UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
NADINE MONTEIRO SALGUEIRO ARAÚJO
ClTI, UM INIBIDOR DE TRIPSINA TIPO KUNITZ PURIFICADO A PARTIR DAS SEMENTES DE Cassia leiandra BENTH., EXERCE EFEITO CANDIDICIDA, INDUZINDO ESTRESSE OXIDATIVO E APOPTOSE CELULAR EM C. albicans
FORTALEZA 2019
NADINE MONTEIRO SALGUEIRO ARAÚJO
ClTI, UM INIBIDOR DE TRIPSINA TIPO KUNITZ PURIFICADO A PARTIR DAS SEMENTES DE Cassia leiandra BENTH., EXERCE EFEITO CANDIDICIDA, INDUZINDO ESTRESSE OXIDATIVO E APOPTOSE CELULAR EM C. albicans
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira.
Coorientadora: Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos
FORTALEZA 2019
NADINE MONTEIRO SALGUEIRO ARAÚJO
ClTI, UM INIBIDOR DE TRIPSINA TIPO KUNITZ PURIFICADO A PARTIR DAS SEMENTES DE Cassia leiandra BENTH., EXERCE EFEITO CANDIDICIDA, INDUZINDO ESTRESSE OXIDATIVO E APOPTOSE CELULAR EM C. albicans
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Hermógenes David de Oliveira
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Maria Izabel Florindo Guedes Universidade Estadual do Ceará (UECE)
A Deus.
Aos meus avós, Nazaré Salgueiro e Ovídeo Monteiro
À minha mãe, Vitória Régia À toda a minha família Aos amigos Labtox/LPVD.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e à Nossa Senhora por sempre me concederem saúde, amor e perseverança. Todo o dia é me dada uma chance para o recomeço, crescimento com meus erros e fortalecimento para novos desafios.
Agradeço à toda minha família pelo amparo e amor incondicional. Lá do céu, tenho certeza que meus avós torcem e zelam pela minha felicidade. Minha mãe, minha rainha, minha melhor amiga, é a responsável pelo que me tornei, é a minha força para a vida! Minhas tias e primos sempre dedicaram apoio à minha formação, me ensinaram a ter mais fé e a acreditar mais em mim.
Minha gratidão à Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos e Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, meus pais científicos e orientadores. Confiaram-me grandes responsabilidades, me deram as ferramentas para o conhecimento e acreditaram no meu sucesso. Graças a vocês, conquistei minha graduação e mestrado com grande amadurecimento pessoal e profissional.
Agradeço a Profa. Dra. Daniele Sousa pelo carinho, ensinamentos e amizade. Sua alegria é contagiante, será uma honra imensa tê-la como orientadora no Doutorado. Agradeço de coração pela confiança!
Minha gratidão e carinho ao meu grande amigo e orientador Dr. Lucas Pinheiro. Obrigada pela pessoa incrível que você é na minha vida! Sua dedicação, paciência e amizade incondicional me tornaram mestre, obrigada! Sempre será meu Chefinho lindo!
Meu agradecimento especial para Dra. Helen Costa, minha segunda chefinha. Obrigada pelos ensinamentos, dedicação e amizade! Esta dissertação é fruto do seu amor pela ciência.
Meus sinceros agradecimentos a todos os integrantes do Laboratório de Toxinas Vegetais, Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa e Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais. A amizade e apoio de todos foram cruciais para o sucesso desta dissertação.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) pela concessão de bolsa de mestrado
financiada pelo projeto: Pró-Amazônia: Biodeversidade e Sustentabilidade, Edital nº 047/2012, subprojeto - “Análises prospectivas e aplicativas de recursos vegetais da Floresta Amazônica’’- Código de Financiamento 3267/2013.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ (UFC) – Laboratório de Toxinas Vegetais (Coordenação da Dra. Ilka Maria Vasconcelos e Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa), Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa (Coordenação do Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira), Laboratório de Ecologia Microbiana e Biotecnologia (Coordenação da Dra. Vânia Maria Maciel Melo) e Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Coordenação da Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho).
CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPq), nº projetos: 308107/2013-6, 306202/2017-4 e 431511/2016-0.
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA -UFC- Coordenação e corpo docente do Programa.
