UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
CINÉTICA DO FLUORETO SOB DIFERENTES FORMAS APÓS ESCOVAÇÃO COM DENTIFRÍCIO DE PRÓPOLIS VERMELHA BRASILEIRA: ENSAIO CLÍNICO
RANDOMIZADO
FRANCISCO JOSIMAR GIRÃO JÚNIOR
FORTALEZA 2020
FRANCISCO JOSIMAR GIRÃO JÚNIOR
CINÉTICA DO FLUORETO SOB DIFERENTES FORMAS APÓS ESCOVAÇÃO COM DENTIFRÍCIO DE PRÓPOLIS VERMELHA BRASILEIRA: ENSAIO CLÍNICO
RANDOMIZADO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles (Universidade Federal do Ceará).
FORTALEZA 2020
FRANCISCO JOSIMAR GIRÃO JÚNIOR
CINÉTICA DO FLUORETO SOB DIFERENTES FORMAS APÓS ESCOVAÇÃO COM DENTIFRÍCIO DE PRÓPOLIS VERMELHA BRASILEIRA: ENSAIO CLÍNICO
RANDOMIZADO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em __/___/2020
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________ Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________ Profa. Dra. Lidiane Costa de Souza
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________ Profa. Dra. Thereza Cristina Farias Botelho Dantas
“A Deus, à minha família e aos meus amigos, que junto a mim cultivaram este sonho.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela força que me foi dada para chegar ao fim dessa etapa de minha vida.
À memória do meu pai, Josimar Girão, que permanece viva em meu coração, e nunca permite que eu olhe para trás com arrependimento, mas sempre com orgulho daquilo que fiz e conquistei.
À minha orientadora, professora Dra. Marta Maria de França Fonteles, pela confiança depositada em mim e pela paciência e brandura com a qual sempre me tratou.
À minha esposa, Sandra Mara, por sempre ficar ao meu lado não importando o quão duras eram as batalhas nem o quanto ela teria que ceder para que eu pudesse seguir em frente com este sonho.
À minha família pelo apoio e pelo suporte que me deram, em especial minha mãe, Deuracy Nobre, que nunca permitiu que os maus pensamentos me dominassem e tentassem me fazer desistir.
À minha tia Delvanci, seus filhos, genros e nora, que me deram um lugar para chamar de lar mesmo longe da minha querida cidade natal, sem vocês essa jornada teria sido infinitamente mais árdua.
À Ideijane Sena e Wellington Santos que me trataram como um filho durante o período em que morei junto a eles.
À Lídia Valadas por ter sido desbravadora de diversos caminhos que guiaram meus passos até aqui, e que sem pensar duas vezes compartilhou de suas conquistas e ofereceu a mim oportunidades de crescimento.
À Mara Lotif, que dedicou inúmeras horas de seus dias para se fazer presente nos dias de experimento, partilhando dos momentos de êxito e revés sem desistir do propósito.
Ao Dr. Peter Bottenberg, pelo auxílio crucial na implementação do método utilizado e na análise estatística dos resultados.
Ao meu eterno professor Edilson Martins, por um dia ter me apresentado o caminho que hoje luto para trilhar.
Ao professor Said, pela manipulação dos dentifrícios e pela prontidão em esclarecer minhas dúvidas sempre que o procurei.
A todos os funcionários que compõem o Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, que prestaram seus serviços de maneira exemplar e humana.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico por me proporcionar o apoio financeiro necessário para cumprir as atividades do mestrado.
Aos participantes que se disponibilizaram a participar desse estudo.
Aos meus amigos, que se tornaram verdadeiros irmãos, que fizeram parte da minha formação humana e sempre estiveram presentes.
Aos pastores Carlos Sousa e Dislene Maia, por suas palavras de ensinamento e orações, que me sustentaram espiritualmente ao longo dessa caminhada.
Ao pastor Roberto Silva, por ser o amigo de conversas longas e descontraídas, que sempre atendeu ao meu chamado nos momentos de necessidade.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação profissional e acadêmica, um pouco de cada um de vocês é o que me faz ser o que sou hoje.
“Tenho duas armas para lutar contra o desespero, a tristeza e até a morte: o riso a cavalo e o galope do sonho. É com isso que enfrento essa dura e fascinante tarefa de viver” (Ariano Suassuna)
RESUMO
Existem vários compostos naturais com atividade biológica que tiveram suas propriedades e aplicabilidade avaliadas em Odontologia, dentre eles a Própolis Vermelha Brasileira (PVB), um complexo resinoso com diversas atividades biológicas documentadas na literatura, sendo um produto natural dos mais promissores, com atividades antimicrobianas e anti-inflamatórias comprovadas in vitro e in vivo. Os tecidos duros dentais passam por processos contínuos de desmineralização seguidos de remineralização e restauração da integridade do esmalte dental, processos influenciados por vários fatores, como presença de saliva, concentração de fluoreto biodisponível e controle do biofilme dental. Dentifrícios fluoretados com propriedades antimicrobianas são cada vez mais indicados para o controle de biofilme dental, onde a incorporação com produtos naturais é uma alternativa acessível e eficaz. Este estudo teve como objetivo avaliar a disponibilidade de flúor após o uso de um creme dental incorporado à própolis vermelha brasileira (PVB, número de patente INPI BR1020170110974) e compará-lo a um creme dental com flúor em participantes saudáveis. Este estudo foi conduzido em um design duplo-cego, randomizado, controlado e cruzado. Duas formulações de dentifricio foram produzidas, para que os participantes utilizassem em dois momentos. A primeira consistia de um dentifrício fluoretado PVB (G1) e a segunda de um dentifrício fluoretado comum (G2). Antes do estudo e entre os diferentes tratamentos, foi aplicado um período de washout com pasta de dente não fluoretada por três dias. As amostras de saliva dos participantes foram coletadas nos momentos: 0 - baseline e 5, 15, 30, 45 e 60 minutos após a escovação com cada dentífricio. As amostras foram analisadas eletroquimicamente quanto ao fluoreto (EIS), utilizando o método descrito por Cury e colaboradores. As concentrações de fluoreto salivar por ponto de amostragem foram submetidas ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e comparadas pelos testes de Wilcoxon e Mann-Whitney entre os dois cremes dentais. O valor de α foi estabelecido em 0,05 em todos os casos. As concentrações de fluoreto salivar não apresentaram diferença estatisticamente significante na comparação dos dois tratamentos (p> 0,05). Após uma hora, todas as concentrações disponíveis de flúor na saliva diminuíram, sem diferença significativa entre a PVB e as amostras de tratamento com dentifrício comum com flúor (p> 0,05; ANOVA bidirecional). Os resultados mostraram que, após 1 hora de escovação com os diferentes dentifrícios, não houve diferença entre as concentrações de flúor analisadas. Desta forma os resultados desse estudo sugerem que a própolis incorporada ao dentifrício não interferiu na cinética e biodisponibilidade do íon fluoreto nas amostras de saliva, possibilitando sua integração à fórmula farmacêutica, promovendo seus benefícios anti-inflamatórios e antimicrobianos sem comprometer a atividade anticárie da formulação.
