1 1 INTRODUÇÃO GERAL
A hepatite C é uma doença amplamente distribuída no mundo. Estima-se que 3% da população mundial esteja infectada (PERZ et al., 2004). A maior parte dos pacientes infectados evolui para a fase crônica da doença (SEEFF, 1997), com lesões hepáticas que podem comprometer o funcionamento do fígado e levar ao desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (FRIEDMAN, 1993; MARCELLIN et al., 2002). A patogênese dessas lesões hepáticas ainda é pouco compreendida, mas a resposta imune local pode ter alguma participação.
Os níveis séricos de citocinas estão elevados em pacientes com hepatite C crônica quando comparados a indivíduos saudáveis e isso sugere ativação das respostas mediadas pelos linfócitos T (CACCIARELLI et al., 1996; FAN et al., 1998). A literatura mostra que um desequilíbrio na produção de citocinas tem sido observado em várias doenças infecciosas humanas, como na infecção pelo HIV, HBV, leptospirose e leishmaniose (CLEIRICI & SHEARER, 1994; YAMAMURA et al., 1991; SHER & COFFMAN, 1992; JIANG et al., 2000). A resposta imune mediada por células, favorecida pelas citocinas relacionadas ao perfil Th1, tem sido associada ao controle de várias doenças, enquanto que as citocinas relacionadas ao perfil Th2 exercem funções imuno-regulatórias negativas (TSAI et al., 1997).
Na hepatite C, as citocinas produzidas pelos linfócitos T são importantes para o controle da replicação viral, mas também podem contribuir com a progressão do dano hepático (KOZIEL, 1997; TSAI et al., 1997). Assim, ainda não está claro qual o perfil de citocinas está associado à gravidade das lesões hepáticas (BROWN & NEUMAN, 2001).
A grande variação das condições clínicas dos pacientes, as diversas metodologias empregadas para análise das citocinas (citometria de fluxo, ELISA) e os tipos de amostras (soro, sobrenadante de culturas e fragmentos de tecido hepático) dificultam a comparação dos resultados dos estudos e o entendimento de como as citocinas contribuem com o agravamento das lesões hepáticas observadas na hepatite C crônica (VISO et al., 2010).
Este trabalho teve como objetivo caracterizar o perfil sérico de citocinas em pacientes com hepatite C crônica e diferentes estágios de fibrose hepática, graus de atividade necroinflamatória, esteatose hepática e síndrome metabólica. Para tanto,
2 formam avaliados por citometria de fluxo os níveis séricos das seguintes citocinas: IFN-gama, IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10 e TGF-Beta.
É importante considerar que tal avaliação representou a expressão momentânea do que ocorre no organismo infectado pelo HCV. Assim, os achados foram interpretados com base no conhecimento atual sobre a imunopatogenia da infecção crônica pelo HCV.
3 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A HEPATITE C
A hepatite C é uma doença amplamente distribuída no mundo. Estima-se que 3% da população mundial esteja infectada (Figura 1) (PERZ et al., 2004).
No Brasil, a prevalência da hepatite C varia entre 1 e 2%, dependendo da região estudada (BRASIL, 2008).
A principal forma de transmissão da hepatite C, no Brasil, ocorre pelo contato com sangue, hemoderivados e objetos perfuro-cortantes contaminados. A transmissão sexual e materno-fetal é pouco frequente (BRASIL, 2008; LIANG et al., 2000).
O agente etiológico da hepatite C é o HCV, um vírus envelopado, pertencente à família Flaviviridae e ao gênero Hepacivirus (Figura 2).
Figura 1: Prevalência da hepatite C nas diferentes regiões do mundo.
4 O genoma do HCV é composto por uma fita simples de RNA (Ácido ribonucleico), que codifica um grande polipeptídeo. A ação de proteases virais e celulares cliva esse polipeptídeo em proteínas estruturais (Core, E1 e E2) e não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) (Figura 3) (PENIN et al., 2004).
O HCV caracteriza-se por sua grande variabilidade genética, e por este motivo foi classificado em 6 grupos diferentes, conforme seu genótipo. Cada genótipo pode ainda ser dividido em vários subtipos (SIMMONDS et al., 1994). A distribuição
Figura 3: Proteínas estruturais e não estruturais do HCV.
Fonte: Modificado de DUSTIN & RICE, 2007.
Figura 2: Estrutura do HCV.
5 geográfica dos genótipos do HCV no mundo é bastante variável e no Brasil, os genótipos mais frequentes são o 1, 3 e 2 (CAMPIOTTO et al., 2005).
2.2 O DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da infecção pelo HCV é realizado a partir de testes sorológicos e de biologia molecular.
Os testes sorológicos identificam anticorpos específicos contra o HCV. Esses anticorpos já podem ser detectados em amostras entre 20 e 150 dias após a infecção (BRASIL, 2008). Entre os testes sorológicos destacam-se o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), de alta sensibilidade e usado no rastreamento da infecção pelo HCV, e o RIBA (Recombinant Immunoblot Assay), de maior especificidade, denominado por isso um teste suplementar (BRANDÃO et al., 2001). O ELISA de terceira geração (ELISA III) utiliza antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos para a captura de anticorpos contra o HCV, aumentando, assim, a sensibilidade do teste e reduzindo o tempo médio de soroconversão, ou seja, o intervalo de tempo compreendido entre a infecção e o aparecimento dos anticorpos (GRETCH, 1997). O RIBA é um teste mais específico porque detecta anticorpos contra antígenos individuais do HCV (LOK & GUNARATNAM, 1997).
Os testes de biologia molecular possibilitam a detecção do RNA do HCV, que já pode ser identificado em amostras entre 7 e 21 dias após a infecção (BRASIL, 2008). A PCR (Polymerase Chain Reaction) é um teste que possibilita a detecção qualitativa e quantitativa do RNA do HCV, esta última também conhecida como carga viral. A determinação do genótipo do HCV pode ser realizada a partir de técnicas de biologia molecular ou sorológicas (BRANDÃO et al., 2001). A genotipagem do HCV por técnicas de biologia molecular tem como principais vantagens a informação direta da sequência dos nucleotídeos do genoma viral, a alta sensibilidade, por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o subtipo do HCV. Já as técnicas sorológicas têm baixo custo e maior facilidade de execução (PAWLOTSKY & GRETCH, 1998).
Os testes que avaliam a função hepática, como ALT (Alanina Aminotransferase), AST (Aspartato Aminotransferase), FA (Fosfatase Alcalina) e Gama-GT (Gama-Glutamil Transpeptidase), não são necessários para o diagnóstico da infecção pelo HCV, embora sejam indicadores sensíveis de dano hepático (BRASIL, 2008).
6 2.3 O TRATAMENTO
O tratamento da infecção pelo HCV tem como objetivo eliminar o vírus, tornando indetectável o RNA do HCV no soro dos pacientes. Os pacientes infectados com o HCV podem ser classificados em pelo menos dois grupos, de acordo com a resposta ao tratamento: respondedores sustentados e não respondedores. Os respondedores sustentados são os pacientes que obtém êxito em eliminar o vírus do soro, 6 meses após o término da terapia, enquanto que os não respondedores permanecem com viremia detectável durante ou após o término do tratamento (NIH, 2002).
O tratamento está indicado para os pacientes que apresentam o RNA do HCV detectável no soro, elevação dos níveis de ALT (1,5 a 2 vezes maior que o limite normal) e lesões necroinflamatórias e fibrose moderadas a acentuadas (BRASIL, 2008).
Antes do início do tratamento, portanto, recomenda-se que todo paciente seja biopsiado (BRASIL, 2008). A biópsia hepática, quando indicada, é útil na determinação do estágio de fibrose e do grau de atividade necroinflamatória. Segundo a classificação METAVIR, a fibrose é definida em uma escala de 0 a 4 e a atividade necroinflamatória em uma escala de 0 a 3 (BEDOSSA & POYNARD, 1996).
Estágio de fibrose Grau de atividade necroinflamatória
F0 = Ausência de fibrose A0 = Sem inflamação
F1 = Fibrose periportal sem septos A1 = Inflamação leve F2 = Fibrose periportal e raros septos A2 = Inflamação moderada F3 = Fibrose periportal e numerosos septos
sem cirrose
A3 = Inflamação grave
F4 = Cirrose
Figura 4: Sistema METAVIR para classificação do estagio de fibrose e do grau de atividade necroinflamatória
Fonte: Adaptado de BEDOSSA & POYNARD, 1996
O não consumo de bebidas alcoólicas e o controle de distúrbios metabólicos como obesidade e diabetes também são importantes durante o tratamento (BRASIL, 2008).
