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Controle físico-químico de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) cápsulas

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Academic year: 2021

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Controle físico-químico de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) cápsulas.. Juliana Lima Meira. Recife, 2006.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Controle físico-químico de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) cápsulas.. Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Produção e Controle.. JULIANA LIMA MEIRA. Orientador: Prof. Dra. Miracy de Albuquerque Muniz Co-orientador: Prof. Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim.

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(5) Dedicatória Aos meus queridíssimos pais e irmãos, que sempre estiveram do meu lado, me apoiando nos momentos mais em toda minha vida..

(6) AGRADECIMENTOS ESPECIAIS. A Deus, pela luz, eterno companheirismo e força nos momentos de alegria e provação. Aos meus pais, José Cláudio Meira e Nilda Maria Lima Meira e aos meus irmãos André Luis Lima Meira e Ana Flávia Lima Meira por toda paciência e carinho a mim dispensado. Aos meus Sobrinhos Guilherme e Heitor pelos momentos de carinho e alegria. Ao meu amigo, namorado e companheiro Romero de Azevedo Maciel por todo carinho paciência, dedicação apoio e ensinamentos. Ao meu avô Cláudio (i.m.), meu avô Edmilson (i.m.) e minha avó Dorotéia (i.m.), minha avó Maria de Lourdes pelos exemplos de vida, luta e força. A minha orientadora professora Dra. Miracy Muniz de Albuquerque pela confiança e orientação. A minha co-orientadora professora Dra Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim. Ao professor Dr. Haroudo Sátiro Xavier, Prof. João Pedro dos Santos, Prof. Dr. Alexandre Góes pelos ensinamentos. A todos os professores da pós-graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas pelos ensinamentos. A toda equipe do LCQMC: Ruth, Rosário, Rosana, Ana Cristina e Aurenice pela ajuda e companheirismo. Aos meus velhos amigos do LAFEPE: Gracinha, Jovita, Luciana, Luciene, Rose, Carlos Alberto e Eliane pelos ensinamentos e momentos de descontração. A minha queridíssima amiga Jovita Maria de Farias Braga pelos ensinamentos em controle de qualidade, pela amizade fiel e carinho. Aos meus grandes amigos: Danielle Lordão, Luciana Ramos de Lima, Marcos André de Oliveira e Karina Perrelli Randau pelo apoio, incentivo e força em momentos difíceis. A Petroflex Ind e Com. SA pelo consentimento de prosseguir com esta etapa dos meus estudos. Aos meus colegas de trabalho Maurício Francisco, Maria do Carmo, Ana Cilene e todos os funcionários do laboratório central da Petroflex pelo apoio. Aos meus colegas do mestrado Bráulio, Danielle, Luciana, Marcão, Aila, Jovita, Roseane pelo apoio e descontração..

(7) “A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o mistério. É essa emoção fundamental que está em toda raiz da ciência e toda arte” Einstein.

(8) SUMÁRIO Página Lista de Figuras. ix. Lista de Tabelas. x. Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos. xi. Resumo. xiii. Abstract. xiv. 1.0 CAPÍTULO I – Revisão da literatura. 15. 1.1. Objetivo. 23. 1.2.Objetivo geral. 23. 1.3. Objetivo específico. 23. 1.4 Referências Bibliográficas. 24. 2.0 CAPÍTULO II – Artigo I - Método alternativo para análise qualitativa de flavonóides em formas sólidas de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae). Resumo. 26. Abstract. 27. 2.1. Introdução. 28. 2.2. Materiais. 29. 2.3. Métodos. 30. 2.4. Resultados e Discussão. 30. 2.5. Conclusão. 31. 2.6. Referências Bibliográficas. 32. 3.0. CAPÍTULO III – Artigo II – Desenvolvimento Espectrofotométrico validação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L. Resumo. 34. Abstract. 35. 3.1. Introdução. 36. 3.2. Materiais. 37. 3.3. Métodos. 38. 3.4 Resultados e Discurssão. 41. 3.5. Conclusão. 42. 3.6. Referências Bibliográficas. 43.

(9) Página 4.0. CÁPÍTULO IV – Artigo III- Desenvolvimento metodológico e validação de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L. Resumo. 48. Abstract. 49. 4.1. Introdução. 49. 4.2. Materiais. 51. 4.3. Métodos. 51. 4.4. Resultados e Discussão. 53. 4.5. Conclusão. 55. 4.6. Referências Bibliográficas. 55. 5.0 Conclusões gerais. 63. 6.0 Perspectivas. 64.

(10) LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO I - Revisão da literatura Figura 1. Folhas de Ginkgo biloba L.. 16. Figura 2. Frutos de Ginkgo biloba L.. 16. Figura 3. Árvore de Ginkgo biloba L.. 16. CAPÍTULO II- Artigo I - Método alternativo para análise qualitativa de flavonóides em formas sólidas de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae). Figura 1. Fórmula estrutural das principais agliconas e glicosídeos derivados, em formas sólidas de Ginkgo biloba L.. 29. Figura 2. Cromatograma dos extratos metanólicos dos comprimidos e cápsulas de Ginkgo, após revelação com reagente de Neu e observação em UV. 31. CAPÍTULO III– Artigo II – Desenvolvimento Espectrofotométrico validação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L Figura 1. Linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor de do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.. 46. CAPÍTULO IV- Artigo III- Desenvolvimento metodológico e validação de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L. Figura 1. Perfil de dissolução comparativo de Flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L, meio de dissolução HCl 0,1N, cestas 100rpm e pás a 50rpm.. 58. Figura 2. Perfil de dissolução comparativo de flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L aparatos cestas a 100rpm e pás a 50rpm, meio de dissolução água. 59. Figura 3. Perfil de dissolução comparativo de flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. aparatos cestas a 100rpm e pás a 50rpm, meio de dissolução tampão acetato pH=4,1.. Figura 4. Curva de calibração do método da dissolução de Flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. meio de dissolução HCl 0,1 N, aparato cestas, rotação 100 rpm e tempo de 60 minutos.. 60. 61. ix.

(11) LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO III - Artigo II – Desenvolvimento Espectrofotométrico validação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L. Tabela 1. Valores das curvas autênticas do parâmetro de linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor do Flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.. 46. Tabela 2. Valores da ANOVA (Análise de variância) da linearidade do método espectrofotométrico para determinação do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.. 46. Tabela 3. Precisão intermediária da metodologia com analistas e dias diferentes.. 46. Tabela 4. Resultados de repetibilidade da metodologia espectrofotométrica de quantificação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L.. 47. Tabela 5. Resultados de exatidão do método espectrofotométrico de quantificação de flavonóides totais de Ginkgo biloba L.. 47. Tabela 6. Robustez do método quanto a variação na quantidade de Cloreto de alumínio (solução complexante). 47. Tabela 7. Robustez do método quanto a variação do tempo de exposição à luz após a adição de cloreto de alumínio (solução complexante).. 47. CAPÍTULO IV - Artigo III- Desenvolvimento metodológico e validação de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L. Tabela 1. Resultados do doseamento para quantificação de flavonóides totais das cápsulas de Ginkgo biloba L.. 58. Tabela 2. Dissolução de cápsulas de Ginkgo biloba L meio de dissolução HCl 0,1N 900ml, aparato cesta, 100rpm.. 58. Tabela 3. Teor de Flavonóides Totais liberados na dissolução de cápsulas de Ginkgo biloba L meio HCl 0,1N 900ml, aparato pá, 50 rpm.. 58. Tabela 4. Percentuais de dissolução de flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L meio de dissolução água, aparato cestas, 100rpm.. 59. Tabela 5. Percentuais de dissolução de flavonódes totais em cápsulas de Ginkgo biloba L meio de dissolução água, pás 50 rpm.. 59. x.