ABSTRACT
FLUORIDE KINETICS IN DIFFERENT SHAPES AFTER BRUSHING WITH BRAZILIAN RED PROPOLIS DENTIFRICE: RANDOMIZED CLINICAL TRIAL. There are several natural compounds with biological activity that have had their properties and applicability evaluated in Dentistry, among them the Brazilian Red Propolis (BRP), a resinous complex with several biological activities documented in the literature, being o of the most promising natural products, with proven in vitro and in vivo antimicrobial and anti-inflammatory activities. Dental hard tissues undergo continuous demineralization processes followed by remineralization and restoration of dental enamel integrity, a process influenced by several factors such as the presence of saliva, bioavailable fluoride concentration and dental biofilm control. Fluoride dentifrices with antimicrobial properties are increasingly being indicated for dental biofilm control, where incorporation with natural products is an affordable and effective alternative. This study aimed to evaluate the availability of fluoride after use of a toothpaste incorporated with brazilian red propolis (BRP, INPI Patent Number BR1020170110974) and to compare it to a fluoride toothpaste in healthy participants. This study was conducted in a double-blind, randomized, controlled, and crossover design. Following a washout period with non-fluoridated toothpaste for three days, participants brushed with the common fluoride toothpaste, followed by three more washout days and a new brush with the propolis toothpaste. Saliva samples of participants were collected at the times: 0 - baseline and 5, 15, 30, 45 and 60 minutes after brushing with each toothpaste. The samples were electrochemically analyzed for fluoride (ISE) using the method described by Cury and collaborators. Salivary fluoride concentrations per sampling time point were submitted to the Kolmogorov-Smirnov normality test and compared by Wilcoxon and Mann-Whitney tests between both toothpastes. The value of α was set at 0.05 in all cases. Results: Salivary fluoride concentrations showed no statistically significant difference when comparing the two treatments (p> 0.05). After one hour, all available fluoride concentrations in saliva decreased, with no significant difference between BRP and common fluoride dentifrice treatment samples (p> 0.05; two-way ANOVA). The results showed that, after 1 hour of brushing with the different toothpastes, there was no difference between the fluoride concentrations analyzed. Thus, the results of this study suggest that the propolis incorporated in the dentifrice did not interfere in the kinetics and bioavailability of fluoride ion in saliva samples, enabling its integration with the pharmaceutical formula, promoting its anti-inflammatory and antimicrobial benefits without compromising the anti-caries activity of the formulation.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Representação da estrutura química dos isoflavonóides, neovestitol e
vestitol...19
Figura 2: Colmeia de abelhas em apiário na cidade de Marechal, Deodoro, Alagoas...20
Figura 3: Equação da reação de dissociação da hidroxiapatita na saliva...21
Figura 4: Equipamentos utilizados para as análises de fluoreto ... 27
Figura 5: Fluxograma de distribuição dos participantes no estudo...34
Figura 6: Eletrodo específico de flúor Orion 96-09, Orion Research Inc., Beverly, EUA, utilizado nas determinações de flúor realizadas na pesquisa...35
Figura 7: Padrões de fluoreto utilizados para calibrar o eletrodo, nas concentrações de 0,5 a 32 ppm...36
Figura 8: Fluxograma do método de análise de Flúor Total (FT), Flúor Iônico (FI) e Flúor Solúvel Total (FST) nas amostras de saliva...37
Gráfico 01: Concentração versus Tempo de FT, FI e FST na saliva após a escovação com dentifrícios fluoretados à 1500 ppm incorporado e não incorporado com PVB...40
Gráfico 02: Comparação da concentração de Flúor total em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios...41
Gráfico 03: Comparação da concentração de Flúor solúvel total em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios...41
Gráfico 04: Comparação da concentração de Flúor iônico em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios...42
Gráfico 05: Área sob a curva das concentrações de FT, FST e FI nas amostras de saliva dos participantes após uso dos dentifrícios...42
Gráfico 06: Concentrações máximas de FT, FST e FI nas amostras de saliva dos participantes após uso dos dentifrícios...43
LISTA DE QUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS
AmF Fluoreto de amina ANOVA Análise de variancia
ANVISA Agência Nacional de Vigilancia Sanitaria CG Cromatografia gasosa
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CMAX Concentração máxima
EIS Eletrodo íon seletivo
FDA Food and Drug Administration FI Flúor iônico
Fins Flúor insolúvel FST Flúor solúvel total FT Flúor total
FTIR Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier ICDAS II International Caries Detection and Assessment System MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MEFS Microextração em fase sólida
MFP Monofluorfosfato NaF Fluoreto de sódio OH- Íon hidroxila
pH Potencial Hidrogeniônico PVB Própolis Vermelha Brasileira ppm Partes por milhão
REBEC Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos SnF2 Fluoreto de estanho
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1 Produtos naturais ... 16
1.2 Própolis ... 17
1.3 Própolis vermelha brasileira ... 19
1.4 Flúor e remineralização dentária ... 20
1.5 Métodos de análise de fluoreto ... 25
2. OBJETIVOS ... 29
2.1 Objetivo geral ... 29
2.2 Objetivos específicos ... 29
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 31
3.1 Tipo de estudo e aspectos éticos ... 31
3.2 Preparação do dentifrício ... 31
3.3 Procedimentos para seleção dos sujeitos... 31
3.4 Examinadores ... 32
3.5 Critérios de inclusão ... 32
3.6 Critérios de exclusão ... 32
3.7 Medicamentos ... 33
3.8 Fase clínica... 33
3.9 Coleta de saliva e análise do pH ... 34
3.10 Análise do flúor total, solúvel e iônico ... 34
3.11 Método estatístico ... 38
4. RESULTADOS ... 40
5. DISCUSSÃO... 45
6. CONCLUSÃO ... 50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51
APÊNDICE I – FICHA DE ANAMNESE ... 59
ANEXO I – APROVAÇÃO DO CEP ... 60
1. INTRODUÇÃO
A cárie dentária e a doença periodontal são as doenças orais de maior prevalência na população mundial. A cárie dentária é caracterizada pela desmineralização dos tecidos duros dentários através da liberação de ácidos por bactérias cariogênicas a partir da fermentação de carboidratos provenientes da dieta. Já as doenças periodontais se manifestam pela destruição dos tecidos de sustentação dos dentes (gengiva, ligamento periodontal e osso) por toxinas provenientes de bactérias presentes na placa dentária subgengival (MAGALHÃES et al., 2011).
Um dos principais ativos utilizados para a prevenção e controle da cárie dentária é o flúor, que é acrescentado a vários produtos odontológicos tanto de uso pessoal como profissional, pois o fluoreto absorvido distribui-se através do fluido que circunda o esmalte dentário, formando fluorapatita, mais resistente aos ácidos bacterianos que a hidroxiapatita, por meio da substituição de íons hidroxila (OH-). A
disponibilização de flúor à comunidade através dos dentifrícios e da água fluoretada são, significativamente, os métodos preventivos mais bem-sucedidos (PEREIRA, 2014; WHELTON et al., 2019).
A aplicação tópica de flúor através de formulações como géis, cremes dentários, soluções e vernizes vêm sendo amplamente pesquisada quanto a sua capacidade preventiva na doença cárie e erosão dentária (ARAÚJO, 2016). Fórmulas farmacêuticas com fluoreto de sódio (NaF), fluoreto de estanho (SnF2), fluoreto de amina (AmF) e monofluorfosfato (MFP) são as mais comumente encontradas no mercado. Todos estes compostos possuem o mesmo mecanismo de ação, a indução de formação de fluorapatita sobre a superfície dentária, auxiliando como barreira mecânica na resistência a ácidos, na orientação da difusão dos íons no processo de desmineralização dentária (FERNÁNDEZ; TENUTA; CURY, 2015) e funcionando também como reservatório de fluoreto (LIRA et al., 2013).
Além do fluoreto como princípio ativo nos dentifrícios, os mesmos podem ser adicionados de outras substâncias ativas, como agentes antimicrobianos, o que pode ser benéfico quando há limitação da remoção do biofilme oral apenas pela escovação com dentifrício comum (CIEPLIK et al., 2019). No entanto, formulações de dentifrícios com antimicrobianos sintéticos vem diminuindo a cada dia devido às
evidências relacionadas a resistência microbiana e absorção sistêmica (WEATHERLY; GOSSE, 2017).
Dessa forma, crescem as pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de produtos à base de matérias primas naturais com propriedades terapêuticas. Logo, a procura por ativos naturais se mostra bastante promissora quando o conhecimento popular das espécies é associado ao método científico e à realização de ensaios farmacológicos, fatos estes que tornam o Brasil um dos países com maior potencial de avanço no campo de produtos naturais (SILVA et al., 2019a).