7 A determinação do genótipo do HCV é importante para a definição do melhor esquema terapêutico para o paciente. Os pacientes portadores do HCV genótipo 1 são os que menos respondem ao tratamento antiviral, cerca de 40-50%, enquanto que os portadores dos genótipos 2 e 3 respondem em torno de 80%.
O tratamento atualmente recomendado para pacientes com hepatite C portadores do HCV genótipo 1 consiste na utilização de IFN-alfa (Interferon-alfa) Peguilado em associação com Ribavirina durante 48 semanas, enquanto que os pacientes portadores dos genótipos 2 e 3 devem ser tratados com IFN-standard em associação com Ribavirina durante 24 semanas (BRASIL, 2008).
O IFN-alfa é uma citocina antiviral naturalmente produzida pelo nosso organismo, especialmente por linfócitos B e monócitos. No passado, o tratamento da hepatite C era feito apenas com o IFN-alfa standard e a porcentagem de resposta ao tratamento era muito baixa, menos de 20% (CUMMINGS et al., 2001; MCHUTCHISON et al., 1998). A adição de polietilenoglicol ao IFN-alfa (PegInterferon) aumentou a meia vida do IFN, prolongando o seu tempo de ação no organismo (HARRIS & CHESS, 2003).
A Ribavirina é um análogo sintético da guanosina e sua associação com o IFN-alfa aumentou para mais de 40% a resposta sustentada após 6 meses do fim da terapia (HOOFNAGLE & SEEF, 2006). O mecanismo de ação da Ribavirina não é bem conhecido, mas provavelmente seu mecanismo de ação seja o de inibir a DNA polimerase vírus dependente.
O tratamento da infecção pelo HCV, porém, provoca uma série de efeitos colaterais, como fadiga, náusea, diarréia, dores abdominais, musculares, articulares, alterações do humor, alterações na função tireoidiana, entre outras queixas.
Novas estratégias terapêuticas vêm sendo estudadas, especialmente com o objetivo de aumentar a taxa de resposta virológica em pacientes portadores do HCV genótipo 1. O Telaprevir (inibidor da protease NS3\NS4) e o Boceprevir (inibidor da protease NS3) são dois inibidores de proteases do HCV que agem diretamente no vírus, bloqueando a sua replicação (FORESTIER et al., 2007; KWO et al., 2010). Os estudos mostram que a associação de um desses inibidores de proteases ao tratamento atualmente recomendado (IFN-alfa peguilado e Ribavirina) é capaz de
8 aumentar a taxa de resposta virológica em mais de 70% em pacientes portadores do HCV genótipo 1 (BACON et al, 2011; KWO et al., 2010).
2.4 A HISTÓRIA NATURAL DA HEPATITE C
A história natural da hepatite C ainda não é totalmente compreendida. As dificuldades em se determinar a forma e do tempo de infecção contribuem para isso. A evolução da hepatite C é bastante variável (Figura 4). Cerca de 15% a 40% dos indivíduos infectados conseguem eliminar o vírus ainda na fase aguda da doença. A maior parte dos indivíduos infectados, entretanto, evolui para a fase crônica (SEEFF, 1997). Destes, cerca de 20% desenvolverão cirrose hepática nos próximos 10 ou 20 anos e uma vez instalada a cirrose os pacientes apresentam 1 a 4% de chance ao ano de desenvolver carcinoma hepatocelular (MARCELLIN et al., 2002).
A hepatite C é uma doença de curso longo e em geral os pacientes levam décadas até apresentarem os primeiros sintomas. A fase aguda da doença é caracterizada pela ausência de sintomatologia (mais de 75% dos casos são assintomáticos). Apenas 20% dos pacientes infectados apresentam icterícia (BRASIL, 2008). A fase crônica da hepatite C também pode ser assintomática, entretanto, é comum que os pacientes nesta fase da doença apresentem algum grau de lesão hepática. Assim, muitas vezes o diagnostico é feito ao acaso, durante a fase crônica da doença, a partir de alterações esporádicas em exames de rotina.
Figura 5: História natural da hepatite C.
Fonte: MARCELLIN et al., 2002
Hepatite C aguda Hepatite C crônica (85%) Cura (15%) CHC (1- 4% ao ano) Cirrose (20%)
9 A principal consequência da hepatite C crônica é a formação de fibrose hepática, que a depender da sua extensão pode comprometer a função do órgão, levando à cirrose (FRIEDMAN, 1993; NIH, 2002). A fibrose é caracterizada pela síntese e deposição de matriz extracelular, composta principalmente por colágenos tipo I e IV, proteoglicanos, fibronectina e ácido hialurônico (GRESSNER & BACHEM, 1990).
A fibrose surge sempre quando há uma lesão tecidual e é reversível quando o estímulo agressor é removido. Assim o excesso de matriz extracelular depositado é degradado por enzimas proteolíticas, principalmente pelas metaloproteinases (fibrólise), possibilitando assim a completa regeneração do tecido lesado. A fibrose é irreversível quando o estímulo à lesão persiste, provocando um dano tecidual crônico e o acúmulo de grandes quantidades de matriz extracelular (fibrogênese) (BENYON & ARTHUR, 2001). Neste último caso, também ocorre diminuição da liberação das metaloproteinases e aumento da secreção dos seus inibidores naturais. As fibras de colágeno tornam-se resistentes à degradação, ocorrem alterações na arquitetura do parênquima hepático e dependendo da sua extensão pode haver comprometimento da função do órgão e o desenvolvimento de cirrose (IREDALE, 2001; NEUBAUER et al., 2001).
Inicialmente acreditava-se que o HCV era um vírus citopático e, portanto, poderia causar lesão direta aos hepatócitos com consequente formação de fibrose (BARONE et al., 1999; MILLER & PURCELL, 1990). Porém, a resposta imune local pode ter um papel mais relevante nisso.
Algumas características relacionadas ao paciente, como idade avançada no momento da infecção, o sexo masculino, a ingestão abusiva de álcool, a presença de obesidade, esteatose e resistência à insulina, parecem contribuir com uma evolução mais rápida da fibrose hepática em pacientes com hepatite C (POYNARD et al., 1997; POWELL et al., 2005; CHUNG et al., 2012).
A esteatose hepática, caracterizada pelo aumento do conteúdo de gordura no fígado, é uma condição frequentemente observada em pacientes com hepatite C (RAMALHO, 2003). Cerca de 40% a 80% dos pacientes com hepatite C crônica têm esteatose hepática (ASSELAH et al., 2006). Características tanto relacionadas ao paciente quanto ao vírus parecem contribuir com o desenvolvimento da esteatose hepática. Nos pacientes infectados com o HCV genótipo 1, a esteatose parece ser
10 devido a coexistência de esteatohepatite não alcoólica ou NASH (Nonalcoholic Steatohepatitis) e de um aumento no índice de massa corpórea. A NASH é um achado histológico onde, além da esteatose, é possível observar inflamação, necrose e fibrose no tecido hepático. Já nos pacientes infectados com o HCV genótipo 3, a esteatose parece ser resultado de um efeito citopático direto do vírus. Sequências virais específicas seriam as responsáveis pelo acúmulo de lipídios no citoplasma dos hepatócitos (RUBBIA-BRANDT et al., 2000).
A esteatose hepática, assim como a obesidade abdominal, redução dos níveis séricos de HDL colesterol, aumento dos níveis séricos de triglicerídeos, aumento da pressão sanguínea e resistência à insulina, são componentes importantes da chamada síndrome metabólica, condição relacionada ao aumento do risco cardiovascular e do desenvolvimento de diabetes tipo 2 (MAGLIANO et al., 2006; WUBBEN & ADAMS, 2006). As causas da síndrome metabólica não são conhecidas, mas a infecção crônica pelo HCV aumenta o risco de desenvolvimento de síndrome metabólica (SERSTÉ et al., 2010).
2.5 MANIFESTAÇÕES EXTRA-HEPÁTICAS
A hepatite C frequentemente está associada a manifestações extra-hepáticas (JADALI, 2013). Estima-se que cerca de 40% dos pacientes infectados pelo HCV apresentam algum tipo de manifestação extra-hepática da doença (CACOUB et al., 2000).
As manifestações extra-hepáticas associadas a infecção pelo HCV mais comumente observadas são a crioglobulinemia, vasculite, glomerulonefrite, neuropatia e linfoma de células B (TANG & LAI, 2013). Desordens cutâneas (ANDRADE et al., 2012) e da glândula tireoide (JADALI, 2013) também têm sido descritas, mas sua associação com a hepatite C crônica ainda precisa ser melhor investigada (ZIGNEGO et al., 2012).
