Avaliação do perfil fenólico e atividade antioxidante de suplementos alimentares baseados em frutas e legumes

Avaliação do perfil fenólico e atividade

antioxidante de suplementos alimentares

baseados em frutas e legumes

Maria Marlene Ribeiro Cunha

Orientadora: Prof. Doutora Ana Isabel Ramos Novo Amorim Barros

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar

Vila Real, Julho 2014

I

Universidade de Trás-Os-Montes e Alto-Douro

Avaliação do perfil fenólico e atividade

antioxidante de suplementos alimentares

baseados em frutas e legumes

Maria Marlene Ribeiro Cunha

Composição de júri: Prof

_{. Doutora Ana Alexandra Ferreira}

Prof. Doutor Luís Carvalho

Doutor Raúl Domínguez-Perles

Prof

. Doutora Ana Barros

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar

Vila Real, Julho 2014

I

Agradecimentos

A realização desta dissertação não seria possível, nem fazia sentido, sem o apoio e incentivo de pessoas que preenchem a minha vida todos os dias.

Primeiramente, queria agradecer aos meus pais, irmão e à minha querida avó por todo o apoio que me deram, alegrias, carinho, força e incentivo, por tornarem os meus fins-de-semana dias de descanço e de conforto.

Ao meu companheiro Miguel Magalhães pelos conselhos, paciência, força e por transparecer todas as minhas qualidades, as quais, muitas vezes me esqueço que possuo. Obrigado por estares ao meu lado durante esta fase e acreditares sempre em mim.

À professora Doutora Ana Novo Barros por me transmitir todos os ensinamentos, pelo carinho, incentivo, pelos sorrisos, pelas palavras ditas, por me mostrar como é ser uma lutadora, como ser uma grande mulher, como ultrapassar os obstáculos sempre de cabeça erguida. Obrigada por ser uma excelente professora e amiga.

À minha querida amiga Irene Gouvinhas, por me mostrar todas as qualidades de uma boa profissional, pelos dias bem passados em laboratório, pelas palavras de apoio, alegrias, ensinamentos e acima de tudo pela amizade e paciência que teve para comigo neste ano de dissertação, sem dúvida que não me vou esquecer de todo o apoio que me deste, e tudo que fizeste por mim.

Às minhas grandes amigas e únicas, que me vou lembrar sempre, Filipa Santos, Carolina Gonçalves e Patrícia Nunes. Obrigada por fazerem destes dias académicos, os melhores da minha vida e por me demonstrarem todos os dias o valor de uma boa amizade, pelo incentivo, pelas gargalhadas, pela confiança e pela paciência que tiveram comigo neste último ano.

Aos meus amigos, Carla Sobreira, Ana Abrãao, André Lemos e Rui Costa pelos momentos de alegria, partilha e ensino que me proporcionaram.

Ao colega Nelson Machado e Raúl Perles por me ter ajudado nos cálculos estatísticos pelo apoio, pelos ensinamentos e pela paciência.

Aos técnicos de laboratório Sr. Carlos, D. Paula e D. Palmira por me fornecerem material e reagentes que precisava para concretizar esta dissertação.

II

Índice

Capítulo I- Revisão bibliográfica ... 1

1. Enquadramento temático... 2

1.1. Suplementos alimentares ... 3

1.1.1. Classificação dos suplementos alimentares... 4

1.1.1.1. Suplementos alimentares baseados em proteínas e aminoácidos ... 5

1.1.1.2. Suplementos alimentares baseados em ácidos gordos ... 6

1.1.1.3. Suplementos alimentares baseados em plantas ... 6

1.1.1.4. Suplementos alimentares baseados em minerais e vitaminas ... 7

1.1.2. Consumo de suplementos alimentares em Portugal ... 8

1.2. Principais caraterísticas das frutas e legumes ... 10

1.2.1. Consumo de frutas e legumes em Portugal ... 12

1.2.2. Benefícios para a saúde ... 13

1.3. Compostos fenólicos ... 14

1.3.1. Não-Flavonóides ... 16

1.3.2. Flavonóides ... 17

1.3.3. Composição fenólica de frutas e legumes ... 20

1.4. Atividade antioxidante ... 23

III

1.6. Objetivos ... 27

Capítulo II- Material e Métodos ... 29

2.1. Amostragem ... 29

2.2. Determinação da composição fenólica ... 30

2.2.1. Extração dos compostos fenólicos ... 30

2.2.2. Quantificação dos fenóis totais. ... 30

2.2.3. Quantificação dos orto-difenóis. ... 31

2.2.4. Quantificação das antocianinas. ... 32

2.2.5. Quantificação dos flavonóides ... 32

2.2.6. Quantificação da atividade antioxidante. ... 33

2.3. Determinação da atividade da enzima Fenilalanina Amónia Liase ... 34

2.3.1. Preparação do extrato para a quantificação da enzima ... 34

2.3.2. Quantificação da enzima fenilalanina amónia liase ... 34

2.4. Análise estatística ... 35

Capítulo III- Resultados e Discussão ... 36

3.1. Estudo dos parâmetros químicos nos suplemento ... 36

3.2. Estudo dos parâmetros químicos dos legumes que constituem o suplemento de legumes ... 39

3.3. Estudo dos parâmetros químicos das frutas que constituem o suplemento de frutas ... 45

3.4. Estudo dos parâmetros químicos nos frutos vermelhos... 49

3.5. Relação entre os suplementos e as misturas ... 54

3.6. Importância dos diferentes parâmetros químicos para a atividade antioxidante ... 59

Capítulo IV- Conclusão ... 60

4. Conclusão ... 61

Capítulo V- Referências Bibliográficas ... 62

IV

Índice de tabelas

Tabela 1: Composição nutricional de legumes e frutas……….…....11

Tabela 2: Estruturas dos ácidos fenólicos………...………...16

Tabela 3: Estruturas dos flavonóides………...………...18

Tabela 4: Composição fenólica de frutas……….………..…19

Tabela 5: Constituição de cada gama de suplementos………..………....….28

Tabela 6: Quantificação dos parâmetros químicos dos suplementos………..…..36

Tabela 7: Quantificação dos parâmetros químicos dos legumes………..….41

Tabela 8: Quantificação dos parâmetros químicos das frutas………...46

Tabela 9: Quantificação dos parâmetros químicos nos frutos vermelhos……….…50

V

Índice de Figuras

Figura 1: Consumo por categoria de suplementos alimentares………9

Figura 2: Consumo de frutas em Portugal entre 2008 e 2013……….……...12

Figura 3: Consumo de legumes em Portugal entre 2000 e 2004………13

Figura 4: Estrutura base dos estilbenos………...…...17

Figura 5: Estrutura base dos flavonóides………...17

Figura 6: Mecanismo da atividade antioxidante………...…………..23

Figura 7: Mecanismo da atividade antioxidante dos compostos fenólicos…………....25

Figura 8: Esquema representativo da via biossintética das classes de flavonóides…....26

Figura 9: Extratos metanólicos de frutas………30

Figura 10: Quantificação das antocianinas……….……32

Figura 11: Mecanismo de redução do ABTS………..…...33

Figura 12: Extratos da enzima das várias amostras………35

Figura 13: Produção do ácido trans-cinâmico no suplemento de frutas……….37

Figura 14: Análise em componentes principais dos parâmetros químicos estudados nos diferentes suplementos………...……….39

Figura 15: Análise em componentes principais dos parâmetros químicos estudados nos diferentes legumes e na sua mistura………43

Figura 16: Análise em componentes principais dos parâmetros químicos estudados nas diferentes frutas e na sua mistura………....49

Figura 17: Análise em componentes principais dos parâmetros químicos estudados nas diferentes frutas vermelhas e na sua mistura………..54

Figura 18: Análise em componentes principais dos parâmetros químicos estudados nas diferentes frutas vermelhas e o seu respetivo suplemento……….58

VI

Lista de abreviaturas

ABTS: Ácido 2,2'-azino-bis (3 - etilbenzotiazolino-6-sulfónico) AG: Ácido Gálico

Anova: análise de variância

INE: Instituto Nacional de Estatistica

INSA: Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge PAL: Fenilalanina Amónia Liase

PCA: Principal Component Analysis PLS: Partial Least Squares, PLS

SPSS: Statistical Package for the Social Sciences TEAC: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity

VII

Resumo

Hoje em dia, tem-se verificado um aumento do consumo de suplementos alimentares por forma a complementar a dieta tornando-a saudável e equilibrada. Este estudo teve como base a análise de três gamas de suplementos alimentares baseados em frutas e legumes.