(12) Página Tabela 6: Percentuais de dissolução de Flavonóides totais em cápluas Ginkgo biloba L. meio de dissolução tampão acetato de sódio pH 4,1, aparato cestas 100 rpm. 60. Tabela 7. Percentuais de dissolução de Flavonóides totais em cápsulas Ginkgo biloba L. meio de dissolução tampão acetato de sódio pH 4,1, aparato pás 50 rpm. 60 Tabela 8: Valores das curvas autênticas do parâmetro de linearidade do método de dissolução meio HCl 0,1N, aparato cesta com velocidade de 100rpm para cápsulas de Ginkgo biloba L.. 61. Tabela 9: Valores da ANOVA (Análise de variância) da linearidade do método dissolução meio HCl 0,1N, aparato cesta com velocidade de 100rpm para cápsulas de Ginkgo biloba L.. 61. Tabela 10: Resultados da precisão intermediária do de Flavonódes totais em cápsula de Ginkgo biloba L com analistas e dias diferentes, média de 3 (três) determinações.. 61. Tabela 11. Resultados de Repetibilidade de Flavonóides totais em cápsula de Ginkgo biloba L. média de seis determinações.. 62. Tabela 12. Resultados de exatidão média quatro dissoluções por nível de concentração do método de dissolução utilizando como meio HCl 0,1N aparato cesta e 60 minutos para cápsulas de extrato seco de Ginkgo biloba L.. 62. xi.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS e SÍMBOLOS. % - percentagem °C – Graus centígrados ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária CCD – Cromatografia em camada delgada CV – coeficiente de variação g – Grama GL – Graus de liberdade h – Hora H2O – Água H2SO4 – Ácido sulfúrico HCl – Ácido Clorídrico N - Normal EGb 761 – Extrato padronizado de Ginkgo biloba L.761 Kg – Quilograma LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação MeOH – Metanol mg – miligrama min - minuto mL- mililitro mm - milimetro MQ – Média quadrática SQ – Soma Quadrática v/v – volume/volume. xii.

(14) RESUMO A terapia com plantas data de milênios e no mundo moderno teve seu advento em países Europeus. Medicamentos constituídos de Ginkgo biloba L. representam um dos fitoterápicos mais vendidos no mundo. Sua aplicação vai desde doenças respiratórias, passando por doenças do sistema nervoso central e periférico até aplicações de casos iniciais para mal de Alzeheimer. Neste trabalho foi realizado o desenvolvimento metodológico qualitativo por cromatografia de camada delgada, onde se pode observar a presença, em vários fabricantes deste fitoterápico, de uma das principais moléculas farmacologicamente ativa, Flavonas glicosídicas, através de revelador de Neu e posterior observação em lâmpada ultravioleta. Em seguida desenvolveu-se a metodologia de quantificação de teor através de uma extração de flavonóides glicosídeos totais e leituras realizadas em espectrofotômetro, a validação da metodologia seguiu de acordo com os requisitos da RE-899 (Brasil, 2003).Por fim fez-se o desenvolvimento metodológico da dissolução das cápsulas, para que desta forma pudéssemos garantir a biodisponibilidade do ativo em tempo hábil, através de perfis comparativos utilizando 03 (três) meios diferentes, 02 aparatos de agitação, cestas e pás e 05 (cinco) tempos de coletas para desta forma obter a performance ideal do teste, em tempo aplicável a rotina de controle de qualidade, com a finalidade de quantificar os flavonóides totais contido em cápsulas de Ginkgo biloba L., a validação desta metodologia seguiu, assim como o desenvolvimento metodológico do teor, ao requisitos da RE-899 (Brasil, 2003) para também garantir, através de parâmetros estatísticos sua confiabilidade.. xiii.

(15) ABSTRACT. Plant therapy is millenary, and in the modern world it had its advent in European countries. Medicines consisting of Ginkgo biloba L. represent one of the most sold herbal medicines in the world. Their application comprises from respiratory diseases, to central and peripheral nervous system diseases, and even applications in initial stages of Alzheimer's disease. In this paper, we conducted the qualitative methodological development by thin layer chromatography, where one can observe, in several manufacturers of this herbal medicine, the presence of the main pharmacologically active molecules, the glycosidic flavones, when mounted in Neu solution and then observed under ultraviolet light.Then, we developed the methodology for the quantitative analysis of contents by means of a total glycosidic flavonoid extraction and readings on a spectrophotometer. Validation of this methodology met the requirements of Brazilian resolution RE-899 (Brasil, 2003). Lastly, we conducted the methodological development for the dissolution of capsules, so that we could assure the bioavailability of the active substance within reasonable time, by means of comparative profiles using 03 (three) different mediums, 02 shaking apparatuses, with baskets and paddles, and 05 (five) sampling timepoints in order to obtain the ideal testing performance, within a timeframe applicable to the quality control routine, aiming to quantify the total flavonoids contained in Ginkgo biloba L. capsules; validation of this methodology, as well as that of the methodological development of contents was in agreement with the requirements of Brazilian resolution RE-899 (Brasil, 2003) to assure also its reliability, through statistical parameters.. xiv.

(16) CAPÍTULO I (Revisão da Literatura).

(17) 1. INTRODUÇÃO. O valor de plantas medicinais é um argumento conveniente, e por isso freqüente, do qual se lança mão para mostrar a importância da preservação dos ecossistemas, não se podem avaliar quantos fármacos desconhecidos, de substancial valor medicinal, se extinguirem-se as espécies ali presentes. Estima-se que 25% de todos os medicamentos prescritos nos EUA sejam baseados em produtos vegetais. Levando-se em conta o preço desses medicamentos, estimou-se na década de 1980 que cada espécie vegetal portadora dos fármacos que entram na composição dos remédios teria o valor médio de US$ 290.000,00 por ano. No entanto, ao levar-se em conta o custo das perdas de vidas humanas que são evitadas pelo consumo dos medicamentos, e assumindo-se como US$ 4.000.000,00 o valor estatístico da vida de um cidadão norte-americano, chega-se ao valor de US$ 6 bilhões por ano por espécie (Edward-Jones et al. 2000).. Ginkgo biloba L.. Nome Científico: Ginkgo biloba L. da família Ginkgoáceas de Origem asiática, partes utilizadas sementes e folhas. Na medicina Tradicional Chinesa, os frutos eram preferidos às folhas. Os chineses sempre usaram o ginkgo como tônico para o coração e pulmões, chamava-o de “árvore da vida”, e tinha propriedade de eliminar a “fleuma” pois facilitava a drenagem de secreções e líquidos. Era também usado como banho de assentos para curar hemorródias, (Duniau, 2003).. 15.

(18) Figura 2: Frutos de Ginkgo biloba L. Figura 1: Folhas de Ginkgo biloba L.. Uso Mágico Para os budistas, o Ginkgo é a árvore sagrada, que planta sempre em volta dos templos como proteção contra malefícios. (Brosse, 2001). Figura 3: Árvore de Ginkgo biloba L.. 16.

(19) Origem, características físicas e algumas aplicações farmacológicas. Nativa da Coréia, China e Japão, o Ginkgo biloba L. é uma árvore que chega a 40 metros de altura e pode viver 4 mil anos, tendo sido considerada por Charles Darwin um "fóssil vivo". Sua longevidade deve-se à grande capacidade de suportar insultos tóxicos e à resistência a infecções. Extratos das folhas de Ginkgo biloba L. encontram-se na farmacopéia chinesa antiga e atual para o tratamento de disfunções cardiopulmonares, bem como para promover a longevidade. Na Europa (particularmente França e Alemanha) e nos Estados Unidos, os extratos de Ginkgo biloba L. figuram entre os produtos botânicos mais comercializados. As indicações mais comuns são o tratamento e a prevenção das condições médicas relacionadas ao envelhecimento, em particular para melhorar a memória e as funções cognitivas correlatas, bem como no tratamento de labirintopatias (zumbidos e vertigens) e cefaléias (Luo, 2001).. Características Macroscópicas. Folhas inteiras secas, dobradas ou fragmentadas, com ou sem pecíolo, variando de verde-caqui a marrom esverdeado, normalmente mais marrom na extremidade do ápice, e mais escura na superfície axial. Limbo amplamente em forma de leque, com 2 a 12 cm em largura e 2 a 9.5 cm em comprimento do pecíolo à margem apical; na maioria 1.5 a 2 vezes mais larga que comprida. As margens de base inteiras, côncavas; margem apical sinuosa, normalmente truncada ou centralmente cortada, e raramente cortada multiplamente. Superfície lisa, com aparência enrugada graças a um proeminente sistema de veias dicotômico surgindo paralelo e se estendendo da base do limbo até a margem apical. Pecíolo de uma cor similar à folha, estriado na superfície axial, com 2 a 8 cm de comprimento.. 17.