A origem dessas manifestações pode ser a formação de imunocomplexos ou outras desordens do sistema imune. Em doenças infecciosas de curso longo, como na hepatite C, é comum a produção de autoanticorpos (BOGDANOS et al., 2005; HIMOTO & MASAKI, 2012). Esses autoanticorpos podem ser contra ácidos nucleicos, proteínas ou mesmo lipídios e ao interagir com seus respectivos
11 antígenos formam imunocomplexos que se depositam em pequenos vasos, obstruindo-os e provocando uma inflamação (AGNELLO et al., 1992). A infecção crônica pelo HCV pode ainda provocar uma estimulação excessiva e persistente do sistema imune. O resultado pode ser o aparecimento de desordens linfoproliferativas (ZIGNEGO et al., 2007).
2.6 A RESPOSTA IMUNE AO HCV
A resposta imune ao HCV tem início logo após a infecção. Ao entrar na corrente sanguínea o HCV pode infectar várias células e se replicar dentro delas enquanto migra para o fígado, seu órgão alvo (GOWANS, 2000). São essas células infectadas que constituem a primeira linha de defesa contra o vírus.
O reconhecimento dos Padrões Moleculares Associados a Patógenos ou PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) do HCV na superfície das células induz a produção de IFNs tipo I (IFN-alfa e IFN-beta), responsáveis pela inibição da replicação viral na célula recém infectada e pela indução do estado antiviral em células vizinhas. Este mecanismo limita a disseminação do HCV (TAYLOR et al., 2000; MIZUKOSHI & REHERMANN, 2001).
Os IFNs do tipo I também ativam células NK (TAYLOR et al., 2000), que contribuem com esse controle inicial da replicação viral, eliminando as células infectadas (REHERMANN, 2000). As células NK também são uma importante fonte de IFN-gama, que entre outras funções atua em macrófagos, potencializando seus efeitos microbicidas e em linfócitos T contribuindo para a sua ativação.
A literatura tem mostrado que pacientes que durante a fase aguda da hepatite C apresentam uma resposta vigorosa e sustentada de linfócitos T CD4 e CD8 contra múltiplos epítopos do HCV, em geral conseguem fazer uma eliminação viral eficiente e controlar a infecção (THIMME et al., 2001; URBANI et al., 2006). Em contrapartida, a fase crônica da hepatite C é caracterizada por uma resposta atenuada de linfócitos T contra o vírus (WEDEMEYER et al., 2002).
Os motivos que levam a essa falha na reatividade dos linfócitos T durante a hepatite C crônica ainda não são compreendidos, mas, provavelmente, fatores tanto relacionados ao hospedeiro quanto ao vírus podem contribuir com isso. A estimulação constante das células de defesa pode levar a exaustão ou deleção dos
12 linfócitos T. Células com perfil imunomodulatório, como os linfócitos Treg também podem estar envolvidos na manutenção da infecção crônica. Pacientes com hepatite C crônica têm uma frequência maior de linfócitos T CD4+CD25+ que suprimem a resposta proliferativa de linfócitos T específicos para o HCV (CABRERA et al., 2004). Determinados polimorfismos no Complexo Principal de Histocompatibilidade ou MHC (Major histocompatibility complex) e em genes de citocinas podem favorecer a eliminação ou persistência do vírus (HARUNA et al., 2000; MANGIA et al., 1999). O HCV também pode prejudicar o funcionamento de células do sistema imune. Segundo Bella et al (2007), células dendríticas de pacientes com hepatite C crônica apresentam alterações em suas funções que não são observadas em pacientes que conseguem controlar a infecção. As células dendríticas são células apresentadoras de antígenos que têm papel crucial na ativação e diferenciação dos linfócitos T naives. Mutações nos epítopos alvo do sistema imune também são estratégias utilizadas pelo HCV para se evadir da resposta imune do hospedeiro (IWATA et al., 1995; GUAN et al., 2012; FOFANA et al., 2012).
2.6 AS CITOCINAS NA HEPATITE C
As citocinas são importantes mediadores da resposta imune. Em pacientes com hepatite C crônica, os níveis séricos de citocinas estão elevados quando comparados a indivíduos saudáveis, sugerindo que as respostas mediadas pelos linfócitos T estão ativadas nesses pacientes (CACCIARELLI et al., 1996; FAN et al., 1998).
De forma similar ao que foi descrito por Mosmann et al (1986) em murinos, os linfócitos T CD4 humanos, quando ativados, podem se diferenciar em subpopulações distintas, caracterizadas conforme o padrão de citocinas que secretam e as funções que estimulam. Os linfócitos Th1 produzem predominantemente as citocinas pró-inflamatórias IFN-gama, IL-2 e linfotoxina, e favorecem a inflamação e as respostas mediadas por células. Os linfócitos Th2 produzem principalmente as citocinas anti-inflamatórias IL-4, IL-5 e IL-13, que inibem as respostas mediadas por células e estimulam as respostas humorais (DEL PRETE et al., 1994). Os linfócitos T regulatórios ou Treg são outra subpopulação de linfócitos T que secretam IL-10 e TGF-beta e exercem funções imunossupressoras,
13 inibindo tanto das respostas do tipo Th1 quanto Th2 (MOORE et al., 2001; LETTERIO & ROBERTS, 1998). Mais recentemente foram descritas outras subpopulações de linfócitos T, como os linfócitos Th9, que secretam IL-9 e estão relacionados a doenças alérgicas, como a asma (XING et al., 2011). Os linfócitos Th17 produzem principalmente a IL-17 e participam do recrutamento, ativação e migração de neutrófilos para o sítio da infecção, além de influenciar a secreção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-6 e a IL-8 (ROMAGNANI, 2008). Os linfócitos Th17 também são importantes na defesa do organismo contra infecções fúngicas e por bactérias gram-negativas (ZHU & PAUL, 2008; ZELANTE et al., 2007). Os linfócitos Th22, que secretam IL-22, têm sido relacionados a doenças autoimunes, como artrite reumatoide (YANG et al., 2013).
A literatura mostra que um desequilíbrio na produção de citocinas tem sido observado em várias doenças infecciosas humanas, com na infecção pelo HIV, HBV, leptospirose e leishmaniose (CLEIRICI & SHEARER, 1994; JIANG et al., 2000, YAMAMURA et al., 1991; SHER & COFFMAN, 1992). A resposta imune mediada por células, favorecida pelas citocinas relacionadas ao perfil Th1, tem sido associada ao controle de várias doenças, enquanto que as citocinas relacionadas ao perfil Th2 exercem funções imuno-regulatórias negativas (TSAI et al., 1997).
Na hepatite C, as citocinas produzidas pelos linfócitos T são importantes para o controle da replicação viral, mas também podem contribuir com a progressão do dano hepático (KOZIEL, 1997; TSAI et al., 1997). Assim, ainda não está claro qual perfil de citocinas está associado à gravidade das lesões hepáticas (BROWN & NEUMAN, 2001).
A grande variação das condições clínicas dos pacientes, as diversas metodologias empregadas para análise das citocinas (citometria de fluxo, ELISA) e os tipos de amostras (soro, sobrenadante de culturas, fragmentos de tecido hepático) dificultam a comparação dos resultados dos estudos e o entendimento de como as citocinas contribuem com o agravamento das lesões hepáticas observadas na hepatite C crônica (VISO et al., 2010).
Bozkaya et al (2000), relataram que a lesão hepática observada na hepatite C crônica estava associada a um aumento nos níveis séricos de citocinas relacionadas ao perfil Th1, cuja citocina de assinatura é o IFN-gama. O IFN-gama é uma citocina
14 pró-inflamatória produzida por linfócitos T e células NK. Entre suas principais funções, o IFN-gama potencializa os efeitos microbicidas dos macrófagos. Segundo Gilles et al (1992) e Paul & Seder (1994), o IFN-gama não favorece apenas a eliminação dos hepatócitos infectados pelo HCV, mas também aumenta a gravidade da doença, já que estimula a imunidade celular. Bertoletti et al (1999) e Taylor et al (2006), observaram que a maior parte dos linfócitos T que infiltram o fígado de pacientes com hepatite C crônica têm perfil Th1 e Napoli et al (1996), observaram níveis intra-hepáticos elevados de IFN-gama e IL-2. Gonzales-Reimers et al (2009), observaram níveis séricos elevados de IFN-gama em pacientes com hepatite C crônica e atividade necroinflamatória intensa. Zhang et al (2009), relataram um aumento dos níveis séricos de IFN-gama após a conclusão do tratamento antiviral apenas no grupo dos respondedores. O tratamento da hepatite C tem como objetivo eliminar o vírus, porém, o mecanismo imunológico exato não é bem conhecido. Provavelmente o sucesso do tratamento está associado a ativação das respostas mediadas pelos linfócitos T(CACCIARELLI et al., 1996). De acordo com Tsai et al (1997), a ativação de respostas relacionadas ao perfil Th1 durante a terapia é um mecanismo imunológico comum aos pacientes que conseguem obter sucesso no tratamento da hepatite C. Entretanto, ainda não há um consenso sobre o que ocorre com os níveis séricos de citocinas após a conclusão da terapia.