O consumo de legumes e frutas tem sido encorajado por ser uma boa fonte de vitaminas, proteínas, minerais e compostos fenólicos. Além disso, está associado a inúmeros benefícios para a saúde uma vez estes que previnem doenças cardiovasculares, diabetes e doenças crónicas.

Neste trabalho foi realizada a quantificação da atividade da enzima fenilalanina amónia liase, o conteúdo em fenóis totais, orto-difenóis e flavonóides assim como a atividade antioxidante de suplementos alimentares baseados em frutas, legumes e frutos vermelhos. Para além disso, também foram quantificados os mesmos parâmetros químicos nos respetivos constituintes que compõem cada um dos suplementos.

A quantificação do conteúdo fenólico, atividade da PAL e atividade antioxidante realizada nos suplementos permitiu concluir que aqueles que são baseados em frutos vermelhos apresentam os valores mais elevados em todos os parâmetros, seguindo-se os legumes e as frutas com a exceção para este último do valor de atividade antioxidante. Apesar do conteúdo fenólico e atividade antioxidante dos suplementos advir da conjugação de 9 frutas e legumes respetivamente, a análise individual de cada constituinte permitiu concluir que a beterraba (legumes), a acerola (frutas) e o sabugueiro (frutos-vermelhos) foram os que mais contribuíram para esse poder ao apresentarem os valores mais elevados na maioria dos parâmetros.

Em suma, pode concluir-se que a valorização destes suplementos alimentares pode ser importante, visto que estes contribuem beneficamente para a saúde ao apresentarem um forte conteúdo fenólico e poder antioxidante. Além disso, o consumo dos três suplementos por dia pode ser vantajoso uma vez que a mistura destes revelou ter um efeito sinergético.

Contudo é de ter especial atenção que o consumo de compostos antioxidantes presentes nestes suplementos quando consumidos em excesso pode tornar-se em compostos pró-oxidantes.

VIII

Abstract

The consumption of vegetables and fruits has been encouraged since they are a good source of vitamins, proteins, minerals, and bioactive compounds. Hence, it is associated with numerous health benefits once they help to reduce the prevalence of several chronic and disabling diseases namely cardiovascular and metabolic disorders.

Given the reduction of the slowfood intake, nowadays, there has been an increase consumption of the dietary supplements in order to fulfil the dietary intake of nutrients and bioactive phytochemicals, contributing to more balanced dietary habits. On this matter, this study was based on the analysis of three types of dietary supplements based on fruits and vegetables.

In this work, the content of phenylalanine ammonia lyase (PAL), ortho-diphenols, total phenols, and flavonoids as well as the antioxidant activity of extracts from fruits, vegetables, and dietary supplements was achieved.

The results obtained showed that the content of phenolic compounds and phenylalanine ammonia lyase as well as the antioxidant capacity was higher in red fruits supplements, followed by those of vegetables and fruits, except for the in terms of antioxidant activity of fruits. Despite the phenolic content and antioxidant activity of the supplements come from the combination of nine fruits and vegetables respectively, the analysis of each constituent showed that beet (vegetables), acerola cherry (fruit), and elderberry (red fruit) presented the highest values for these parameters.

Thus, it can be concluded that the healthy attributions of these supplements might be important since they present a high content in bioactive phenolic and a strong antioxidant power. Thus, the daily consumption of these three supplements could be advantageous once the mixture have shown a synergistic effect.

Capítulo I

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1. Enquadramento temático

Atualmente existem muitos fatores que afetam a qualidade de vida, existindo uma maior consciencialização em realizar uma alimentação saudável e equilibrada e incluir nela os nutrientes necessários ao organismo bem como compostos que promovam a saúde (Moraes e Cola, 2006). Contudo, esta ideologia nem sempre é alcançada sendo necessário recorrer ao uso de suplementos alimentares de forma a fornecer ao organismo os nutrientes necessários à sua manutenção, no sentido de proporcionar compostos não essenciais que permitam melhorar os estados de saúde reduzindo a incidência de determinadas doenças.

Os suplementos alimentares têm sido comumente utilizados e podem ser classificados em quatro grupos distintos de acordo com a sua constituição. Segundo o Decreto - Lei n.º 136/2003, os suplementos alimentares podem conter vitaminas, minerais, ácidos gordos, aminoácidos e extratos de plantas. Este estudo baseia-se na análise de suplementos alimentares à base de frutas e legumes, uma vez que estes constituem uma peça fundamental numa dieta e cuja ingestão é fortemente recomendada pelos nutricionistas.

Os fitoquímicos são um grupo amplo e estruturalmente diverso de metabolitos secundários em plantas que não são essenciais para os humanos, pelo que se não forem consumidos não provocam qualquer deficiência específica no ser humano.

Hoje em dia, tem-se verificado um crescente interesse relativamente aos fitoquímicos e ao seu consumo, uma vez que estes estão associados a benefícios para a saúde. Tal acontece com o consumo de frutas e legumes, uma vez que diversos estudos demonstram que o consumo de fitoquímicos, nomeadamente de polifenóis e carotenóides, na forma de frutas e legumes (Carter et al., 2010), previnem doenças crónicas, tais como: diabetes, cancro, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (Krzyzanowska et al., 2010).

A biodisponibilidade dos fitoquímicos pode ser afetada por inúmeros fatores, incluindo o tipo de compostos, a polaridade, a massa molecular,metabolismo microbiano, as suas diferentes associações com as matrizes das plantas, digestão por enzimas gastrointestinais, entre outros.

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1.1. Suplementos alimentares

Os produtos naturais obtidos principalmente a partir de plantas têm sido usados como uma fonte importante de agentes profiláticos, para a prevenção e tratamento de doenças em seres humanos e animais (Bagchi, 2006).

Nos últimos anos, tem havido um aumento de interesse na obtenção de alimentos ricos em compostos bioativos com benefícios fisiológicos a longo prazo.

A prevenção de inúmeras patologias, como vários tipos de cancro, diabetes, alzheimer e doenças coronárias, está associada ao consumo de compostos bioativos (Byers et al., 1992). Os compostos bioativos, tal como acontece com os compostos fenólicos, estão fortemente presentes em frutas e vegetais, café, chocolate, grãos, especiarias e vinho (Dai et al., 2010). Contudo, hoje em dia estes compostos bioativos podem ser adquiridos não só numa alimentação equilibrada como também por meio de suplementos alimentares.

O Decreto-Lei n.º 136/2003 define os suplementos alimentares como géneros alimentícios que apenas podem ser postos à disposição do consumidor final sob a forma de produto pré-embalado.Estes destinam-se a complementar e/ou suplementar o regime alimentar normal não devendo ser utilizados como substitutos de um regime alimentar variado. Constituem fontes concentradas de determinadas substâncias, nutrientes ou outras com efeito nutricionais ou fisiológicos, extremas ou combinadas.

Os suplementos alimentares podem ser um conjunto de diversas substâncias e outros ingredientes, designadamente vitaminas, minerais, aminoácidos, ácidos gordos essenciais, fibras e várias plantas e extratos de ervas.

Dos suplementos alimentares conhecidos, destacam-se os nutracêuticos, devido ao facto destes possuírem fortes propriedades benéficas para a saúde (Zeisel, 1999).

Zeisel (1999) definiu nutracêuticos como sendo suplementos alimentares que proporcionam uma fonte concentrada de um agente bioativo a partir de um alimento, usado com o propósito de melhorar a saúde em doses que excedem os que podem ser obtidos de alimentos normais.

Muitas vezes, não se compreende a diferença entre nutracêuticos e alimentos funcionais. Os alimentos funcionais são aqueles que, quando consumidos regularmente, produzem um efeito benéfico específico para a saúde para além das suas propriedades nutricionais. Estes diferem dos nutracêuticos no modo como são obtidos pelo nosso organismo: enquanto os alimentos funcionais são obtidos diretamente do próprio

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alimento, os nutracêuticos são obtidos sob formas distintas como cápsulas, comprimidos ou pós (Espín et al., 2007).

