu- mulação de cálcio em ambos os tipos de mito- côndrias. A TPM está também associada a um aumento do consumo respiratório pela suspen- são mitocondrial, de modo a compensar a des- polarização verificada. O consumo de oxigénio foi monitorizado com um eléctrodo selectivo, do tipo Clark, numa câmara fechada, termosta- tizada a 25 ºC e com agitação permanente.

RESULTADOS

A capacidade de tomada de cálcio de mito- côndrias cardíacas de ratos GK e Wistar foi determinada observando o efeito de adições de pulsos de Ca²⁺ no ∆Ψ mitocondrial. A Fig. 1

762

the release of all its previously accumulated calcium. To check this, a fluorescent probe specific to extra-mitochondrial calcium was used, Calcium Green-5N (excitation 506 nm, emission 531 nm). Calcium pulses were added in order to calculate the calcium loading capacity in both types of mitochondria. The MPT is also associated with increased respiratory oxygen consumption in the mitochondrial suspension, so as to compensate for the depolarization. Oxygen consumption of monitored with a selective Clark electrode, in a closed chamber kept at 25 ºC and with constant agitation.

RESULTS

The ability of cardiac mitochondria of GK and Wistar rats to take up calcium was deter- mined by observing the effect of calcium pulses on mitochondrial ∆Ψ. Fig. 1 shows that, after the addition of a 500 µM calcium pulse, cardiac mitochondria from the GK rats were able to repolarize the ∆Ψ to its initial value.

The control mitochondria underwent a depolarization that was completely inhibited by cyclosporin A, a selective MPT inhibitor. Two other parameters related to the MPT were also studied, namely mitochondrial swelling and oxygen consumption. The fact that cardiac mitochondria from GK rats were able to return their respiratory consumption values to normal (Fig. 2) demonstrated higher calcium loading capacity. Indeed, the figure shows that, after the respiratory stimulation resulting from the uptake of calcium, isolated mitochondria from diabetic rats presented values of respiratory consumption that were consistently close to those found before the addition of calcium. By contrast, isolated mitochondria from the control rats continued to show high respiratory rates.

In agreement with this observation, mitochondrial swelling was also reduced in diabetic mitochondria (Fig. 3). The final evidence for the higher calcium loading capacity of the mitochondria of diabetic GK rats came from experiments using an extra-mitochondrial calcium probe (Fig. 4). It can be clearly seen that the GK group was able to accumulate a greater quantity of calcium before its release into the extra-mitochondrial environment by induction of the MPT.

DISCUSSION

A major controversy related to the cardiovascular problems associated with diabetes

225 220

215

195

GK

Wistar

Succ.

Ca²⁺

∆ψ (-mV)

Fig. 1 Medição do ∆Ψ mitocondrial com um eléctrodo de TPP⁺. 600 µM cálcio foram adicionados para induzir a TPM. As mito- côndrias (1 mg. proteína) foram energizadas com succinato num meio de reacção contendo 200 mM sacarose, 10 µM EGTA, 10 Tris-Mops e 5 µM KH2PO4, pH 7,4, 25 ºC. Como sonda para o utilizou-se 3 M TPP⁺. O registo é representativo de 5 preparações diferentes.

Fig. 1 Measurement of mitochondrial ∆Ψusing a TPP⁺electrode. 600 µM of calcium was added to induce the MPT. The mitochondria (1 mg protein) were energized with succinate in a reaction medium containing 200 mM sucrose, 10 µM EGTA, 10 Tris-Mops and 5 mM KH2PO4, pH 7.4, 25 ºC. 3 M TPP⁺was used as a probe for ∆Ψ. The record is representative of 5 different pre- parations.

(5)

mostra que, após a adição de um pulso de 500 µM de cálcio, as mitocôndrias cardíacas de ratos GK foram capazes de repolarizar o valor de

∆Ψ para o seu valor inicial. As mitocôndrias controlo sofreram uma despolarização do ∆Ψ que foi totalmente inibida por ciclosporina A, um inibidor selectivo da TPM. Dois outros pa- râmetros relacionados com a TPM foram tam- bém estudados, nomeadamente o entumescimento e o consumo de oxigénio mitocondrial.

