ESTIMATIVADAATIVIDADEMICROBIANAPELOMÉTODODEHIDRÓLISEDIACETATODEFLUORESCEÍNA

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(1)ESTIMATIVA DA ATIVIDADE MICROBIANA PELO MÉTODO DE HIDRÓLISE DIACETATO DE FLUORESCEÍNA Regina Tereza Rosim Monteiro (Embrapa. Indicadores biológicos e bioquímicos da qualidade do solo: manual técnico. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2000. 133-137p.. INTRODUÇÃO Compostos fluorogênicos são enzimaticamente transformados em produtos fluorescentes que podem ser visualizados em microscópio de fluorescência. A fluoresceína é um exemplo desse grupo de compostos. Os derivados de fluoresceína são hidrolisados pelas lípases, esterases e parcialmente, pelas proteases. A reação pode ser catalisada pelas próprias células ou pelas enzimas extracelulares. Os microrganismos, algas, protozoários e tecidos animais estão habilitados a catalisar esta reação. Os ésteres de fluoresceína são compostos não-polares e podem facilmente ser transportados pelas membranas de células vivas. Em contraste, os produtos fluorescentes são polares e permanecem dentro das células. Por isso, o método pode ser usado para detectar células microbianas ativas em cultura pura ou no solo, mas nunca os esporos ou células na fase estacionária do seu crescimento. Schnürer and Rosswall (1982) utilizaram a hidrólise de diacetato de fluoresceína (3,6-diacetil-fluoresceína) (FDA) para estimar atividade microbiana na palha e no solo. Ghini et al. (1997) utilizaram com sucesso o método descrito por Chen et al. (1998) em amostras de solo brasileiro. O método se baseia em estimar a fluoresceína produzida no solo tratado com solução de diacetato de fluoresceína e incubado a 24oC. Utilizar amostras de solo recém coletadas. Antes de iniciar o experimento deve-se conhecer o valor do peso seco. OBJETIVO Estimar a atividade microbiana pelo método de hidrólise diacetato de fluoresceína em duas amostras de solo. ANÁLISE MATERIAL - Agitador – 150rpm com temperatura ajustada à 24oC; - Balança analítica; - Balão volumétrico de 100 mL; - Balão volumétrico de 1000 mL; - Banho-maria para fervura a 100oC (ou Becker com água em chapa aquecedora); - Bastão de vidro; - Becker de 100 mL; - Becker de 1000 mL; - Erleynmayer de 125mL de capacidade (15 por amostra de solo); - Espectrofotômetro – luz visível 490nm; - Frasco âmbar de 100 mL; - Frasco âmbar de 1000 mL; - Funil de plástico; - Funil de vidro;.

(2) - Luvas látex descartáveis; - Micropipeta; - Papel alumínio; - Papel de filtro quantitativo de filtração lenta; - Peagâmetro; - Peneira de malha 2 mm; - Pêra de sucção; - Pipeta graduada de 1 mL; - Pipeta volumétrica de 20 mL; - Potes de plástico de 100 mL; - Suporte para tubos de ensaio; - Suporte para funil; - Tubos de ensaio 20mL com tampa de rosca (8 por amostra de solo); - Amostras de solo recém coletadas COM PESO SECO E CAPACIDADE DE CAMPO DETERMINADOS. SOLUÇÕES - Solução tampão fosfato de sódio 60 mM, pH 7,6; - Solução de diacetato de fluoresceína (solução 2 mg/mL em acetona); - Solução de ácido clorídrico 0,1 M para ajuste pH; - Solução de hidróxido de sódio 10% para ajuste do pH; PROCEDIMENTO a) Amostra - Amostra de 5g de solo (peso seco) recém – coletado, passadas em peneira de malha 2 mm, são distribuídas em Erlenmeyer de 125ml , em cinco repetições. - Acrescenta-se 20mL de tampão fosfato e adiciona-se finalmente 200µL da solução de diacetato de fluoresceína em cada repetição (concentração final de 2 mg µg/mL –200µL da solução). - Fechar os frascos com folha de alumínio. - A mistura é incubada em agitador a 150rpm a 24 oC, por 20 min. - Após esse período de incubação, a reação é interrompida pela adição de acetona (20ml). - A suspensão de solo é filtrada tomando-se alíquotas do sobrenadante para análise em espectrofotômetro a 490 nm.(ou centrifugada a 4000rpm por 10 minutos).. b) Curva de calibração - Prepara-se curva de calibração exatamente como descrito acima, de tal modo que a relação entre a concentração de fluoresceína e a densidade óptica seja linear. - Os resultados são expressos em µg de fluorescaína /g peso seco/hora ou µg de FDA hidrolisado por 5g de solo. - Para cada amostra de solo a ser ensaiada, fazer a curva de calibração nas concentrações de 0, 50, 100, 150, 200 µL de FDA, previamente hidrolisadas por calor..

