Ratos Wistar
Paulo Vinicios Camuzi Zovico
Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
PAULO VINICIOS CAMUZI ZOVICO
Efeitos De Doses Controladas Do Suplemento
OxyElite Pro Sobre a Performance Física em
Ratos Wistar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito final para obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Valério Garrone Barauna
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
REGISTRO DE JULGAMENTO DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DO CANDIDATO PAULO VINICIOS CAMUZI ZOVICO AO TÍTULO DE MESTRE PELO
PPGCF/CCS/UFES
N°. Matrícula do Candidato: 2015130662
A Comissão Julgadora que examinou a Dissertação de Mestrado, intitulada “Efeitos de Doses Controladas do Suplemento OxyElite Pro Sobre a Performance Física em Ratos Wistar”, apresentada e defendida publicamente pelo aluno Paulo Vinicios Camuzi Zovico, no dia 26 de abril de 2017, às 14h, decidiu por unanimidade, aprovar a referida dissertação de Mestrado e, portanto, declara que o aluno faz jus à obtenção do Título de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Vitória – ES, 26 de abril de 2017.
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Nuno Manuel Frade de Sousa
Faculdade Estácio de Sá Membro externo
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Rafael de Oliveira Alvim
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) Membro externo
___________________________________________________________________ Prof. Drª. Lívia Carla de Melo Rodrigues
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) Membro interno
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Valério Garrone Baraúna
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) Orientador
Zovico, Paulo Vinicios Camuzi
Efeitos de doses controladas do suplemento OxyElite Pro sobre a performance física em ratos Wistar/ Paulo Vinicios Camuzi Zovico. – Vitória, UFES/ PPGCF, 2017
91f
Orientador: Prof. Dr. Valério Garrone Baraúna
Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo.
1. Suplementos alimentares 2. Performance física 3. Fígado 4. Estresse oxidativo 5. Biogêneses mitocondrial
Dedico esta dissertação de mestrado, com muito carinho e gratidão, à minha família, amigos e professores por toda compreensão e apoio durante
toda esta trajetória.
Em especial à Juliana do Nascimento Camara, por todo apoio, cuidado, paciência e todos os momentos em que
eu não estive presente e ao meu filho Heitor Camuzi Camara Zovico, se não fosse por todo apoio de vocês
eu não teria conseguido chegar até aqui.
Meu especial agradecimento ao meu orientador Valério Garrone Baraúna, que me proporcionou está incrível experiência, por me acolher com muita consideração,
respeito e confiança durante todo o projeto. Com palavras não conseguiria expressar minha gratidão.
concluído neste momento, ainda tenho um longo caminho a percorrer para chegar ao real objetivo. Porém, mais uma etapa está sendo concluída, foram muitas ideais, aprendizados, emoções, experimentos, leituras e escritas nestes dois anos de mestrado, muitos fizeram parte deste turbilhão de sentimentos, seja de forma direta ou indireta e neste momento gostaria de demostrar todos os meus sentimentos de carinho e gratidão.
A palavra agradecimento significa reconhecimento, é uma declaração de se estar grato por algo dado ou feito por outrem. Se torna fácil entender quando se ler no dicionário, porém, o sentimento de gratidão vai muito além desta simples palavra e até mesmo a compreensão da mesma. Com todo respeito, admiração e carinho os meus mais que sinceros e especiais agradecimentos para todos aqueles que tornaram possíveis todas as minhas impossibilidades.
Em primeiro lugar, quero agradecer a Deus por iluminar e me abençoar em todos os momentos deste processo. De me dar paciência e sabedoria para lidar com todas as dificuldades encontradas no caminho durante esta formação pessoal e profissional, de fato, não foi fácil passar por tudo, porém nunca perdi a fé e a esperança que iria dar tudo certo no final.
Meus agradecimentos mais que especial a minha esposa Juliana do Nascimento Camara e ao meu amado filho Heitor Camuzi Camara Zovico, os quais não pouparam esforços para que eu fosse capaz de chegar a este objetivo. Obrigado por me ajudar de todas as formas possíveis na qual uma pessoa possa ser ajudada, sem vocês eu não teria conseguido. Ainda milhões de desculpas não seriam suficiente por todas as vezes em que estive ausente em suas vidas, seja elas nas horas boas ou ruins, foi difícil eu sei, mas tenho certeza que irá valer a pena.
A minha imensa gratidão, admiração e carinho ao meu orientador Dr. Valério Garrone Baraúna, muito obrigado pela oportunidade e por ter me acolhido de forma tão confiante. Obrigado por toda orientação, compreensão, aprendizado e por me fazer enxergar a ciência de forma tão crítica e com muita paixão durante todo o
mestrado. Sou eternamente grato pela oportunidade e por todo aprendizado adquirido sob a sua orientação.
A todos os professores que contribuíram pelo sucesso desta caminhada: Drª. Paula Frizera Vassalo, Drª. Silvana dos Santos Meyrelles, Dr. Elisardo Corral Vasquez Drª. Ágata Lages Gava, Drª. Lívia Carla de Melo Rodrigues, Dr. Daniel Ventura Dias e Drª Edilamar Menezes de Oliveira por suas colaborações, conhecimentos, ideias, paciência e sabedoria, além de ter me acolhido de forma tão carinhosa e prestativa em seus laboratórios.
Aos meus queridos amigos de todas as horas que não pouparam esforços para me ajudaram tanto de forma indireta ou direta durante estes dois anos, além de terem tornado esses anos mais divertidos e produtivos: Victor, Eduardo, Marquinhos, Bruna Coelho, Hadassa, Ricardo, Rose, Ananda, Rossana, Brunella, Jamila, Fran, Brenna entre muitos outros que contribuíram com este projeto.
A todos os alunos e funcionários dos laboratórios de: Fisiologia Translacional, Regulação Neuro Humoral da Circulação, Neurotoxicologia e Psicofarmacologia, Imunopatologia e Multiusuário de Análises Biomoleculares que sempre estiveram de portas abertas para me atender.
A todos os professores e funcionários do PPGCF/UFES.
A toda minha família que nunca me deixaram desistir, em especial aos meus pais Vera Lúcia Camuzi e José Márcio da Fonseca. Obrigado por todos os ensinamentos e por contribuírem para a formação do homem que hoje sou. Aos meus irmãos em especial a Vitor Camuzi Zovico que esteve presente em todo este processo. A todos os outros familiares, os quais torceram por mim e ficaram felizes por todas as minhas conquistas.
Meus sinceros agradecimentos a toda família da minha esposa, em especial a Elisabete do Nascimento Camara, Jocimar Sartório Camara, Jair José da Camara Neto e Jocieli Fonseca do Nascimento que em todos os momentos estiveram sempre presentes ajudando sempre que possível. Minha imensa gratidão á todos vocês.
A todos as pessoas que de certo modo participaram desta longa caminhada, meus mais sinceros agradecimentos!