Neuman et al (2012) e Zylberberg et al (1999), associaram níveis séricos elevados de TNF à fibrose grave. Cua et al (2007), entretanto, discordaram e afirmaram em seu estudo que os níveis séricos de TNF não estavam associados à fibrose hepática. O TNF é outra citocina pró-inflamatória, secretada por macrófagos, células endoteliais, musculares e adipócitos. O TNF atua no recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção e em macrófagos e células endoteliais, age estimulando a secreção de IL-1beta e quimiocinas, que atraem outros leucócitos. Zylberberg et al (1999), Neuman et al (2002), Hung et al (2009) e Cua et al (2007), afirmaram em seus estudos que os níveis séricos de TNF refletiam a progressão da inflamação hepática. Crespo et al (2002), entretanto, não observaram isso. Segundo Zhang et al (2002), o TNF também age sobre o tecido adiposo estimulando a lipólise, ou seja, a quebra das moléculas de gordura para a produção de energia. Isso ocorre porque o TNF estimula a atividade da enzima Lipase Hormônio Sensível
15 ou LHS, que, como o próprio nome já diz, é sensível a ação de hormônios, como a insulina, que inibe sua ação (SUMIDA et al., 1990). O TNF também inibe a atividade da enzima Lipase Lipoproteica ou LL, responsável pela remoção dos lipídeos da circulação e acúmulo destes nos adipócitos. Esses dois efeitos combinados resultam em um aumento dos níveis séricos de triglicerídeos (FEINGOLD & GRUNFELD, 1992; MENDALL et al., 1997). Ziccardi et al (2002), Mendall et al (1997) e Yudkin et al (1999), observaram níveis séricos elevados de TNF em indivíduos obesos. Segundo Cua et al (2007) e Crespo et al (2002), entretanto, os níveis séricos de TNF não estão associados à esteatose hepática, caracterizada pelo aumento do conteúdo de gordura dentro dos hepatócitos, embora a esteatose hepática esteja associada à um estado pró-inflamatório em pacientes com hepatite C crônica (JOSSON et al.,2008). O TNF também afeta o metabolismo da glicose, suprimindo a sinalização do receptor de insulina na membrana das células (LIU et al., 1998). O resultado disso é a diminuição na captação de glicose pelas células e um quadro de hiperinsulinemia. Assim, Ziccardi et al (2002), Mendall et al (1997), Yudkin et al (1999) e Bruun et al (2003), relataram aumento dos níveis séricos de TNF em indivíduos com resistência à insulina. O mesmo, entretanto, não foi observado por Hung et al (2009) e Cua et al (2007). Ainda assim, Eckel et al (2005) e Grundy et al (2005), afirmaram que a síndrome metabólica está associada a um quadro pró-inflamatório.
Sobchak & Monakova (2004) e Huang et al (1999), observaram níveis séricos elevados de IL-1beta, IL-2 e IL-6 em pacientes com hepatite C e fibrose grave e cirrose. A IL-1-beta é produzida principalmente por macrófagos e células endoteliais e age de forma semelhante ao TNF, estimulando a expressão de moléculas de adesão e facilitando assim a migração de leucócitos para o sítio da infecção. A IL-1beta também reduz a atividade da LL no tecido adiposo, contribuindo com o aumento dos níveis séricos de triglicerídeos (FEINGOLD & GRUNFELD, 1992). A IL-2 estimula a proliferação de linfócitos T e B e a ativação de células NK. Mazur et al (2001), observaram um aumento nos níveis séricos de IL-2 no grupo dos respondedores à terapia antiviral. A IL-1beta, juntamente com o TNF, estimulam a produção de 6 em macrófagos e células endoteliais (WINNOCK et al., 1993). A IL-6 é o principal mediador da resposta inflamatória de fase aguda. Atua no fígado,
16 estimulando a produção da proteína C reativa ou PCR, que possui funções imuno-regulatórias, estimulando a ativação do sistema complemento, a reatividade dos leucócitos e a síntese de citocinas (BLACK et al., 2004). Malaguarnera et al (1997) e Gonzáles-Reimers et al (2009), observaram que os níveis séricos de IL-6 estavam elevados em pacientes com hepatite C crônica e se correlacionavam com o grau de atividade necroinflamatória. Cua et al (2007) porém, não observou essa associação. Com relação à terapia, Mazur et al (2001), observaram um aumento nos níveis séricos de IL-6 tanto no grupo dos respondedores quanto no grupo dos NR ao tratamento antiviral. O tecido adiposo também é uma importante fonte de IL-6, existindo uma correlação direta dessa citocina com a massa adiposa (FRIED et al., 1998). Josson et al (2008) e Baranova et al (2011), relataram que os níveis séricos de IL-6 estão associados à obesidade e à esteatose hepática em pacientes com hepatite C. Cua et al (2007) entretanto, não observaram essa associação.De acordo com Yudkin et al (1999), em pessoas saudáveis, a IL-6 se correlaciona com todos os componentes da síndrome metabólica (glicemia, circunferência da cintura, concentrações séricas de triglcerídeos e HDL colesterol e pressão sanguínea), de modo que, quanto maior o número de componentes da síndrome metabólica apresentados pelos indivíduos, maiores foram os níveis séricos de IL-6. Como a síndrome metabólica aumenta o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares, Ogiwara et al (2004), sugerem que a avaliação dos níveis séricos de TNF e IL-6 pode ser uma importante ferramenta para predizer a ocorrência de eventos cardiovasculares. Hung et al (2009), entretanto, afirmaram não existir associação entre os níveis séricos de IL-6 e a resistência a insulina em pacientes com hepatite C crônica.
Baranova et al (2011) e Neuman et al (2007), também observaram níveis séricos elevados de IL-8 em pacientes com hepatite C e fibrose moderada e grave, e afirmaram que os níveis séricos de IL-8 em pacientes com hepatite C crônica continuavam aumentando, mesmo naqueles com cirrose hepática. A IL-8 é produzida principalmente por macrófagos e em menor quantidade por células endoteliais. Também conhecida como CXCL8, a IL-8 é uma quimiocina. As quimiocinas são citocinas que funcionam como quimioatraentes para outras células, estimulando a migração para o sítio da infecção (BAGGIOLINI et al., 1997). Neuman
17 et al (2007), relataram níveis séricos elevados de IL-8 em pacientes com atividade necroinflamatória intensa. Baranova et al (2011), afirmaram que os níveis séricos de IL-8 estão associados à esteatose hepática em pacientes com hepatite C crônica. Bruun et al (2003) e Straczkowski et al (2002), relataram aumento dos níveis séricos de IL-8 em indivíduos obesos e naqueles com resistência à insulina. O mesmo, porém, não foi observado por Cua et al (2007).
Fan et al (1998), Koziel (1999) e Tsai et al (1997), entretanto, relataram que as respostas do tipo Th2 também estão presentes em pacientes com hepatite C crônica, e em razão dos seus efeitos modulatórios sobre respostas do tipo Th1, seriam capazes de minimizar o dano hepático, embora comprometessem a eliminação do vírus e também estivessem associadas à cronificação da doença.
Abayli et al (2003), entretanto, não observaram associação entre os níveis séricos de IL-4 e IL-10 e a atividade necroinflamatória em pacientes com hepatite C crônica. A IL-4 é produzida por linfócitos T e é o principal estímulo para a diferenciação de linfócitos T naives em células Th2. A IL-4 também é capaz de ativar macrófagos por uma via diferente daquela utilizada pelo IFN-gama (MONTANER et al., 1999; BIRK et al., 2001). Sobue et al (2001), também não observaram diferenças nos níveis séricos de IL-10 com a progressão da fibrose hepática. A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória produzida por macrófagos e linfócitos T e age principalmente inibindo a secreção de IL-12, principal citocina indutora da diferenciação de linfócitos T naives em células Th1. Esposito et al (2003), observaram níveis séricos elevados de IL-10 em indivíduos obesos e baixos níveis séricos de IL-10 em indivíduos com síndrome metabólica. Shibata et al (1997), entretanto, relataram níveis séricos elevados de IL-10 em pacientes com lesão isquêmica no miocárdio.