Os nutracêuticos são consideravelmente mais seguros e apresentam menos efeitos secundários que muitos produtos farmacêuticos prescritos para o tratamento de certas patologias (McAlindon, 2006). Na realidade, os nutracêuticos oferecem uma vantagem sobre as “drogas sintéticas” desenvolvidas pelas indústrias farmacêuticas.

1.1.1. Classificação dos suplementos alimentares

Os suplementos alimentares podem ser classificados em quatro categorias: 1. Suplementos que contêm só vitaminas e minerais;

2. Suplementos que contêm vitaminas, minerais e outros princípios ativos não botânicos;

3. Suplementos que contêm ervas e ingredientes ativos não herbóreos, inclusive vitaminas e minerais;

4. Suplementos que só contem ervas e botânicos. (Ottaway, 2002).

Segundo o Decreto-Lei n.º 136/2003, os suplementos alimentares podem conter vitaminas, minerais, aminoácidos, ácidos gordos essenciais, fibras e plantas e extratos de plantas.

Dependendo da sua composição e do objetivo a que se destinam, eles podem ser agrupados em:

 Antioxidantes

 Emagrecimento e controlo de peso

 Energéticos

 Melhoria de patologias específicas

 Melhoria do desempenho muscular

 Melhoria do estado de pele, unhas e cabelo

 Melhoria e concentração

 Multivitamínicos

 Prevenção de osteoporose

 Proteção cardiovascular

 Redução de sintomas da menopausa

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Os suplementos alimentares são utilizados com o intuito de melhorar o desempenho, aumentar a massa muscular, diminuir gordura corporal, ajudar a controlar a perda de peso, prevenir doenças, aumentar a imunidade, aumentar a atividade mental e reduzir o stress (Braun et al., 2009)

Contudo, apesar de apresentarem benefícios para a saúde, quando consumidos em doses elevadas podem ter efeitos prejudicais. Estudos já associaram o consumo de suplementos com a hepatoxicidade (Krishnan et al., 2009), insuficiência renal (Gabardi et al., 2007) e problemas toxicológicos devido ao excesso de ingestão de vitaminas e minerais (MacFarquhar et al., 2010).

1.1.1.1. Suplementos alimentares baseados em proteínas e

aminoácidos

As proteínas possuem um elevado valor biológico sendo fundamentais na regulação de processos metabólicos, na reparação, manutenção de órgãos e tecidos e participam na formação de enzimas, hormonas e anticorpos.

A principal proteína consumida sob a forma de suplemento é a proteína “whey” ou proteína do soro de leite. Esta proteína é obtida a partir da extração da caseína do leite através de um método de precipitação. Possui inúmeros benefícios quando ingerida, desde o aumento da síntese proteíca muscular, redução da gordura corporal em função do seu alto teor de cálcio e alta concentração de glutationa e o aumento da concentração de insulina plasmática, favorecendo a captação de aminoácidos para o interior da célula muscular (Kenji, 2006, Calbet 2002). Esta proteína possui elevadas concentrações de aminoácidos essenciais, quando comparada com outras fontes proteicas, sendo ainda rapidamente absorvidas pelo organismo (Fischborn, 2009).

Os suplementos alimentares baseados em aminoácidos mais consumidos em Portugal são a carnitina e a creatina (Lopes, 2013).

A carnitina é um constituinte natural do organismo cuja função primária é facilitar a entrada de ácidos gordos de cadeia longa para a membrana interna da mitocôndria (Brass, 2000). Estando presente naturalmente no organismo apenas necessitam da sua suplementação indivíduos com insuficiência renal cónica e cardíaca, diabetes tipo 2 ou doença vascular periféria. A sua suplementação é requerida muitas vezes por atletas uma vez que retarda a fadiga muscular e dores causadas pelo esforço físico excessivo (Reynier, 1996).

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A creatina é sintetizada endogenamente no fígado, pâncreas e rins através dos aminoácidos glicina, arginina e metionina (Maughan, 2004). Pode ser encontrada em fontes alimentares como: carnes bovinas, bacalhau, linguado, salmão e atum. O consumo de suplementos baseados neste aminoácido é utilizado na obtenção de energia em exercícios de alta intensidade e curta duração (Balsom et al., 1994). A creatina deve ser usada com precaução em indivíduos com doenças renal e/ou hepática. O seu consumo prolongado por levar a a possíveis efeitos nefrotóxicos (Mason, 2007).

1.1.1.2. Suplementos alimentares baseados em ácidos gordos

Os ácidos gordos são fonte de energia e fazem parte integrante de membranas celulares (Zurier, 1991).

Os ácidos gordos essenciais não são sintetizados pelo nosso organismo devendo ser adquiridos a partir da alimentação, como é o caso do ómega-3 (ácido linolénico) e o ómega-6 (ácido linoleico) (Vannice e Rasmussen, 2014).

Contudo, muitas vezes a obtenção destes ácidos gordos a partir da alimentação não é alcançado, sendo necessário a sua suplementação.

Os suplementos alimentares baseados em ácidos gordos mais consumidos em Portugal são o CLA (ácido linoleico) e o Omega-3 (ácido linolénico).

O CLA (ácido linoleico) é utilizado como suplemento alimentar para alterações na composição corporal, diminuição da arterosclerose, prevenção e tratamento de diabetes mellitus tipo II, reforço da mineralação óssea, modulação do sistema imune e efeito anti-trombogénico (Botelho, 2005). Pode ser obtido da alimentação a partir de óleo de milho, girassol e soja (Sanhueza, 2002).

O ómega-3 (ácido linolénico) está associado (enquanto suplemento alimentar) à prevenção de um inúmero conjunto de doenças inflamatórias como: alergias, artrite reumatóide, cancro, asma, diabetes tipo I, esclerose múltipla, lúpus, obesidade,peritonite, peneumonia e lesão renal aguda crónica

(Calder, 2010; Seki, 2010).

1.1.1.3. Suplementos alimentares baseados em plantas

O uso de suplementos alimentares baseados em plantas é muito solicitado devido ao seu conteúdo em compostos bioativos. Destes suplementos os mais consumidos em

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Portugal são o chá verde, extratos de framboesa e bagas de goji, sendo o seu forte poder bioativo associado à presença do seu conteúdo fenólico.

O chá verde deriva da planta Camellia sinensis e é altamente constituído por catequinas, polifenóis e por polissacarideos conjugados com aminoácidos, cafeína e vitaminas. Devido ao forte conteúdo destes compostos, o chá verde é caraterizado por promover a diminuição do peso corporal, gordura corporal, auxiliar na prevenção e tratamento de obesidade e de doenças associadas como a diabetes e as cardiovasculares. (Navarro, 2009)

As bagas de goji são as frutas que derivam da planta Lycium barbarum sendo o seu conjunto de polissacarídeos um dos princípios ativos. Estes possuem ótimas atividades biológicas, dos quais se destacam os efeitos sobre o envelhecimento, neuroproteção, aumento do metabolismo, o controlo da glicose em diabéticos, propriedades antioxidantes, imunomodulação, atividade antitumoral e citoprotecção e hipertensão (Bryan et al., 2008; Potterat, 2010 ).

A framboesa é o fruto da planta Rubus idaeus sendo constituída por inúmeros compostos fenólicos que são responsáveis pela maior parte da atividade antioxidante deste fruto. O extrato deste fruto é muito utilizada como suplemento alimentar.

O suplemento de extrato de framboesa está indicado na perda ou prevenção do ganho de peso, tratamento contra a obesidade e aumento de massa corporal magra, lesões ateroscleróticas múltiplas e doenças coronárias (Lin., 2011). Para além disso, inibe a indução de tumores no fígado, pulmões e do esófago (Morimoto, 2005).

1.1.1.4. Suplementos alimentares baseados em minerais e

vitaminas

As vitaminas são importantes reguladoras dos processos metabólicos funcionando como coenzimas. Podem ser classificadas em lipossolúveis como A, D, E e K e hidrossolúveis como as do complexo B e C (Gomes, 2010). Estas últimas são importantes uma vez que podem ser acumuladas no organismo alcançando níveis tóxicos.