(20) Característica Histológicas Secção transversal do limbo: uma cutícula fina, mas marcada ocorre sobre uma camada epiderme de células em ambas as superfícies. Orifícios (poros) presentes apenas na parte inferior da superfície, com células-guarda mergulhadas em relação a células epidermes adjacentes. Elementos de obstrução, prolongados em ângulos retos à superfície e freqüentemente irregulares na aparência, ocorrem exatamente abaixo da epiderme superior. Maços vasculares ocorrem em intervalos ao longo lâmina, com blocos de cristais de oxalato de cálcio. Células do mesófilo são menores que as células que obstruem, alongadas paralelamente à superfície da folha e separadas por amplos espaços intercelulares. Limbo e pecíolo polvilhados: no microscópio, fragmentos transversais da folha mostram uma cutícula suave, presente em ambas as superfícies da folha e manchando o laranja rosado sudan III TS. Na vista da superfície, células da epiderme superior são alongadas e cercadas, com abundantes gotículas amarelas de 2 a 12 µm em diâmetro visível apenas em folhas maduras e velhas. Células da epiderme inferior são similares em forma, mas tem paredes mais retas e são interrompidas por estomas anisocíticos. Vários elementos convertidos em madeira derivados dos limbos e do pecíolo são presentes, incluindo vasos de xilema com engrossamento anular e vasos com sulcos delimitados. A extensão da lignificação, particularmente no pecíolo, aumenta com a idade da folha. Cristais de oxalato de cálcio são inúmeros, espalhados ou associados com vasos, variando em tamanho de 5-50 µm em folhas jovens a 15-100 µm em folhas maduras. Sob polarizadores cruzados, vários traços brilhantes menores em forma de prisma ou de lágrima de natureza indefinida podem se fazer presente. Tricomas muito ocasionais, extremamente alongados, arrumados em uma linha, sem paredes óbvias e superfícies suaves ou enverrugadas podem ser vistos. Folhas maduras mostram a presença de raros grânulos duros de forma poligonal ou circular de aproximadamente 20 µm de diâmetro, com um hilo central e exibindo uma cruz maltesa sob polarizações cruzadas (USP, 2005).. 18.

(21) Princípios ativos O extrato de Ginkgo biloba L., denominado EGb761, contém porcentagens específicas de glicosídeos de ginkgoflavonas (24%) e terpenóides (6%), entre estes últimos os bilobalídeos e os ginkgolídeos A, B, C, M e J (Kleijnen e Knipschild, 1992). A ação combinada dos diferentes princípios ativos presentes no extrato promove o incremento do suprimento sangüíneo cerebral pela vasodilatação e redução da viscosidade do sangue, além de reduzir a densidade de radicais livres de oxigênio nos tecidos nervosos (Birks et al., 2002). O ginkgolídeo B é antagonista do receptor do fator ativador de plaquetas (PAF), daí suas propriedades de antiagregação plaquetária (Luo, 2001). Além disso, o EGb761 também exerce ações neuroprotetoras e antiapoptóticas, demonstradas por estudos laboratoriais e com animais.. Neuroproteção Três efeitos biológicos, consistentemente demonstrados in vitro, sustentam os possíveis benefícios do Ginkgo biloba L. na fisiopatologia da doença de Alzheimer e outras demências: a prevenção da neurotoxicidade pelo b-amilóide, a inibição de vias apoptóticas e a proteção contra danos oxidativos. O EGb761 mostrou-se capaz de inibir a formação e a agregação de b-amilóide em células de neuroblastoma geneticamente modificadas. (Luo et al., 2002). Os bilobalídeos protegeram neurônios contra o estresse oxidativo e bloquearam mecanismos de apoptose em seus estágios iniciais. (Zhou e Zhu, 2000). Além disso, o antagonismo dos bilobalídeos sobre a sinalização do PAF (fator de ativação plaquetária) também inibiu cascatas apoptóticas dependentes da ativação da proteinaquinase C, guardando semelhanças com a ação do fator de crescimento neuronal (Luo, 2001). Finalmente, o EGb761 mostrou-se capaz de melhorar a peroxidação lipídica, atenuando a oxidação da glutationa e os danos oxidantes subseqüentes para o DNA mitocondrial (Sastre et al., 2000).. 19.

(22) Efeitos sobre a cognição em voluntários saudáveis. Os efeitos do Ginkgo biloba L. sobre a cognição normal foram avaliados por alguns estudos controlados em amostras com adultos jovens e idosos. O uso de 180 mg/dia de EGb761 durante seis semanas em 48 adultos com mais de 55 anos associou-se à melhora objetiva na velocidade de processamento cognitivo, além de uma impressão subjetiva de melhora das habilidades gerais de memória (Mix e Crews, 2000). Com os mesmos parâmetros de dosagem e tempo de tratamento, em amostra de 262 voluntários idosos, observou-se um melhor desempenho no grupo tratado com EGb761 em relação aos controles em testes de memória e reconhecimento (Mix e Crews, 2002). Doses agudas de Ginkgo biloba foram associadas a melhores desempenhos da memória operacional em voluntários de 30 a 59 anos (Rigney et al., 1999) e melhora da atenção e da memória em adultos jovens (Kennedy et al., 2000).. Estudos clínicos na doença de Alzheimer. A inconstância dos achados dos estudos clínicos que avaliaram a eficácia do Ginkgo biloba L. em transtornos dementiantes tem sido interpretada com base em limitações metodológicas e também na gravidade da demência das amostras selecionadas. A partir da constatação de ineficácia do Ginkgo biloba L. na demência grave, o foco dos estudos mais recentes voltou-se para os estágios iniciais da doença de Alzheimer. Estudo multicêntrico conduzido por Le Bars et al. (1997) sugeriu que o tratamento com EGb761 (120 mg/dia) por 52 semanas proporcionou benefícios modestos, porém objetivamente detectáveis em pacientes com demência de Alzheimer e vascular em graus variáveis de severidade clínica. Mais recentemente, os mesmos autores propuseram que as mudanças mais. 20.

(23) significativas em relação à linha basal ocorrem nos pacientes com deficiências cognitivas muito leves ou leves (Le Bars et al., 2002). Estudo de meta-análise recente realizado por Birks et al. (2002) avaliou os trabalhos relevantes sobre a eficácia e a tolerabilidade do Ginkgo biloba L. no comprometimento cognitivo e na demência. Foram incluídos os ensaios clínicos realizados até junho de 2002 sob condições metodológicas adequadas, isto é, estudos duplo-cegos, controlados, randomizados e sem variáveis de confusão. Em geral, não são observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos Gb e placebo no que diz respeito aos eventos adversos. Quanto à eficácia do Ginkgo biloba L., assumindo-se a Impressão Clínica Global (CGI) como parâmetro dicotômico (aqueles que apresentaram melhora em comparação às que permaneceram inalterados ou pioraram), conclui-se que existem benefícios associados ao uso do Ginkgo biloba L. em doses inferiores a 200 mg/dia por 12 semanas ou em doses superiores a 200 mg/dia por 24 semanas. Parâmetros cognitivos, de atividades da vida diária e humor também apontam a superioridade do Ginkgo biloba L. em relação ao placebo nas duas faixas de dosagem após 12, 24 e 52 semanas. Os autores concluem que o Gb é uma droga aparentemente segura e sem efeitos adversos significativos em comparação ao placebo e que existem evidências de que o Gb pode. proporcionar. algum. benefício. cognitivo. e. funcional.. Entretanto,. alguns. estudos. metodologicamente adequados apresentaram resultados inconsistentes, questionando a indicação da Gb no tratamento dos transtornos cognitivos (Birks et al., 2002). Encontra-se em andamento um estudo multicêntrico internacional (França e Estados Unidos) com duração prevista para cinco (5) anos, com os objetivos de: avaliar o efeito do EGb761 (240 mg/dia) na prevenção de demência do tipo Alzheimer, a partir de uma corte de 2.800 indivíduos cognitivamente normais com idade igual ou superior a 75 anos (oito centros na França), e 2. Avaliar a taxa de conversão para demência em 3.000 indivíduos nãodemenciados, com ou sem queixas de memória (quatro centros nos EUA). Um outro estudo, em andamento nos Estados Unidos, tem como objetivo avaliar a segurança e a ação preventiva do extrato. 21.