Tsushima et al (1999), associaram níveis séricos elevados de TGF-beta com a progressão da fibrose hepática. Neuman (2006), Valva et al (2011) e Soliman et al (2010), entretanto, discordaram e afirmaram que os níveis séricos de TGF-beta estavam elevados apenas nos estágios iniciais de fibrose. O TGF-beta é produzido principalmente por linfócitos T e macrófagos e participa do processo de reparo tecidual. Sob seu estímulo, as células estreladas de Ito, bem como os fibroblastos portais e perivasculares, são ativados e se diferenciam em miofibroblastos, principais
18 células secretoras de matriz extracelular no tecido hepático (FRIEDMAN, 2000; TSUKADA et al., 2006). O acúmulo de grandes quantidades de matriz extracelular associado à diminuição da secreção de enzimas capazes de degrada-la como as metaloproteinases, resulta na formação da fibrose hepática (SCHUPPAN et al., 2003; NEUBAUER et al., 2001). Com relação à terapia antiviral, Tsushima et al (1999), relataram uma diminuição nos níveis séricos de TGF-beta após a conclusão do tratamento antiviral tanto no grupo dos respondedores quanto no grupo dos NR. Soliman et al (2010), observaram níveis séricos elevados de TGF-beta em pacientes com hepatite C e esteatose hepática.
19 3 ARTIGO CIENTÍFICO: PERFIL SÉRICO DE CITOCINAS EM PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA: ASSOCIAÇÃO COM FIBROSE HEPÁTICA, ATIVIDADE NECROINFLAMATÓRIA, ESTEATOSE HEPÁTICA E SÍNDROME METABÓLICA
MARTINS CC1,2, LEMAIRE DC1, SAMPAIO GP1, OLIVEIRA LPM3, JESUS RP3, CAVALCANTE LN3, LYRA LGC3, MEYER R1, FREIRE SM1, LYRA AC3
1-Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular do Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Brasil; 2-Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Imunologia, ICS/UFBA; 3-Complexo Hospital Universitário Professor Edgard Santos - CHUPES/UFBA
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil sérico de citocinas em pacientes com hepatite C crônica e diferentes estágios de fibrose hepática, graus de atividade necroinflamatória, esteatose hepática e síndrome metabólica. Para tanto, em 121 pacientes com hepatite C crônica, formam avaliados por citometria de fluxo os níveis séricos das seguintes citocinas: IFN-gama, 1beta, 2, 6, 8, TNF, 4 e IL-10. Destes, 78 pacientes também tiveram os níveis séricos de TGF-beta avaliados. A população estudada foi composta por pacientes com idade média de 52 (±10) anos e principalmente por homens (67%), portadores do HCV genótipo 1 (82%), seguidos do genótipo 3 (17%), pacientes que apresentavam estágio de fibrose moderada (36%) e grave (40%), ausência de atividade necroinflamatória (44%) e atividade necroinflamatória leve (38%), NR ao tratamento antiviral prévio (62%), ausência de esteatose hepática (63%) e ausência de síndrome metabólica (88%). Os pacientes com fibrose moderada tiveram os maiores níveis séricos de IL-4 (163pg/mL) e TGF-beta (60254pg/mL) e os pacientes com fibrose grave tiveram os maiores níveis séricos de IFN-gama (203pg/mL), IL-2 (284pg/mL), IL-8 (489pg/mL), IL-6 (10pg/mL), IL-1beta (13pg/mL) e IL-10 (30pg/mL). Os pacientes com ausência de atividade necroinflamatória tiveram os maiores níveis séricos de TGF-beta (55158pg/mL) e os pacientes com atividade necroinflamatória intensa tiveram os maiores níveis séricos de IFN-gama (190pg/mL), 2 (273pg/mL), 8 (547pg/mL), 1beta (12pg/mL), IL-4 (133pg/mL) e IL-10 (29pg/mL). Os pacientes com esteatose hepática tiveram os maiores níveis séricos de IFN-gama (152pg/mL), IL-2 (216pg/mL), IL-8 (409pg/mL) e TGF-beta (61200pg/mL). Os pacientes com síndrome metabólica tiveram os maiores níveis séricos de IL-2 (249pg/mL), IL-6 (10pg/mL), IL-1beta (11pg/mL), IL-4 (198pg/mL) e IL-10 (14pg/mL). Com base em nossos resultados, concluímos que os pacientes com estágio de fibrose grave e esteatose hepática apresentaram níveis séricos mais elevados de citocinas predominantemente pró-inflamatórias. Os pacientes com grau de atividade necroinflamatória intensa e com síndrome metabólica apresentaram níveis séricos mais elevados tanto de citocinas pró-inflamatórias quanto anti-pró-inflamatórias.
Palavras-chave: Citocinas; Hepatite C crônica; Fibrose hepática; Esteatose; Síndrome metabólica
20 INTRODUÇÃO
A hepatite C é uma doença amplamente distribuída no mundo. Estima-se que 3% da população mundial esteja infectada (PERZ et al., 2004). A maior parte dos pacientes infectados evolui para a fase crônica da doença (SEEFF, 1997), com lesões hepáticas que podem comprometer o funcionamento do fígado e levar ao desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (FRIEDMAN, 1993; MARCELLIN et al., 2002). A patogênese dessas lesões hepáticas ainda é pouco compreendida, mas resposta imune local pode ter alguma participação.
Os níveis séricos de citocinas estão elevados em pacientes com hepatite C crônica quando comparados a indivíduos saudáveis e isso sugere ativação das respostas mediadas pelos linfócitos T (CACCIARELLI et al., 1996; FAN et al., 1998). A literatura mostra que um desequilíbrio na produção de citocinas tem sido observado em várias doenças infecciosas humanas, como na infecção pelo HIV, HBV, leptospirose e Leishmaniose (CLEIRICI & SHEARER, 1994; YAMAMURA et al., 1991; SHER & COFFMAN, 1992; JIANG et al., 2000). As citocinas relacionadas ao perfil Th1 tem sido associadas ao controle de várias doenças, enquanto que as citocinas relacionadas ao perfil Th2 exerceriam funções imuno-regulatórias negativas (TSAI et al., 1997).
Os linfócitos Th1 secretam principalmente citocinas pró-inflamatórias, como IFN-gama, IL-2 e linfotoxina, e favorecem a inflamação e a imunidade mediada por células. Os linfócitos Th2 produzem predominantemente citocinas anti-inflamatórias, como a IL-4, IL-4 e IL-13, que inibem as respostas mediadas por células e estimulam a imunidade humoral (DEL PRETE et al., 1994). Os linfócitos T regulatórios ou Treg são outra subpopulação de linfócitos que secretam IL-10 e TGF-beta e exercem funções imunossupressoras, inibindo tanto as respostas do tipo Th1 quanto Th2 (MOORE et al., 2001; LETTERIO & ROBERTS, 1998).
Na hepatite C, as citocinas produzidas pelos linfócitos T são importantes para o controle da replicação viral, mas também podem contribuir com a progressão do dano hepático (KOZIEL, 1997; TSAI et al., 1997).
A principal consequência da hepatite C é o desenvolvimento de fibrose hepática, frequentemente associada a um infiltrado intra-hepático inflamatório leve (POYNARD et al., 1997). A esteatose hepática, caracterizada pelo aumento de
21 gordura no fígado (RAMALHO, 2003), e a síndrome metabólica, condição relacionada ao aumento do risco cardiovascular e do desenvolvimento de diabetes tipo 2 (MAGLIANO et al., 2006; WUBBEN & ADAMS, 2006), estão associadas a um quadro pró-inflamatório (JONSSON et al., 2008; ECKEL et al., 2005; GRUNDY et al., 2005) e parecem contribuir com uma evolução mais rápida da fibrose hepática em pacientes com hepatite C (POWELL et al., 2005; CHUNG et al., 2012).
A grande variação das condições clínicas dos pacientes, as diversas metodologias empregadas para análise das citocinas (citometria de fluxo, ELISA) e os tipos de amostras (soro, sobrenadante de culturas e fragmentos de tecido hepático) dificultam a comparação dos resultados dos estudos (VISO et al., 2010). Assim, ainda não está claro qual o perfil de citocinas está associado à gravidade das lesões hepáticas (BROWN e NEUMAN, 2001).