“Não fiz o melhor, mas fiz tudo para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas não sou o que era antes”. (Martin Luther King)
metabolismo e contém como principal ingrediente a 1,3-dimetilamilamina (DMAA). Efeitos adversos após o consumo de OEP têm sido relatados. Contudo, estes efeitos estão relacionados com doses desconhecidas ou sobredosagem do produto. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos agudos e crônicos de OEP em doses controladas em ratos Wistar sobre: desempenho físico, respostas hemodinâmicas, atividade locomotora espontanea, parâmetros comportamentais, parâmetros metabólicos, marcadores de lesão hepática, marcadores de estresse oxidativo e biogênese mitocondrial no músculo esquelético. Para isso utilizamos os seguintes grupos de ratos: controle, 4,3 mg/kg de OEP (dose mínima recomendada), 12,9 mg/kg de OEP (dose máxima recomendada) e 25,8 mg/kg de OEP (não recomendada). Todos os grupos foram submetidos a suplementação com OEP durante 4 semanas e os protocolos experimentais foram realizados 30 minutos após a primeira administração de OEP (resposta aguda) e 30 minutos após a última administração de OEP no final da quarta semana (resposta crônica). Observou-se que a distância e o tempo de corrida aumentaram após administração aguda com 12,9 mg/kg de OEP (2,6 vezes) e 25,8 mg/kg de OEP (2,8 vezes). Uma vez que não foi observado qualquer efeito no teste de tolerância ao exercício à dose mais baixa de OEP (4,3 mg/kg de OEP), este grupo foi removido de outras análises. A suplementação aguda com 12,9 mg/kg de OEP foi capaz de aumentar a frequência cardíaca (FC) sem afetar a pressão arterial (PA) de modo significativo, entretanto, doses não recomendadas (25,8 mg/kg de OEP) apresentou um aumento na PA e FC. Por outro lado, a distância e o tempo de corrida diminuíram após a suplementação diária durante 4 semanas de ambos os grupos (64% no grupo 12,9 mg/kg de OEP e 72% no grupo 25,8 mg/kg de OEP). A suplementação crônica com 12,9 e 25,8 mg/kg de OEP diminuiu os níveis de TBARS no músculo sóleo (36 e 31%) e no fígado (43 e 25%). A AOPP também diminuiu com ambas as doses no fígado (39 e 45%). A administração crónica com a dose mais elevada, 25,8 mg/kg de OEP, foi capaz de reduzir a expressão gênica da PGC-1α no músculo sóleo (25%). Nenhum efeito foi encontrado nas outras variáveis analisadas, tais como: atividade locomotora espontânea, parâmetros comportamentais, peso corporal, ingestão de ração e água, toxicidade hepática e na quantidade de DNA mitocondrial. Concluímos
portanto que, doses máximas e não recomendadas de OEP ingeridas de forma aguda apresenta efeito estimulante sobre a capacidade de exercício. Doses não recomendadas com OEP aumenta de forma significativa as respostas hemodinâmicas (PA e FC). No entanto, o seu consumo diário durante 4 semanas causa efeitos antioxidantes no músculo sóleo e no fígado, o que pode ter levado a supressão da expressão do RNAm da PGC-1α no músculo sóleo e ter contribuído parcialmente para um desempenho físico prejudicado no teste de tolerância ao exercício.
Palavras-chave: Suplementos alimentares, Desempenho, Fígado, Estresse oxidativo, Biogênese mitocondrial.
as key stimulant the ingredient 1,3-dimethylamylamine (DMAA). Serious adverse effects have been reported after OEP consumption. However, these effects are related to unknown doses or overdose of supplement. Thus, the aim of this study was to evaluate acute and chronic OEP affects, at controlled doses in Wistar rats, on physical performance, hemodynamic responses, spontaneous locomotor activity, behavioral parameters and metabolic parameters, liver injury markers and oxidative stress markers, and mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. For this we use the following groups of rats: control, 4,3 mg OEP/kg (minimum dose), 12,9 mg OEP/kg (maximum dose) and 25,8 mg OEP/kg (not recommended). All groups were submitted to supplementation with OEP for 4 weeks and the experimental protocols were performed 30 min after the first OEP administration (acute response) and 30 min after the last OEP administration at the end of the forth week (chronic response). Running distance and running time increased after acute administration of 12,9 mg OEP/kg (2.6-fold) and 25,8 mg OEP/kg (2,8-fold). Since no effect on the exercise tolerance test was observed at the lower OEP dose (4,3 mg OEP/kg), this group was removed from further analyzes. Acute supplementation with 12,9 mg/kg OEP was able to increase HR without significantly affecting blood pressure (BP), however, non-recommended doses (25,8 mg/kg OEP) showed an increase in BP and HR. On other hand, running distance and running time decreased after daily supplementation for 4 weeks also in both groups (64% in 12,9 mg OEP/kg and 72% in 25,8 mg OEP/kg). Chronic supplementation at both 12,9 and 25,8 mg OEP/kg decreased TBARS levels in soleus muscle (36 and 31%) and liver (43 and 25%). AOPP was also decreased by both doses in the liver (39 and 45%). Chronic administration of the highest dose, 25,8 mg OEP/kg, was able to reduce mRNA expression of PGC-1α in soleus muscle (25%). No effect was found in other variables such as spontaneous physical activity, behavioral parameters, body weight, food and water intake, hepatic toxicity, cardiac oxidative stress and mitochondrial DNA amount. Concluded that maximum and not recommended doses of OEP ingested acutely presented stimulating effect on the ability to exercise. Doses not recommended with OEP significantly increase hemodynamic responses. However, its daily consumption for 4 weeks showed antioxidant effects in soleus muscle and liver which may have
decreased the PGC-1α mRNA expression on soleus muscle and contributed to the impaired performance in the exercise tolerance test.
anfetamina e metanfetamina...26 Figura 2 – Mecanismo de ação do DMAA sobre os diferentes tecidos do organismo de acordo com os dados descritos na literatura...27 Figura 3 – Alguns dos produtos comercializados que apresentava o ingrediente DMAA em suas formulações...29 Figura 4 – Rótulo do suplemento OxyElite Pro...30 Figura 5 – Esquema representativo do desenho experimental desenvolvido durante o projeto...37 Figura 6 – Foto representativa da esteira e do teste de tolerância ao exercício realizado neste projeto...40 Figura 7 – Gaiolas metabólicas individuais utilizadas para o teste de consumo alimentar...41 Figura 8 – Registro de um animal consciente realizado no presente estudo para avaliação dos efeitos da suplementação com OEP sobre as respostas hemodinâmicas...46 Figura 9 – Efeito da suplementação com OEP sobre a capacidade de exercício...50 Figura 10 – Efeito da suplementação com OEP sobre a atividade locomotora espontânea...51 Figura 11 – Efeito da suplementação com OEP sobre parametros comportamentais...52 Figura 12 – Efeito da suplementação com OEP sobre o ganho de peso corporal....53 Figura 13 – Efeito da suplementação com OEP sobre o consumo alimentar...54
Figura 14 – Efeito da suplementação com OEP sobre os marcadores de lesões hepáticas...55 Figura 15 – Efeito da suplementação com OEP sobre os marcadores de estresse oxidativo circulante e tecidual...56 Figura 16 – Efeito da suplementação com OEP sobre os marcadores de biogênese mitocondrial...57
Figura 17 – Efeito da suplementação aguda com OEP sobre as repostas hemodinâmicas...58 Figura 18 – Efeito da suplementação com OEP sobre a perda de pelos...66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Velocidade percorrido por cada animal de acordo com o tempo durante o período do teste...41 Tabela 2 – Efeito da suplementação crônica (4 semanas) com OEP sobre a massa tecidual...54
Abenutri: Associação Brasileira das Empresas de Produtos Nutricionais
ABIAD: Associação Brasileira da Indústria de Alimentos Para Fins Especiais e Congêneres
Abifisa: Associação Brasileira das Empresas do Setor Fitoterápico, Suplemento Alimentar e de Promoção da Saúde
AHPA: Associação Americana de Produtos Herbais ALT: Alanina aminotransferase
ANOVA: Análise de variância
ANVISA: Agencia Nacional de Vigilância Sanitária AOPP: Produtos avançados da oxidação de proteínas AST: Aspartato aminotransferase