Dentre os produtos naturais mais promissores está a própolis, em especial a própolis vermelha brasileira (PVB) encontrada na região de Marechal Deodoro- Alagoas, a qual vem despertando grande interesse da comunidade científica devido ao enorme potencial que apresenta, tendo diversas propriedades terapêuticas já estudadas, sendo uma das mais significantes a antimicrobiana (CABRAL, 2008).
A PVB foi o 13º tipo de própolis a ser identificado no país, sendo os flavonoides a espécie química majoritária na sua composição (DALEPRANE; ABDALLA, 2013). Logo, a PVB é considerada uma fonte promissora no desenvolvimento de novos produtos baseados em matérias-primas naturais, principalmente devido às atividades antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante já descritas na literatura (AZEVEDO et al., 2018).
Um dos principais pontos favoráveis do uso de produtos naturais é a sua aceitação popular, o que gera boas perspectivas no mercado, tornando os produtos odontológicos de origem natural bastante promissores (SOARES, 2010). Normalmente, quanto às características químicas, os compostos antimicrobianos naturais são ricos em uma gama de terpenos, sesquiterpenos e diterpenos. Enquanto isso, saponinas e flavonoides, que têm atividade antimicrobiana largamente conhecida, são encontrados em frutas, legumes, nozes, sementes, caules, flores, mel e própolis (SILVA et al., 2016).
Em Odontologia, as pesquisas com produtos naturais vêm crescendo, levando pesquisadores e indústrias a buscarem por matérias primas que possuam atividade terapêutica satisfatória, com menor toxicidade e biocompatibilidade (SOARES, 2010). São diversos os compostos naturais que já tiveram suas propriedades e aplicabilidades avaliadas no campo da Odontologia, dentre eles
estão os diversos tipos de própolis, sendo as mais estudadas a própolis verde e a vermelha, principalmente devido à sua atividade inibitória contra microrganismos orais. Também já foram estudados o alecrim (Rosmarinus officinalis), a calêndula (Calendula officinalis) e o guaco (Mikania glomerata), que são espécies que demonstram atividade antimicrobiana sobre as bactérias que compõem o biofilme oral (CAVALCANTI; ALMEIDA; PADILHA, 2011; PINHEIRO et al., 2012).
Devido as propriedades terapêuticas da PVB, principalmente a antimicrobiana, já comprovada in vitro e in vivo, foi desenvolvido um dentifrício fluoretado incorporado com PVB 1% (FURTADO JÚNIOR, 2019). Como o flúor desempenha um importante papel no processo de prevenção e controle da cárie dentária, é indispensável que ele permaneça biodisponível na cavidade oral para exercer sua atividade anticárie. Dessa maneira, torna-se importante avaliar se há a manutenção dos níveis apropriados de fluoreto na saliva quando utilizado o dentifrício fluoretado de PVB 1%.
1.1 Produtos naturais
O uso de produtos naturais como alternativa terapêutica pelo ser humano remonta a idade antiga. Inicialmente esse uso se dava pela ingestão das diversas partes de vegetais na busca por alívio e cura de doenças. A evolução das civilizações Oriental e Ocidental é repleta de exemplos do uso de recursos naturais como meios terapêuticos, destacando-se as civilizações Egípcia, Greco-romana e Chinesa (VIEGAS JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO, 2006; LIU et al., 2019).
Apresentando mais de 20% das espécies do planeta, o Brasil é o país líder em biodiversidade. Estima-se que muitas espécies ainda não foram estudadas, constituindo assim uma reserva de matérias-primas com possível aplicabilidade medicinal (BRASIL, 2016; GIULIETTI et al., 2005).
O estudo dos vegetais já reconhecidos como medicinais e a procura por novas espécies potencialmente terapêuticas é de suma importância, principalmente no que diz respeito ao desenvolvimento e aprimoramento de medicamentos fitoterápicos e opoterápicos. Muitos dos medicamentos hoje presentes no mercado são provenientes de diversos constituintes vegetais e seus derivados semissintéticos (WILSON; DANISHEFSKY, 2006).
A busca contínua por novos compostos antimicrobianos naturais, justifica-se pelo crescimento constante da resistência bacteriana, gerado muitas vezes pelo uso abusivo de ativos como o Triclosan (WEATHERLY; GOSSE, 2017). Nesse contexto entram os ativos antimicrobianos derivados de matérias primas naturais, como a própolis, que possui atividade contra diversos microrganismos de interesse na medicina (JUIZ, 2010).
1.2 Própolis
São 14 os tipos de própolis já identificados no Brasil, os quais são separados conforme suas composições e propriedades bioativas, sendo a comparação da composição química com a fonte vegetal o método preferível para tal classificação (TIVERON et al., 2016). A PVB integra o décimo terceiro tipo, apresentando grandes e diversificadas propriedades farmacológicas, o que vem ocasionando interesse do mercado internacional (CABRAL, 2008).
Própolis é a denominação generalista dada ao produto resinoso, gomoso e balsâmico produzido pelas abelhas (Apis mellifera) através da coleta de resina de diversas partes de vegetais e da incorporação desta com secreções salivares, cera e pólen (TORETI et al., 2013). A resina em sua forma natural e seus extratos apresentam diversas utilidades no tratamento de doenças, o que está relacionado às suas atividades antimicrobiana, antisséptica, antifúngica, antioxidante, antitumoral, anti-inflamatória, citotóxica, anti-úlcera, imunomodulatória e cardioprotetoras (ABUBAKAR et al., 2014; AHMED et al., 2017; DANTAS SILVA et al., 2017). A própolis é reconhecida como um composto seguro para o consumo humano, sendo aplicada em produtos com finalidades terapêuticas, cosméticas e como aditivo alimentar (DALEPRANE; ABDALLA, 2013).
A própolis é usada pelas abelhas na formação das paredes das colmeias, com o intuito de evitar sua contaminação por bactérias e fungos além de fortificar a estrutura da colmeia. Cada tipo de própolis apresenta cores distintas e é composta por diferentes substâncias, dentre estas, derivados de ácido cinâmico, flavonoides, ácidos graxos, hidrocarbonetos, outros compostos orgânicos e minerais (BANKOVA; POPOVA; TRUSHEVA, 2014). São diversos as variáveis que podem alterar a
composição da própolis, como por exemplo o tempo de coleta, origem geográfica, flora local, espécies de abelhas e métodos de extração (SILVA et al., 2019a).
Já foram relatados mais de 300 compostos diferentes nas diversas classes de própolis, incluindo ácidos fenólicos e seus ésteres, flavonoides, terpenos, triterpenos, aldeídos aromáticos, álcoois, ácidos graxos, estilbenos e esteroides, aminoácidos, lignanas e açúcares, dentre outros. Todavia, as espécies químicas fenólicas representam a maior porção destes compostos, dessa maneira a própolis atrai a atenção dos mais diversos campos de pesquisa devido às suas propriedades funcionais, biológicas e farmacológicas (VALENZUELA-BARRA et al., 2015; XUE et al., 2019).
O Brasil é o país com maior representatividade em pesquisas a respeito de produtos derivados de abelhas, incluindo própolis (SENEL; DEMIR, 2018). A origem botânica proporciona uma enorme diferenciação nos tipos de própolis presentes no Brasil, e além disso, o clima brasileiro permite que as abelhas produzam própolis por toda a extensão do ano. Em estudos realizados para avaliar o efeito do período de coleta da própolis na sua composição química e atividade antibacteriana foi observada variabilidade sazonal nas concentrações de suas substâncias ativas, revelando maior presença desses constituintes e maior atividade antibacteriana da própolis colhida na estação chuvosa (BUENO-SILVA et al., 2017). A legislação brasileira considera a própolis um produto alimentício, tendo sua produção e comercialização regida pela portaria Nº 6, de 25 de julho de 1985 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), com segurança comprovada pelo amplo uso popular tradicional (BRASIL, 1985).