O facto de mitocôndrias cardíacas de ratos GK terem conseguido repor os seus valores de consumo respiratório para os valores normais (Fig.

2), mostra uma melhor capacidade de acumu- lação de cálcio. De facto, pode verificar-se pela figura que, após a estimulação respirató- ria resultante da entrada de cálcio, as mitocôn- drias isoladas de ratos diabéticos apresenta- ram sistematicamente valores de consumo respiratório próximos dos verificados previamente à adição de cálcio. Em contraste, as mi- tocôndrias isoladas de ratos controlo permane- ceram com uma elevada taxa respiratória.

Concordante com este facto, o próprio entumescimento mitocondrial foi menor nas mito- côndrias diabéticas (Fig. 3). A evidência final para a maior capacidade acumulativa de cálcio pelas mitocôndrias de ratos diabéticos GK pro- veio da utilização de uma sonda extra-mitocondrial de cálcio (Fig. 4). Pode-se ver claramente que o grupo GK conseguiu acumular uma maior quantidade de pulsos de cálcio antes da sua libertação para o meio extra-mitocondrial por indução da TPM.

DISCUSSÃO

Um das grandes questões à volta dos pro- blemas cardiovasculares associados à diabetes

763

concerns the greater or lesser resistance of the diabetic heart to ischemia and reperfusion.

Cardiac mitochondria may be an important fac- tor in this relationship, particularly in terms of the degenerative phenomenon known as the mitochondrial permeability transition, which is closely associated with the greater or lesser resistance of the cell to the injury caused by ischemia and reperfusion. Figs. 1 to 4 clearly

GK

Wistar

Succ.

Ca²⁺

31.5 natms

10 seg.

10 sec.

Fig. 2 Registo típico (n=5) do consumo respiratório mitocon- drial nas condições da Fig. 1. A medição foi efectuada com um eléctrodo de oxigénio do tipo Clark. Adicionaram-se 600 µM de cálcio no local assinalado.

Fig. 2 Typical record (n=5) of mitochondrial respiratory con- sumption under the conditions of Fig. 1. The measurement was made with a Clark oxygen electrode. 600 µM of calcium was added at the point indicated.

GK

Wistar

Ca²⁺

250 seg.

250 sec.

0,1 A540

0.1 A540

Fig. 3 Registo típico (n=5) das variações de volume mitocondrial após adição de 600 µM de cálcio nas condições da Fig. 1. A turbidez da suspensão foi seguida me- dindo a absorvância da suspen- são a 540 nm.

Fig. 3 Typical record (n=5) of variations in mitochondrial volume after addition of 600 µM of calcium under the conditions of Fig. 1. The turbidity of the sus- pension was monitored by measur- ing the absorbance of the suspension at 540 nm.

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prende-se com a polémica sobre a maior ou menor resistência do coração diabético à is- quémia-reperfusão. A mitocôndria cardíaca po- derá ser um elo muito importante nesta rela- ção, nomeadamente o fenómeno deletério denominado transição de permeabilidade mitocondrial, muito associado à maior ou menor re- sistência da célula aos danos sofridos após a isquémia-reperfusão. O conjunto das Figs. 1 - 4 mostra claramente a maior capacidade para acumular cálcio da mitocôndria cardíaca dia- bética comparando com mitocôndrias controlo de ratos Wistar da mesma idade. De realçar é o facto das mitocôndrias diabéticas serem capazes de manter o seu ∆Ψ elevado após a acu- mulação de cálcio, o que não acontece com as mitocôndrias controlo (Fig. 1). Esse ∆Ψ po- derá depois ser utilizado para a síntese de ATP (adenosina trifosfato), a molécula energética utilizada pela célula e para outros processos activos que dependem do gradiente eléctrico mitocondrial. Como consequência da manuten- ção do ∆Ψ, o consumo respiratório retomou os valores que possuía previamente à entrada de cálcio na mitocôndria (Fig. 2), confirmando uma superior capacidade acumuladora daquele