As vitaminas são consideradas essenciais, uma vez que o nosso organismo não as consegue sintetizar, devendo ser adquiridas a partir da alimentação. Estas são importantes no nosso organismo uma vez que são responsáveis por vários processos

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como proteção e reforço do sistema imunitário, formação de ossos e tecidos, formação e manutenção da estrutura e funções celulares (Guimarães, 2011).

Contudo, nem sempre é possível obter as quantidades necessárias de vitaminas para o desenvolvimento regular do nosso organismo, sendo necessário a utilização de suplementos por forma a complementar a sua deficiência.

O Decreto-Lei n.º 136/2003 indica as vitaminas e minerais que podem ser constituintes dos suplementos alimentares. Segundo este decreto, as vitaminas A, C, D, E, K, B1, B2, B6, B12, Niacina, Biotina, ácido pantoténico e ácido fólico podem entrar na constituição de um suplemento alimentar assim como os minerais cálcio, magnésio, ferro, cobre, iodo, zinco, manganês, sódio, potássio, selénio, crómio, molibdénio e fósforo.

A suplementação em vitaminas e minerais pode ser necessária em vegetarianos, doentes, grávidas ou mulheres em período de aleitamento, desportistas, idosos, consumidores de bebidas alcoólicas e fumadores.

Segundo Roy (2011), a suplementação vitamínica é muitas vezes efetuada em casos de más formações congénitas, constipações, para fortalecer ossos, aumentar energia, reduzir colesterol, ajudar a cicatrização e curar a acne.

Os minerais também apresentam inúmeras funções importantes no nosso organismo. O cálcio é importante na renovação constante dos ossos e participa na contração muscular e condução nervosa, o ferro ajuda no transporte do oxigénio dos pulmões para os tecidos através dos glóbulos vermelhos e o potássio ajuda na transmissão do influxo nervoso, na contração muscular e no suporte da pressão sanguínea.

Tendo em conta que o nosso trabalho consiste no estudo de suplementos alimentares baseados em frutas e legumes, considera-se importante estudar as principais características destes produtos.

1.1.2. Consumo de suplementos alimentares em Portugal

Num estudo sobre consumo de suplementos alimentares em Portugal realizado por Felício em 2006, a 1247 índividuos com idade igual ou superior a 18 anos, verificou-se que 99% dos inquiridos tem um forte conhecimento sobre suplementos alimentares, dos quais 72 % são consumidores dos mesmos.

Neste inquérito ainda foi possível concluir que dos 81% entrevistados que utilizam ou já utilizaram suplementos alimentares, 65% consomem suplementos

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alimentares à base de vitaminas, 52% à base de minerais e cerca de 38% à base de vegetais/chás/plantas. Os dietéticos são a categoria de suplementos alimentares menos utilizados, com cerca de 26%, seguindo-se os energéticos, com cerca de 34%. Os dados relativos a este estudo podem ser encontrados na figura 1.

Figura 1: Consumo por categoria de suplementos alimentares, Felicio (2006).

Segundo um estudo realizado por Lopes em 2013, relativo ao aconselhamento farmacêutico em suplementação alimentar, verifica-se que os mais consumidos em Portugal no ano de 2012 foram:

 CLA (ácido linoleico conjugado)

 Omega-3

 L-carnitina

 Creatina

 Extrato de framboesa

 Depuralina Ampolas

 Bagas de goji (lycium barbarum)

 Biolimão gold

 Beringela slim cápsulas

 Melatonina (angelicalm)

 Centrum

 QI plus study

 Chá verde

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1.2. Principais caraterísticas das frutas e legumes

Devido à forte produção de produtos hortícolas e frutícolas em Portugal, torna-se necessário realçar as suas principais características de forma a fomentar o seu consumo, assim como, promover a prática de uma alimentação saudável e equilibrada.

Praticar uma alimentação saudável contribui para o bem-estar físico e emocional, sendo ainda um fator preventivo de várias doenças. O corpo humano necessita de um determinado número de compostos para se manter saudável, em forma e ativo. As frutas e os legumes fornecem a maioria desses compostos apresentando assim um elevado valor nutricional e funcional. Sendo fonte elevada de micronutrientes essenciais, fibras dietéticas e fitoquímicos, contribuem beneficamente para a saúde. As frutas e legumes são constituídos maioritariamente por água, vitaminas do complexo A, B, C e E, minerais e fibra alimentar. Na tabela 1 encontra-se a composição nutricional de frutas e legumes necessários a este estudo.

As vitaminas são considerados micronutrientes essenciais a inúmeras reações metabólicas do organismo, estando presentes nos alimentos em pequenas quantidades. A maioria das vitaminas são adquiridas a partir da dieta sendo necessário assegurar uma dieta variada para suprir as necessidades diárias e evitar que ocorram deficiências (Carmo, 2011). A vitamina C é um dos antioxidantes mais importantes encontrados em frutas e legumes. É necessária para o crescimento e reparação dos tecidos em todas as partes do corpo humano. É altamente biodisponível, sendo o antioxidante hidrossolúvel mais importante para as células e um eliminador eficiente de espécies reativas de oxigénio (Halliwell, 1996).

Os carotenóides α-caroteno, β-criptoxantina e β-caroteno, presentes em frutas e legumes, são pró-vitamínicos, isto é, são posteriormente transformados em vitamina A, o que pode prevenir doenças oculares graves, como cegueira noturna, suscetibilidade à infeção, pele escamosa e desenvolvimento ósseo (Jasmir et al., 2011).

As frutas e legumes são uma boa fonte de minerais como potássio, zinco, cálcio, magnésio e cobre. O potássio, de um modo geral, é o mineral mais abundante nas frutas e legumes, sendo imprescindível para a produção de energia, síntese de proteínas e ácidos nucleicos. É importante na prevenção de contraturas musculares e condução nervosa. A carência deste mineral causa cansaço, fadiga, fraqueza, dores musculares, vómitos, hipotensão e dilatação cardíaca.

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Tabela 1: Composição nutricional de legumes e frutas por 100g de alimento (adaptado de

INSA). Legumes Água (g) Proteína (g) Hidratos de carbono (g) Fibra alimentar (g) Vitaminas (Caroteno) (mg) Minerais (Potássio) (mg) Alho 79,80 3,80 11,30 3,00 17,00 346,0 Beterraba 92,40 1,00 3,50 2,60 16,00 335,0 Brócolo 91,10 3,40 1,50 2,60 1066 370,0 Cenoura 92,00 0,60 4,40 2,60 5600 312,0 Courgette 94,00 1,60 2,00 1,00 332,0 446,0 Couve portuguesa 90.60 2,20 3,50 2,40 1400 486,0 Espinafre 91,80 2,60 0,80 2,60 3300 471,0 Salsa 91,70 3,10 0,40 2,90 3350 746,0 Tomate 93,50 0,80 3,50 1,30 510,0 455,0 Frutas Acerola 91,00 0,90 8,00 1,50 941,4 165,0 Ameixa 88,00 0,80 7,40 1,90 420,0 190,0 Amora 88,50 1,70 20 2,00 22,00 321,0 Ananás 87,60 0,50 9,50 1,20 20,00 256,0 Arando 87,30 0,39 12,20 4,60 13,30 85,00 Framboesa 84,30 0,90 5,10 6,70 30,00 229,0 Groselha preta 81,30 1,28 6,110 6,78 177,0 303,0 Groselha vermelha 81,30 0.90 17.30 5,00 218,0 169,0 Laranja 86,30 1,10 8,90 1,80 120,0 159,0 Maçã 82,90 0,20 13,40 2,10 26,00 139,0 Mirtilo 84,30 0,70 14,50 2,40 18,00 89,00 Morango 90,10 0,60 5,30 2,00 26,00 139,0 Papaia 88,20 6,60 9,10 2,30 810,0 210,0 Pêssego 87,50 0,60 8,10 2,30 400,0 160,0 Romã 83,30 0,40 12,00 3,40 38,00 240,0 Baga de sabugueiro 79,80 0,66 18,40 7,00 36,00 280,0 Tâmara 20,30 2,50 67,30 7,80 47,00 700,0 Uva 78,90 0,30 18,60 0,90 60,00 344,0

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1.2.1. Consumo de frutas e legumes em Portugal

O consumo diário de fruta na dieta humana é cada vez mais valorizado numa dieta saudável, sendo recomendado a ingestão de 4 a 5 peças de fruta por dia. Este consumo está associado à redução de doenças cancerígenas e cardiovasculares (Heim, 2002).