CEUA: Comissão de Ética em Uso de Animais DMAA: 1,3 dimetilamilamina
DNA: Ácido desoxirribonucleico DP: Duplo produto
DSHEA: Dietary Supplement Health and Education Act of 1994 EPM: Erro padrão da média
FC: Frequência cardíaca
FDA: Food and Drug Administration GAMA-GT: Gama-glutaminotransferase
IUPAC: União Internacional de Química Pura e Aplicada KI: Iodeto de potássio
LCE: Labirinto em cruz elevado LD50: Dose Letal
MDA: Malondealdeído NA: Noradrenalina
NRF-1: Fator respiratório nuclear-1
NRF-2 Fator respiratório nuclear-2
OEP: OxyElite Pro
PA: Pressão sanguínea arterial PAM: Pressão arterial média PAS: Pressão arterial diastólica PAS: Pressão arterial sistólica PBS: Solução de tampão fosfato
PGC-1α: Peroxissoma proliferator activated receptor coactivador 1 alpha PPGCF: Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
RNA: Ácido ribonucleico RNAm: RNA mensageiro
ROS: Espécies reativas de oxigênio
RT-PCR: Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction
SAMHSA: Substance Abuse and Mental Health Services Administration SNC: Sistema Nervoso Central
TBA: Ácido tiobarbitúrico
TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico Tfam: Fator de transcrição A mitocondrial
TTE: Teste de tolerância ao exercício Tween 20: Polioxietileno sorbitano 20
UFES: Universidade Federal do Espirito Santo UNPA: United Natural Products Alliance
1 INTRODUÇÃO ...22
1.1 1,3 DIMETILAMILAMINA (DMAA) ...25
1.1.1 Estrutura e nomeclatura do DMAA ...26
1.1.2 Mecanismo de ação do DMAA ...27
1.1.3 O DMAA possui origem natural?...28
1.2 PRODUTOS CONTENDO DMAA ...28
1.2.1 Suplemento Oxyelite Pro (OEP) ...29
1.2.2 Efeitos associados ao uso do DMAA isolado ou em produtos comercializados ...30
1.2.3 Estudos clínicos com DMAA isolado ou como suplemento OEP...31
2 OBJETIVOS ...33 2.1 OBJETIVO GERAL ...34 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...34 3 MATERIAL E MÉTODOS ...35 3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ...36 3.2 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ...36
3.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DO SUPLEMENTO ...38
3.4 GRUPOS EXPERIMENTAIS ...38
3.5 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE) ...38
3.6 OPEN FIELD ...39
3.7 TESTE DE TOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO (TTE) ...39
3.8 GAIOLA METABÓLICA ...41
3.9 SACRIFÍCIO E COLETA DE TECIDOS ...42
3.10 TOXICIDADE HEPÁTICA ...42
3.11 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ...42
3.11.1 Protocolo de TBARS em amostras de plasma ...42
3.11.2 Protocolo de TBARS em amostras de tecido ...43
3.12 OXIDAÇÃO DE PROTEÍNA ...43
3.12.1 Protocolo de AOPP em amostras de plasma ...43
3.12.2 Protocolo da AOPP em amostras de tecido ...44
3.14 AVALIAÇÃO DE DNA MITOCONDRIAL ...45
3.15 AVALIAÇÃO HEMODINÂMICAS DIRETA ...45
3.16 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS ...47
4 RESULTADOS ...48
4.1 RESULTADOS SOBRE OS EFEITOS ESTIMULANTES DO OEP...49
4.1.1 Ingestão aguda com OEP possui efeitos estimulantes, enquanto a longo prazo ocorre prejuízo sobre a capacidade física...49
4.1.2 A suplementação com OEP não apresentou efeitos sobre a atividade locomotora espontânea em ratos Wistar ...50
4.2 EFEITOS DO OEP SOBRE PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS ...51
4.2.1 A suplementação com OEP não altera o comportamento de ratos Wistar...51
4.3 EFEITOS DO OEP SOBRE PARÂMETROS METABÓLICOS E MASSA TECIDUAL ...53
4.3.1 A suplementação com OEP não contribui com a perda de peso corporal de ratos Wistar...53
4.3.2 A suplementação com OEP não altera o consumo alimentar de ratos Wistar ...53
4.3.3 O OEP não altera a massa tecidual do coração, músculos esqueléticos e glândulas adrenais ...54
4.4 RESULTADOS SOBRE OS EFEITOS DO OEP SOBRE SEU POTENCIAL HEPATOTÓXICO ...55
4.4.1 O OEP por 4 semanas não produz efeitos tóxicos ao fígado...55
4.5 RESULTADOS SOBRE OS EFEITOS DO OEP SOBRE MARCADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO ...55
4.5.1 OEP reduz os níveis de TBARS e AOPP no músculo sóleo e fígado...55
4.6 EFEITOS DO OEP SOBRE A BIOGÊNESE MITOCONDRIAL ...56
4.6.1 Doses não recomendadas de OEP ingeridas a longo prazo reduz a expressão do RNAm do PGC-1α sem alterar o conteúdo mitocondrial no músculo sóleo ...56
5 DISCUSSÃO ...60
6 CONCLUSÃO...71
7 REFERÊNCIAS ...73
8 ANEXO I ...79
A busca pelo corpo perfeito (estética) ou pela melhora do desempenho esportivo nem sempre tem seus limites definidos pelos critérios da fisiologia e por muitas vezes, o uso de substâncias estimulantes como: esteroides, anabolizantes, bebidas energéticas e outros suplementos alimentares são feitos de maneira indiscriminada (PIPE & AYOTTE, 2002). Nesse caminho, nem sempre os riscos são calculados ou os prejuízos para a saúde do indivíduo a longo prazo são levados em consideração. Estudos mostram que 80% dos consumidores destes suplementos não estão familiarizados com os riscos associados ao seu consumo (O’DEA, 2003; ALVES & LIMA, 2013).
Em 2011, um relatório gerado pela Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA) revelou uma tendência ascendente em atendimentos de emergência envolvendo o consumo de bebidas energéticas de forma isolada (56% dos casos) ou combinados com drogas ou álcool (EUDY et al., 2013). Na grande maioria, estas ocorrências resultam de ingredientes capazes de estimular o sistema nervoso central (SNC) presente em suplementos alimentares, como por exemplo o 1,3 dimetilamilamina (DMAA) e a cafeína. Estes estimulantes podem aumentar o risco de efeitos adversos no sistema cardiovascular, e quando combinados ao exercício físico podem impor um estresse adicional, aumentando o potencial para uma piora de tais efeitos (BLOOMER et al., 2011; EUDY et al., 2013). Mesmo assim, indivíduos de todas as idades fazem o uso de pelo menos um tipo de suplemento alimentar (MCCARTHY et al., 2011).
Nos Estados Unidos da América (EUA) aproximadamente 80% dos adultos fazem o uso de um ou mais suplementos durante o ano (MCCARTHY et al., 2011; GELLER et al., 2015). Na Europa (Finlândia, Alemanha, Romênia, Itália, Espanha e Reino Unido) uma recente pesquisa apontou que 18,8% dos indivíduos admitiram usar um ou mais suplementos alimentares (GARCÍA-CORTÉS et al., 2016). No Brasil, uma inédita pesquisa sobre o consumo de suplementos alimentares divulgada pela Associação Brasileira da Indústria de Alimentos Para Fins Especiais e Congêneres (ABIAD) juntamente com Associação Brasileira das Empresas do Setor Fitoterápico, Suplemento Alimentar e de Promoção da Saúde (Abifisa) e a Associação Brasileira das Empresas de Produtos Nutricionais (Abenutri) apontaram que 54% dos lares brasileiros afirmam ter pelo menos um indivíduo que consome algum tipo de suplemento (ABIAD, 2016). Este aumento no consumo de suplementos fez com que esse mercado se tornasse um grande negócio nos países
24
industrializados. Estima-se um aumento de 4.000 tipos de produtos em 1994 para mais de 55.000 em 2012. Os números de vendas destes produtos também aumentaram a partir do ano de 2004 e atingiu um valor de 61 bilhões de dólares para economia dos EUA no ano de 2008 (GELLER et al., 2015).
Segundo a Dietary Supplement Health and Education Act of 1994 (DSHEA) suplementos alimentares são considerados como ervas, produtos botânicos, complementos nutricionais (ex: aminoácidos) e micronutrientes (vitaminas e minerais) (GELLER et al., 2015; GARCÍA-CORTÉS et al., 2016). A regulamentação destes produtos à base de plantas ou ingredientes naturais, podem variar entre diferentes países (GARCÍA-CORTÉS et al., 2016). No Brasil, o órgão responsável pela regulamentação de suplementos alimentares é a agencia nacional de vigilância sanitária (ANVISA). Nos EUA a agência norte-americana U.S. Food and Drug Administration (FDA) é o principal órgão encarregado da supervisão dos suplementos alimentares, embora, nenhum teste seja exigido para determinar a segurança e aprovação destes produtos antes de serem comercializados (GELLER et al., 2015). Entre diversos ingredientes encontrados em suplementos alimentares, o DMAA foi alvo de grande investigação e proibição pelas agências regulamentadoras em diversos países nos últimos anos (RODRICKS & LUMPKIN, 2013; FDA, 2013; EUDY et al., 2013).