(3) - Para isto colocar 5mL de tampão fosfato em 8 tubos de ensaio com rosca, adicionar a solução de FDA nas concentrações acima (adicionar 0, 50, 100, 150, 200 µL, respectivamente da solução 2mg / mL). - Tampar os tubos hermeticamente, ferver em ebulição por 5 minutos em Becker com água em ebulição na chapa para aquecimento (ou em banho-maria) e deixar esfriar. OBS: Os tubos só devem ser colocados na águas após as primeiras bolhas de fervura. - Pesar 5g de amostra, do mesmo solo, em duas repetições para cada concentração em Erlenmeyer, juntar as diferentes concentrações de FDA e adicionar mais 15 mL de tampão fosfato. - Agitar, por 20 min., procedendo como nas amostras. (Ver esquema na próxima página). 1) Pesar 5 g de solo em cada Erleynmayer. 2) Adicionar 20 mL de tampão fosfato nos Erleynmayers 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 11. 3) Adicionar 200 µL de diacetato de fluoresceína nos Erley 1, 2, 3, 4 e 5.. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Curva 1. 12. 13. 14. 15. Curva 2. 7. 8. 11. 9. Amostras. 10 Curva 1. 11. 12. 13. 14 Curva 2. 4) Adicionar 5 mL de tampão fosfato em cada tubo. 5) Adicionar as concentrações de 50, 100, 150 e 200 µL da solução de Diacetato de Fluoresceína respectivamente nos tubos 7, 8, 9 e 10 da curva 1 e o mesmo para os tubos 12, 13, 14 e 15 da curva 2. 6) Levar os tubos fechados ao Banho Maria (aproximadamente 100 °C) por 5 minutos 7) Após esfriar, passar o conteúdo do tubo 7 para o Erleynmayer 7, e assim sucessivamente. 8) Adicionar 15 mL de tampão fosfato em cada tubo e, em seguida, transferir para o mesmo Erleynmayer em que a solução hidrolisada foi adicionada (este procedimento serve para retirar algum resíduo que possivelmente ficou nos tubos). 9) Fechar os Erleynmayers com folha de alumínio. A mistura é incubada em agitador a 150 rpm a 24 oC, por 20 minutos..

(4) 10) Após esse período de incubação, a reação é interrompida pela adição de 20 mL de acetona. 11) A suspensão de solo é filtrada tomando-se alíquotas do sobrenadante 12) Fazer a leitura de absorbância em espectrofotômetro a 490nm. c) Cálculos A atividade das amostras será determinada diretamente na curva ou pela equação da curva-padrão.. 1- Calcular a média das amostras de solo (Erleynmayers 1, 2, 3, 4 e 5) (X) 2- Calcular a média das duas curvas para cada ponto Ex: Curva. 0,0 µL de FDA. 50,0 µL de FDA. 100,0 µL de FDA. 150,0 µL de FDA. 200,0 µL de FDA. 1 2 Média. 0 0. 0,343 0,391. 0,583 0,623. 1,013 0,957. 1,152 1,196. 0. 0,367. 0,603. 0,985. 1,174. Abs, 490 nm. 3- Fazer o gráfico 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0. Amostra 1. y = 2,966x + 0,0326 R2 = 0,9899. 0. 0,1. 0,2. 0,3. Concentração. 4- Calcular a concentração de FDA Ex: =(- 0,0326+X)/2,966 Onde: X= média das amostras = (- 0,0326+0,750)/2,966 = 0,2302 µg FDA hidrolizado/ 3 g de solo úmido/20 min Considerando um solo com 10 % de umidade, temos: = 0,2302 µg FDA hidrolizado/ 2,7 g de solo seco/20 min = (0,2302*1)/2,7 µg FDA hidrolizado/g de solo seco/20 min = 0,0853 µg FDA hidrolizado/g de solo seco/20 min = 0,0853*3 µg FDA hidrolizado/g de solo seco/h. 0,4.

(5) = 0,256 µg FDA hidrolizado/g de solo seco/h. Obs.: 1- A hidrólise de FDA no solo é linear em relação ao tempo e solo, até 3 horas, mas depende da temperatura ambiente. 2- Alguns componentes do solo extraídos no processo podem interferir na medida calorimétrica. 3- A hidrólise de FDA decresce com a profundidade do solo e está correlacionada com a respiração do solo. 4- A hidrólise de FDA é completamente inibida após esterilização pelo calor. 5- Tanto FDA quanto fluoresceína podem ser adsorvidos nas MO e minerais do solo. 6- Tomar todo cuidado no manuseio de FDA, devido à sua toxidez. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: CHEN, R.; HOITINK,A.J.; SCHIMITTHENNER,A.F.;TUOVINEN,O.H. The role of microbial activy in supression of damping-off caused by Pythium ultimum. Phytophatology, v.78, p.314-322, 1988. GHINI, R.; LIGO,M.A.; HERMES,L.C. Efeito de herbicidas na biomassa microbiana de solos de arroz irrigado. Ecossistema, v. 22, p.97-101, 1997. SCHURER,J.; ROSSWALL,T. Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure af total microbial activity in soil and litter. Applied and Environmental Microbiology, v.43,p.1256-1261, 1982..

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