(24) de Gb sobre a cognição de indivíduos muito idosos. Trata-se de estudo randomizado, placebocontrolado (fase III), com amostra de 200 indivíduos com 85 anos ou mais, cognitivamente preservados. Os voluntários serão seguidos por 42 meses com instrumentos de avaliação neuropsicológica, visando à detecção da conversão entre normalidade e Comprometimento Cognitivo Leve. Os voluntários também serão submetidos à volumetria cerebral por ressonância magnética e análises bioquímicas de marcadores de estresse oxidativo em sangue periférico (Kaye J, Oregon Health Sciences University/Neurology, National Center for Complementary and Alternative Medicina, NCCAM). Um outro estudo em andamento (fase IV) visa avaliar os benefícios da terapia combinada Gb mais donepezil no tratamento do Comprometimento Cognitivo Leve em pacientes com 65 anos ou mais. (Schultz SK, University of Iowa Department of Psychiatry, National Institute of Mental Health, NIMH). Concluídas essas pesquisas, teremos sem dúvida contribuições relevantes sobre a aplicação da Gb nos transtornos cognitivos e em seu possível efeito modificador da doença.. 22.

(25) 2. OBJETIVOS. 2.1Objetivo Geral Controle físico-químico e validação da metodologia para Ginkgo biloba L. cápsulas. 2.2Objetivo Específicos •. Análise de matéria-prima (extrato seco padronizado EGB 761). •. Desenvolvimento de metodologia Qualitativa.. •. Desenvolvimento e validação de quantificação de teor por espectrofotometria.. •. Desenvolvimento e validação de método de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L.. 23.

(26) 3.0 Referências Bibliográficas. BIRKS, J.; GRIMLEY, EV.; VAN DONGEN M. – Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia (Cochrane Review). In: Cochrane Library (ISSN 1464-780X). Cochrane Database Syst Rev (4): CD003120, 2002.. BROSSE, J.- Mythologie dês abres. Paris: Éditons Payot & Rivages, 2001).. DUNIAU, M. C. M. Plantas medicinais: da magia a ciência. Rio de Janeiro; Editora: Brasport,2003.. EDWARD-JONES, G., DAVIES, B. & HUSSAIN, S. 2000. Ecological economics. An introduction. Blackwell Science, Oxford.. LUO, Y. – Ginkgo biloba neuroprotection: therapeutic implications in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 3(4): 401-7, 2001.. LUO, Y.; SMITH, J.V.; PARAMASIVAM, V.; BURDICK, A.; CURR Y, KJ.; BUFORD. JP.; KHAN, I.; NETZER, WJ.; XU, H.; BUTKO, P. – Inhibition of amyloid-beta aggregation and caspase-3 activation by the Ginkgo biloba extract EGb761. Proc Natl Acad Sci USA 99(19): 12197-202, 2002.. KENNEDY, D.O.; SCHOLEY, A.B.; WESNES, K.A. – The dose-dependent cognitive effects of acute administration of Ginkgo biloba to healthy young volunteers. Psychopharmacology (Berl) 151(4): 416-23, 2000.. KLEIJNEN, J; KNIPSCHILD, P. – Ginkgo biloba. Lancet 340(8828): 1136-9, 1992.. LLE BARS, P.L.; KATZ, M.M.; BERMAN, N.; ITIL, T.M. FREEDMAN A.M.; Schatzberg, A.F. – A placebo-controlled, double-blind, randomized trial of an extract of Ginkgo biloba for dementia. North American EGb Study Group. JAMA 278(16): 1327-32, 1997.. LLE BARS, PL.; VELASCO, F.M.; FERGUSON, J.M.; DESSAIN, E.C.; KIESER , M.; HOERR, R. – Influence of the severity of cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extract EGb 761 in Alzheimer's disease. Neuropsychobiology 45(1): 19-26, 2002.. 24.

(27) MIX, J.A.; CREWS Jr., W.D. – An examination of the efficacy of Ginkgo biloba extract EGb761 on the neuropsychologic functioning of cognitively intact older adults. J Altern Complement Med 6(3): 2000: 219-29.. MIX, J.A.; CREWS Jr., W.D. – A double-blind, placebo-controlled, randomized trial of Ginkgo biloba extract EGb 761 in a sample of cognitively intact older adults: neuropsychological findings. Hum Psychopharmacol 17(6): 267-77, 2000.. RIGNEY, U.; KIMBER, S.; HINDMARCH, I. – The effects of acute doses of standardized Ginkgo biloba extract on memory and psychomotor performance in volunteers. Phytother Res 13(5): 40815, 1999.. SASTRE, J.; PALLARDO, F.V.; VINA, J. – Mitochondrial oxidative stress plays a key role in aging and apoptosis. IUBMB Life 49(5): 427-35, 2000.. THE UNITES STATES PHARMACOPEIA, 2005. The formulary – USP 28 Rockville: United States Pharmacopeial Convention.. ZHOU, L.J.; Zhu X.Z. – Reactive oxygen species-induced apoptosis in PC12 cells and protective effect of bilobalide. J Pharmacol Exp Ther 293(3): 982-8, 2000.. 25.

(28) CAPÍTULO II (ARTIGO I) Método alternativo para análise qualitativa de flavonóides em formas sólidas de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae)..

(29) Método alternativo para análise qualitativa de flavonóides em formas sólidas de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae). Juliana L. Meira1 Luciana R. de Lima3 , Haroudo S. Xavier 2, Miracy M. de Albuquerque1*. 1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8511/2126-8510.. 2 - Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510.. 3- Laboratório de Tecnologia Farmacêutica dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510. ________________________________________________________________________ RESUMO A infusão das folhas de Ginkgo biloba tem sido usada pelos chineses a milhares de anos para cura de doenças respiratórias. Estudos mais recentes mostram que esse vegetal também é usado em doenças do sistema nervoso central, periférico e até em estados iniciais do mal de Alzheimer. Análise de medicamentos especificamente fitoterápico requer muito custo e tempo agregado. Por esta razão se fez necessário o desenvolvimento de uma metodologia qualitativa alternativa. O método proposto foi. *E-mail: miracy@ufpe.br Tel (81) 2126-8511/2126-8510. Fax (81) 21268572 26.