A fração volátil da própolis está diretamente ligada à sua região geográfica de origem e é um dos atributos para determinação de qualidade mais importantes que definem o caráter organoléptico da própolis. Para autenticar e identificar as diversas classes de compostos químicos e marcadores na própolis de várias origens botânicas e geográficas têm sido empregados diversos métodos, entre estes a cromatografia gasosa (CG) e a microextração em fase sólida (MEFS) representam ferramentas confiáveis na análise de compostos orgânicos voláteis (BANKOVA; POPOVA; TRUSHEVA, 2014; CHENG et al., 2013).
1.3 Própolis vermelha brasileira
A PVB trata-se de uma resina produzida pelas abelhas, Apis mellifera, através da coleta de exsudatos da espécie vegetal Dalbergia ecastophyllum, sendo usada na estrutura da colmeia e na defesa contra agentes externos, como fungos, microrganismos e insetos. A PVB é heterogênea e complexa, com mais de 180 compostos identificados, dos quais se destacam os flavonoides, compostos orgânicos de tamanha importância nesta composição que são utilizados como medida de qualidade de amostras (DE-MELO et al., 2014).
As várias categorias de própolis brasileira apresentam atividade farmacológica, destacando-se na Odontologia a PVB, que demonstrou atividade antiplaca e anticariogênica in vitro e in vivo. Entre os constituintes químicos que compõem a própolis vermelha nordestina merecem destaque o vestitol e o neovestitol (Figura 1), os quais são isoflavonoides que apresentam atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus aureus, Actinomyces naeslundii e significante atividade anti-inflamatória (BUENO-SILVA et al., 2013; RODRIGUES NETO et al., 2019).
Figura 1 − Representação da estrutura química dos isoflavonóides, neovestitol e vestitol
Fonte: BUENO-SILVA et al (2013)
A PVB se destaca entre os outros tipos de própolis por apresentar os isoflavonoides vestitol e neovestitol na sua composição química, que estão relacionados as suas propriedades terapêuticas. Estudos anteriores demonstram que em baixas concentrações (0,1-1,0%) essa própolis já apresenta atividade antimicrobiana e anti-inflamatória (AZEVEDO et al., 2018; FRANCHIN et al., 2016; PORTO et al., 2018).
A PVB é especificamente originada da região de Marechal Deodoro – Alagoas (figura 2), fazendo o Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) conferir à região o título de Indicação Geográfica, garantindo a esse estado o certificado internacional de produtor exclusivo desse tipo de própolis no mundo, onde se produz uma própolis com qualidade constante devido às condições de sazonalidade e clima da região (FREIRES; ALENCAR; ROSALEN, 2016; FRANCHIN et al., 2016; SALATINO, 2018).
Figura 2 – Colmeia de abelhas em apiário na cidade de Marechal, Deodoro, Alagoas.
Fonte: DAUGSCH (2007)
As indústrias farmacêutica e cosmética internacionais demonstram alto interesse na PVB, gerando alta demanda por parte de nações como Japão, China, Rússia, França e Alemanha. A produção e o consumo de PVB se encontram em expansão no mercado internacional, provocando uma modernização cada vez maior de seus derivados e progressivo interesse na padronização dos produtos (AZEVEDO et al., 2018; DO NASCIMENTO et al., 2016; SALATINO, 2018).
1.4 Flúor e remineralização dentária
O esmalte dentário maduro é o tecido com maior mineralização do corpo humano, sendo formado por 96% de cristais inorgânicos de fosfato de cálcio e hidroxiapatita, constituindo a ultraestrutura prismática do tecido, 3% de água e 1% de matriz orgânica (TUNG; EICHMILLER, 2004; YEH et al., 2005). Tal tecido
apresenta dureza altíssima, porém pode sofrer desmineralização ácida, a qual é intensamente influenciada pelo pH e atividade iônica do ambiente oral (FEJERSKOV; KIDD, 2011).
Os tecidos duros dentários passam por contínuos processos de desmineralização seguida por remineralização e reestabelecimento da integridade do esmalte dentário por conta do processo de controle do biofilme dentário, presença de saliva, entre outros fatores (SILVA, et al., 2008). Tal fenômeno está descrito pela equação da dissociação da hidroxiapatita na saliva ilustrada a seguir:
Figura 3 −Equação da reação de dissociação da hidroxiapatita na saliva.
Fonte: TEIXEIRA; BUENO; CORTÉS (2010)
Os cristais de hidroxiapatita são arranjados em uma configuração hexagonal, átomos de cálcio e fósforo apresentam-se na parte externa do cristal, e, no centro, grupamentos hidroxila são circundados por três átomos de cálcio. Tais cristais possuem, aproximadamente, 40nm de diâmetro. A relação de cada grupamento hidroxila no cristal desempenha um papel importante em sua estabilidade (PEREIRA; OLIVA, 2016). Entre os prismas está presente uma matriz orgânica, formada por proteínas, lipídeos e água, assim, mesmo o esmalte sendo extremamente duro e mineralizado, sua superfície é porosa, o que permite a circulação de íons, como sódio, potássio, magnésio e flúor. A solubilidade da hidroxiapatita depende de temperatura, pH e do grau de ionização da solução que circunda os cristais, dessa maneira, alterações dessas variáveis podem levar à solubilização dos cristais. Fisiologicamente a saliva é supersaturada de cálcio e fosfato, o que favorece o estado cristalino do esmalte (COSTA et al., 2009).
Devido à natureza da reação de equilíbrio da cavidade bucal, o esmalte se encontra em um estado constante de mineralização e desmineralização em condições de homeostase (cálcio e fosfato supersaturados, pH 6,8). No entanto, quando o pH cai e chega ao seu valor “crítico” (5,5), a solubilidade dos cristais aumenta e a dissolução ocorre. O efeito ácido sobre os grupamentos hidroxila no centro do cristal desestabilizam sua estrutura, resultando na formação de água.
Quando ocorre um desequilíbrio do processo de des-remineralização, ocasionando períodos frequentes de saída de íons do tecido mineral dentário, o que leva à destruição deste, ocorre a cárie dentária (CURY, 2001; WU, GENG; GAO, 2019).
Quando o íon fluoreto reage com os grupos hidroxila presentes na hidroxiapatita ocorre a formação de fluorapatita, formando uma estrutura com menor solubilidade quando comparada à apatita não ligada ao fluoreto. Em consequência disto, o pH crítico da apatita na presença de flúor é ligeiramente menor que o da estrutura original. Contudo, o desafio ácido bacteriano pode gerar valores de pH abaixo de 5,0, condições em que a presença de fluoreto na cavidade oral não é suficiente para inibir a dissolução da rede cristalina (CATE; BUZALAF, 2019).
O fenômeno da des-remineralização, equilibrado e na presença de fluoreto, existe de maneira estável e não provoca lesões relevantes no esmalte. Dessa forma, não há possibilidade de definir quanto tempo demanda a formação completa da lesão cariosa. Porém, ao adicionar uma dieta cariogênica ao conjunto de variáveis, na presença de placa, ocorre a desmineralização, ainda assim, a remineralização regulada pela saliva, que atua de maneira defensiva no organismo, é muitas vezes capaz de reverter o processo, evitando o progresso da lesão e reestabelecendo as condições normais sem causar prejuízos ao esmalte (FEJERSKOV; KIDD, 2011; SFALCIN et al., 2019).