O DMAA esteve presente na formulação de diversos produtos conhecidos como pré-treinos, entre os mais famosos o Lipo-6-Black, Jack3d e OxyElite Pro (OEP). Muitos destes produtos têm sido apontados pela literatura como responsáveis a apresentar diversos efeitos nocivos à saúde, associado ao seu uso (FORRESTER, 2012; ELIASON et al., 2012; YOUNG et al., 2012; GEE et al., 2012; FARNEY et al., 2014; SMITH et al., 2014; ARCHER et al., 2015). Ao mesmo tempo, alguns estudos veem tentando estabelecer um perfil seguro para o uso do DMAA isolado ou como ingrediente em suplementos alimentares. Apesar destes estudos já terem sido realizados, a grande maioria foi desenvolvida por um único grupo de pesquisa que recebeu financiamento da USPlabs (Empresa que fabrica produtos contendo DMAA) (BLOOMER et al., 2011; MCCARTHY et al., 2011; MCCARTHY et al., 2012; WHITEHEAD et al., 2012; BLOOMER et al., 2013; SCHILLING et al., 2013). Até o momento, para nosso conhecimento ninguém estudou os efeitos de suplementos contendo DMAA em doses controladas em modelo animal.
1.1 1,3 DIMETILAMILAMINA (DMAA)
O DMAA foi inicialmente usado entre os anos de 1940-1970 como princípio ativo de descongestionante nasal chamado de Forthane® desenvolvido pelo laboratório farmacêutico Eli Lilly atuando como agente vasoconstritor na mucosa nasal (VENHUIS & KASTE, 2012; ELIASON et al., 2012). O seu uso se deu até o ano 1983 quando este ingrediente foi retirado do mercado, ressurgindo anos mais tarde (2006) como um componente de diversos suplementos alimentares com a promessa de auxiliar com a perda de peso, bem como, melhorar a performance física (ARMSTRONG, 2012; FORRESTER et al., 2013; DOLAN et al., 2014).
Desde então o número de produtos contendo DMAA veio aumentando e se tornando os mais vendidos em lojas de nutrição convencionais sob o pretexto de ser uma substância natural (GEE et al., 2102; ELIASON et al., 2012; FORRESTER et al., 2013; DUNN, 2016). Isso só se tornou possível devido a um pequeno artigo publicado no ano de 1996 no Jornal do Instituto de Tecnologia de Guizhou, onde descreveram o DMAA como um ingrediente natural extraído de gerânio (Pelargonium graveolens) (ZHANG et al., 2012). Entretanto, em 2009 este ingrediente foi adicionado à lista de substâncias proibidas pela Agência Mundial Antidoping (WADA) considerado como agente estimulante, podendo melhorar o desempenho, bem como, representar uma ameaça à saúde (ZHANG et al., 2012; DUNN, 2016). Em 2011, a Associação Americana de Produtos Herbais (AHPA) declarou que os fabricantes de suplementos não deveriam rotular o DMAA como sendo de origem natural. Está ação foi apoiada pela United Natural Products Alliance (UNPA) (ZHANG et al., 2012).
No mesmo ano (2011) o DMAA passou a ser proibido no Canadá e desde então, diversos outros países restringiram e proibiram o seu uso (DUNN, 2016). Em fevereiro de 2012 o Departamento de Defesa do Estados Unidos removeu das lojas todos os produtos contendo DMAA. No mesmo período no Reino Unido o Agência Reguladora de Medicamentos e Produtos de Saúde advertiu várias empresas a interromper a venda destes produtos. Em março do mesmo ano o ministério da saúde de Nova Zelândia impôs a proibição por completo do DMAA no país (GEE et al., 2012; FORRESTER et al., 2013; SMITH et al., 2014; DUNN, 2016). Entretanto, o uso do DMAA ainda se tornou evidente por ter sido encontrado em testes toxicologicos no público em geral de Londres. Archer e colaboradores (2014)
26
detectaram o DMAA em 25% das amostras de urinas coletadas de banheiros portáteis nas ruas do centro de Londres (ARCHER et al., 2014; ARCHER et al., 2015). Finalmente, após a divergências de informações sobre a segurança de produtos contendo DMAA e diversos eventos adversos graves, bem como, o questionamento sobre sua origem, a Food and Drug Administrarion (FDA) anunciou em abril de 2013 que suplementos alimentares contendo o DMAA eram ilegais e deveriam ser retirados do mercado (FDA, 2013; KARNATOVSKAIA et al., 2014).
1.1.1 Estrutura e nomeclatura do DMAA
O DMAA é uma amina alifática simples de cadeia linear e sua estrutura molecular contém dois centros quirais. Está molécula partilha de amplas semelhanças estruturais com as anfetaminas e metanfetaminas (figura 1). Devido a esta grande semelhança, está pequena molécula pode resultar em falso positivo para anfetaminas (VORCE et al., 2011; VENHUIS & KASTE, 2012). O DMAA é um dos diversos nomes conhecidos para 4-metil-hexano-2-amina, além de serem encontrados na lista da União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) como: (Chemical Abstracts Service number: 105-41-9), methylhexaneamine, 2-amino-4-metilhexano, 4-metil-2-hexalamina, 4-metil-2-hexanoamina 1,3-dimetilpentalamina entre outros (GEE et al., 2012; ELIASON et al., 2012; FLEMING et al., 2012; FORRESTER et al., 2013; SMITH et al., 2014). O nome geranamina refere-se ao óleo de gerânio o que é questionado como uma fonte natural de DMAA (VENHUIS & KASTE, 2012).
Figura 1: Estrutura química do 1,3 dimetilamilamina (DMAA) relacionadas com anfetamina e metanfetamina (adaptado de Gee et al., 2012).
1.1.2 Mecanismo de ação do DMAA
Até o momento pouco é conhecido sobre o mecanismo de ação do DMAA, embora este mecanismo não esteja bem compreendido, alguns estudos em animais demonstraram que esta substância é capaz de atuar como um simpatomimético (MIYA & EDWARDS, 1953). Seus efeitos cardiovasculares podem se dar por sua ação como inibidor na recaptação de noradrenalina (NA) e/ou indiretamente como um agente liberador de NA. Este aumento na atividade de NA estimula a lipólise, aumentando assim a concentração sanguínea de ácidos graxos livres, o que fornece uma fonte adicional de energia durante o exercício (EUDY et al., 2013). Ainda, o DMAA pode estimular o músculo liso e agir como um vasoconstritor (BLOOMER et al., 2011; FORRESTER et al., 2013). Além disso, um recente estudo demonstrou o DMAA como um forte inibidor da enzima Citocromo P450 2D6 que é responsável por 25% do metabolismo de fármacos, componentes de suplementos alimentares entre outros (LIU et al., 2015). O DMAA é absorvido de forma eficiente pelo corpo quando ingerido via oral e seu metabolismo ocorre de forma relativamente lenta (4-12 horas) sendo excretado de forma ainda mais lenta através da urina (24 horas) (VENHUIS et al., 2012). Com base nos dados descritos na literatura sobre o possível mecanismo de ação, montamos o seguinte esquema mostrado na figura 2.
Figura 2: Mecanismo de ação do DMAA sobre os diferentes tecidos do organismo de acordo com os dados descritos na literatura.
28
1.1.3 O DMAA possui origem natural?
A origem natural do DMAA (plantas de gerânio ou Pelargonium graveolens), argumento da indústria fabricante dos suplementos, tem sido seriamente debatida na literatura. Esta discussão teve origem entre os anos de 2010-2013, quando o rótulo de diversos suplementos alimentares contendo DMAA vendido no mercado, listava este ingrediente como um extrato de planta. Consequentemente, estudos começaram a investigar folhas, caules e óleos de plantas de gerânio com o objetivo de identificar e determinar a presença deste ingrediente ser de fato de origem natural, já que está molécula pode ser facilmente preparada sinteticamente (FLEMING et al., 2012; LI et al., 2012; VENHUIS & KASTE, 2012).