RESUMO
Inibidores de protease são biomoléculas multifuncionais encontradas em todos os organismos, responsáveis por inibir a ação catalítica de enzimas envolvidas em importantes processos fisiológicos e patológicos. Estas moléculas podem ser utilizadas como ferramenta biotecnológica para o controle de infecções microbianas. Em ambiente hospitalar, leveduras oportunistas do gênero Candida protagonizam um sério problema de saúde pública no mundo. Estes microrganismos tornaram-se resistentes aos antimicóticos tradicionais e são responsáveis por altas taxas de mortalidade. Diante da necessidade emergencial por terapias antimicrobianas novas, a prospecção e a caracterização da atividade biológica de moléculas antifúngicas, principalmente aquelas de origem vegetal, têm se intensificado. Neste contexto, vários inibidores de proteases já foram isolados a partir de plantas medicinais e demonstraram promissor efeito anticandida. Em estudo anterior, um inibidor de tripsina do tipo Kunitz, intitulado ClTI, foi purificado das sementes de Cassia leiandra Benth. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ClTI sobre diferentes espécies de Candida, investigar o modo de ação antifúngico deste inibidor e avaliar sua toxicidade frente a células humanas. O ClTI inibiu a multiplicação celular de Candida
albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis e Candida krusei em intensidades
diferentes, mas seu efeito fungicida foi maior para C. albicans. Na dose correspondente à MIC50 (2,1 μM) para C. albicans causou alterações morfológicas, alterou a permeabilização da membrana plasmática e alterou o bombeamento de prótons para o meio extracelular. O inibidor induziu, ainda, a geração aumentada de espécies reativas de oxigênio, foi capaz de degradar o material genético e exibiu atividade antibiofilme. Em células humanas tratadas com ClTI não foram observados sinais de toxicidade. Os dados obtidos demostram que o ClTI apresenta grande potencial para vir a se tornar, futuramente, um produto médico para o tratamento de infecções hospitalares causadas por C. albicans.
Palavras-chave: Cassia leiandra. Inibidor de tripsina. Proteína anticandida. Candida albicans
ABSTRACT
Protease inhibitors are multifunctional biomolecules found in all organisms responsible for inhibiting the catalytic action of enzymes involved in important physiological and pathological processes. These molecules can be used as a biotechnological tool for the control of microbial infections. In a hospital environment, opportunistic yeasts of the genus Candida carry a serious public health problem in the world. These microorganisms have become resistant to traditional antimycotics and are responsible for high rates of morbidity and mortality. The view of the urgent need for new antimicrobial therapies, the prospection and characterization of the biological activity of antifungal molecules, especially from vegetable, has intensified. In this context, several protease inhibitors have already been isolated from medicinal plants and have shown a promising anticandidal effect. In a previous study, a Kunitz trypsin inhibitor, ClTI, was purified from the seeds of Cassia leiandra Benth. The objective of this work is to evaluate the effect of ClTI on different Candida species, to investigate it mode of antifungal action and to evaluate its toxicity against human cells. ClTI interrupted the cell multiplication of Candida albicans, Candida tropicalis,
Candida parapsilosis and Candida krusei at different intensities, demonstrating
potent fungicidal effect for C. albicans. At the dose of MIC50 (2.1 μM) caused morphological changes, permeabilized the plasma membrane and altered the pumping of protons in C. albicans cells. For the same species, the inhibitor still induced the increased generation of reactive oxygen species, was able to degrade the genetic material and exhibited antibiofilm activity. No signs of toxicity were observed in human cells treated with ClTI. The data obtained demonstrate that the C.
leiandra inhibitor has a great anticandidicidal potential, and may in the future become
a medical product for the treatment of hospital infections caused by C. albicans.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 − Fatores de risco associados a infecções fúngicas invasivas... 15 Figura 2 − Principais tipos de infecções causadas por espécies do gênero
Candida... 17 Figura 3 − Aumento da disponibilidade de antifúngicos ao longo dos anos... 19 Figura 4 − Características morfológicas de C. leiandra... 22
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1 Infecções hospitalares: O impacto das infecções fúngicas... 14
2.2 Gênero Candida: Um problema de saúde pública mundial... 16
2.3 Antifúngicos vegetais: Inibidores de proteases, uma ferramenta alternativa para o controle de Candidemias... 19
2.4 Inibidor de tripsina das sementes de Cassia leiandra (ClTI): Inibidor com potencial anticandida inexplorado... 21
3 OBJETIVOS ... 24
4 CONCLUSÃO ... 25