O controle mecânico de placa feito através da escovação otimiza a função remineralizadora da saliva, mantendo a lesão do esmalte reversível por um período indeterminado. Assim, se o controle de placa for insuficiente ou a dieta cariogênica tornar-se mais frequente, há a possibilidade de surgimento de desmineralizações ainda em nível subclínico, as quais não são consideradas lesões de cárie, já que há ausência de sinais. Se houver o reequilíbrio da des-remineralização nas condições de lesão subclínica, seja por incremento do controle da placa ou diminuição da ingestão de dieta cariogênica, esta lesão poderá permanecer inativa por tempo indeterminado, sem ser diagnosticada como lesão cariosa (GELLER, 2007; NORONHA, 2016).
As desmineralizações causadas pelos constantes desafios cariogênicos podem ocasionar a impossibilidade de reversão da lesão inicial, levando ao avanço da lesão até o aparecimento de sinais. Assim, se o desequilíbrio permanece, a lesão irreversível poderá evoluir ao estado clínico, exibindo lesões de esmalte, surgindo
assim a lesão de cárie (SILVA et al., 2019b). Quanto maior o desequilíbrio, mais acentuada será a lesão, chegando à perfuração do esmalte, configurando assim uma lesão de cárie avançada. A eficácia do controle mecânico da placa é variável, e depende diretamente da periodicidade em que é realizada. Pode-se assim dizer que não há apenas um fator determinante para o surgimento de uma lesão de cárie, e sim um grupo de variáveis que compõem o desafio cariogênico (LIMA, 2007).
É necessário que haja uma concentração adequada de fluoreto solúvel, seja na forma de íon fluoreto ou monofluorfosfato (MFP), para que um dentifrício fluoretado seja classificado como eficaz na contenção da cárie dentária (KUMAR; SREEDHARAN, 2018). São as formas solúveis do flúor que têm a capacidade de modular a dinâmica dos processos que levam à formação de lesões de cárie, diminuindo a desmineralização e promovendo a remineralização da dentina e do esmalte. O flúor pode se ligar ao abrasivo presente na formulação do dentifrício, de tal maneira que a concentração total de flúor não representa a realidade da concentração do fluoreto solúvel disponível para intermediar o processo de des-remineralização (HASHIZUME et al., 2003).
A importância sobre o controle da concentração de fluoreto solúvel que deve estar presente nas formulações de dentifrícios é bem descrita na literatura. Nos Estados Unidos o órgão Food and Drug Administration (FDA) exige que o íon fluoreto solúvel (F-) para dentifrícios com base em NaF e os íons F- solúveis (F- mais
PO3F2-) para cremes dentários MFP não sejam inferiores a 60% do total de fluoreto,
da mesma forma na Austrália e na Comunidade Europeia foram estabelecidas regras semelhantes para a quantidade mínima de fluoreto solúvel que deve permanecer no dentifrício fluoretado durante o seu prazo de validade (PAIVA, 2017).
Para apresentarem atividade anticárie os dentifrícios devem apresentar pelo menos 1.000 ppm (partes por milhão) de flúor solúvel. Aos dentifrícios fluoretados é atribuída a redução mundial da cárie (FARHA, et al. 2006). O uso dos dentifrícios fluoretados se justifica pela capacidade de desestabilizar a placa dentária através da escovação e liberar flúor na cavidade oral simultaneamente. Entretanto, para que o dentifrício seja eficaz como agente anticárie sua formulação deve ser capaz de liberar flúor solúvel, seja como íon fluoreto ou MFP, na cavidade oral, interferindo assim no processo de formação da cárie, diminuindo a desmineralização do esmalte/dentina e favorecendo a remineralização (RICOMINI FILHO et al., 2012).
O potencial anticárie dos dentifrícios fluoretados é baseado em evidências científicas provenientes de diversos estudos clínicos randomizados e controlados. Foi através de estudos e evidências que se determinou que além da presença de flúor no dentifrício, é necessário que haja uma concentração mínima de flúor para que se obtenha a atividade anticárie eficiente (SASAKI, et al. 2017). Ainda é necessário acrescentar que a concentração de 1.000 ppm F deve apresentar-se em forma solúvel a fim de que o fluoreto seja capaz de interferir no processo de cárie. Deve-se levar em conta também que a concentração de flúor solúvel está diretamente ligada à compatibilidade química entre o agente fluoretado e o abrasivo utilizado na formulação (CURY et al., 2015).
Os sais de flúor que fazem parte das formulações de dentifrícios podem interagir com outros excipientes da formulação e impurezas, dando origem a sais insolúveis com eficácia anticárie limitada. Assim, faz-se necessário esclarecer que há diferença entre a concentração total de flúor presente em uma formulação (FT), o flúor insolúvel (Fins), e o quanto deste flúor estará na forma de fluoreto solúvel (em sua totalidade [FST], fluoreto iônico [FI] ou MFP), que são as formas do flúor que têm a capacidade de se tornarem biodisponíveis através da escovação para exercer seu efeito anticárie (Quadro 1) (MARTINEZ-MIER et al., 2019).
Quadro 1 – Diferentes formas do flúor e suas definições
Formas de flúor Definição
FT F + MFP + Fins
FST F + MFP (Flúor iônico + Ionizável)
FI F (Flúor Iônico solúvel)
Fins
Flúor insolúvel (ligado ao abrasivo) FT - FST
MFP FST - FI
1.5 Métodos de análise de fluoreto
Os estudos de análise de fluoreto tiveram seu início na primeira metade do século XX devido à necessidade de controlar os níveis de fluoreto presentes na água para consumo humano, a fim de garantir níveis seguros que proporcionassem diminuição da incidência de cárie sem provocar fluorose. Assim, em 1930, surgiram as primeiras publicações que avaliaram a concentração de fluoreto na água nos Estados Unidos da América, enquanto no Brasil estudos semelhantes apareceram somente a partir de 1970 (FRAZÃO, 2018).
A análise de flúor com a finalidade de assegurar seus níveis seguros e satisfatórios em produtos de higiene oral como cremes dentários, géis, vernizes, espumas, etc. assim como na água, é de extrema importância. Após o início dos estudos sobre fluoreto diversas mudanças significantes ocorreram, entre elas, o ajuste da concentração de flúor para 1 ppm F - na água para consumo humano na
década de 40 nos Estados Unidos e a recomendação de fluoretação da água para países com alto índice de cárie pela OMS em 1958 (WHELTON et al., 2019; OMS, 1958).
Diversas tecnologias vêm sendo aplicadas no que diz respeito à análise de fluoreto, como as sondas moleculares colorimétricas e luminescentes, a cromatografia iônica e os quimiodensímetros de medição baseada em reação, que permitem a quantificação de fluoreto de maneiras excepcionalmente rápidas. No entanto, os métodos sugeridos para quantificar os íons fluoreto disponíveis em grande escala e com base científica consolidada são o eletrométrico e o colorimétrico, ainda que sejam os mais tradicionais e simples (BUTLER, 2015).
O método eletrométrico é baseado na quantificação de íons fluoreto empregando um sensor de íons seletivo ao íon F-. Sensor este que possui uma
membrana que funciona como uma fina divisão de material condutor elétrico, separando duas soluções, a solução interna do sensor e a amostra a ser analisada, desenvolvendo assim uma diferença de potencial que é transmitida como sinal analógico, elétrico, a um potenciômetro que o converte em sinal digital e gera um valor de concentração. Estes eletrodos seletivos a íons (EIS) garantem sua seletividade devido ao tipo de cristal que dopa o eletrodo, no caso fluoreto de
lantânio. Por meio do eletrodo é estabelecido um potencial elétrico proporcional à concentração de fluoreto em solução (NARDIN, 2016; MOTTER et al. 2011).