764

show the higher calcium loading capacity of the diabetic cardiac mitochondria compared to Wistar control rats of the same age. Of particular interest is the ability of the diabetic mitochondria to maintain their ∆Ψ after calcium loading, which is not the case with the control mitochondria (Fig. 1). This ∆Ψ may be used subsequently for the synthesis of ATP (adeno- sine triphosphate), the energy molecule used by the cell and in other active processes that depend on the mitochondrial electrical gra- dient. As a consequence of ∆Ψ maintaining, respiratory consumption returned to the values obtained before calcium uptake by the mitochondria (Fig. 2), demonstrating their higher loading capacity for this ion. Mitochondria from the control rats maintained a high respiratory rate, showing uncoupling as a result of the induction of the MPT. The fact that depolarization in the control mitochondria was inhibited by cyclosporin A (not shown) demonstrated that it was due to the induction of the MPT.

Furthermore, the higher degree of swelling in the control mitochondrial population (Fig.

3) proved beyond doubt that a higher number of mitochondria underwent the MPT. The MPT-

GK

Wistar

Succ. EGTA

400 seg.

400 sec.

21.0

7.0

4.0

2.5

[ca²⁺] (µM)

Fig. 4 Medição representativa (n=5) da capacidade de carga mitocondrial de ambos os tipos de mitocôndrias. As mitocôndrias (0,2 mg. proteína) foram energizadas com succinato num meio de reac- ção contendo 200 mM sacarose, 10 µM EGTA, 10µM Tris-Mops e 1 mM KH2PO4, suplementado com 100 nM de Calcium Green 5-N. S experiências foram efectuadas a 25 ºC, pH 7,4. Adições sucessivas de cálcio (setas) foram efectuadas à suspensão mitocondrial. EGTA foi adicionado no final para deter- minar a linha base.

Fig. 4 Representative measure- ment (n=5) of mitochondrial loading capacity for both types of mitochondria. The mitochondria (0.2 mg protein) were energized with succinate in a reaction medium containing 200 mM sucrose, 10 µM EGTA, 10nM Tris-Mops and 1 mM KH2PO4, supplemented by 100 nM of Calcium Green-5N.

The experiments were carried out at 25 ºC, pH 7.4. Successive addi- tions of calcium (arrows) were made to the mitochondrial suspension. EGTA was added at the end to determine the baseline.

(7)

ião. Mitocôndrias de ratos controlo mantiveram uma elevada taxa respiratória, mostrando um desacoplamento resultante da indução da TPM.

O facto da despolarização nas mitocôndrias controlo ser inibida por ciclosporina A (não mostrado) mostrou uma relação directa com a TPM.

Mais ainda, o facto da população mitocondrial controlo sofrer um maior grau de entumescimento (Fig. 3) mostra, sem sombra de dúvida, que um maior número de mitocôndrias sofreu a TPM. O rebentamento da membrana externa mitocondrial associado à TPM pode desencadear a morte celular por libertação de factores apoptóticos proteicos do espaço inter- membranar⁽⁵⁾. A Fig. 4 confirma que a mito- côndria diabética pode de facto captar um maior número de pulsos de cálcio que as mito- côndrias controlo.

A TPM foi já considerada como fulcro da vida ou morte do cardiomiócito⁽⁸⁾. Sabe-se tam- bém que durante a isquémia-reperfusão, os PTPM só abrem durante a fase de reperfusão, em próxima relação com o incremento da gera- ção de espécies reactivas de oxigénio⁽⁹⁾. Os factos já descritos na literatura associados aos nossos resultados permitem-nos sugerir que, numa condição que possa envolver a disfunção do cardiomiócito motivada pela indução da TPM (como a isquémia-reperfusão), o cardio- miócito diabético estará mais protegido. Há que realçar que os ratos GK apresentam uma forma de diabetes muito semelhante à diabetes tipo 2 nos humanos, sendo portanto uma forma de diabetes mais ligeira. Resultados do nosso grupo (Oliveira et al., submetido) utilizando modelos animais para formas mais severas de diabetes mostraram resultados opostos aos do presente trabalho.