Segundo dados do INE em 2012-2013, ocorreu um decréscimo do consumo de frutas comparativamente ao ano anterior, com um valor de consumo de 1 028 toneladas. Na figura 2 podemos ver a variação do consumo de frutas a partir de 2008.

Figura 2: Consumo de frutícolas em Portugal entre 2008 e 2013.

Os dados mais recentes relativos ao consumo de produtos hortícolas em Portugal correspondem ao ano de 2003-2004. Segundo o INE, neste ano o seu consumo foi de 1 126 toneladas, um valor superior aos anos anteriores.

Na figura 3 podemos observar a variação do consumo de legumes entre os anos de 2000 a 2004.

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Figura 3: Consumo humano de legumes entre 2000 e 2004.

1.2.2. Benefícios para a saúde

Atualmente, existe uma grande variedade de estudos que suportam a funcionalidade de inúmeros alimentos na prevenção de patologias, como stress oxidativo, e na redução do risco de doenças.

O stress oxidativo está implicado em várias doenças incluindo disfunção cardiovascular, várias tipologias de cancro, reumatismo, diabetes, artrite reumatoide, enfisema pulmonar, dermatite, cataratas, doenças neuro degenerativas, disfunção das células endoteliais (Benzie, 2003) e vários doenças autoimune ligadas ao processo degenerativo do envelhecimento (Shukitt-Hale et al., 2008).

A estabilidade e funcionalidade dos compostos fitoquímicos no corpo humano depende de vários fatores, entre os quais: a quantidade, espécies, ligação das moléculas, a sua biodisponibilidade, localização e presença de outros compostos bioativos em frutas e vegetais.

Os efeitos aditivos e sinergéticos, previstos a partir da mistura complexa de fitoquímicos presentes em frutas e vegetais, não podem ser alcançados por meio de suplementos de micronutrientes (Liu, 2003). Os diferentes frutos e vegetais, além de apresentarem uma elevada capacidade antioxidante, apresentam também uma boa

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combinação de diferentes antioxidantes, as quais exercem um efeito sinérgico, quando presentes em conjunto.

Praticar uma alimentação correta e equilibrada previne patologias causadas pelo stress oxidativo. Em 2009, Herrera et al. afirmou que há uma correlação positiva entre o consumo diário de frutas e produtos hortícolas e a redução do risco de doenças.

Vários autores afirmaram que o consumo de frutas e legumes está associado a uma prevenção de doenças crónicas como doenças coronárias cancro (Liu et al., 2009), diabetes (Harding et al., 2008) e alzeihmer (Eckert, 2008).

Os efeitos do consumo de dietas ricas em gorduras e hidratos de carbono pro-oxidantes e pro-inflamatórias podem ser atenuados com o consumo de frutas devido ao seu conteúdo em antioxidantes (Dembitsky, 2011).

Uma redução da ingestão de gordura total, em particular da gordura saturada, de sal, e um aumento simultâneo da ingestão de alimentos ricos em amido, frutos e vegetais, bem como também uma redução do stress oxidativo externo, promove a proteção do organismo.

Vitaminas e certos antioxidantes fitoquímicos incluindo flavonóides e carotenóides são eficazes contra a proliferação colo-rectal humana e células cancerígenas da mama e do estômago (Sexton et al., 2006).

Outros estudos realizados in vitro demonstraram que o crescimento de células tumorais do estômago, mama, cólon e próstata foi fortemente inibido por extratos de framboesa, mirtilo, amora e arando (Boivin et al., 2007; McDougall et al., 2008; Seeram et al., 2006; Zhang et al., 2008).

1.3. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são metabolitos secundários que ocorrem naturalmente em plantas (Anklam, 1998; Tomas-Barberan et al., 2000); como são compostos fitoquímicos, apresentam diversas funções biológicas (Ignat et al., 2011) desempenhando um papel importante no seu crescimento e reprodução (Popa et al., 2002; Bravo 1998).

Os polifenóis atuam na eliminação de radicais livres, defesa contra a radiação ultravioleta, patogénicos e predadores (Lata, 2009). Para além disso, podem atuar como fitoalexinas (Popa et al., 2008), polinizadores e agentes antioxidantes (Naczk, 2006), contribuindo ainda para a pigmentação da planta e resistência a condições adversas.

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Em particular, os compostos fenólicos naturais têm sido mencionados por possuírem excelentes propriedades nomeadamente na preservação de alimentos (Valenzuela et al., 1992) e proteção contra inúmeros distúrbios patológicos, tais como arteriosclerose, disfunção cerebral, cancro, diabetes, cataratas, alzheimer, infeções do trato urinário, doenças cardiovasculares (Sesso, 2007).

Presentes não só em frutas e vegetais, mas também em cereais, chá, café, chocolate, vinho e cerveja (Dai et al., 2010), estes compreendem mais de 8000 substânciasidentificadas até à data de 2011 (Ignat et al., 2011).

O conteúdo em compostos fenólicos nos alimentos vegetais pode variar significativamente, de acordo com diferentes fatores intrínsecos e extrínsecos como a genética das plantas, cultivar, composição do solo e condições de maturação e pós-colheita (Jaffery et al., 2003).

Os compostos fenólicos possuem uma grande influência nas caraterísticas dos alimentos ao contribuir para a cor, odor, estabilidade oxidativa e sabor, preferencialmente a adstringência, de fruta e sumos de fruta, sendo a adstringência causa da interação entre os compostos fenólicos, principalmente procianidina, com as glicoproteínas encontradas na saliva (Dai et al., 2010).

Os polifenóis possuem muitas aplicações industriais sendo utilizados como corantes naturais, conservantes para alimentos, produção de tintas, papel e cosméticos (Ignat et al., 2011).

Quimicamente, são compostos que possuem um ou mais anéis aromáticos ligados a um ou mais grupos hidroxilo (Dai et al., 2010). Estas estruturas variam de moléculas de fenóis simples a polímeros complexos de alta massa molecular (Balasundram et al., 2006).

São facilmente oxidáveis, tanto por ação de enzimas vegetais como por metais, luz, calor ou em meio alcalino.

Os compostos fenólicos são geralmente classificados em duas classes: não-flavonóides e não-flavonóides.

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1.3.1. Não-Flavonóides

A classe dos não-flavonóides dividem-se em duas sub-classes: ácidos fenólicos e estilbenos.

Os ácidos fenólicos dividem-se em: ácidos cinâmicos e ácidos benzóicos. Os ácidos cinâmicos possuem estrutura geral em C6-C3 e incluem: ácido caféico, ferúlico, cumárico e sinápico (Bravo, 1998). Os ácidos benzóicos compreendem: ácido gálico, protocatecuico, vanílico e siríngico (Bravo, 1998). Estes possuem estrutura geral em C6-C1 sendo que a variação das estruturas individuais são derivadas de metilações e hidroxilações do anel aromático (Macheix et al., 1990). Na tabela 2 encontram-se as estruturas dos ácidos fenólicos.

Tabela 2: Estrutura base dos ácidos fenólicos e ácidos fenólicos mais abundantes nos alimentos

(Balasundram et al., 2006).

Estrutura base Substituintes

Ácido Cinâmico Ácido p-cumárico R=R`=H Ácido Caféico R=OH,R`=H Ácido Ferúlico R=OCH3, R`=H Ácido Sinápico R=R`= OCH3 Ácido Benzóico Ácido p-hidroxibenzóico R=R`=H Ácido gálico R=R`=OH Ácido vanílico R=OCH3 , R`=H Ácido Siríngico R=R`=OCH3

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Os estilbenos são caraterizados por terem elevada atividade antioxidante, destacando-se nesta classe de compostos, o resveratrol, composto com importância relevante nos vinhos. Na figura 4 encontra-se a estrutura base dos estilbenos.