Estudos utilizando o método high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry, afirmaram conter a presença de DMAA em plantas de gerânio (FLEMING et al., 2012; LI et al., 2012). Estes resultados foram questionados já que estes estudos foram financiados pela USPlabs, empresa responsável pela produção de diversos suplementos que listava o DMAA em suas formulações. Entretanto, têm sido encontradas poucas evidências para esta sugestão, já que investigações independentes não detectaram a presença deste ingrediente em amostras de gerânio (ZHANG et al., 2012; DI LORENZO et al., 2012).
De fato, esta discussão não pode ser um caso de certo ou errado, já que falhas nos métodos, juntamente com as diferenças na origem das amostras de plantas de gerânio, como é o caso dos estudos citados anteriormente, processamento e composição podem explicar por que tanta controvérsia entre as investigações. Além disso, já se sabe que as variações das condições ambientais e localizações geográficas têm grande efeito sobre os perfis químicos das plantas (FLEMING et al., 2012; LI et al., 2012). Mesmo assim, vale ainda ressaltar que as concentrações de DMAA encontrados na grande maioria dos suplementos são elevadas e de modo geral as concentrações desta molécula encontrados em extratos de plantas são geralmente em pequenas proporções (ZHANG et al., 2012).
1.2 PRODUTOS CONTENDO DMAA
O DMAA esteve presente na formulação de mais de 250 suplementos alimentares, com concentrações que variavam de 25-65 mg (VENHUIS & KASTE, 2012) até 285 mg por dose nos suplementos (ZHANG et al., 2012). Este ingrediente
foi listado na composição de diversos produtos comercializados como por exemplo: Forthan, Forthane, Floradrene, Geranamine, Adrena GTM, Tiger ClawTM, Jack3dTM,
VyperizeTM, DStunnerTM, Razor8TM, MethyldreneTM, ALLMAXTM, Freak n MuscleTM,
Methyl FireTM, Hemo Rage BlackTM, Muscle WarfareTM, NapalmTM, Nitric BlastTM,
OxyElite ProTM, PressurgeTM, UnleashedTM, Muscle SpikeTM, Cellucor M5 ExtremeTM,
Body Octane GAME DAYTM, CryoShockTM, FlashoverTM, C4TM, MesomorphTM, e
PumpFixxTM (figura 3) (FORRESTER et al., 2013). A venda destes produtos
contendo DMAA foram responsáveis por mais de 100 milhões de dólares gastos nos Estados Unidos em 2010, sendo o Jack3d e o OxyElite Pro (OEP) os mais famosos encontrados no mercado (CARPENTER, 2012).
Figura 3: Alguns dos produtos comercializados que apresentava o ingrediente
DMAA em suas formulações (fonte
http://www.fitnessboutique.com.br/blog/Fitness/suplementoalimentar/suplementosco m-dmaa/).
1.2.1 Suplemento Oxyelite Pro (OEP)
O OEP é um conhecido suplemento produzido e comercializado pela USPlabs (figura 3). Este suplemento foi comercializado com o objetivo de auxiliar o consumidor na perda de peso, bem como melhorar a performance física durante o exercício (ROYTMAN et al., 2014). A formulação antiga deste suplemento continha uma combinação de diversos ingredientes que prometia aumentar um ou mais aspectos da taxa metabólica ou lipólise. Especificamente, este produto continha uma mistura de cafeína bauhinia purpurea, bacopa monniera, extrato de caule de gerânio (1,3 dimetilamilamina), cirsium oligophyllum e extrato de rauwolscine (figura 4) (MCCARTHY et al., 2012). Embora no rótulo deste suplemento não é descrito a quantidade de DMAA presente no produto, na literatura, um estudo descreveu a concentração de 31 mg de DMAA por porção (cápsula) de OEP (ZHANG et al.,
30
2012). Por fim, a presença do DMAA como ingrediente neste suplemento, começou a ser associado aos efeitos cardiovasculares e de toxicidade hepática, fazendo com que a FDA declarasse o banimento de todos produtos contendo DMAA do mercado, incluindo o OEP. Dentre um dos mais famosos encontrados no mercado, o OEP, foi reformulado em diversas versões sem a adição do DMAA onde permitiu que USPlabs retornasse com este suplemento para o mercado (ROYTMAN et al., 2014; JOHNSTON et al., 2016).
Figura 4: Rótulo do suplemento OxyElite Pro (fonte www.oxyelite.pro)
1.2.2 Efeitos associados ao uso do DMAA isolado ou em produtos comercializados.
Uma revisão publicada no ano de 2012, indentificou diversos estudos em animais nos anos de 1940-1950 descrevendo que o DMAA possui efeitos similares aos da efedrinas e anfetaminas dos quais incluem: aumento da pressão sanguinea arterial, vasoconstrição, taquicardia, diurese e broncodilatação (VENHUIS & KASTE, 2012). Na literatura é descrito que em camundongos a dose letal (LD50) deste
ingrediente é de 39 mg/kg quando injetado intravenoso e de 185 mg/kg quando injetado intraperitoneal (MIYA & EDWARDS, 1952; SCHILLING et al., 2013) e em ratos a LD50 é de 72,5 mg/kg quando injetado intraperitoneal (MIYA & EDWARDS,
1952; ARCHER et al., 2015).
Em humanos, vários efeitos adversos foram relatados ao Texas Poison Center Network, Dallas, TX, EUA durante 2010-2011 associados a exposição de produtos contendo DMAA. Os efeitos descritos foram: taquicardia (28,6%), náusea
(16,1%), vômitos (12,5%), agitação/irritabilidade (8,9%), tremor (7,1%), dores abdominais (5,4%), dor torácica (5,4%), tonturas (5,4%), cefaleia (3,6%), hipertensão (3,6%), altos níveis de creatina fosfoquinase (1,8%), diaforese (1,8%), anormalidade do eletrólito (1,8%), hematêmese (1,8%), hiperventilação (1,8%), hipotensão (1,8%), midríase (1,8%), entorpecimento (1,8%), retenção urinaria (1,8%) e outros/não específicos (16,1%) (FORRESTER et al., 2013). Estes não são os únicos efeitos associado a tais produtos, casos mais graves e potencialmente fatais a vida dos consumidores destes suplementos foi descrita como: infarto agudo do miocárdio (SMITH et al., 2014), parada cardíaca (KARNATOVSKAIA et al., 2015), acidente vascular cerebral (GEE et al., 2010, GEE et al., 2012; YOUNG et al., 2012), efeitos hepatotóxicos (FOLEY et al., 2014) e morte (ELIASON et al., 2012; ARCHER et al., 2015). Entretanto, na grande maioria dos casos associados a estes efeitos estão relacionados ao consumo de doses altas e desconhecidas de produtos contendo DMAA ou ao uso de álcool, outros tipos de suplementos, drogas e exercício físico extenuante.
1.2.3 Estudos clínicos com DMAA isolado ou como suplemento OEP
Com intuito de estabelecer um perfil seguro em condições mais controladas, estudos clinicos foram desenvolvidos para determinar os efeitos causados pelo DMAA ou produtos contendo este ingrediente. Estes estudos foram desenvolvidos para verificar o perfil farmacocinéticos e dinâmicos para o DMAA. A questão é que a grande maioria destes estudos foram realizados com financiamento da USPlabs (BLOMMER et al., 2011; MCCARTHY et al., 2011; MCCARTHY et al., 2012; FARNEY et al., 2012; WHITEHEAD et al., 2012; SCHILLING et al., 2013) e em menor número por grupos de pesquisas independentes (não financiados pela USPlabs) (VAUGHAN et al., 2012; DOLAN et al., 2014; POWERS, 2015).
O DMAA em forma de suplemento alimentar é frequentemente ingerido combinado a cafeína, com intuito de potencializar os efeitos desta substância. Neste sentido, algumas investigações conduziram seus experimentos utilizando o DMAA isolado ou combinado a cafeína, enquanto, outros estudos avaliaram a administração de suplementos vendidos no mercado contendo DMAA. Quatro estudos estão disponíveis usando concentrações variáveis de DMAA e cafeína ingerido de forma aguda e crônica em um modelo placebo-controlado, estes estudos apresentaram efeitos notáveis sobre as respostas hemodinâmicas com aumento da
32
pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), duplo produto (DP) e frequência cardíaca (FC) de maneira dose dependente com a ingestão aguda destes ingredientes (BLOOMER et al., 2011a; BLOOMER et al., 2011b; BLOOMER et al., 2013; SCHILLING et al., 2013). As mudanças encontradas na pressão arterial (PA) e FC não foram explicadas pelas alterações nos níveis de norepinefrina ou epinefrina circulante (BLOOMER et al., 2011a). Além disso, efeitos ergogênicos da combinação destas substâncias no desempenho de corrida em humanos não foram evidentes (BLOOMER et al., 2011b).