Este trabalho teve como objetivo caracterizar o perfil sérico de citocinas em pacientes com hepatite C crônica e diferentes estágios de fibrose hepática, graus de atividade necroinflamatória, esteatose hepática e síndrome metabólica. Para tanto, formam avaliados por citometria de fluxo os níveis séricos das seguintes citocinas: IFN-gama, IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10 e TGF-Beta.
É importante considerar que tal avaliação representou a expressão momentânea do que ocorre no organismo infectado pelo HCV. Assim, os achados foram interpretados com base no conhecimento atual sobre a imunopatogenia da infecção crônica pelo HCV.
22 METODOLOGIA
Tipo de estudo
Este é um estudo retrospectivo, descritivo e corresponde a uma subanálise de um estudo previamente publicado (OLIVEIRA L. P. et al. Effect of soy protein supplementation in patients with chronic hepatitis C: a randomized clinical trial. World J Gastroenterol, v.18, n. 18, p. 2203-2211, May 2012). No referido estudo, o objetivo geral foi avaliar o efeito da suplementação à base de soja integral em pó sobre os parâmetros clínicos e nutricionais de pacientes com infecção pelo vírus da hepatite C.
População de estudo
No estudo prévio, pacientes não diabeticos e não obesos com hepatite C crônica foram randomizados para dois tipos de suplementação dietética. Os pacientes que fizeram parte deste estudo eram acompanhados no ambulatório de Hepatologia do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos (c-HUPES) da Universidade Federal da Bahia. Foram incluídos consecutivamente 160 pacientes entre Julho de 2008 e Dezembro de 2009, que atendiam aos seguintes critérios de inclusão: Idade superior a 18 anos, com diagnóstico de hepatite C (detecção de anticorpos específicos para o HCV pelo método Imunoenzimático ELISA e detecção do HCV-RNA pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase-PCR), com ou sem cirrose hepática, com consumo de etanol inferior a 20 g/dia, naives de tatamento antiviral e aqueles com tratamento antiviral finalizado há pelo menos 3 meses. Para este estudo prévio não foram incluídos pacientes co-infectados com vírus HIV e/ou HBV, com insuficiência renal, cardiopatia, cirrose descompensada, gestantes, pacientes com neoplasia, Diabetes Melitus e obesidade (IMC > 30 kg/m2). Para o estudo atual, foram excluídos ainda os pacientes coinfectados com HTLV I e II e aqueles que não possuíam dados referentes ao genótipo e estágio de fibrose. Foram excluídos, portanto, 39 pacientes para o estudo atual pelos seguintes motivos: 28 indivíduos não apresentavam dados referentes à fibrose hepática, 8 não apresentavam informações sobre o genótipo viral, 2 eram co-infectados com HTLV e 1 apresentava sorologia positiva para doença de Chagas. Assim, foram incluídos para o presente estudo um total de 121 pacientes, que foram classificados em
23 grupos de acordo com o estágio de fibrose: grupo F0/F1 (sem fibrose e com fibrose leve), grupo F2 (fibrose moderada) e grupo F3/F4 (fibrose grave); de acordo com o grau de atividade necroinflamatória: grupo A0 (sem inflamação), grupo A1(inflamação leve) e grupo A2/A3 (inflamação intensa); e de acordo com a presença ou ausência de tratamento antiviral prévio, esteatose hepática e síndrome metabólica.
Parâmetros clínicos
Os dados referentes ao genótipo do HCV, estágio de fibrose hepática (classificação METAVIR), grau de atividade necroinflamatória (classificação METAVIR), realização do tratamento antiviral prévio e presença/ausência de esteatose hepática foram todos obtidos a partir dos prontuários dos pacientes. A síndrome metabólica foi definida com base nos critérios estabelecidos no Adult Treatment Panel III (ATPIII), elaborado pelo National Cholesterol Education Program (NECP), em 2001. Assim, o diagnóstico de síndrome metabólica incluiu pelo menos três dos seguintes critérios: medida da circunferência da cintura maior que 102cm para os homens e maior que 88cm para as mulheres, pressão arterial maior que 130/85mmHg, triglicérides maior que 150mg/dl, colesterol HDL menor que 40mg/dl para os homens e menor que 50 mg/dl para as mulheres e glicose de jejum maior que 100mg/dl.
Dosagem sérica de citocinas
Os 121 pacientes que fizeram parte do presente estudo tiveram amostras de sangue coletadas antes da intervenção dietética. Todos os pacientes submetidos ao tratamento antiviral já tinham finalizado o esquema terapêutico há pelo menos 3 meses e não estavam em re-tratamento no momento da coleta. Após a centrifugação, uma parte do o soro foi aliquotado e armazenado a -20ºC para a posterior dosagem das citocinas. Uma vez congeladas, essas alíquotas não foram manipuladas até o momento da realização dos experimentos.
Os níveis séricos de IFN-gama, TNF, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 e IL-10 foram analisados em todas as 121 amostras de soro, das quais 78 amostras foram selecionadas, também, para a análise dos níveis séricos de TGF-Beta.
24 As dosagens das citocinas foram realizadas pela técnica de citometria de fluxo, que possibilita a análise de várias citocinas simultaneamente. O princípio consiste na utilização de micro esferas (beads) revestidas com anticorpos específicos para vários tipos de citocinas. Uma vez em contato com as beads as citocinas presentes na amostra se ligam especificamente aos anticorpos. A adição de anticorpos biotinilados e da estreptavidina marcada com Ficoeritrina (PE) completa o ensaio e possibilita a detecção da fluorescência pelo citômetro de fluxo.
Os kits utilizados na dosagem das citocinas foram o Human Th1/Th2 11plex FlowCytomix Kit (BMS810FF-Bender MedSystems) e o Human TGF-β1 FlowCytomix Simplex Kit (BMS8249FF-Bender MedSystems) e o software utilizado para o cálculo das concentrações séricas das citocinas foi o FlowCytomix Pro (Bender MedSystems).
A metodologia foi executada de acordo com padronização prévia, levando-se em consideração as instruções do fabricante. Inicialmente foram preparadas a curva padrão, o mix de Beads e o mix de conjugado biotinilado. Em seguida as amostras e a curva padrão foram transferidas para tubos tipo eppendorf, junto com o mix de beads e o mix de conjugado biotinilado. O ensaio foi incubado por 2h a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Posteriormente foram feitas três lavagens e adicionada a estreptavidina marcada com PE. O ensaio foi incubado por mais 1 hora a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Mais três lavagens foram feitas e o conteúdo dos eppendorfs foi transferido para tubos de citometria. Os tubos de citometria foram mantidos em geladeira e ao abrigo da luz até o momento da leitura no citocimetro de fluxo. Todas as amostras foram lidas em menos de 24h. Para a dosagem do TGF-Beta as 78 amostras de soro selecionadas por sorteio foram pré diluídas 1:10 no tampão do ensaio, em seguida foram acidificadas por 1h com HCl e posteriormente neutralizadas com NaOH. Logo após este procedimento o ensaio foi executado como o descrito acima.
Os limites de detecção das citocinas foram 1,6pg/mL (IFN-gama), 3,2 pg/mL (TNF), 4,2 pg/mL (IL-1beta), 16,4 pg/mL (IL-2), 20,8 pg/mL (IL-4), 1,2 pg/mL (IL-6), 0,5 pg/mL (IL-8), 1,9 pg/mL (IL-10), e 10 pg/mL (TGF-beta). O range das curvas-padrão foi de 27pg/mL à 20.000pg/mL para as citocinas IFN-gama, TNF, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e de 14pg/mL à 10.000 pg/mL para a IL-8 e TGF-beta.
25 Considerações éticas
Este estudo foi realizado atendendo aos aspectos éticos e bioéticos, de acordo com as normas vigentes, tendo sido submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Maternidade Climério de Oliveira da Universidade Federal da Bahia.
Os pacientes que aceitaram participar deste estudo foram informados sobre o objetivo desta pesquisa através do Termo de Consentimento Livre e Pré-Esclarecido (anexo). A coleta das amostras de sangue não implicou em riscos adicionais à saúde dos pacientes.
Todas as informações coletadas foram mantidas sob sigilo, e armazenadas em bancos de dados protegidos, acessíveis apenas aos investigadores. Os resultados obtidos serão publicados sob a forma de artigos científicos em revistas especializadas e comunicações em congressos. A identidade dos participantes será preservada.