O método colorimétrico tem seus fundamentos na reação química entre íons fluoreto e o corante que contém átomos de zircônio na formação de um composto complexo incolor [ZrF6]2-. Esta reação sofre interferência da acidez da
solução e a cor produzida é inversamente proporcional à concentração de fluoreto na amostra. A reação é semelhante à do método da alizarina, no entanto o reagente utilizando é o sódio 2 (parassulfofeniazo)-1,8-dihidroxi-3,6-naftaleno dissulfonato (SPADNS). As cores geradas são muito próximas de tons de vermelho e a alta velocidade da reação é uma das principais facilidades desse método. O equipamento básico para realizar medições de fluoreto através deste método são um espectrofotômetro com comprimento de onda ajustável a 570 nm com percurso ótico de 10 mm e os reagentes de consumo (DOVIDAUSKAS et al., 2015; VINCENT; THOMAS, 2019).
Os dois métodos supracitados são considerados eficientes, no entanto o desvio padrão se mostra menor no método eletrométrico. Além disso, o método eletrométrico empregando o eletrodo íon-seletivo demonstra maior capacidade analítica, conseguindo detectar a presença do íon em questão em concentrações muito menores que o método colorimétrico (DE MARCO; CLARKE; PEJCIC, 2007).
Comparando os dois métodos pode-se considerar que o método eletrométrico se mostra mais eficiente e proporciona resultados com maior precisão que o método colorimétrico na análise de flúor, no entanto é importante ressaltar que o método baseado em EIS demanda maior custo e padronização do procedimento, sendo muito facilmente influenciado por qualquer tipo de viés durante as aferições (FOUSKAKI, et al., 2003).
Além dos métodos descritos anteriormente, também pode-se realizar a análise de fluoreto através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), na qual se estabelece uma curva de calibração com soluções de concentração de fluoreto já conhecidas, e então compara-se com as curvas geradas pelas amostras através das áreas dos picos do cromatograma, gerando resultados em ppm, sendo a área dos picos do cromatograma diretamente proporcional à concentração de fluoreto. No entanto tal método é oneroso e demanda especialização do operador (OLIVEIRA; MARCEL; ANDERLE, 2003).
A partir do que foi descrito acima, pode-se perceber que a utilização do método eletrométrico empregando EIS é eficaz e confiável para obtenção de resultados no que diz respeito a amostras biológicas, sendo este um método capaz de aferir concentrações baixíssimas de fluoreto com um grau de confiança muito elevado.
A figura a seguir mostra alguns dos equipamentos utilizados na determinação do fluoreto em laboratório (figura 4). Na esquerda, o eletrodo íon seletivo acoplado ao potenciômetro, e na direita o espectrofotômetro, acompanhados dos reagentes utilizados no método SPADNS acima descritos.
Figura 4 – Equipamentos utilizados para as análises de fluoreto.
A: Eletrodo íon-seletivo acoplado a potenciômetro e reagentes de consumo utilizados no método eletrométrico; B: Espectrofotômetro e reagentes de consumo utilizados no método colorimétrico.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a disponibilidade de fluoreto após o uso de um dentífrico incorporado com própolis vermelha a 1%, e comparar a de um dentifrício fluoretado comum em participantes saudáveis.
2.2 Objetivos específicos
• Determinar a concentração de fluoretos total, iônico e solúvel na saliva dos participantes, em diferentes tempos de coleta;
• Realizar análise comparativa da cinética do fluoreto no uso dos diferentes dentifrícios;
• Avaliar o pH da saliva durante a utilização dos dentifrícios avaliados no estudo nos diferentes tempos de coleta.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo de estudo e aspectos éticos
Trata-se de um ensaio clínico, randomizado, duplo-cego, controlado e cruzado, realizado após aprovação no comitê de ética em pesquisa, sob o parecer de número 3.358.397 (Anexo I), de acordo com a Resolução 466/12, que preconiza diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos. O estudo foi inscrito no Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos (REBEC) sob o Universal Trial Number U1111-1245-8255.
3.2 Preparação dos dentifrícios
Os dentifrícios utilizados para comparação foram manipulados no laboratório de Farmacotécnica, do Curso de Farmácia, da Universidade Federal do Ceará, na concentração de 1500 ppm F (MFP) e contendo carbonato de cálcio como agente abrasivo.
Para preparação do dentifrício de própolis vermelha foi utilizado o extrato de própolis vermelha georreferenciado de Marechal Deodoro-AL, região de indicação geográfica do extrato pelo Instituto Nacional de Propriedade Industrial. Foi utilizada a concentração de 1%, previamente avaliada in vitro e in vivo (FURTADO JÚNIOR et al., 2020). O dentifrício de PVB está patenteado sob o número de pedido BR1020170110974A2.
3.3 Procedimentos para seleção dos sujeitos
A seleção dos participantes foi realizada na clínica de Cirurgia e Periodontia, do curso de Odontologia, da Universidade Federal do Ceará.
Como procedimento inicial, foi feito um esclarecimento sobre as condições nas quais são desenvolvidas as pesquisas clínicas e explicações sucintas do que se trata e quais os procedimentos envolvidos no estudo. Os participantes que aceitaram fazer parte do estudo, e que não se enquadravam em nenhum dos critérios de exclusão, foram atendidos individualmente, para que fossem prestadas informações adicionais relativas ao estudo e esclarecidas todas as dúvidas
restantes. Após a coleta de dados pessoais, e de saúde geral, os sujeitos elegíveis foram submetidos a uma avaliação preliminar de triagem e, aqueles que concordaram em participar da pesquisa, assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo II), constituindo, efetivamente, a população a ser estudada.
3.4 Examinadores
A seleção de voluntários foi feita pelo pesquisador responsável e por duas cirurgiãs-dentistas previamente calibradas (Kappa=0,76). Foi realizado exame clínico intra-oral para avaliação da condição de saúde bucal. A avaliação do índice de cárie dentária foi realizada pelo método ICDAS II (International Caries Detection and Assessment System).
3.5 Critérios de inclusão
Os seguintes critérios foram adotados no processo de recrutamento dos sujeitos:
• Idade entre 12 e 18 anos • ICDAS II 0
• Ser destro • Estar sadio
• Não estar fazendo uso de qualquer medicamento
3.6 Critérios de exclusão
Foram excluídos do estudo os sujeitos nos quais se observou informações referentes a:
• Presença alterações sistêmicas relacionados com o processo saúde-doença periodontal;
• Uso de terapia medicamentosa; • Usuários de drogas lícitas/ ilícitas; • Portadores de próteses;
• Usuários de aparelho ortodôntico;
• Portadores de menos de 10 elementos dentários por arco dentário; • Participantes com histórico de alergias (asma, urticária, rinite, sinusite);
• Participantes com histórico de hipersensibilidade a medicamentos, alimentos ou a outros fatores;
• Participantes com histórico de doenças crônicas; • Gravidez.
3.7 Medicamentos
Durante a fase de uso do dentifrício os participantes foram orientados a não fazer uso de antibióticos, anti-inflamatórios, anticoagulantes e anticonvulsivantes.
Todavia, em caso de emergência, os participantes foram orientados a, sob orientação médica, receber a administração de medicamentos, caso isto fosse considerado necessário para o bem-estar dos voluntários. Neste caso, os medicamentos deveriam também ser registrados apropriadamente no formulário.
3.8 Fase clínica
O tamanho da amostra foi calculado baseado em estudos similares com 95% de intervalo de confiança (LARSEN et al., 2017; NAUMOVA et al., 2019). Foram selecionados oito participantes que utilizaram no primeiro período um dentífrico e no segundo período o outro. Os participantes foram randomizados pelo programa excel a fim de definir o tratamento a ser recebido em cada período (Figura 5). Antes de cada coleta seriada de saliva, aplicou-se um período de washout aos participantes, que consistia na utilização de um dentifrício não fluoretado por três dias, garantindo, assim, a não interferência nas análises (FERNÁNDEZ; TENUTA; CURY, 2015).