Os resultados deste trabalho sugerem o mo- tivo para a maior resistência do coração diabé- tico aos danos por isquémia-reperfusão, pelo menos nos casos clínicos onde o estado diabé- tico ainda não é muito severo.

CONCLUSÕES

As mitocôndrias cardíacas de ratos diabéti- cos GK apresentam uma maior resistência ao fenómeno da transição de permeabilidade mitocondrial, um fenómeno associado a morte celular e muito activo durante a isquémia-reper- fusão do miocárdio. Estes resultados são relevantes para a já descrita menor susceptibi-

lidade do coração diabético à lesão de isque- 765

associated disruption of the outer mitochondrial membrane associated with the MPT can result in cell death through the release of protein factors from the intermembrane space⁽⁵⁾. Fig. 4 confirms that diabetic mitochondria were able to take up a greater number of calcium pulses than the controls.

The MPT has been defined as a fulcrum of life or death for the cardiomyocyte⁽⁸⁾. It is also known that during ischemia and reperfusion, MPTPs only open during the reperfusion phase, in a close relation with the increased generation of reactive oxygen species⁽⁹⁾. The data in the literature, together with our results, enable us to suggest that, in a situation which may involve cardiomyocyte dysfunction brought on by the induction of the MPT (such as ischemia and reperfusion), the diabetic cardiomyocyte is better protected. It should be noted that GK rats present a form of diabetes that is very similar to type 2 diabetes in hu- mans, which is a milder form of the disease. A study by our group (Oliveira et al., submitted) using animal models for more severe forms of diabetes produced results opposite to those of the present work.

The results of this study suggest an expla- nation for the greater resistance of the diabetic heart to injury by ischemia and reperfusion, at least in clinical cases in which the diabetes is not yet severe.

CONCLUSIONS

Cardiac mitochondria from diabetic GK rats present greater resistance to the phenomenon known as the mitochondrial permeability transition, which is associated with cell death and is very active during ischemia and reperfusion of the myocardium. These results are relevant to the reported lower susceptibility of the diabetic heart during the ischemia and reperfusion-related lesion, at least in the milder forms of the disease.

ACKNOWLEDGEMENTS

This research was carried out with funding from the Portuguese Foundation for Science and Technology, project PRAXIS /PSAU/S/

16/96, and Ph.D. scholarships for Paulo J. Oli- veira and Anabela P. Rolo, PRAXIS XXI /BD/21494/99 and PRAXIS XXI/BD/21454/

99, respectively.

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mia-reperfusão, pelo menos para formas mais ligeiras de diabetes.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi efectuado com apoio fi- nanceiro da Fundação Para a Ciência e Tecno- logia, Projecto PRAXIS/PSAU/S/16/96 e bol- sas de Doutoramento para Paulo J. Oliveira e Anabela P. Rolo, PRAXIS XXI/BD/21494/99 e PRAXIS XXI/BD/21454/99, respectivamente.

Estamos muito agradecidos ao Prof. João Patrício e colaboradores por todo o trabalho na manutenção dos animais.

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We are grateful to Prof. João Patrício and colleagues for all they did in caring for the animals.

BIBLIOGRAFIA / REFERENCES

Pedido de separatas para:

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PAULO J. OLIVEIRA

Centro de Neurociências de Coimbra Unidade Investigação Básica em Cardiologia Instituto Biomédico de Investigação de Luz e Imagem (IBILI)

Azinhaga Celas de Santa Comba 3000-354 COIMBRA