Análise estatística
Os dados coletados dos prontuários, as dosagens bioquímicas e as concentrações séricas das citocinas foram apresentados na forma de média e desvio padrão ou mediana e intervalo interquartil conforme sua distribuição. Os gráficos foram elaborados com auxílio do software GraphPad Prism 5. Uma vez que a seleção dos pacientes para este estudo realizou-se através de uma amostragem propositiva e de conveniência, sendo, portanto, um plano amostral não probabilístico, o erro padrão não pôde ser estimado adequadamente. Consequentemente não foram calculadas estatísticas inferenciais (testes estatísticos e intervalo de confiança).
26 RESULTADOS
Características da população estudada
A população estudada, como mostra a tabela 1, foi composta por 121 pacientes com idade média de 52 (±10) anos e principalmente por homens (67%), portadores do genótipo 1 (82%), seguidos do genótipo 3 (17%), pacientes que apresentavam estágio de fibrose moderada (36%) e grave (40%), ausência de atividade necroinflamatória (44%) e atividade necroinflamatória leve (38%), NR ao tratamento antiviral prévio (62%), ausência de esteatose hepática (63%) e ausência de síndrome metabólica (88%). Essas características foram mantidas no momento da seleção dos 78 pacientes que também tiveram os níveis séricos de TGF-beta avaliados.
Tabela 1: Características gerais da população estudada, Salvador-BA (2008-2009) Idade (anos)* 52 (±10) Gênero Masculino 81 (67%) Feminino 40 (33%) Genótipo 1 99 (82%) 2 2 (1%) 3 20 (17%) Fibrose F0+F1 29 (24%) F2 44 (36%) F3+F4 48 (40%) Ativ. Necroinflamat. A0 53 (44%) A1 46 (38%) A2+A3 21 (18%) Tratamento NR 75 (62%) Naives 46 (38%) Esteatose Sim 35 (37%) Não 59 (63%) S. Metabólica Sim 14 (12%) Não 104 (88%)
27 De acordo com o estágio de fibrose, 121 pacientes foram estudados (Tabela 2). Destes, 1 paciente não teve dados referentes ao grau de atividade necroinflamatória, 27 não tiveram dados referentes à presença/ausência de esteatose hepática e 3 pacientes não tiveram dados referentes à presença/ausência de síndrome metabólica registrados em seus prontuários. Foram encontrados 29 pacientes sem fibrose hepática e com fibrose hepática leve (grupo F0/F1), 44 pacientes com estágio de fibrose moderada (grupo F2) e 48 pacientes com estágio de fibrose grave (grupo F3/F4). O grupo F3/F4 apresentou idade mais elevada (56±9 anos). Em todos os grupos predominou o gênero masculino (62% no grupo F0/F1, 68% no grupo F2 e 69% no grupo F3/F4) e o HCV genótipo 1 (83% no grupo F0/F1, 82% no grupo F2 e 81% no grupo F3/F4). O grupo F0/F1 apresentou a maior proporção de indivíduos não tratados (90%), enquanto que o grupo F3/F4 apresentou a maior proporção de indivíduos tratados (85%). Nos grupos F0/F1 e F2 predominaram indivíduos sem atividade necroinflamatória (A0) (69% e 54% respectivamente), enquanto que no grupo F3/F4 houve uma proporção maior de indivíduos com grau de atividade necroinflamatória leve (A1) (52%). No grupo F0/F1 a proporção de indivíduos naives de tratamento antiviral foi maior (90%) enquanto que nos grupos F2 e F3/F4 a proporção de indivíduos NR foi maior (70% e 85% respectivamente). Em todos os grupos predominaram os indivíduos sem esteatose hepática (45% no grupo F0/F1, 62% no grupo F2 e 40% no grupo F3/F4) e sem síndrome metabólica (86% no grupo F0/F1, 86% no grupo F2 e 85% no grupo F3/F4).
28 Tabela 2: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada, de acordo com o estágio de Fibrose hepática, Salvador-BA (2008-2009) Características Fibrose F0/F1 (n=29) F2 (n=44) F3/F4 (n=48) Idade (anos)* 49(±11) 51(±10) 56(±9) Gênero Masculino 18(62%) 30(68%) 33(69%) Feminino 11(38%) 14(32%) 15(31%) Genótipo 1 24(83%) 36(82%) 39(81%) 2 1(3%) 1(2%) 0 3 4(14%) 7(16%) 9(19%) Ativ. Necroinflamat. A0 20(69%) 24(54%) 9(19%) A1 8(28%) 13(30%) 25(52%) A2+A3 1(3%) 7(16%) 13(27%) Tratamento NR 3(10%) 31(70%) 41(85%) Naives 26(90%) 13(30) 7(15%) Esteatose Sim 6(21%) 12(27%) 17(35%) Não 13(45%) 27(62%) 19(40%) S. Metabólica Sim 3(10%) 5 (11%) 6(13%) Não 25 (86%) 38 (86%) 41 (85%)
29 De acordo com o grau de atividade necroinflamatória, 120 pacientes foram estudados (Tabela 3). Destes, 27 pacientes não tiveram dados referentes à presença/ausência de esteatose hepática e 3 pacientes não tiveram dados referentes à presença/ausência de síndrome metabólica registrados em seus prontuários. Foram encontrados 53 pacientes sem atividade necroinflamatória (grupo A0), 46 pacientes com grau de atividade necroinflamatória leve (grupo A1) e 21 pacientes com grau de atividade necroinflamatória intensa (grupo A2/A3). O grupo A1 apresentou idade mais elevada (55±10 anos). Em todos os grupos predominou o gênero masculino (74% no grupo A0, 63% no grupo A1 e 57% no grupo A2/A3) e o HCV genótipo 1 (87% no grupo A0, 80% no grupo A1 e 71% no grupo A2/A3). No grupo A0 predominaram indivíduos com estágio de fibrose moderada (F2) (45%), enquanto que nos grupos A1 e A2/A3 predominaram indivíduos com estágio de fibrose grave (F3/F4) (55% e 62% respectivamente). Em todos os grupos predominaram os indivíduos NR (53% no grupo A0, 63% no grupo A1 e 81% no grupo A2/A3), sem esteatose hepática (53% no grupo A0, 46% no grupo A1 e 43% no grupo A2/A3) e sem síndrome metabólica (87% no grupo A0, 87% no grupo A1 e 81% no grupo A2/A3).
30 Tabela 3: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada, de acordo com o grau de Atividade Necroinflamatória, Salvador-BA (2008-2009)
Características Atividade Necroinflamatória
A0(n=53) A1 (n=46) A2/A3 (n=21) Idade (anos)* 49(±10) 55(±10) 53(±9) Gênero Masculino 39(74%) 29(63%) 12(57%) Feminino 14(26%) 17(37%) 9(43%) Genótipo 1 46(87%) 37(80%) 15(71%) 2 1(2%) 0 1(5%) 3 6(11%) 9(20%) 5(24%) Fibrose F0+F1 20(38%) 8(17%) 1(5%) F2 24(45%) 13(28%) 7(33%) F3+F4 9(17%) 25(55%) 13(62%) Tratamento NR 28(53%) 29(63%) 17(81%) Naives 25(47%) 17(37%) 4(19%) Esteatose Sim 13(25%) 15(32%) 7(33%) Não 28(53%) 21(46%) 9(43%) S. Metabólica Sim 6 (11%) 5 (11%) 3 (14%) Não 46 (87%) 40 (87%) 17 (81%)
31 De acordo com o tratamento antiviral, 121 pacientes foram estudados (Tabela 4). Destes, 1 paciente não tinha dados sobre atividade necroinflamatória, 27 pacientes não tinham dados referentes à presença/ausência de esteatose hepática e 3 pacientes não tinha dados referentes à síndrome metabólica registrados em seus prontuários. Foram encontrados 46 pacientes naives de tratamento e 75 pacientes não respondedores (NR) ao tratamento antiviral. O grupo NR apresentou idade mais elevada (54 ±9 anos). Em ambos os grupos predominou o gênero masculino (54% no grupo naives e 75% no grupo NR) e o HCV genótipo 1 (76% no grupo naives e 85% no grupo NR). No grupo naives, a proporção de indivíduos sem fibrose e com fibrose leve (F0/F1) foi maior (57%), enquanto que no grupo NR predominaram indivíduos com estágio de fibrose grave (F3/F4) (55%). No grupo naives predominaram os indivíduos sem atividade necroinflamatória (A0) (54%), enquanto que no grupo NR predominaram os indivíduos com grau de atividade necroinflamatória leve (A1) (39%). Em ambos os grupos predominaram a ausência esteatose hepática (43% no grupo naives e 52% no grupo NR) e de síndrome metabólica (89% no grupo naives e 84% no grupo NR).