Uma semana antes, os participantes selecionados foram atendidos por uma cirurgiã-dentista, ocasião na qual a ficha de anamnese foi preenchida (APÊNDICE I), e foi feita uma raspagem para remoção do biofilme supragengival e
profilaxia com pedra pomes e água. Após isso, receberam um dentifrício não-fluoretado para utilizar por três dias.
Depois de pelo menos 2 horas de jejum, os voluntários realizaram escovação com 1 g de dentifrício (1 min) seguido de enxágue com 10 mL de água purificada (10 segundos). Saliva foi coletada para análise da concentração de fluor após a escovação, nos diferentes tempos (0 – baseline, 5, 15, 30, 45 e 60 minutos).
Figura 5 − Fluxograma de distribuição dos participantes no estudo.
Fonte: Autor, 2019
3.9 Coleta de saliva e análise do pH
Foi coletada saliva não estimulada, 2mL de cada participante. Esta foi coletada através de um dispositivo plástico e armazenada em microtubos estéreis (Eppendorfs®). O pH foi aferido no momento de cada uma das coletas através da utilização de fitas de pH (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemanha). Em seguida, as amostras foram devidamente armazenadas sob resfriamento a -80oC e analisadas
no dia seguinte (PONTE, 2017).
3.10 Análise do flúor total, solúvel e iônico
Demanda de participantes 1ª escovação: Dentifrício fluoretado comum (n = 8) 2ª escovação: Dentifrício fluoretado + PVB (n = 8) Critérios de inclusão e exclusão TCLE
8 participantes selecionados Randomizacao da ordem dos tratamentos
O flúor foi analisado pelo método direto, utilizando a metodologia de Cury et al., (2010) com um eletrodo específico de flúor (Orion 96-09, Orion Research Inc., Beverly, EUA) (Figura 6). Analisou-se flúor total (FT), flúor solúvel total (FST) e flúor iônico (FI). Antes da análise das amostras, um conjunto de padrões de flúor, com variação entre 0,5 e 32,0 ppm F (Figura 7) foi preparado em triplicata, usando diluição seriada de uma solução de estoque NaF a 1000 ppm (ANALYSER # 110902, Analyser Comércio e Indústria LTDA., Paraná, BRA). Os potenciais de milivoltagem foram convertidos para µg de Flúor usando uma curva padrão com um coeficiente de correlação de r ≥ 0,99.
Todas as amostras foram lidas em duplicata. Para a medição de flúor total e flúor solúvel total a 0,25 mL de cada amostra de saliva, foram adicionados 0,25 mL de ácido clorídrico 2mol L-1 e as amostras foram mantidas por 1 hora a 37°C em
estufa. Em seguida, a neutralização foi realizada com 0,5 mL de hidróxido de sódio 1 mol L-1 e as amostras foram tamponadas com 1 mL de TISAB II (tampão de ajuste
de força iônica total). Como demonstrado no fluxograma na figura 8.
Figura 6 − Eletrodo específico de flúor Orion 96-09, Orion Research Inc., Beverly, EUA, utilizado nas determinações de flúor realizadas na pesquisa.
Fonte: acervo pessoal
Figura 7 – Padrões de fluoreto utilizados para calibrar o eletrodo, nas concentrações de 0,5 a 32 ppm.
Figura 8 − Fluxograma do método de análise de Flúor Total (FT), Flúor Iônico (FI) e Flúor Solúvel Total (FST) nas amostras de saliva.
3.11 Método estatístico
Para a análise estatística dos resultados foram empregados os seguintes procedimentos:
• Os resultados foram inicialmente analisados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar a normalidade da distribuição. Para a estatística descritiva, foram calculadas a mediana e intervalo interquartil. As comparações entre os resultados nos diferentes tempos foram realizadas mediante o uso do teste t para o pH e do teste de Mann-Whitney para as análises de fluoreto.
• Os testes paramétricos de análise de variância (ANOVA) e teste t pareado para análise de comparação de médias foram aplicados na comparação intergrupos com os diferentes dentifrícios.
• Em todos os casos, estabeleceu-se em 0,05 (5%) a probabilidade α do erro tipo I (nível de significância), sendo considerado como estatisticamente significante um valor P bicaudal menor que 0,05.
• O software GraphPad Prism® versão 5.00 para Windows® (GraphPad Software, San Diego, California, USA, 2007) foi utilizado tanto para a realização dos procedimentos estatísticos como para a elaboração dos gráficos.
4. RESULTADOS
Dos oito participantes, seis eram do gênero feminino e dois do gênero masculino, tiveram média de idade de 16 anos. Todos os participantes completaram o estudo, totalizando 12 amostras coletados de cada um deles, resultando em 96 amostras que foram analisadas em duplicata quanto à presença de flúor total (FT), flúor solúvel total (FST) e flúor iônico (FI), como demonstrado no quadro abaixo. O teor basal de flúor na saliva variou nos oito participantes, em um total de 576 medições, de 0,009 a 8,261 ppm.
A concentração de flúor na saliva aumentou significantemente após a escovação com dentifrício fluoretado à 1500 ppm incorporado e não incorporado com própolis vermelha brasileira (PVB), alcançando concentração máxima nos primeiros cinco minutos do teste, como mostrado no Gráfico 1.
Gráfico 1–Concentração versus Tempo de FT, FI e FST na saliva após a escovação com dentifrícios fluoretados à 1500 ppm incorporado e não incorporado com PVB.
P= dentifrício fluoretado incorporado com PVB, F= dentifrício fluoretado comum, FT= flúor total, FST = flúor solúvel total e FI= flúor iônico
Fonte: Autor, 2019
Todas as concentrações de flúor na saliva diminuíram no período de teste, não ocorrendo diferença significativa entre as amostras dos tratamentos com dentifrício fluoretado incorporadas com PVB e fluoretado comum, p > 0,05 (two-way ANOVA). Os gráficos a seguir (Gráficos 2, 3 e 4) mostram as concentrações em ppm
0 15 30 45 60 0.1 1 10 tempo (min) F - ( m g L -1 ) P-FT P-FST P-FI F-FT F-FST F-FI 5
para FT, FST e FI, comparando os dentifrícios com e sem PVB, para cada participante, no tempo de 1h.
Gráfico 2– Comparação da concentração de Flúor total em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios.
Fonte: Autor, 2019
Gráfico 3– Comparação da concentração de Flúor solúvel total em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios.
Fonte: Autor, 2019 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 1 2 3 4 5 6 7 8 F -(m g L -1) Amostras
Flúor total
Fluoretado + PVB Fluoretado 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 1 2 3 4 5 6 7 8 F -(m gL -1) AmostrasFlúor solúvel total
Gráfico 4– Comparação da concentração de Flúor iônico em ppm nas amostras de saliva no período de 1 hora após a escovação com os dentifrícios.
Fonte: Autor, 2019
Não houve diferença significativa entre as concentrações no tempo de 1h para nenhuma espécie de flúor analisada, p > 0,05.
Analisando a área sob a curva das concentrações em mgL-1*min, gráfico
5, encontra-se diferença estatística significante apenas quando comparadas as medidas de flúor total dos dois dentifrícios (two-way ANOVA).
Gráfico 5– Área sob a curva das concentrações de FT, FST e FI nas amostras de saliva dos participantes após uso dos dentifrícios.
AUC= Área sob a curva FT= flúor total, FST = flúor solúvel total e FI= flúor iônico
Fonte: Autor, 2019 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 1 2 3 4 5 6 7 8 F -(m gL -1) Amostras
Flúor Iônico
Fluoretado + PVB FluoretadoAUC-FT AUC-FST AUC-FI
0 50 100 150 A U C ( m g L -1 *m in ) Fluoretado + PVB Fluoretado
As concentrações de fluoreto em mgL-1 variaram de 0,401 a 7,638 para o
dentifrício incorporado com PVB e 0,009 a 8,261 para o dentifrício fluoretado comum, não mostrando diferença estatística significante entre os dois grupos para FST e FI (two-way ANOVA), como demonstrado no gráfico abaixo.