Figura 4: Estrutura base dos estilbenos

1.3.2. Flavonóides

Dos 8000 polifenóis conhecidos até 2011 (Ignat et al., 2011), 4000 pertencem à classe dos flavonóides, sendo que existem ainda muitos flavonóides por identificar.

Os flavonóides são caraterizados por possuírem uma estrutura base com 15 átomos de carbono, com uma configuração em C6-C3-C6 (Haslam, 1998). Na figura 5 encontra-se a estrutura base destes compostos.

Figura 5: Estrutura base dos Flavonóides

Estas estruturas consistem em dois anéis aromáticos A e B, ligados entre si por um anel hetercíclico de 6 lados, anel C (Ignat et al., 2011). O anel aromático A é derivado da via etilo/malonato, e o anel B é derivado da fenilalanina através da via do chiquimato (Merken et al., 2000). A variação do anel C origina as diferentes classes de flavonóides: flavonóis, flavonas, flavanóis, flavanonas, calconas, auronas e antocianinas.

Nas plantas, estes compostos atuam como protetores contra a radiação ultravioleta, agentes patogénicos e herbívoros (Harborne, 2000). As antocianinas atraem insetos predadores (Harborne, 2000), sendo também responsáveis pela cor azul, vermelha e roxa de frutas, vinhos e certos vegetais que são fonte de flavonóides na dieta

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humana. Para além disso afetam o sabor e a diferença de cor branca, rosa e tinta dos vinhos, bem como a sua preservação, manutenção e envelhecimento (Dai et al., 2010).

Os flavonóides tem sido mencionados por exibirem uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo atividade anti-bacteriana, anti-inflamatória, antialérgica e anti trombótica. Estudos epidemiológicos apontam para a possibilidade de estes prevenirem doenças cardiovasculares e cancerígenas (Gheldof, 2002).

Classe Estrutura geral Flavonóide Substituintes Flavanol (+) - Catequina (-) - Epicatequina Flavona Crisina Apigenina Rutina Luteolina Glucosideo luteolina R2,R3=OH R2,R3,R5=OH R2,R3,R5,R4=OH, R1=rutinoso R2,R3,R5,R4=OH R2,R3, R4=OH,R5=glucose Flavonol Kampferol Quercetina Miricetina Tamarixetina R,R2,R1=H R=OH, R2,R1=H R,R2,R1=OH R-OH, R1=Me, R2=H Flavanona Naringina Naringenina Taxifolina Eriodictiol Hespiridina R1=H, R2=OH, R=ramnoglucose R,R2=OH, R1=H R,R1,R2, R3=OH R,R1,R2=OH

R1,R3=OH, R2-OMe, R=rutinoso

Isoflavona Genistina Genisteína Daidzin Daidzeina R2=OH, R-glucose R2=OH, R=H R=glucose R=H Antocianidina Delfinidina Cianidina Pelargonidina Peonidina Malvidina Petunidina R=R1=OH R=OH, R1=H R=R1=H R=OCH3, R1=H R=R1=OCH3 R=OCH3, R1=OH

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1.3.3. Composição fenólica de frutas e legumes

Existem inúmeros estudos que demonstram uma associação positiva entre o conteúdo fenólico de frutas e legumes com a saúde (Higdon et al., 2003; Santi et al., 2000). O efeito nutracêutico dos compostos fenólicos é atribuído ao seu elevado poder antioxidante e propriedades anticancerígenas e anti-inflamatórias (Pérez-matute et al., 2009). Os compostos fenólicos possuem na sua estrutura química grupos que são responsáveis por grande parte das características organoléticas das frutas e legumes. Na tabela 4 estão representadas as principais classes de polifenóis presentes em algumas frutas e legumes.

Tabela 4: Composição fenólica de frutas (adaptado de Naczk e Shahidi, 2006).

Classes dos compostos

fenólicos Fonte alimentar

Ácidos fenólicos

Ácidos hidroxicinâmicos Pêssego, mirtilo, cenoura, amoras, cerejas, frutos

cítricos, tomate, espinafre e oleaginosas.

Ácidos hidroxibenzóicos Mirtilo, cereais, arando e oleaginosas.

Flavonóides

Antocianinas Mirtilos, groselha, morango e uva.

Flavanóis Maças, mirtilos, uva, cebolas e alface.

Flavanonas Frutos cítricos.

Flavonóis Maçãs, feijão, mirtilos, alho-porro, alface cebola,

azeitona pimenta e tomate.

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Dos flavonóides mais comuns encontram-se a quercetina, abundante na cebola, brócolos e maçã, a catequina, encontrada no chá e em diversas frutas, a naringerina principal flavanona encontrada na toranja, a cianidina, a antocianina mais abundante nos frutos vermelhos, groselha preta, framboesa e amora, a daidzeína, genisteina e gliciteína que são as principais isoflavonas da soja (D`Archivio et al., 2007) e por fim, a hespertina presente em laranja e eriodictiol em limão.

Alguns estudos já referiram a quantificação destes elementos em maçã. Wu (2007), num estudo de oito variedades de maçãs, tendo sido identificados seis tipos de compostos fenólicos: o ácido clorogénico, caféico, epicatequina, catequina, cumarina e floridzina. Para além disso, verificou que o ácido clorogénico apresentava valores mais elevados. Contudo, apenas as variedades Granny Smith, Delicious e Orin, apresentaram o teor de epicatequina superior ao do ácido clorogénico.

Dembitsky et al. (2011), caraterizaram a composição fenólica da acerola. Esta é rica em ácidos fenólicos (p-cumárico, ferúlico, caféico e clorogénico), flavonóis (quercetina, kampferol), flavanóis (epigalocatequina galacto e epicatequina), antocianinas (pelargonidina, malvidina-3,5-diglicósido e cianidina-3-glicósido) e o flavonol rutina.

Os frutos cítricos são constituídos pelo ácido ferúlico, ácidos hidroxicinâmicos, cianidina glicosilada, hespiridina e naringina. Para além disso, são uma boa fonte de carotenóides e vitamina C.

Os brócolos são uma fonte natural de flavonóides e ácidos hidroxicinâmicos. Em 2010, Podsedek identificou os principais compostos fenólicos deste legume nomeadamente ácido 3-cafeoilquínico, quercetina e campferol.

Edenharder (2001) identificou o conteúdo fenólico dos espinafres e verificou que estes eram constituídos maioritariamente por flavonóides como quercetina, campferol e miricetina.

O conteúdo fenólico da groselha também é evidente. Vagiri (2012) fez a identificação destes compostos por HPLC e identificou particularmente ácidos fenólicos (hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos), flavanóis (catequinas e procianidinas) e flavonóis (glicosídeos de miricetina, quercetina, campferol e isoramnetina).

O mirtilo é constituído pelos ácidos caféico, gálico, ferúlico, cumárico e elágico e ainda pelas antocianinas 3-galactósidos, 3-arabinósidos e 3-glucósido de cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina e malvidina (Sellappan, 2002).

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Rochfort et al. (2006), caraterizaram a composição fenólica de couves pertencentes à família Brassica, as quais incluem a couve-repolho, couve-flor e brócolos. Verificaram que continham essencialmente duas classes, nomeadamente os flavonóides campferol e quercetina e as flavonas apigenina e luteolina.

Em 2004, George et al. identificaram os principais compostos fenólicos presentes no tomate. Os ácidos 5-cafeoilquínico e 4-cafeoilquínico pertencentes à classe dos ácidos hidroxicinâmicos, o flavonol quercetina e as flavanonas rutina, prunina e a calconaringenina foram os fenóis presentes em maior abundância neste legume.

Os principais polifenóis encontrados na cenoura são os ácidos fenólicos, mais precisamente os ácidos 5-cafeoilquínico, feruloilquínico e o ácido coumaroilquínico. (Beveridge e Harrison, 2001).

Enquanto a salsa é caraterizada pela presença de furanocumarinas, flavonas e flavonóis o rabanete é fenolicamente caraterizado pela presença dos ácidos fenólicos cumáricos e ferúlicos e por antocianinas baseadas na pelargonidina-3-O- soforósido-5-O-glucósido as quais são aciladas com ácidos cinâmicos e com ácido malónico (Otsuki et al., 2002)

.

