Submetido pela Revista Brasileira de Farmacognosia
3.4 Resultados e Discussão Desenvolvimento da Metodologia
O método desenvolvido foi baseado na literatura, com adaptações de concentração final de 3x10-5 g/mL ao invés de 1x10-5 g/mL (Petry et al, 1998) e após a varredura de 200 a 400nm observou- se o pico máximo de absorção de 272nm.
Linearidade
A linearidade do método foi avaliada num intervalo de seis (6) concentrações: 1x10-5, 2x10-5, 3x10-5, 4x10-x, 5x10-5, 6x10-5 g/mL, em três curvas de calibração autêntica pela equação y = 0,08612x + 0,0026, onde y representa as leituras espectrofométrica e x representa a concentração de Flavonóides em g/ml. Os resultados estão ilustrados na (Tabela 1) e a curva de calibração na (Figura 1).
A curva de calibração mostrou-se ajustada e apresentando coeficiente de correlação de 0,99887, os valores da análise de variância (ANOVA) das média da três curvas autênticas estão conforme (Tabela 2).
Precisão
A precisão intermediária foi realizada por dois analistas em dias diferentes e os resultados estão ilustrados na (Tabela 3) e apresentaram valores de coeficiente de variação menores que 5%, conforme parâmetros da legislação vigente, intra e inter analistas e dias.
Os resultados de repetibilidade estão ilustrados na (Tabela 4), onde se verifica um coeficiente de variação (CV%) menor que 1%, com desvio padrão amostral de 0,7173.
Exatidão
Os resultados da exatidão do método, em sextuplicata, nos níveis alto (50%), médio (100%) e baixo (50%) de concentração estão ilustrados na (Tabela 5), tiveram uma boa recuperação do ativo em todos os níveis, com coeficientes de variância baixos 1,12%, 0,67%, e 0,62% respectivamente.
Robustez
A robustez do método avaliada pela duplicação do volume de complexante e pela variação do tempo de exposição, após a adição do complexante (sextuplicata), os resultados estão ilustrado nas (Tabelas 6) e (Tabela 7).O método mostrou-se robusto e pouco passível a pequenas variações.
Especificidade
As aborvâncias, para o teste de especificidade, variaram de 0,001 a 0,008 os que não representa grau de interferência significativo que interfira no cálculo do teor.
3.5 Conclusão
O método espectrofotométrico para flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L. mostrou-se simples, de fácil execução e de custo relativamente baixo quando comparado com os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência para a mesma finalidade.
A curva de calibração mostrou-se ajustada e linear, teve como o coeficiente de correlação linear quadrático R2= 0,9987, comprovando que o método responde proporcionalmente a concentração da solução do extrato seco padronizado.
Quanto a sua exatidão o método conseguiu recuperar o princípio ativo nos três níveis de concentração: baixo (50%), médio (100%) e alto (150%).
atendendo aos requisitos do guia de validação de métodos analíticos e bioanalíticos, RE 899 da agência nacional de vigilância sanitária (ANVISA).
No teste de robustez na fase de variação de volume da solução complexante (solução hidroalcoólica de cloreto de alumínio), mesmo dobrando o volume da solução de cloreto de alumínio, e tempo de exposição a luz não observou-se diferenças significativas, comprovando a robustez do método.
Com base nestes resultados o método desenvolvido pode ser aplicado com segurança e confiança nas rotinas dos controles de qualidades das indústrias de fitoterápicos.
3.6 Referências Bibliográficas
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Tabela 1: Valores das curvas autênticas do parâmetro de linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor do Flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
Conc. Teórica
(g/mL) Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média D. P. CV%
0,0001 0,100 0,084 0,096 0,093 0,007 7,28 0,0002 0,173 0,172 0,176 0,174 0,002 0,98 0,0003 0,260 0,257 0,254 0,257 0,002 0,95 0,0004 0,344 0,345 0,346 0,345 0,001 0,24 0,0005 0,432 0,427 0,435 0,431 0,003 0,77 0,0006 0,521 0,529 0,522 0,524 0,004 0,679 Linearidade 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 0,0007 absorvância C o n c en tr a ç ão (g /m L )
Figura 1: Linearidade do método espectrofotométrico para determinação do teor de do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.
Tabela 2: Valores da ANOVA (Análise de variância) da linearidade do método espectrofotométrico para determinação do flavonóides totais em cápsulas de Ginkgo biloba L.
ANOVA
Fonte SQ GL MQ F F-crítico
Modelo 0,389408805 1 0,389408805 14091,8 4,4940
Residual 0,00044214 16 2,76337E-05 Curva Linear
Falta de ajuste 0,00020414 4 5,10349E-05 2,57319 3,2592
Erro puro 0,000238 12 1,98333E-05 Não há falta de ajuste
Total 0,389850944 17 0,022932408
Tabela 3: Precisão intermediária da metodologia com analistas e dias diferentes.
Concentração (%) Média (%) RSD CV(%)
Analista A (dia 01) 98,05 100,39 101,55 99,99 1,7828 1,78
Analista B (dia 01) 104,28 102,72 101,56 102,85 1,3648 1,32
Analista A (dia 02) 100,78 100,39 99,61 100,26 0,5957 0,59
Tabela 4: Resultados de repetibilidade da metodologia espectrofotométrica de quantificação do teor de cápsulas de Ginkgo biloba L.
Concentração das amostras (%)
1 2 3 4 5 6 Média RSD CV(%)
101,55 100,77 100,39 99,61 99,72 100,59 100,43 0,7173 0,7142
Tabela 5: resultados de exatidão do método espectrofotométrico de quantificação de flavonóides totais de Ginkgo biloba L. Amostra Concentração teórica (%) 01 02 03 04 05 06 Média RSD CV(%) 50 50,52 50,90 49,59 50,50 49,52 49,94 50,16 0,561 1,12 100 12,72 102,20 103,74 102,24 103,14 101,90 102,65 0,687 0,94 150 152,1 152 151,3 153,8 151,2 151,7 152,01 0,945 0,62
Tabela 6: Robustez do método quanto a variação na quantidade de Cloreto de alumínio (solução complexante) Concentração da amostra (%) Volume de cloreto de Alumínio (mL) 01 02 03 04 05 06 Média RSD CV(%) 0,2 101,55 100,77 100,39 99,61 99,61 100,39 100,38 0,736 0,9962 0,4 100,77 98,11 100,38 98,44 103,89 100,77 100,39 2,07 0,9961
Tabela 7: Robustez do método quanto a variação do tempo de exposição à luz após a adição de cloreto de alumínio (solução complexante).
Concentração (%) Amostra
5 min. 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min.
Média RSD CV(%) 01 100,38 98,05 100,77 97,66 98,83 97,27 98,82 0,003 1,012 02 96,89 97,27 99,18 99,22 98,44 97,66 98,11 0,002 1,019 03 100 100,77 100 98,05 96,88 100 99,28 0,003 1,007