(30) realizado em extratos metanólicos de formas sólidas de ginkgo através de cromatografia de camada delgada analítica (CCDA) empregando-se placas prontas de gel de sílica (Merck-Alemanha, art. 105554) tendo-se como fase móvel um sistema polar constituído por acetato de etila / ácido acético / ácido fórmico / água (100:11: 11:26, v/v), revelendo-se os cromatogramas com solução a 1% de difenilborinato de amino-2-etila (Neu, 1956) seguido de observação à luz ultravioleta (365 nm). Unitermos: Ginkgo, cromatografia de camada delgada Analítica (CCDA).. ABSTRACT: Alternative method for qualitative analysis of flavonoids in solid form of de Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) The infusion of Ginkgo biloba L. has been used by the Chinese for millions of years in the cure of respiratory diseases. Recent studies have shown that this plant is also used in diseases of the central and peripheral nervous system, and even in initial states of Alzheimer’s disease. Analysis of drugs, specifically phytotherapeutic drugs, requires much cost and combined time. Therefore, it is necessary for the development of an alternative qualitative method. The proposed method was accomplished in solid forms of methanolic extracts of ginkgo through analytical thin layer chromatography (ATLC) employing ready silica gel plates (Merck-Germany, art.105554) having as mobile phase a polar system made up of ethyl acetate / acetic acid / formic acid / water (100:11: 11:26, v/v), revealing the chromatograms with solution at 1% of amino-2-ethyl diphenylborinate (Neu, 1956)followed by the ultraviolet light observation (365 nm).. Keyword: Ginkgo, Analytical thin layer chromatography (ATLC).. 27.

(31) 2.1 Introdução. Embora se tenham parâmetros específicos para a produção e comércio de fitoterápicos, a fraude e a má qualidade têm preocupado profissionais da área de saúde, e a comunidade científica. A ausência de qualidade, a adulteração e a incorreta utilização, interferem na eficácia e até mesmo na segurança do produto, somando-se a isto um serviço de fiscalização não muito eficiente. Conseqüentemente, diversos trabalhos têm sido realizados para alertar sobre a situação atual em que se encontram os fitoterápicos no mundo (CHOI et al., 2002; ABOU-ARAB et al.,1999; ELVIN-LEWIS, 2001; ZUCCOLOTTO et al., 1999). Ginkgo biloba L. é uma planta medicinal, que atrai até hoje, o interesse de diversas áreas da ciência. É a única representante viva da ordem Gikgoales (Report, 1996), cuja origem remota ao Paleozóico Superior (Robbers et al., 1996). Seu emprego na medicina tradicional chinesa contra doenças respiratórias, já era descrito em 2800 a.C. (Squires, 1995). No Brasil o seu uso é recente, sendo empregada principalmente para promover maior circulação sangüínea no cérebro, indicada nas disfunções cerebrais, vertigens e para melhorar a concentração e a memória (Lorenzi & Matos, 2002). Da aplicação de compressas de folhas, a ingesta de chás, tinturas, extratos espessos e secos, até a incorporação de produtos otimizados na obtenção de formas farmacêuticas sólidas, fazem desse vegetal um exemplo do aprimoramento do conceito de produto fitoterápico e de estratégia terapêutica (Feistel, 1994). Comercialmente representou , na Europa, no ano de 1992, um mercado de 200 milhões de dólares (Sticher,1993). A parte usada compreende as folhas, cujos principais constituintes químicos pode ser classificado em cinco grupos majoritários: terpenos tais como os diterpenos (gincolídeos), sesquiterpenos (bilobalídeo), triterpenos; poliprenóis; representados principalmente por flavonóides, na forma de agliconas de flavonas, glicosídeos de flavonóides e biflavonóides; hidrocarbonetos de cadeia longa ; derivados do ácido anacárdico (ácidos gincólicos) e componentes nitrogenados de baixo peso molecular (Feistel, 1994). 28.

(32) De fato os glicosídeos de flavonóides e as lactonas terpênicas têm se revelado os dois grupos farmacologicamente mais importantes presentes nesse vegetal. Em Ginkgo Folhas e extratos ocorrem diversos glicosídeos de flavonóides, a maioria deles tendo como agliconas a quercetina, o canferol ou a isohamnetina. A figura 1 mostra as estruturas dos principais flavonóides já assinalados em G. biloba (Van BeeK, 2002).. OH O. HO. OH R. OH. O. R H Derivados de campferol OH Derivados de quercetina OCH3 Derivados de Isoramnetina Fig.1. Fórmula estrutural das principais agliconas e glicosídeos de flavonóides, presentes em formas sólidas de Ginkgo biloba L.. 2.2 Materiais. Foram utilizados, comprimidos revestidos de extrato seco de Ginkgo biloba L. marca Bionatus® , cápsulas de folhas secas de Ginkgo biloba marca Vita Hervas® ,cápsulas de folhas secas de Ginkgo biloba L. marca Amazon Ervas® ,cápsulas de extrato seco de Ginkgo biloba L. marca Sundown® , cápsulas. de extrato seco padronizado de Ginkgo biloba L. marca Herbarium®,. comprimidos de extrato seco padronizado de Ginkgo biloba L marca Tanakan®, extrato seco marca Deg®, metanol grau analítico marca Quimis®, cromatoplacas Merck®, art. 105554, Difenilborinato de amino-2-etila (Fluka, art. 42810). 29.

(33) 2.3 Métodos Preparação dos extratos metanólicos Os extratos foram obtidos efetuando-se infusão metanólica de 5 g de comprimidos pulverizados e o mesmo quantitativo para o material foliar contido em cápsulas, mantendo-se sob agitação constante durante 15 minutos, em 10mL de metanol.. Procedimento para obtenção dos cromatogramas Alíquotas de cada extrato (15 µL), de formas sólidas de fabricantes diferentes, foram cromatografadas e o cromatograma revelado de forma a se ter a observação dos polifenóis, primeiramente expondo-se unicamente à luz ultravioleta (365 nm), e em seguida após a aplicação do reagente de Neu, nova observação foi efetuada ao ultravioleta, no comprimento de onda descrito, agora buscando revelar os flavonóides presentes, conforme a coloração da fluorescência emanada das manchas no cromatograma. 2.4 Resultados e Discurssão A revelação com o reagente de Neu permite em muitas circunstâncias se fazer previsões a respeito do esqueleto estrutural aglicônico, de flavonóides principalmente flavonas, flavonóis e flavanonas (Brasset & Angenot, 1986). Dessa forma o exame de um cromatograma após revelação com aquele reagente, permite, pela coloração emanada da florescência de cada mancha, definir se trata de aglicona luteolínica (amarelo-canário), quercetínica (laranja), miriscetínica (laranj avermelhada) e canferólica ou apigeninica (verde-lodo).. 30.

(34) Figura 2 : cromatograma dos extratos metanólicos dos comprimidos e cápsulas de Ginkgo, após revelação com reagente de Neu e observação em UV.. 2.5 Conclusão A realização de uma análise qualitativa antes do doseamento final vem da observação que procedimentos analíticos de controle de qualidade está agregado muito tempo e custo. O procedimento proposto trata-se de um método rápido e de custo baixo em se comparando com métodos quantitativos. Dependendo da preparação de cada fabricante as manchas são observadas com maiores ou menores intensidades, mas são sempre percebidas principalmente manchas de agliconas quercetínicas de coloração laranja uma das principais agliconas presentes nas formas farmacêuticas de ginkgo comercializada.. 31.

(35) 2.6 Referências Bibliográficas ABOU-ARAB, A.A.K.; KAWTHER, M.S.; TANTAWY, M.E.El.; BADEAA, R.I.; KHAYRIA N. Quantity estimation of some contaminants in commonly used medicinal plants in the Egyptian market. Food Chemistry, v.67, n.1, p.357-363, 1999.. CHOI, D.W.; KIM, J.H.; CHO, SO Y.; KIM, D.H.; CHANG, S.Y. Regulation and quality control of herbal drugs in Korea. Toxicology, v.181-182, n.1, p. 581-586, 2002.. ELVIN-LEWIS,. M.. Should. we. be. concerned. about. herbal. remedies.. Journal. of. Ethnopharmacology, v.75, n.1, p.141-164, 2001.. FIESTEL, B. untersuchungen zur analytischen Standardisierung von Ginkgo biloba-Extrakten und deren galenischerZubereitungen.Halle: Martin-Luther-Universität Halle-Wttenberg/Alemanha, 1994.(Tese doutorado em Ciências Naturais).. STUMPF K.-H. IN: PROCEEDINGS OF ’97 INTERNATIONAL SEMINAR ON GINKGO, THE STATE SCIENCE AND TECHNOLOGY COMMISSION, BEIJING, 1997, P. 39.. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2002.. NEU R. A. Neu Reagnt for Differentiating and determining flavones on paper chromatograms. Naturswisenschaften. N. 43, p.82, 1956.. REPORT of the consultation on model monographs on widely used medicinal plants. Munich: World Health Organization, 1996. WHO/TRM/96.3.. ROBBERS, J.E.; SPEEDIE, M.K.; TYLER, V.E. Pharmacognosy and pharmacobiothecnology. Baltimore: Williams e Wilkins,1996.. SQUIRES, R. Ginkgo biloba .Sidney: Australian Traditional Medicine Society, 1995. 32.