Em 2004, Hong et al. avaliaram a composição fenólica do pêssego e identificaram os ácidos 5-cafeoilquínico e 3-cafeoilquínico, os flavanóis (-) - epicatequina, (+) - catequina, a flavona rutina e o flavonol quercetina-3-O-glucósido. No entanto, Fu et al., em 2011, ainda identificaram neste fruto o ácido caféico, catecol e ácido clorogénico

Em 2011, Fu et al. caraterizaram a atividade antioxidante e o perfil fenólico de 62 frutos. Verificaram que a laranja era constituída por ácido ferúlico, quercetina, ácido clorogénico e luteolina e a papaia maioritariamente pelos ácidos hidroxicinâmicos, caféico e ferúlico. O ananás é constituído pela luteolina-7-O-glucósido, ácido clorogénico, ácido ferúlico e o ácido protacatecuico. Já a romã possui cianidina-3-O-galacósido, 3-cafeoilquínico, quercetina-3-O-glucósido.

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1.4. Atividade antioxidante

Os antioxidantes são substâncias que previnem ou retardam o dano oxidativo de lípidos, proteínas e ácidos nucleicos causados por espécies reativas de oxigênio, bem como radicais livres (Bayili et al., 2011). Das espécies reativas conhecidas, destacam-se os radicais superóxido, peróxido de hidrogénio, hidroxilo e o oxigénio singuleto (Tawaha, 2007) por serem os mais nocivos nos processos biológicos. Na figura 6 podemos observar o principal mecanismo da atividade antioxidante.

Antioxidantes:

Figura 6: Mecanismo de atividade antioxidante (Melo e Guerra, 2002).

O excesso de espécies reativas de oxigénio no organismo leva a um desequilíbrio designado de stress oxidativo (Neves et al., 2009).

O stress oxidativo é um estado de desequilíbrio onde quantidades excessivas de oxigénio reativo e / ou espécies de nitrogénio, possuem a capacidade de superar antioxidantes endógenos, conduzindo à oxidação de lípidos celulares, proteínas e DNA resultando na sua modificação e inutilização (Valko, 2007).

Os antioxidantes podem exercer a sua atividade por mecanismos de ação diferentes, isto é, a nível radicalar, através da complexação de metais pró-oxidantes (ferro ou cobre) ou por uma ação complementar, ou seja, efetuando a regeneração de antioxidantes primários através da cedência de átomos de hidrogénio (Rajalakshmi, 1996).

Os antioxidantes podem ser classificados em duas categorias: antioxidantes primários e secundários. Os antioxidantes primários são capazes de inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres devido à doação de átomos de hidrogénio ou de eletrões, transformando os radicais em substâncias estáveis. Os antioxidantes

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secundários apresentam uma grande variedade de modos de ação, entre eles, a ligação de iões metálicos, a inativação de espécies reativas de oxigénio, a conversão de hidroperóxidos em espécies não radicalares ou ainda a absorção da radiação UV (Maisuthisaku et al., 2007).

Alguns dos antioxidantes são endogenamente produzidos, como é o caso de enzimas, de moléculas de baixo peso molecular ou de cofatores enzimáticos. Os tecidos humanos dispõem de um sistema antioxidante endógeno que permite alcançar uma proteção eficiente. Este sistema consiste num arranjo de diversos componentes lipossolúveis, como vitamina E e carotenóides, hidrossolúveis, como ácido ascórbico e glutatinona, e enzimáticos, como glutatinona peroxidase, superóxido dismutase e catalase (Mclean et al., 2005). Os antioxidantes exógenos são obtidos de fontes dietéticas e podem ser classificados em várias classes como polifenóis, vitaminas, carotenóides, compostos organossulfurados e minerais (Ratnam et al., 2006).

Para além disso, os antioxidantes fornecem proteção contra radicais livres prejudiciais que são produzidos pelo metabolismo aeróbio. Estes antioxidantes estão fortemente associados à redução do risco de doenças crónicas, tais como doenças cardiovasculares, cancro, diabetes, alzheimer, cataratas, podendo desta forma ser bastante benéficos para a saúde (Zulueta, 2007).

Os alimentos, principalmente as frutas e legumes, contêm agentes antioxidantes, tais como as vitaminas C, E e A, os flavonóides, carotenóides, curcumina e outros que são capazes de restringir a propagação das reações em cadeia e as lesões induzidas pelos radicais livres (Bianchi e Antunes, 1999).

Os compostos fenólicos são os antioxidantes naturais mais abundantes na dieta humana, como flavonóides, tocoferóis, derivados do ácido cinâmico, cumarinas e alguns ácidos orgânicos.

A atividade antioxidante dos compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura química. Estas caraterísticas desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição (Sousa, 2007). O mecanismo da atividade antioxidante dos compostos fenólicos encontra-se na figura 7.

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Figura 7: Mecanismo da atividade antioxidante dos compostos fenólicos.

1.5. Fenilalanina Amónia Liase

A fenilalanina é o precursor da grande parte dos compostos fenólicos sendo a enzima fenilalanina amónia liase (PAL) a enzima responsável pela biossíntese destes compostos.

A atividade da PAL varia de acordo com a fase de desenvolvimento da planta, da célula e diferenciação dos tecidos. Para além disso, também varia com fatores de stress, tais como: irradiação, feridas, deficiências nutricionais, herbicidas, ataques e tratamentos virais, fúngicos e insetos que podem aumentar a atividade desta (Morello et al.,2004).

Fenilalanina, tirosina e triptofano são os principais metabolitos precursores de muitos produtos naturais (secundários) como os flavonóides, ácidos fenólicos, cumarinas, alcalóides, glicosídeos cianogênicos e glucosinolatos

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Quando os tecidos vegetais saudáveis são sujeitos a lesões estes produzem sinais que vão dos tecidos feridos para os tecidos saudáveis e induzem a síntese de proteínas específicas. Estas proteínas podem ser enzimas do metabolismo fenólico, como a PAL (Saltveit, 2000).

Esta reação processa-se de acordo com a via metabólica do ácido chiquímico e pelo metabolismo do fenilpropanóide.

A PAL catalisa a primeira fase na biossíntese dos compostos fenólicos, que por desaminação da L-fenilalanina origina o ácido trans-cinâmico (Rivero, 2001). Estes ácidos são o ponto de partida biossintético no que diz respeito ao metabolismo dos compostos fenólicos nas plantas, obtendo-se a partir deles outros compostos secundários através de diferentes reações: hidroxilações, interconversões, conjugações, polimerizações e degradações. Na figura 8 encontra-se o esquema da via biossíntética dos compostos fenólicos a partir da fenilalanina.

Figura 8: Esquema representativo da via biossintética das classes de flavonóides. As principais

enzimas representadas desta via biossintética são: fenilalanina amónia liase (PAL), calcona sintetase (CHS), calcona isomerase (CHI), flavona 3 hidroxilase (F3H), di-hidroflavonol-4-redutase (DFR), flavonol sintase (FLS), antocianidina sintase (ANS), antocianidina di-hidroflavonol-4-redutase (ANR), leucoantocianidina redutase (LAR). Adaptado de Menezes et al. e winkel-shirley (2008)

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A via do ácido chiquímico leva à formação de três aminoácidos aromáticos, triptofano, tirosina e fenilalanina. A maioria das classes de compostos fenólicos são derivados de fenilalanina, embora o tanino hidrolisável seja produzido diretamente através do ácido gálico na rota do ácido chiquímico.

O elevado poder da atividade da PAL está associado com a acumulação de antocianinas e outros compostos fenólicos em tecidos de várias espécies de frutos. Assim, a acumulação de compostos fenólicos varia com o estado fisiológico do fruto e resulta do equilíbrio entre a sua biossíntese e catabolismo (Blankenship e Unrath, 1988).

1.6. Objetivos

Hoje em dia, verifica-se uma crescente procura de produtos alimentares que complementem a nossa dieta por serem entendidos como benéficos para a saúde. Este facto é cada vez mais impulsionado pela própria indústria, que insistentemente publicita e coloca no mercado suplementos alimentares que satisfaçam a procura do consumidor. Estes têm sido amplamente utilizados por exemplo por atletas de alta competição, por consumidores que tentam associar estes produtos ao bem-estar, e ainda por crianças ou jovens que necessitam de um reforço vitamínico.