Estudos com administração aguda e a longo prazo de suplementos contendo DMAA encontrados no mercado, como o Jack3d, (WHITEHEAD et al., 2012) e o OEP (FARNEY et al., 2012) foram realizados. Estes suplementos ingeridos a longo prazo não resultaram em quaisquer efeitos sobre a PA, FC e de outros marcadores de saúde avaliados. Quando ingerido ambos os suplementos OEP e Jack3d de forma aguda, apenas o OEP foi capaz de aumentar PAS, PAD e DP. Contudo, é difícil de atribuir os efeitos encontrados ao DMAA, já que, ambos os produtos contêm substâncias adicionais únicas (FARNEY et al., 2012). Como o OEP era vendido com a promessa de auxiliar na perda de peso corporal estudos conduzidos com a ingestão aguda (MCCARTHY et al., 2011; MCCARTHY et al., 2012) e crônica (MCCARTHY et al., 2012) demonstraram resultados positivos do suplemento sobre a redução do peso.
Na literatura a maioria dos estudos são desenvolvidos em humanos como descrito anteriormente, porém, apenas um estudo foi realizado em modelo animal a fim de avaliar o potencial de abuso do DMAA (DOLAN & KASTE, 2012) e um estudo em cultura celular resultando em um aumento no metabolismo, conteúdo mitocondrial e na Peroxissoma proliferator activated receptor coactivador 1 alpha (PGC-1α) (VAUGHAN et al., 2012). Contudo, a falta de estudos mecanicistas para compreender de fato os efeitos destes produtos, bem como, o pequeno número de provas em torno do DMAA, o uso de doses descontroladas ou desconhecidas, pesquisas experimentais com falta de rigor científico, associação com outros produtos, experimentos em um ambiente não controlado e com a grande maioria dos estudos financiados pela USPlabs, levou a elaboração e o desenvolvimento deste projeto.
34
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos fisiológicos e comportamentais de doses controladas do suplemento OEP ingerida de forma aguda e crônica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Avaliar os efeitos do OEP ingerido de forma aguda e crônica sobre a tolerância ao esforço físico.
2) Investigar os efeitos de doses controladas do OEP ingerida de forma aguda e crônica sobre parâmetros comportamentais.
3) Investigar os efeitos do OEP ingerida de forma aguda e crônica sobre a peso corporal, consumo de ração e água.
4) Investigar os efeitos do OEP ingerido de forma crônica sobre a toxicidade hepática.
5) Avaliar os efeitos do OEP ingerido de forma crônica sobre a massa tecidual.
6) Avaliar os efeitos do OEP ingerido de forma crônica sobre o estresse oxidativo circulante e tecidual.
7) Investigar os efeitos do OEP ingerido de forma crônica sobre a biogênese mitocondrial muscular esquelética.
8) Investigar os efeitos do OEP ingerido de forma aguda sobre respostas hemodinâmicas cardiovasculares.
36
3.1 CONSIDERAÇÔES ÉTICAS
Todos os protocolos experimentais foram aprovados e autorizados pela Comissão de Ética em Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Espirito Santo (UFES), sob o protocolo nº 007/2015. Todos os procedimentos experimentais estão em conformidade com os princípios internacionais para pesquisa envolvendo animais (Genebra), e com a legislação brasileira disposta na Lei n° 11.794/2008.
3.2 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus) machos, entre seis e dez semanas de idade. Os ratos foram fornecidos pelo biotério central do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas (PPGCF) da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). Todos os animais foram mantidos em condições adequadas com temperatura (23ºC ± 2ºC) e umidade controladas com livre acesso a água e ração, com ciclo claro-escuro de 12/12 horas. Os animais foram mantidos em caixas coletivas com no máximo cinco animais em cada caixa.
Inicialmente os ratos foram suplementados com doses controladas do suplemento OEP de forma a ingerir uma única dose (aguda) para avaliar os efeitos agudos sobre performance física, atividade locomotora espontânea, parâmetros comportamentais, consumo alimentar e respostas hemodinâmicas. Após os testes com a suplementação aguda, os animais foram suplementados diariamente por um período de 4 semanas (crônico). Ao final do período de suplementação crônica, foram avaliados novamente o efeito sobre a performance física, atividade locomotora espontânea, parâmetros comportamentais, consumo alimentar, além disso, foram avaliados massa tecidual, toxicidade hepática, estresse oxidativo e biogênese mitocondrial. Apenas o protocolo de medidas hemodinâmicas não foi realizado após a suplementação crônica. Em ambos os protocolos (agudo e crônico) os testes foram realizados 30 minutos após a ingestão do OEP, com exceção para o segundo teste de tolerância ao exercício que foi realizado 48 horas após o último dia de suplementação. O grupo 4,3 mg/kg de OEP foi excluído do protocolo crônico por não apresentar efeitos no teste de tolerância ao exercício desenvolvido após a ingestão aguda. Um esquema do desenho experimental realizado no presente estudo pode ser observado na figura 5.
Figura 5 – Esquema representativo do desenho experimental desenvolvido durante o projeto.
38
3.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DO SUPLEMENTO
As cápsulas do suplemento OxyElite Pro (OEP) foram abertas, pesadas e diluídas em solução de Tween20 a 5% com auxílio de vortex por três minutos. Uma solução estoque do OEP foi preparada na concentração de 24 mg de OEP para cada 1 ml de solução de Tween20 a 5%. As doses para cada animal foram calculadas com base no peso corporal e preparada em um volume padrão de 400 µl. Para a ingestão aguda (dose única) as doses de OEP foram preparados e administrados 30 minutos antes dos testes. Para a ingestão crônica (4 semanas de suplementação) os suplementos eram preparados por um período de 3 dias de suplementação. A administração foi realizada por gavagem via oral e todos os experimentos foram realizados no desenho cego, onde quem realizava o protocolo experimental não sabia o que cada animal havia ingerido. Os pesos dos animais foram avaliados semanalmente, ao longo das 4 semanas de suplementação para avaliação da perda de peso corporal.
3.4 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os grupos experimentais foram determinados de acordo as doses recomendadas no rótulo do produto pelo fabricante (uma cápsula de OEP para 70 quilogramas de peso corporal de um adulto). Os animais foram separados randomicamente em 4 grupos experimentais: grupo controle (Tween20 a 5%), 4,3 mg/kg de OEP (equivalente a uma capsula, dose mínima recomendada por dia), 12,9 mg/kg de OEP (equivalente a três cápsulas, dose máxima recomendada por dia) e 25,8 mg/kg de OEP (equivalente a seis cápsulas, dose não recomendada). As doses excessivas (não recomendadas) foram utilizados para avaliar os efeitos indesejados que poderiam ser causados pelo suplemento.
3.5 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)
Para analise comportamental foi utilizado o teste do Labirinto em cruz elevado (LCE), primeiramente a sala foi preparada nas condições adequadas para a execução do teste. Uma luz vermelha foi colocada para manter o ambiente confortável para os animais e uma câmera de vídeo digital foi posicionada a cima do aparato e acoplada a um computador para registro. O labirinto foi montado no centro da sala posicionado em baixo da câmera elevado a 60 cm do solo. O labirinto em
cruz elevado consiste em um aparato com dois braços abertos (sem paredes) e dois braços fechados (com paredes), com os braços de tamanhos iguais cruzados em ângulo reto conectados por uma área central. Os animais receberam a suplementação via gavagem e 30 minutos após a ingestão foram colocados na área central do labirinto com a cabeça voltada para um dos braços abertos, durante 5 minutos os animais poderiam andar livremente tanto entre os braços abertos quanto nos braços fechados. Durante a execução do teste não havia barulhos ou ruídos dentro da sala. O número de entradas em ambos os braços, assim como o tempo gastos em cada braço do LCE foram avaliados. Entre cada sessão de teste todo o aparato era limpo com álcool 70%. Os vídeos foram analisados utilizando o software AnyMaze.