Gráfico 6– Concentrações máximas de FT, FST e FI nas amostras de saliva dos participantes após uso dos dentifrícios.
FT= flúor total, FST = flúor solúvel total e FI= flúor iônico Fonte: Autor, 2019
Quanto ao pH, não houve diferença estatística entre as amostras de saliva analisadas em nenhum dos tempos (p > 0,05), apresentando médias de 7,104 para o dentifrício de própolis e 7,083 para o dentifrício fluoretado comum (Teste-t).
FT FST FI 0 2 4 6 8 10 F - ( m g L -1 ) Fluoretado + PVB Fluoretado
5. DISCUSSÃO
No presente estudo foram analisadas as concentrações de diferentes formas de fluoreto após o uso de um dentífrico incorporado com 1% de própolis vermelha brasileira na saliva dos participantes, comparando os resultados aos de um dentifrício fluoretado comum, não obtendo diferenças estatísticas das concentrações entre os dois grupos durante as coletas realizadas no decorrer do tempo.
O declínio na incidência da cárie dentária em todo o mundo tem como principal fator a ampla utilização de dentifrícios fluoretados (WADGAVE; VEERESH, 2014). A efetividade destes tem sido demonstrada com forte evidência científica quando apresentam concentrações apropriadas de fluoreto solúvel e estável (BENZIAN; HOLMGREN; VAN PALENSTEIN, 2012). A alta incidência de cárie dentária associada a falta de fluoretação da água ou sal, aumenta ainda mais a importância de dentifrícios fluoretados com adequado potencial anticárie, especialmente em países onde considerável parte da população é socioeconomicamente vulnerável (VOSTER et al., 2018).
Estudos indicam que um pequeno aumento da concentração de flúor nos fluidos orais já tem grande efeito no processo de remineralização e desmineralização (VOGEL et al., 2001). No estudo de Talwar et al. (2016) os autores constataram que a presença de pequenas concentrações de fluoreto, como 0,1-1 ppm, são capazes de interferir no processo cariogênico, reduzindo a desmineralização e aumentando a remineralização do esmalte dentário.
Normalmente os dentifrícios possuem NaF ou MFP em sua formulação. O dentifrício proposto possui MFP, que são os mais utilizados em dentifrícios por serem de baixo custo, entretanto podem reagir com excipientes presentes nessas formualções, como os abrasivos, detergentes e ativos farmacêuticos, formando sais insolúveis não biodisponíveis que são incapazes de fornecer proteção anticárie (BRASIL, 2009). Esses componentes atuam sobre a disponibilidade potencial de flúor, podendo interferir na cinética do flúor e afetar negativamente a eficácia clínica da fórmula farmacêutica e consequentemente a biodisponibilidade nos fluidos orais (NAUMOVA et al., 2012; MARTINEZ-MIER et al., 2019). Apesar da existência de estudos que avaliaram a concentração e estabilidade do flúor em dentifrícios,
nenhum avaliou a disponibilidade do fluoreto em formulações com moléculas antimicrobianas e nem a biodisponibilidade na saliva após uso dessas formulações.
Diferente do NaF, o MFP quando liberado na saliva não inicia sua ação imediatamente, necessitando ser hidrolisado para ser dissociado. Sabe-se que a adição de componentes aos dentifrícios pode interferir na ação do flúor, entretanto, na presente formulação, com a adição do extrato de PVB não houve diminuição da concentração biodisponível após 1 hora de escovação. O MFP depende do pH para ser hidrolisado mais rapidamente, sendo mais rápido entre 7,2 e 8,6, o que pode justificar os valores encontrados, visto que se encontrou níveis de pH semelhantes a estes (VOGEL et al., 2000).
O esclarecimento das diferenças entre flúor total, flúor insolúvel e flúor solúvel no estudo conduzido por Martinez-Mier et al. (2019) é imprescindível para a compreensão dos resultados demonstrados nesse estudo, pois embora maiores concentrações de flúor total tenham sido encontradas na saliva proveniente da escovação com o dentifrício fluoretado comum isso não prova a existência de maior quantidade de flúor biodisponível para exercer atividade anticárie.
Diversos são os estudos que avaliaram a concentração de flúor em formulações odontológicas utilizando metodologia semelhante, sugerindo que ocorre um depósito de flúor nos fluidos orais logo após o uso desses materiais (VOGEL et al., 2001). O EIS possui diversas vantagens como a facilidade de utilização e ser um método eficaz. Apesar de não ter a precisão de métodos como cromatografia e espectofotometria, o mesmo é o método atualmente mais utilizado por conseguir reproduzir valores precisos em um tempo menor (DE MARCO; CLARKE, 2007).
Estudos que avaliaram a concentração de flúor na saliva com o NaF encontraram valores de até 0,33 ppm de F total na saliva após 1 hora de escovação (LARSEN et al., 2019). O diferencial do presente estudo com o dentifrício de PVB foi a avaliação não somente da concentração de flúor total, mas do solúvel total e iônico.
O comportamento da curva de concentração de flúor total em mgL -1encontrado neste trabalho é semelhante ao evidenciado por diversos estudos como
os de Naumova et al. (2012), Larsen et al. (2019), Bezerra et al. (2019), mostrando aumento da concentração no início do protocolo, seguido por diminuição gradual inversamente proporcional ao tempo decorrido. Além disto, o estudo conduzido por
Naumova et al. (2012) apresentou variabilidades interindividuais semelhantes as encontradas no presente estudo.
Neste estudo as concentrações de flúor de ambos os dentifrícios alcançaram seus correspondentes picos de concentração nos primeiros 5 minutos do protocolo, corroborando com os dados obtidos por Almeida (2009), que utilizou dentifrícios com 1100 ppm F- e também fez as medições através de EIS.
Além da saliva, outros meios biológicos como o biofilme e mucosa vêm sido avaliados. Larsen et al. (2017) demonstraram que entre o biofilme fluido, biofilme sólido e saliva, a última é o compartimento oral mais suscetível ao aumento de concentrações de fluoreto, podendo atingir níveis 35% maiores que no biofilme, visto que o fluoreto encontrado no mesmo é disponibilizado pela saliva. Além do que, obteve resultados que sugerem uma quebra da linearidade na relação dose-resposta situada entre as concentrações de 2500 e 5000 ppm de F para dentifrícios.
Comparando o dentifrício utilizado neste estudo com um dispositivo de liberação prolongada fabricado em vidro e testado durante um período de três meses por Tatsi & Toumba (2019), a curva de concentração de fluoreto em mgL-1
apresentou o mesmo comportamento da curva obtida neste estudo, com um pico inicial seguido de diminuição progressiva tendendo à concentração de baseline.
O estudo de Vincent & Thomas (2019) que trabalhou com concentrações de flúor de 1000 a 5000 ppm revelou que maiores concentrações de flúor salivares podem ser obtidas através da escovação com dentifrícios com alto teor de flúor, fenômeno explicado pela formação de reservas intraorais, além de estabelecer uma relação diretamente proporcional entre as concentrações de flúor no dentifrício e na saliva, relação também encontrada no presente estudo.
O desenvolvimento de formulação dentárias com atividade antimicrobiana cresce a cada dia devido à resistência bacteriana, toxicidade e altos custos dos materiais disponíveis. Na Odontologia, o agente antimicrobiano mais utilizado é a clorexidina que, quando utilizada por um período prolongado, causa descoloração dentária, alteração do paladar e perde sua capacidade antimicrobiana, ocorrendo assim a recolonização de bactérias. (GOES et al., 2016; VALADAS et al., 2019). Outro agente que foi bastante utilizado é o triclosan, formulação que diversos estudos apontam efeitos adversos. Em cobaias, a literatura aponta que o triclosan pode causar a formação de espécies químicas desreguladoras do sistema