32 Tabela 4: Características clínicas e epidemiológicas da
população estudada, de acordo com Tratamento Antiviral prévio, Salvador-BA (2008-2009)
Características Tratamento Antiviral
Naives (n=46) NR (n=75) Idade (anos)* 40 (±10) 54 (±9) Gênero Masculino 25 (54%) 56 (75%) Feminino 21 (46%) 19 (25%) Genótipo 1 35 (76%) 64 (85%) 2 2 (4%) 0 3 9 (20%) 11 (15%) Fibrose F0+F1 26 (57%) 3 (4%) F2 13 (28%) 31 (41%) F3+F4 7 (15%) 41 (55%) Ativ. Necroinflamat. A0 25 (54%) 28 (37%) A1 17 (37%) 29 (39%) A2+A3 4 (9%) 17 (23%) Esteatose Sim 11 (24%) 24 (32%) Não 20 (43%) 39 (52%) S. Metabólica Sim 4 (9%) 10 (13%) Não 41 (89%) 63 (84%)
33 De acordo com o a presença/ausência de esteatose hepática, 94 pacientes foram estudados (Tabela 5). Destes, 1 paciente não teve dados referentes ao grau de atividade necroinflamatória e 3 pacientes não tinham dados referentes à presença/ausência de síndrome metabólica registrados em seus prontuários. Foram encontrados 35 pacientes com esteatose hepática e 59 pacientes sem esteatose hepática. O grupo com esteatose apresentou idade mais elevada (54±10 anos). Em ambos os grupos predominou o gênero masculino (69% em ambos) e o HCV genótipo 1 (80% no grupo com esteatose e 83% no grupo sem esteatose). No grupo com esteatose a proporção de indivíduos com estágio de fibrose grave (F3/F4) foi maior (49%), enquanto que no grupo sem esteatose predominaram indivíduos com estágio de fibrose moderada (F2) (46%). No grupo com esteatose predominaram os indivíduos com grau de atividade necroinflamatória leve (A1) (43%) enquanto que no grupo sem esteatose predominaram os indivíduos sem atividade necroinflamatória (A0) (47%). Em ambos os grupos predominaram os indivíduos NR (69% no grupo com esteatose e 66% no grupo sem esteatose) e sem síndrome metabólica (86% no grupo com esteatose e 88% no grupo sem esteatose).
34 Tabela 5: Características clínicas e epidemiológicas da
população estudada, de acordo com a presença ou ausência de Esteatose hepática, Salvador-BA (2008-2009)
Características Esteatose Sim (n=35) Não (n=59) Idade (anos)* 54(±10) 51(±10) Gênero Masculino 24(69%) 41(69%) Feminino 11(31%) 18(31%) Genótipo 1 28(80%) 49(83%) 2 0 2(3%) 3 7(20%) 8(14%) Fibrose F0+F1 6(17%) 13(22%) F2 12(34%) 27(46%) F3+F4 17(49%) 19(32%) Ativ. Necroinflamat. A0 13(37%) 28(47%) A1 15(43%) 21(36%) A2+A3 7(20%) 9(15%) Tratamento NR 24(69%) 39(66%) Naives 11(31%) 20(34%) S. Metabólica Sim 5 (14%) 4 (7%) Não 30 (86%) 52 (88%)
35 De acordo com a síndrome metabólica, 118 pacientes foram estudados (Tabela 6). Destes, 1 paciente não tinha dados sobre atividade necroinflamatória e 27 pacientes não tinham dados referentes à presença/ausência de esteatose hepática registrados em seus prontuários. Foram encontrados 14 pacientes com síndrome metabólica e 104 pacientes sem síndrome metabólica. O grupo sem síndrome metabólica apresentou idade mais elevada (52 ±11 anos). No grupo com síndrome metabólica predominou o gênero feminino (71%) enquanto que no grupo sem síndrome metabólica predominou o gênero masculino (73%). Em ambos os grupos predominou o HCV genótipo 1 (86% no grupo com síndrome metabólica e 81% no grupo sem síndrome metabólica), o estágio de fibrose grave (F3/F4) (43% no grupo com síndrome metabólica e 39% no grupo sem síndrome metabólica), a ausência de atividade necroinflamatória (A0) (43% no grupo com síndrome metabólica e 44% no grupo sem síndrome metabólica) e os indivíduos NR (71% no grupo com síndrome metabólica e 61% no grupo sem síndrome metabólica). No grupo com síndrome metabólica a proporção de pacientes com esteatose hepática foi maior (36%) enquanto que no grupo sem síndrome metabólica predominaram os pacientes sem esteatose hepática (50%).
36 Tabela 6: Características clínicas e epidemiológicas da
população estudada, de acordo com a presença ou ausência de Síndrome Metabólica, Salvador-BA (2008-2009)
Características Síndrome Metabólica
Sim (n=14) Não (n=104) Idade (anos)* 51 (±8) 52 (±11) Gênero Masculino 4 (29%) 76 (73%) Feminino 10 (71%) 28 (27%) Genótipo 1 12 (86%) 84 (81%) 2 0 2 (2%) 3 2 (14%) 18 (17%) Fibrose F0+F1 3 (21%) 25 (24%) F2 5 (36%) 38 (37%) F3+F4 6 (43%) 41 (39%) Ativ. Necroinflamat. A0 6 (43%) 46 (44%) A1 5 (36%) 40 (38%) A2+A3 3 (21%) 17 (16%) Tratamento NR 10 (71%) 63 (61%) Naives 4 (29%) 41 (39%) Esteatose Sim 5 (36%) 30 (29%) Não 4 (29%) 52 (50%)
37 Análise dos níveis séricos de citocinas
Citocinas x fibrose
A mediana dos níveis séricos de citocinas conforme o estágio de fibrose hepática foi apresentada na tabela 7 e ilustrada graficamente nas figuras 1 e 2.
Os pacientes com fibrose moderada tiveram os maiores níveis séricos de IL-4 (163pg/mL) e TGF-beta (60254pg/mL) e os pacientes com fibrose grave tiveram os maiores níveis séricos de IFN-gama (203pg/mL), IL-2 (284pg/mL), IL-8 (489pg/mL), IL-6 (10pg/mL), IL-1beta (13pg/mL) e IL-10 (30pg/mL).
Não houve diferença quanto aos níveis séricos de TNF entre os grupos estudados.
38 IFN-gama F0/F 1 F2 F3/F 4 0 100 200 300 400 500 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) IL-2 F0/F 1 F2 F3/F 4 0 200 400 600 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) IL-1Beta F0/F 1 F2 F3/F 4 0 20 40 60 80 300 600 900 1200 1500 1800 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) TNF F0/F 1 F2 F3/F 4 0 200 400 600 800 6000 8000 10000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) IL-8 F0/F 1 F2 F3/F 4 0 500 1000 1500 2000 3000 4000 6000 7000 8000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) IL-6 F0/F 1 F2 F3/F 4 0 10 20 30 C o n c e n tr a ç ã o ( p g /m L )
Figura 1: Níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias de acordo com o estágio de fibrose hepática. A linha em vermelho indica a mediana.
39 IL-4 F0/F 1 F2 F3/F 4 0 200 400 600 800 1000 2000 3000 4000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) IL-10 F0/F 1 F2 F3/F 4 0 50 100 150 200 300 400 500 600 700 800 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L ) TGF-beta F0/F 1 F2 F3/F 4 0 20000 40000 60000 80000 100000 Co n c e n tr a ç ã o ( p g /m L )
Figura 2: Níveis séricos de citocinas anti-inflamatórias de acordo com o estágio de fibrose hepática. A linha em vermelho indica a mediana.
40 Citocinas x atividade necroinflamatória
A mediana dos níveis séricos de citocinas conforme o grau de atividade necroinflamatória foi apresentada na tabela 8 e ilustrada graficamente nas figuras 3 e 4.
Os pacientes com ausência de atividade necroinflamatória tiveram os maiores níveis séricos de TGF-beta (55158pg/mL) e os pacientes com atividade necroinflamatória intensa tiveram os maiores níveis séricos de IFN-gama (190pg/mL), IL-2 (273pg/mL), IL-8 (547pg/mL), IL-1beta (12pg/mL), IL-4 (133pg/mL) e IL-10 (29pg/mL).
Não houve diferença quanto aos níveis séricos de IL-6 e TNF entre os grupos estudados.