3.6 OPEN FIELD
Imediatamente após a exposição do protocolo de labirinto em cruz elevada foram realizados o teste Open Field (campo aberto) utilizado para avaliação de atividade locomotora espontânea. O aparato consiste em uma caixa quadrada preta de acrílico medindo 43,2 cm x 43,2 cm fechado por paredes de 30,5 cm de altura posicionado no meio da sala. Uma câmera de vídeo digital foi posicionada em cima do aparato e acoplada ao computador para registro. Rapidamente após passar pelo LCE o animal era posicionado no centro da arena onde poderia se movimentar livremente por um período de 5 minutos. Os parâmetros determinados para avaliação da atividade locomotora espontânea foram: os números de cruzamento de um lado para o outro da caixa, distância total percorrida e tempo móvel. Entre cada sessão de teste todo o aparato era limpo com álcool 70%. As analises foram realizados pelo software AnyMaze.
3.7 TESTE DE TOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO (TTE)
Para avaliação de performance física foi utilizado o protocolo de teste de tolerância ao exercício (TTE). O teste foi realizado tanto com a ingestão aguda quanto após 4 semanas de suplementação (crônico). Com a ingestão aguda foi realizado apenas um TTE e após o período de suplementação crônica dois TTE foram realizados: um teste realizado 30 minutos após a última gavagem e um segundo teste 48 horas após ao término da suplementação. O teste de esforço
40
máximo constituiu em um teste escalonado em esteira motorizada para ratos com 6 baias individuais com altura 180 mm, largura interna 97 mm, comprimento de 385 mm (Sciencelabor, modelo SLP 033ª) por um período total de cinco dias (figura 6).
Figura 6 – Foto representativa da esteira e do teste de tolerância ao exercício realizado neste projeto. Este protocolo foi desenvolvido em três momentos, após 30 minutos a ingestão de uma única dose; 30 minutos após a última dose ao final do período de suplementação por 4 semanas (crônico); e 48 horas após a ingestão da última dose ao final do período de suplementação por 4 semanas.
A adaptação foi realizada nos três primeiros dias consecutivos. Os animais foram colocados em baias individuais e adaptados por um período de 10 minutos com velocidade incremental, iniciando com velocidade de 7 metros/minutos até o tempo de 4 minutos, aumentando a velocidade para 9 metros/minutos até o tempo de 7 minutos e finalmente com velocidade de 13 metros/minutos até o tempo de 10 minutos. Após o período de adaptação os animais ficaram em repouso por um dia (4º dia) e no dia seguinte ao repouso os animais foram submetidos ao teste de esforço máximo (5º dia). O teste iniciou com velocidade de 7m/min com incremento a cada 3 minutos, até que fosse atingida a velocidade máxima suportada pelos animais, ou seja, a exaustão. A exaustão foi estimada pela incapacidade de locomoção do animal durante o teste e as variáveis analisadas foram o tempo total e a distância em metros percorrido por cada animal durante o teste de esforço ao exercício. A tabela 1 mostra a velocidade utilizado em cada tempo durante o teste.
Tabela 1 – Velocidade percorrida por cada animal de acordo com o tempo durante o período do teste.
3.8 GAIOLA METABÓLICA
O teste de gaiola metabólica (figura 7) foi utilizado para avaliar o consumo de ração e água de cada animal por um período de 24 horas. Os animais de cada grupo foram colocados em gaiolas metabólicas individuais (TECNIPLAST, ITALIA) e o consumo de ração e água foram quantificados. O teste tem um período de duração de 2 dias. No primeiro dia os animais foram adaptados por um período de 24 horas antes do teste com uma dieta padrão com água e ração à vontade. Após o período de adaptação os animais receberam um volume de água padrão de 250 ml e uma quantidade de ração de 40g e permaneceram por mais um período de teste por 24 horas (2º dia). Após o período de teste a água e ração foram pesados e medidos e a diferença foi calculado para determinar o consumo alimentar de cada animal.
Figura 7 – Gaiolas metabólicas individuais utilizadas para o teste de consumo alimentar: A) local onde o animal é mantido durante o período de teste; B) bebedouro com volume de 250 ml; C) pote de armazenamento de ração com 40g acoplado a repartição de desperdício; e D) pote onde é armazenado o desperdício de água.
42
3.9 SACRIFÍCIO E COLETA DE TECIDOS
Ao final do período experimental, os ratos foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal da combinação de 100 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg de xylazina, para a retirada do sangue e eutanasiados com uma injeção intravenosa de ketamina. As amostras de sangue foram retiradas através da veia submandibular com seringa contendo heparina. As amostras de sangue foram centrifugadas a temperatura de 4ºC a 3.500 rpm com duração de 10 minutos. O plasma foi coletado e armazenados no -80ºC para futuras analises.
Após a coleta de sangue os animais foram eutanasiados e imediatamente as amostras de tecidos foram retiradas cirurgicamente: coração, glândulas adrenais, músculo esquelético (sóleo, gastrocnêmios ambas as porções) e uma porção do fígado. Os tecidos foram pesados, lavados em solução de tampão fosfato salino (PBS) e armazenados a -80ºC para futuras analises.
3.10 TOXICIDADE HEPÁTICA
A atividade das enzimas Alanina Aminotransferase (ALT) e Aspartato Aminotransferase (AST) e ˠ-Glutaminotransferase (GAMA-GT) foram medidas no plasma, usando kits comerciais Bioclin de acordo com as instruções do fabricante. Uma curva padrão foi construída usando solução estoque dos substratos das transaminases para quantificação. Todas as amostras de transaminases foram lidas no comprimento de onda de 505 nm e GAMA-GT a 405 nm.
3.11 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
3.11.1 Protocolo de TBARS em amostras de plasma
Os níveis de peroxidação lipídica foram determinadas usando o ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Ensaio espectrofotométrico baseado na reação entre Malondialdeído (MDA) e ácido tiobarbitúrico (TBA) (Leal et al., 2015). Foram colocadas em um eppendorf 75 µl de água destilada, 50 µl de plasma, 125 µl de ácido tricloroacético 17,5% e 125 µl ácido tiobarbitúrico 0,6% e rapidamente misturados em um vortex. Em seguida as amostras foram colocadas em banho seco a 100ºC durante o período de 20 minutos. Após ser retirado do banho seco, as amostras foram esfriadas em gelo e em seguida acrescentados 125 µl de ácido tricloroacético 70% e novamente misturado em vortex. As amostras foram incubadas em caixa tampada contendo gelo por 20 minutos. Após o período
de incubação as amostras foram centrifugadas a 3.000 rpm por 15 minutos a temperatura de 4ºC. Ao final do processo de centrifugação 100 µl do sobrenadante foram coletados e colocados em triplicata em placa de Elisa e lida em comprimento de onda a 532 nm usando espectrofotômetro. Para o cálculo da concentração de MDA de cada amostra utilizou-se a seguinte fórmula: Concentração de MDA (nmol) = [Absorbância a 532 nm/ (coeficiente de extinção molar do MDA x caminho óptico)] x diluição. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford.
3.11.2 Protocolo de TBARS em amostras de tecido
Para realizar o protocolo de peroxidação lipídica nos tecidos (músculo sóleo e gastrocnêmio porção vermelha e branca, fígado e coração) foram colocadas 100 mg de amostra de cada tecido avaliado em um eppendorf e homogeneizada em 500 µL de solução de ácido tricloroacético 15% misturado ao hidroxitolueno butilado 45 nM. Após o processo de homogeneização as amostras foram levadas ao banho seco com temperatura de 100ºC por um período de 15 minutos. Assim que foram retiradas do banho seco as amostras foram rapidamente centrifugadas a uma velocidade de 14.000 rpm por um período de 2 minutos a temperatura de 4ºC. Ao término do processo de centrifugação 300 µL do sobrenadante foram coletados e misturado com 300 µL de Ácido tiobarbitúrico 0,73% com as amostras ainda quente. Rapidamente as amostras foram levadas novamente ao banho seco a 100ºC por um período de 30 minutos. Em seguida ao término dos 30 minutos foram pipetadas 200 µL do sobrenadante de cada amostra em triplicata em placa de Elisa e lida em comprimento de onda a 532 nm usando espectrofotômetro. Para o cálculo da concentração de MDA em cada amostra utilizou-se a seguinte fórmula: Concentração de MDA (nmol) = [Absorbância a 532 nm/ (coeficiente de extinção molar do MDA x caminho óptico)] x diluição. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford.