(36) STICHER, O. Quality of Ginkgo preparation.Planta Medica, v.59, p.2-11, 1993.. T.A. van Beek, M.S. Wintermans, J. Chromatogr. 967 (2002) 21–55 A. WAGNER, H. BLANT. S. Plant drug analysis. 2 ed. New York: Springer 1996, p. 384.. ZUCCOLOTTO, T.; APEL, M.; RATES, S.M.K. Avaliação da qualidade de produtos fitoterápicos comercializados em Porto Alegre- RS. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.58, n.2, p.25-31, 1999.. 33.

(37) CAPÍTULO III (ARTIGO II) Desenvolvimento Espectrofotométrico e validação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L. Submetido pela Revista Brasileira de Farmacognosia.

(38) Desenvolvimento Espectrofotométrico e validação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L.. Juliana L. Meira1, Ruth R. Strattmam1, Elba L.C. de Amorim2, Pedro J. Rolim Neto3 , Miracy Muniz de Albuquerque1*. 1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8511/2126-8510.. 2 - Laboratório de Química farmacêutica e Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510.. 3- Laboratório de Tecnologia Farmacêutica dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510. ________________________________________________________________________ RESUMO A Quantificação do princípio ativo de um medicamento é uma característica de grande relevância, para o controle de qualidade, independente da forma farmacêutica, sobretudo quando se trata de medicamentos fitoterápicos, onde poucos estudos têm sido desenvolvidos. O teor de Flavonóides em extrato seco e cápsulas de Ginkgo biloba L., foi desenvolvido e posteriormente validado, baseado na metodologia de doseamento do teor de flavonóides totais em extratohidroalcóolico de Passiflora alata Dryander (Petry et al., 1998). Ensaios clínicos e farmacológicos com extrato de Ginkgo biloba 761 (EGb761) têm demonstrado que a sua principal indicação terapêutica é nos casos de insuficiência sanguínea periférica e central. Os compostos ativos Ginkgo biloba L, são as flavonas glicosídicas e lactonas terpênicas (Bara et al., 2004). *E-mail: miracy@ufpe.br Tel (81) 2126-8511/2126-8510. Fax (81) 21268572 34.

(39) Este trabalho objetiva quantificar flavonóides totais já que são moléculas em quantidade majoritária nos extratos comercializados e em cápsulas, EGb 761, cerca de 24%. O método desenvolvido foi validado, conforme os parâmetros descritos na legislação vigente, mostrando-se seguro, eficaz e de fácil emprego nas rotinas das indústrias de fitoterápicos. Unitermos: Ginkgo biloba L., EGb 761, flavonas glicosídicas, lactonas terpenicas, validação.. ABSTRACT: Spectrophotometric Development and content validation of Ginkgo biloba L. capsules. The quantification of the active component of a drug is a characteristic of great importance for quality control, independent on the dosage form, above all when it is about phytotherapeutic drugs, where few studies have been developed. The of Flavonoids in dry extract and Ginkgo biloba L. capsules, was developed and later validated, based on dosage methodology of total flavonoid content in hydroalcoholic extract of Passiflora alata Dryander (Petry et al., 1998).Clinical and pharmacological trials with extracts of Ginkgo biloba 761 (EGb761) have shown that its main therapeutic indication is in cases of peripheral and central blood supply limitations. The Ginkgo biloba L. active compounds are glycosidic flavones and terpene lactones (Bara et al., 2004). This work aims at quantifying total flavonoids as they are molecules in greater quantity in the marketed extracts and in capsules, EGb 761, around 24%. The method developed was validated, according to the parameters described in the effective legislation, showing it as safe, efficient and of easy use in the phytotherapeutic industry routines.. Keywords: Ginkgo biloba L., EGb 761, glycosidic flavones, terpene lactones, validation.. 35.

(40) 3.1 Introdução. Os extratos de Ginkgo biloba L. contêm flavonóides como substâncias ativas, com cerca de 21 já isolados. Dentre estes uma grande variedade de glicosídeos de núcleo flavonol como quercetina, campferol e isoramnetina. Ocorrem também nestes extratos lactonas terpênicas, como ginkgolídeos e bilobalídeos, porém devido às baixas concentrações na planta, às fracas características de absorção na região do UV e às dificuldades na etapa de extração, estes não têm sido usados na padronização de extrato de Ginkgo (Sticher, 1993). O extrato padronizado de Ginkgo biloba EGb761, segundo a RE 89/2004 (Brasil, 2004), deve conter no mínimo 24,0 % de ginkgoflavonóides e 6% de terpenóides. As cápsulas de ginkgo disponíveis no mercado freqüentemente são preparadas na concentração de 40, 80 ou 120 mg de flavonóides. O uso de pó das folhas desta planta não é recomendado por apresentar ácido gincólico, substância alergênica que é encontrada em concentrações menores que 5ppm no extrato padronizado, conforme descrições em monografias americanas e na farmacopéia européia esse deve ser o limite máximo para evitar tais efeitos adversos, além disso, sua concentração em flavonóides é aproximadamente de 0,8% abaixo da concentração terapêutica que é de 24%. (Eur. Pharm, 1999). Ginkgo biloba L. constitui o fitoterápico mais comercializado no Brasil (Suzuki, 2002), sendo usado por ter um mecanismo de ação polivalente: neuroproteção, vaso-regulação. generalizada, antioxidante, sequestrador de radicais livres (Simões e Farias, 2002). As reações adversas mais freqüentes incluem náusea, azia, dor de cabeça, hematoma subdural e hemorragia subaracnóide intracerebral (Desai e Grossberg, 2003). Embora diversos estudos tenham procurado comprovar a eficácia e garantir segurança aos produtos de origem vegetal (Bauer e Tittel, 1996; Choi et al, 2002; Bast et. al, 2002), o. 36.

(41) desenvolvimento, aplicação e a validação de métodos analíticos para matérias-primas e fitoterápicos ainda são escassos na literatura (Sticher, 1993; Watson e Pitt, 1998; Van Beek e Wintermans, 2001). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), RE n° 899, de 29 de maio de 2003, no caso de metodologias analíticas não descritas em farmacopéias ou formulários especiais devidamente reconhecidos a metodologia será considerada validada, desde que sejam avaliados os parâmetros relacionados nas tabelas de classificação dos testes segundo sua finalidade e em seguida na de ensaios necessários para a validação segundo sua categoria (Brasil, 2003). Para a categoria III, onde estão descritos testes para validação de teor, que é a finalidade deste estudo, são exigidos os testes de: especificidade, linearidade, precisão, repetibilidade, exatidão e robustez. A precisão de um método é avaliada em três níveis: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. O teste de precisão intermediária se houver comprovação da reprodutibilidade não é requerida (Brasil, 2003). 3.2 Materiais Foram utilizados tanto na etapa do desenvolvimento metodológico como na etapa de validação da metodologia o extrato seco padronizado de Ginkgo biloba L. Deg®, cápsula de extrato seco de Ginkgo biloba L. (Polymar®) álcool etílico (Merck®), cloreto de Alumino (Aldrich), amido (Spectrum). As vidrarias utilizadas na realização dos ensaios foram selecionadas de um único fabricante e devidamente calibradas. Como equipamento foi utilizado para o estudo, balança analítica de alta precisão modelo AE260 (Mettler) e espectrofotômetro modelo 50UV-VIS (Vankel).. 37.