Tendo em conta estes pressupostos, torna-se necessário confirmar a eficácia destes produtos na saúde do consumidor, nomeadamente ao nível da sua composição em fitoquímicos, já que estes estão francamente associados à atividade antioxidante.

Assim, o objetivo deste trabalho foi o estudo de três gamas de suplementos alimentares (legumes, frutas e frutos vermelhos). Este estudo foi solicitado por uma multinacional, com sede em Itália, sendo o objetivo da multinacional, a propagação do consumo destes suplementos, associando-os às suas carateristicas fitoquímicas e consequentemente benefícios na saúde e desta forma fomentar a sua comercialização. Estes foram analisados em termos de composição fenólica, atividade antioxidante e atividade enzimática de forma a verificar a veracidade dos benefícios que estes suplementos suportam na saúde do consumidor.

Além disso, foi também objetivo do trabalho a análise dos alimentos individuais que fazem parte da constituição de cada suplemento a fim de verificar de que forma estes podem contribuir com as suas carateristicas fitoquímicas para o bem-estar do consumidor.

Capítulo II

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2.1. Amostragem

A amostragem deste trabalho foi constituída por três suplementos alimentares produzidos e comercializados por uma multinacional italiana, e pelos constituintes individuais de cada um dos suplementos. As frutas e legumes que fazem parte da constuição de cada suplemento foram obtidos numa superfície comercial. Foram utilizadas as suas partes edivéis e colocadas num liofilizador, sendo posteriormente moídas e conservadas a uma temperatura de -18ºC para uma utilização posterior.

Os suplementos alimentares e os seus constituintes individuais foram avaliados ao nível da sua composição fenólica (fenóis totais, orto-difenóis, atividade antioxidante e atividade da enzima PAL. Na tabela 5 encontra-se a constituição de cada gama de suplementos.

Tabela 5: Constituição de cada gama de suplementos.

Suplementos Constituição

Frutas Maçã, Laranja, Ananás, Mirtilo, Acerola, Pêssego,

Papaia, Tâmara, Ameixa preta

Legumes Cenoura, Brócolos, Couve-Repolho, Courgette,

Salsa, Beterraba, Tomate, Alho, Espinafre

Frutos vermelhos Uva concord, Mirtilo azul, Arando, Amora,

Framboesa, Groselha vermelha, Cássis, Baga de sabugueiro e Romã.

Para além disso, fez-se uma mistura com os respetivos legumes e frutas em fresco equivalente à composição de cada gama de nutracêutico, isto é, as mesmas proporções de cada constituinte individual, e estudaram-se os mesmos parâmetros químicos. Procedeu-se ainda à mistura das três gamas de suplementos de forma a verificar se existe um efeito sinérgico ou antagonista entre os diferentes compostos.

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Determinação da composição fenólica

Para a extração dos compostos fenólicos procedeu-se à pesagem de 0,50 g de amostra moída (quer dos suplementos, quer dos alimentos liofilizados) e adicionou-se 5 ml de Metanol:Água (50:50) aos suplementos de legumes e frutas e 5 ml de uma solução metanólica de HCl a 1% aos suplementos de frutos vermelhos e aos constituintes deste suplemento. As soluções foram colocadas num agitador durante 30 minutos e seguidamente centrifugadas durante 5 minutos a 5000 rpm. O líquido sobrenadante foi recuperado para balões de 50 ml. Esta metodologia foi repetida 4 vezes. Depois de extraído todo o sobrenadante, o volume dos balões foi completado com a respetiva solução de extração. Este procedimento foi efetuado para cada amostra em triplicado. As amostras foram diluídas tantas vezes quantas as necessárias para a sua quantificação.

Figura 9: Extratos metanólicos de frutas.

2.2.2. Quantificação dos fenóis totais.

Princípio do método: Na pesquisa de fenóis totais foi utilizado o método

espetrofotométrico de Folin-Ciocalteau. Este consiste numa mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunfuístico, em meio alcalino, de coloração amarela, que na presença de agentes redutores como compostos fenólicos originam óxidos de molibdénio e tungsténio de coloração azul (Sousa et al., 2014).

A partir da coloração azul é possível determinar o conteúdo em compostos fenólicos existentes na solução, lendo-se num espetrofotómetro a uma absorvância de 750 nm (Modificado por Sousa et al., 2014).

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De forma a possibilitar a construção da reta de calibração foram realizados oito padrões a partir de uma solução-mãe de ácido gálico, com diferentes concentrações: 200, 150, 100, 75, 50, 25, 10 e 5 mg/l.

A cada um dos oito tubos de ensaio foram adicionados sequencialmente 1 ml de cada padrão, 0,5 ml de Folin-Ciocalteau, 2,0 ml de carbonato de sódio a 7,5% e 6,5 ml de água. Levou-se 30 min a um banho de água a 70ºC, de seguida arrefeceu-se os tubos em água corrente e leu-se a absorvância a 750 nm em cuvetes de 1cm de percurso ótico (Modificado por Barros, 2013).

Na figura A, em anexo, encontra-se a reta de calibração utilizada para a quantificação dos fenóis totais na amostra.

Para a quantificação dos fenóis totais das nossas amostras foi adicionada a um tudo de ensaio sequencialmente 1 ml de amostra diluida, 0,5 ml de Folin-Ciocalteau, 2,0 ml de carbonato de sódio e 6,5 ml de água. Levou-se 30 min a um banho de água a 70ºC, de seguida arrefeceu-se os tubos em água corrente e leu-se a absorvância a 750 nm em cuvetes de 1cm de percurso ótico. A análise foi efetuada em triplicado.

Por interpolação, a partir da reta de calibração foram calculadas as concentrações de fenóis totais em cada uma das amostras. Os resultados são expressos em mg ácido gálico por g amostra seca.

2.2.3. Quantificação dos orto-difenóis.

Para a construção da reta de calibração foram usadas oito soluções padrão de ácido gálico, com diferentes concentrações: 200, 150, 100, 75, 50, 25, 10, 5 mg/L. Em cada um dos oito tubos de ensaio foram adicionados 4 ml de cada padrão e 1 ml de molibdato de sódio 0,5%. Deixou-se em repouso durante 15 min e leu-se a absorvância a 370 nm (Mateos, 2001). Na figura C, em anexo, encontra-se a reta de calibração utilizada para os cálculos da quantificação dos orto-difenóis.

Para quantificar os orto-difenóis das nossas amostras foram adicionados a um tubo de ensaio 4 ml da amostra e 1 ml de molibdato de sódio. Deixou-se em repouso 15 minutos e leu-se a absorvância a 370 nm. Este ensaio foi realizado em triplicado. Os resultados são expressos em mg ácido gálico por g amostra seca.

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2.2.4. Quantificação das antocianinas.

O teor em antocianinas em cada gama de suplementos foi determinado colorimetricamente pela diferença de cor obtida em dois tubos de ensaio, um a pH 3,5 e outro a pH 0,6. Este ensaio consistiu em colocar 1 ml de amostra concentrada num tubo de ensaio juntamente com 1 ml de solução etanólica /HCL 0,1 %. Seguidamente, adicionou-se 10 ml de solução tampão 3,5. O procedimento repetiu-se num outro tubo de ensaio, mas utilizando uma solução tampão 0,6. A leitura das amostras efetuou-se a um comprimento de onda de 520 nm. A quantidade de antocianinas presentes nas amostras determinou-se pela seguinte fórmula:

Os resultados foram expressos em mg/g de amostra seca.

Figura 10: Quantificação das antocianinas.

2.2.5. Quantificação dos flavonóides

Para a construção da reta de calibração foram usadas oito soluções padrão de catequina com diferentes concentrações: 250, 200, 150, 100, 50, 25, 10 e 5 mg/l. A cada um dos oito tubos de ensaio foram adicionados 0,5 ml da solução de catequina e 150 μl de NaNO2 5%. Após 5 minutos, foi adicionado 150 μl de AlCl3 10% e seguidamente após 6 minutos foi adicionado 1 ml de NaOH e agitou-se a mistura (Zhishen, 1999).

Após a agitação, a absorvância foi medida a um comprimento de onda de 510 nm.