3.12 OXIDAÇÃO DE PROTEÍNA
3.12.1 Protocolo de AOPP em amostras de plasma
Um outro marcador para o estresse oxidativo, chamado de produtos avançados da oxidação de proteínas (AOPP) foi utilizado. Os níveis dos produtos de
44
oxidação proteica presente no plasma foram quantificados pipetando diretamente na placa de Elisa 160 µL de PBS seguidos de 10 µL de iodeto de potássio (KI) e 40 µL da amostra do plasma. Após o termino da primeira etapa do protocolo foram adicionados 20 µL de ácido acético glacial (ultrapuro) e em seguida a placa foi submetida ao shaker para agitação com velocidade de 90 rpm durante um tempo de 6 minutos. Imediatamente ao processo de agitação a leitura da placa foi realizado com o comprimento de onda de 340 nm. A curva padrão para quantificar os níveis de AOPP foi feita com o uso de cloramina-T (0 a 100 µM). Todas as amostras foram feitas em triplicata e o resultado final foi expresso em µmol/L. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford.
3.12.2 Protocolo da AOPP em amostras de tecido
Os níveis de AOPP nos tecidos (músculo sóleo e gastrocnêmio porção vermelha e branca, fígado e coração) foram determinados de acordo com o seguinte protocolo, foram colocados 200 mg de amostra de tecido em um eppendorf para homogeneização com 1,0 mL de água destilada. Após este processo as amostras foram centrifugadas a temperatura de 4ºC com velocidade de 3.500 rpm em um tempo de 10 minutos. Foram pipetados diretamente na placa de Elisa 40 µL do sobrenadante e acrescentado 160 µL de PBS, 10 µL de Kl e 20 µL de ácido acético glacial (ultrapuro), submetidos ao shaker para agitação com velocidade de 90 rpm durante 6 minutos. A leitura foi realizada em comprimento de onda de 340 nm. Imediatamente ao processo de agitação a leitura da placa foi realizado com o comprimento de onda de 340 nm. A curva padrão para quantificar os níveis de AOPP foi feita com o uso de cloramina-T (0 a 100 µM). Todas as amostras foram feitas em triplicata e o resultado final foi expresso em µmol/L. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford.
3.13 QUANTIFICAÇÃO DO RNAm do PGC-1α
Para a análise da expressão relativa do gene do peroxissoma proliferator activated receptor coactivador 1 alpha (PGC-1α), foi utilizado o método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR). As amostras dos músculos
esqueléticos foram homogeneizadas em Trizol e o RNA total foi isolado de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Life Technologies, Strathclyde, UK). A concentração total do RNA e sua integridade foram avaliadas, e posteriormente foi realizado o RT-PCR. A expressão do RNAm foi avaliada por oligonucleótideos iniciadores como se segue: PGC-1α, 5’-ACC AAA CCC ACAGAGAACAG-3’ e 5’ GGGTCAGAGGAAGAGATAAAGTTG-3’. A expressão de Ciclofilina A, 5’-AATGCTGGACCAAACACAAA-3’ e 5’-CCTTCTTTCACCTTCCCAAA-3’, foi utilizada como controle interno do erro experimental da RT-PCR. A quantificação da expressão de gene alvo foi realizada com o kit SYBRgreen PCR Master Mix (Applied Biosystem, CA, EUA). A expressão relativa do RNAm foi realizada por PCR em tempo real utilizando o Sistema de Dectecção de Sequência ABI PRISM 7700 (Aplicado Biosystem).
3.14 AVALIAÇÃO DE DNA MITOCONDRIAL
A relação DNA mitocondrial e nuclear foi utilizada para estimar o número de cópia mitocondrial no tecido muscular esquelético. O DNA do músculo esquelético foi extraído usando Trizol seguindo as instruções dos fabricantes (Invitrogen Life Technologies, Strathclyde, UK). O DNA template, também chamado de fita molde, foi amplificado por PCR em tempo real para determinar a quantidade relativa de DNA mitocondrial e nuclear usando o kit SYBRgreen PCR Master Mix (Applied Biosystem, CA, USA). Os seguintes primers para o gene ND1 (subunidade 1 da NADH desidrogenase) 5’-TCGGAGCCCTACGAGCCGTT-3’ e 5’-AGGGAGCTCGATTTGTTTCTG-3’ e para o gene do RNA 18S codificado pelo núcleo, 5’-TAGTTGCATCTTGGGAGCGGG-3’ e 5’-CCGCGGTCCTATTCCATTATT-3 foram usados. As expressões de DNA’s mitocondrial e nuclear foram realizadas por meio do PCR tempo real utilizando o Sistema de Dectecção de Sequência ABI PRISM 7700 (Aplicado Biosystem).
3.15 AVALIAÇÃO HEMODINÂMICAS DIRETA
Para a medida direta da pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC), os animais foram pesados e anestesiados com ketamina 90 mg/kg e Xylazina 10 mg/kg através de injeção intraperitoneal, e submetidos à cirurgia para cateterização da artéria femoral direita. Após a anestesia os animais eram fixados em uma mesa
46
cirúrgica adequada para ratos, feita com uma superfície plana na posição de supino. A pele entre a pata esquerda e o abdômen, onde foi feita a incisão cirúrgica foi cuidadosamente limpa para a introdução do cateter na artéria. Após a identificação da arterial femoral, ela foi cuidadosamente separada e cateterizada usando uma cânula de polietileno PE-50 acoplada na ponta uma cânula de polietileno PE-10 preenchida com solução de heparina (50 UI/mL), para evitar a formação de coágulos, e ocluídas com um pino de metal. O cateter foi transpassado com auxílio de um trocáter pelo tecido subcutâneo ao longo do dorso até próximo a região do pescoço, no qual, ficou exteriorizado. A extremidade do cateter foi fixada à pele para avaliação das medias hemodinâmicas.
As medidas hemodinâmicas foram realizadas 24 horas após o procedimento cirúrgico com o animal consciente. Para medidas hemodinâmicas a cânula foi lavada com solução de heparina para evitar possíveis interferências durante o registro, em seguida os animais foram mantidos com a cânula acoplada ao transdutor de pressão conectado a um sistema de aquisição de dados (BIOPAC Systems Santa Barbara, CA, USA) por quinze minutos para a estabilizar o sinal, após este tempo o suplemento foi administrado via gavagem e os parâmetros hemodinâmicos foram registrados por mais uma hora e trinta minutos em um ambiente isento de barulhos e ruídos (figura 8). As variáveis hemodinâmicas pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) foram avaliados pelo software LabChart.
Figura 8 – Registro de um animal consciente realizado no presente estudo para avaliação dos efeitos da suplementação com OEP sobre as respostas hemodinâmicas. Este protocolo foi desenvolvido apenas com uma única ingestão do suplemento.
3.16 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados serão expressos como média± erro padrão da média (EPM). Os resultados obtidos no TTE, Open Field, LCE e peso corporal foram avaliados usando a análise de variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas. Quando ANOVA resultou em diferença significante, está análise foi seguida pelo teste post-hoc Bonferroni. Ingestão de ração e água, AST, ALT e GAMA-GT e estresse oxidativo foi usado analise de variância (ANOVA) de uma via. Quando ANOVA resultou em diferença significante, está análise foi seguida pelo teste post-hoc Bonferroni. Os valores de p < 0.05 foram considerados estatisticamente significativo. Software de estatística Prism 6.0 (Graphpad, Inc., San Diego, CA, EUA) foi usado para todas analises.
48