(42) 3.3 Métodos Desenvolvimento da Metodologia. Seleção do comprimento de onda Na seleção do comprimento de onda a ser utilizado no ensaio foi utilizada uma solução extraída por refluxo, durante 30 minutos a 100°C, partindo-se de 0,2 g de pó de extrato seco de Ginkgo biloba L para 10 mL de solução etanólica a 40%, em triplicata. Em seguida as amostras foram resfriada a temperatura ambiente (25 °C) e filtrada. Foi retirada da solução uma alíquota de 0,1 mL e completado o volume para 200 mL com solução etanólica a 40% (Petry et al, 1998). Procedeu-se a varredura espectrofotométrica, das três amostras extraídas, no espectro de absorvância ultravioleta de 200 nm a 400 nm. Um pico máximo de absorvância foi selecionado, para ser empregado nos experimentos seguintes.. Preparação da amostra. A amostra foi preparada da mesma maneira como foi realizada a varredura a e retirando uma alíquota 0,3 mL e completar para um volume de 200 mL com solução etanólica 40% após a adição de 0,2 mL de solução etanólica de cloreto de alumínio 0,5% (m/V). As amostras foram lidas em espectrofotômetros no comprimento de onda de 371nm. previamente selecionado.. 38.

(43) Estudo da Validação Validação é o processo pelo qual se estabelece evidência documentada, através de estudos laboratoriais, de que as características de desempenho ou parâmetros analíticos do método alcançam os requisitos para as aplicações analíticas pretendidas (Britthain, 1998). O método desenvolvido foi baseado na e constituiu-se na diluição de 3x10-5 g/mL, de uma solução extraída, filtrada e fria de 0,2 g equivalente ao peso médio das cápsulas em 10 mL de solução etanólica 40% e foi validado quanto aos parâmetros de: linearidade, precisão, especificidade, robustez, exatidão. Linearidade A linearidade corresponde a capacidade do método de apresentar resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma faixa de aplicação. A linearidade do método foi avaliada pela análise de regressão linear dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração autênticas, utilizando os pontos médios de concentrações de 1x10-5 g/mL 2x10-5, 3x10-5, 4x10-5, 5x10-5 g/mL, 6x10-5 g/mL do extrato seco de Ginkgo biloba L. (Petry et al, 1998).. Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ). Os limites de detecção e o de quantificação foram calculados pela divisão do desvio padrão dos coeficientes lineares das três curvas de calibração do ensaio de linearidade pela média dos coeficientes angulares destas respectivas curvas e multiplicado por 3,0 e 10,0 respectivamente. Robustez Robustez corresponde à capacidade do método de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros, indica a sua confiabilidade durante o seu uso normal (ICH, 1995).. 39.

(44) A robustez do método foi testada levando em consideração dois parâmetros:variação da quantidade do complexante (Cloreto de alumínio) e o tempo de exposição a luz após a adição de complexante. Especificidade Corresponde ao grau de interferência de espécies como outro princípio ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação garantindo que a resposta seja exclusivamente de um componente simples, não existindo interferências simultâneas (ICH, 1995; SWARTZ et al., 1998).Para este método foi realizada em 06 amostras com cápsulas duras cheias de amido.. Precisão. A precisão foi avaliada nos níveis de repetibilidade e precisão intermediária. A precisão pode ser expressa como o desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV%), não se admitindo valores superiores a 5 % (Brasil, 2003). A precisão intermediária foi determinada em dois dias por dois analistas diferentes e a repetibilidade foi realizada com 06 (seis) extrações diferentes do pó das cápsulas conforme preparação da curva padrão.. Exatidão A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, foi avaliada em três (3) níveis de concentração: baixa (50%), média (100%) e alta (150%). Cada nível foi analisado em sextuplicata e foi calculada em relação a. 40.

(45) concentração média e ao ponto médio da curva, conforme preparo das amostras, nos 3 (três) níveis de concentração. 3.4 Resultados e Discussão Desenvolvimento da Metodologia. O método desenvolvido foi baseado na literatura, com adaptações de concentração final de 3x10-5 g/mL ao invés de 1x10-5 g/mL (Petry et al, 1998) e após a varredura de 200 a 400nm observouse o pico máximo de absorção de 272nm. Linearidade A linearidade do método foi avaliada num intervalo de seis (6) concentrações: 1x10-5, 2x10-5, 3x10-5, 4x10-x, 5x10-5, 6x10-5 g/mL, em três curvas de calibração autêntica pela equação y = 0,08612x + 0,0026, onde y representa as leituras espectrofométrica e x representa a concentração de Flavonóides em g/ml. Os resultados estão ilustrados na (Tabela 1) e a curva de calibração na (Figura 1). A curva de calibração mostrou-se ajustada e apresentando coeficiente de correlação de 0,99887, os valores da análise de variância (ANOVA) das média da três curvas autênticas estão conforme (Tabela 2).. Precisão A precisão intermediária foi realizada por dois analistas em dias diferentes e os resultados estão ilustrados na (Tabela 3) e apresentaram valores de coeficiente de variação menores que 5%, conforme parâmetros da legislação vigente, intra e inter analistas e dias. Os resultados de repetibilidade estão ilustrados na (Tabela 4), onde se verifica um coeficiente de variação (CV%) menor que 1%, com desvio padrão amostral de 0,7173.. 41.

(46) Exatidão Os resultados da exatidão do método, em sextuplicata, nos níveis alto (50%), médio (100%) e baixo (50%) de concentração estão ilustrados na (Tabela 5), tiveram uma boa recuperação do ativo em todos os níveis, com coeficientes de variância baixos 1,12%, 0,67%, e 0,62% respectivamente.. Robustez A robustez do método avaliada pela duplicação do volume de complexante e pela variação do tempo de exposição, após a adição do complexante (sextuplicata), os resultados estão ilustrado nas (Tabelas 6) e (Tabela 7).O método mostrou-se robusto e pouco passível a pequenas variações.. Especificidade As aborvâncias, para o teste de especificidade, variaram de 0,001 a 0,008 os que não representa grau de interferência significativo que interfira no cálculo do teor.. 3.5 Conclusão O método espectrofotométrico para flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. mostrou-se simples, de fácil execução e de custo relativamente baixo quando comparado com os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência para a mesma finalidade. A curva de calibração mostrou-se ajustada e linear, teve como o coeficiente de correlação linear quadrático R2= 0,9987, comprovando que o método responde proporcionalmente a concentração da solução do extrato seco padronizado. Quanto a sua exatidão o método conseguiu recuperar o princípio ativo nos três níveis de concentração: baixo (50%), médio (100%) e alto (150%). Na precisão a metodologia foi avaliada em nível de precisão intermediária, com analistas e dias diferentes e de repetibilidade, podendo-se observar coeficientes de variâncias inferiores a 5%. 42.

(47) atendendo aos requisitos do guia de validação de métodos analíticos e bioanalíticos, RE 899 da agência nacional de vigilância sanitária (ANVISA). No teste de robustez na fase de variação de volume da solução complexante (solução hidroalcoólica de cloreto de alumínio), mesmo dobrando o volume da solução de cloreto de alumínio, e tempo de exposição a luz não observou-se diferenças significativas, comprovando a robustez do método. Com base nestes resultados o método desenvolvido pode ser aplicado com segurança e confiança nas rotinas dos controles de qualidades das indústrias de fitoterápicos.. 3.6 Referências Bibliográficas Bara MTF, Cirilo, HNC, Oliveira V, 2004. Determinação de ginkgoflavonóides por cromatografia líquida de alta eficiência em matérias-primas e produtos acabados. Revista Eletrônica da Faculdade de Farmácia / UFG, v.1, n. 1.. Bast A, Chandler, RF, Choy, Delmulle PC, Gruenwald LM, Halkes J, Keller SBA, Koeman K, Peter JH, Przyrembel PH, Ree EM,. Renwick AG, Vermeer ITM 2002. Botanical health products,. positioning and requirements for effective and safe use. Environmental Toxicology and Pharmacology. v. 12, p. 195-21i.. Bauer R 1998. Quality criteria and standardization of phytopharmaceuticals: can acceptabçle drug standards be achieved Drug Information Journal. v.32, p. 101-110.. Brasil, Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução – RE nº 89, de 16 de março de 2004.Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos. Brasília, 2004. 43.

(48) Brasil, Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, RE nº 899, de 29 de maio de 2003, Guia de validação de métodos analíticos e bioanalíticos, Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília.. Brittain HG 1998. Validação de Métodos Analíticos Não Cromatográficos, Pharmaceutical Technology, V.2, Junho, p.4-9, Ed. Brasileira. Choi DW, Kim JH, Cho SY, Him DH, Chang SY 2002. Regulation and quality control of herbal drugs in Korea.Toxicology v. 181-182, p. 581-586.. Desai AK, Grosseberg GT 2003. Herbals and botanicals in geriatric psychiatry.American Journal of Geriatric and Psychiatry. v. 11, n. 5, p. 498-506.. Eur Pharm Commiss Pharmaeur, 1999; 11(2): 333.. Green JM 1996. A pratical guide to analytical method validation. Analytical Chemistry News & Features, p.305-309.. ICH, International Conference on Harmonization of Technical Requiriments for Registration on Pharmaceuticals for Human Use Q2A. “Text on Validation of Analytical Procedures”March1995, Genebra.. Petry RD, Souza KCB, Bassami VL, Petrovick PR, Ortega. GG 1998. Revista Brasileira de. Farmácia.v.79 (1/2), p.7-10. Sticher O 1998. Quality of Ginkgo preparations. Planta Medica. v. 59, p. 2-11. 44.

(49) Swartz MR, Krull IS Validação de Métodos Cromatográficos, Pharmaceutical Technology, V.2, no.1, p.12-20, Ed. Brasileira.. Simões CMO, Farias MR 2002. Equivalência terapêutica entre medicamentos fitoterápicos. Folha Médica. v. 121, n.2, p. 65-71.. Suzuki SF, Schulz V, Hansel R, Tyler VE 2002. O Mercado de Medicamentos Fitoterápicos no Brasil. Fitoterapia Racional. São Paulo: Editora Manole.. The United States pharmacopeia 2005. The formulary – USP 28. Rockville: United States Pharmacopeial Convention.. Van Beek TA, Wintermans MS 2001. Preparative isolation and dual column high-performance liquid chromatography of ginkgolic acids from Ginkgo biloba. Journal of Chromatography A. v. 930, n.1-2, p. 109-117.. Watson DG, Pitt AR 1998. Analysis of flavonoids in tablets and urine by gas chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography /mass spectrometry. Rapid Communication Mass Spectrometry. v. 12, n. 4, p. 153-156.. 45.

(50) Tabela 1: Valores das curvas autênticas do parâmetro de linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor do Flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. CURVA DE CALIBRAÇÃO Conc. Teórica (g/mL) 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006. Curva 1 0,100 0,173 0,260 0,344 0,432 0,521. Curva 2 0,084 0,172 0,257 0,345 0,427 0,529. Curva 3 0,096 0,176 0,254 0,346 0,435 0,522. Média 0,093 0,174 0,257 0,345 0,431 0,524. D. P.. 0,007 0,002 0,002 0,001 0,003 0,004. CV% 7,28 0,98 0,95 0,24 0,77 0,679. Concentração (g/mL). Linearidade 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0. 0,0001. 0,0002. 0,0003. 0,0004. 0,0005. 0,0006. 0,0007. absorvância. Figura 1: Linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor de do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. Tabela 2: Valores da ANOVA (Análise de variância) da linearidade do método espectrofotométrico para determinação do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. ANOVA Fonte Modelo. SQ 0,389408805. GL 1. MQ 0,389408805. Residual. 0,00044214. 16. 2,76337E-05. Falta de ajuste. 0,00020414. 4. 5,10349E-05. Erro puro Total. 0,000238. 12. 1,98333E-05. 0,389850944. 17. 0,022932408. F 14091,8. F-crítico 4,4940. Curva Linear. 2,57319. 3,2592. Não há falta de ajuste. Tabela 3: Precisão intermediária da metodologia com analistas e dias diferentes. Concentração (%) Média (%) Analista A (dia 01) 98,05 100,39 101,55 99,99 Analista B (dia 01) 104,28 102,72 101,56 102,85 Analista A (dia 02) 100,78 100,39 99,61 100,26 Analista B (dia 02) 101,55 102,33 101,16 101,68. RSD 1,7828 1,3648 0,5957 0,5957. CV(%) 1,78 1,32 0,59 0,58. 46.

(51) Tabela 4: Resultados de repetibilidade da metodologia espectrofotométrica de quantificação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L. Concentração das amostras (%) 1. 2. 101,55 100,77. 3. 4. 5. 100,39. 99,61. 99,72. Média. RSD. CV(%). 100,59 100,43. 0,7173. 0,7142. 6. Tabela 5: resultados de exatidão do método espectrofotométrico de quantificação de flavonóides totais de Ginkgo biloba L. Concentração teórica (%) 50 100 150. Amostra 01. 02. 03. 04. 50,52 12,72 152,1. 50,90 102,20 152. 49,59 103,74 151,3. 50,50 102,24 153,8. 05. 06. Média RSD. 49,52 49,94 50,16 0,561 103,14 101,90 102,65 0,687 151,2 151,7 152,01 0,945. CV(%) 1,12 0,94 0,62. Tabela 6: Robustez do método quanto a variação na quantidade de Cloreto de alumínio (solução complexante) Volume de cloreto de Alumínio (mL) 0,2 0,4. Concentração da amostra (%) 01 101,55 100,77. 02 100,77 98,11. 03 04 05 06 100,39 99,61 99,61 100,39 100,38 98,44 103,89 100,77. Média RSD CV(%) 100,38 0,736 0,9962 100,39 2,07 0,9961. Tabela 7: Robustez do método quanto a variação do tempo de exposição à luz após a adição de cloreto de alumínio (solução complexante). Concentração (%) Amostra Média RSD CV(%) 5 min. 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min. 01 02 03. 100,38 96,89 100. 98,05 97,27 100,77. 100,77 99,18 100. 97,66 99,22 98,05. 98,83 98,44 96,88. 97,27 97,66 100. 98,82 0,003 1,012 98,11 0,002 1,019 99,28 0,003 1,007. 47.

(52) CAPÍTULO IV (ARTIGO III) Desenvolvimento metodológico e validação de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L..

(53) Desenvolvimento metodológico e validação de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L. Juliana L. Meira1, Ruth R. Strattmam1, Elba L.C. de Amorim2, Pedro J. Rolim Neto3 , Miracy Muniz de Albuquerque1*. 1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8511/2126-8510.. 2 - Laboratório de Química farmacêutica e Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510.. 3- Laboratório de Tecnologia Farmacêutica dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária – Recife-PE, CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8510. ________________________________________________________________________ RESUMO Ginkgo biloba L. é uma planta medicinal muito antiga, que atrai até hoje, o interesse de diversas áreas da ciência. É a única representante viva da família Ginkgoaceae (Report, 1996). Seu emprego, principalmente em doenças respiratórias na medicina popular chinesa, já era descrito em 2800 a.C. (Squires, 1995). O teste de dissolução para cápsulas de Ginkgo biloba L. garantira a sua disponibilidade in vitro e, portento, a sua absorção. A validação assegura que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, garantindo a confiabilidade dos resultados (Brasil, 2003). O método proposto foi desenvolvido através da levando em consideração liberação do ativo em função das concentrações em tempos pré-estabelecidos e dos desvios padrões. Foram testados três meios de dissolução, os aparatos pá e cesta e as rotações de 50 e 100 rpm, respectivamente. O método foi de fácil execução e respondeu *E-mail: miracy@ufpe.br Tel (81) 2126-8511/2126-8510. Fax (81) 21268572 48.

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